本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)和免疫治療領(lǐng)域，特別涉及一種體外高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

自然殺傷細(xì)胞由造血干細(xì)胞分化發(fā)育而來，屬于人體免疫細(xì)胞的一種，是具有細(xì)胞溶解作用、能夠分泌免疫調(diào)節(jié)因子的效應(yīng)淋巴細(xì)胞，醫(yī)學(xué)上稱之為“人體抗腫瘤和抗感染的第一道防線”。與T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞不同，NK細(xì)胞無須預(yù)先接觸抗原即可殺傷靶細(xì)胞(包括細(xì)菌、病毒感染的宿主細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞)，且其殺傷效應(yīng)無MHC限制性，這種特性使得NK細(xì)胞在抗腫瘤反應(yīng)和免疫監(jiān)視病變細(xì)胞、癌變細(xì)胞過程中發(fā)揮著巨大的作用。大量臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，NK細(xì)胞治療在骨肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌和乳腺癌等癌癥治療中，起到了非常積極的治療效果。

然而，如何在體外獲得大量高純度高質(zhì)量的NK細(xì)胞一直限制著NK細(xì)胞免疫治療在臨床上的廣泛應(yīng)用。在健康人的外周血中，NK細(xì)胞大約占外周血淋巴細(xì)胞的5％-10％。傳統(tǒng)地，通過磁珠去除外周血淋巴細(xì)胞中的T淋巴細(xì)胞，再用高劑量的細(xì)胞因子如高劑量的白介素2或飼養(yǎng)層細(xì)胞刺激NK細(xì)胞的方法所獲得的NK細(xì)胞表現(xiàn)出低擴(kuò)增倍數(shù)、細(xì)胞因子依賴性、細(xì)胞衰老等問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種能獲得大量高純度高質(zhì)量的NK細(xì)胞的方法，即利用人工抗原遞呈細(xì)胞（artifical Antigen Presenting Cell, aAPC）和細(xì)胞因子聯(lián)合刺激外周血單核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC），獲得大量高純度高質(zhì)量NK細(xì)胞的方法。

本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：

一種體外高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法，所述方法包括如下步驟：

Step1.通過傳統(tǒng)的Ficoll-Paque密度梯度離心法從人的外周血中分離出PBMC；

Step2.將人工抗原遞呈細(xì)胞經(jīng)輻照處理后，液氮凍存；

Step3.將PBMC與輻照處理后的人工抗原遞呈細(xì)胞按質(zhì)量比為1:2的比例在添加有白介素2的RPMI 1640培養(yǎng)基的T75的細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)共培養(yǎng)，每2-3天更換新鮮培養(yǎng)基；

Step4.每隔7天，計(jì)算T75的細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的總細(xì)胞數(shù)目，添加等細(xì)胞數(shù)目的輻照處理后的人工抗原遞呈細(xì)胞再次刺激，連續(xù)培養(yǎng)21天，得到擴(kuò)增后的NK細(xì)胞。

通過采用上述技術(shù)方案，F(xiàn)icoll-Paque密度梯度離心法利用顆粒之間存在沉降系數(shù)差，在一定的離心力下，在對應(yīng)梯度取得純度較高的PBMC；利用輻照后的人工抗原蛋白具有不同于普通抗原蛋白新性能；按比例添加后，人工抗原遞呈細(xì)胞與低劑量的白介素2協(xié)同作用，相較于僅使用高劑量的白介素2，能夠進(jìn)一步刺激PBMC，使NK細(xì)胞在體外得到擴(kuò)增，得到高純度高質(zhì)量的NK細(xì)胞，通過該種方法，可進(jìn)行相對大規(guī)模的NK細(xì)胞的制備，使NK細(xì)胞的臨床應(yīng)用成為可能，每隔7天對細(xì)胞進(jìn)行人工抗原遞呈細(xì)胞再次刺激，使PBMC分化NK細(xì)胞的過程能夠得到源源不斷地刺激，使NK細(xì)胞具有較大的擴(kuò)增量，經(jīng)上述方法制得的擴(kuò)增后的NK細(xì)胞，具有高純度、高質(zhì)量的特點(diǎn)，延長了NK細(xì)胞的壽命，使擴(kuò)增后的NK細(xì)胞相較于未擴(kuò)增前具有更好的活性功能。

作為優(yōu)選，所述人工抗原遞呈細(xì)胞為K562-mb.IL21＋CD137L細(xì)胞株，其包括穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞膜結(jié)合型的白介素21和CD137配體的K562細(xì)胞株。

通過采用上述技術(shù)方案，K562-mb.IL21+CD137L細(xì)胞株能夠在細(xì)胞膜表面穩(wěn)定表達(dá)白介素21和CD137配體，同時(shí)，細(xì)胞膜結(jié)合型的白介素21的穩(wěn)定效果更好，以此作為PBMC擴(kuò)增的飼養(yǎng)細(xì)胞，能夠直接擴(kuò)增NK細(xì)胞，獲得高純度且擴(kuò)增量大的NK細(xì)胞，CD137配體通過與表達(dá)在NK細(xì)胞、T細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞表面上的公刺激分子CD137結(jié)合，起到促進(jìn)NK細(xì)胞、T細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞的活化的作用。

作為優(yōu)選，所述細(xì)胞膜結(jié)合型的白介素21為白介素21與跨膜蛋白或鉸鏈蛋白相連而成的融合蛋白，其結(jié)構(gòu)由GM-CSF signal peptide、白介素21、IgG4和CD4相連而形成。

通過采用上述技術(shù)方案， GM-CSF signal peptide 為出膜信號肽，提供出膜信號給白介素21，引導(dǎo)白介素21出細(xì)胞膜；IgG4 Hinge+Fc 段連接白介素21，使白介素21在細(xì)胞膜外流動性不會過差，提升白介素21的靈活性；CD4TM為CD4的跨膜段，負(fù)責(zé)將白介素21固定在細(xì)胞膜上，使白介素21不會呈游離態(tài)脫離細(xì)胞膜表面，完整的氨基酸序列或具備其功能的氨基酸序列片段的GM-CSF signal peptide、白介素21、IgG4、CD4和CD137配體的氨基酸表達(dá)更加穩(wěn)定。

作為優(yōu)選，所述輻照處理的輻照強(qiáng)度為80~150Grays。

通過采用上述技術(shù)方案，處于80~150Grays輻照強(qiáng)度內(nèi)進(jìn)行輻照的K562-mb.IL21＋CD137L細(xì)胞株具有其突變對NK擴(kuò)增的效果較好，輻照強(qiáng)度過大，細(xì)胞株的突變過多，所擴(kuò)增制得的NK細(xì)胞的純度較低，輻照強(qiáng)度過大，細(xì)胞株無法突變，無法起到提升NK細(xì)胞擴(kuò)增的效果。

作為優(yōu)選，所述白介素2的劑量為40~70IU/mL。

通過采用上述技術(shù)方案，白介素2計(jì)量過小或過大會導(dǎo)致培養(yǎng)基濃度過低或過高，細(xì)胞擴(kuò)增和分化過程對培養(yǎng)基濃度要求十分苛刻，濃度過高會導(dǎo)致細(xì)胞失水，濃度過低細(xì)胞膜則容易漲破，均不利于細(xì)胞的擴(kuò)增和分化。

作為優(yōu)選，所述細(xì)胞膜結(jié)合型的白介素21和CD137配體通過T2A連接。

通過采用上述技術(shù)方案，細(xì)胞膜結(jié)合型的白介素21和CD137配體進(jìn)通過T2A連接，當(dāng)mb.IL21+CD137L細(xì)胞株的基因在細(xì)胞內(nèi)翻譯時(shí)會在T2A區(qū)域斷裂成2個(gè)獨(dú)立的片段。

作為優(yōu)選，所述K562-mb.IL21＋CD137L細(xì)胞株的細(xì)胞系內(nèi)整合有慢病毒載體，所述慢病毒載體上裝載有可轉(zhuǎn)錄成上述氨基酸序列的基因序列。

通過采用上述技術(shù)方案，慢病毒表達(dá)載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息，可提供所有的轉(zhuǎn)錄并包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白，為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。

作為優(yōu)選，所述細(xì)胞膜結(jié)合型的白介素21和CD137配體都表達(dá)在K562細(xì)胞株的細(xì)胞系的細(xì)胞膜上。

通過采用上述技術(shù)方案，細(xì)胞膜結(jié)合型的白介素21和CD137配體在K562細(xì)胞株的細(xì)胞膜上表達(dá)，提高了NK細(xì)胞的擴(kuò)增效率，使擴(kuò)增后的NK細(xì)胞具有高純度的特點(diǎn)。

作為優(yōu)選，所述擴(kuò)增后的NK細(xì)胞的平均擴(kuò)增的倍數(shù)為10⁵~10⁷，NK細(xì)胞的端粒長度要比擴(kuò)增之前的NK細(xì)胞的端粒長度長8~15倍。

通過采用上述技術(shù)方案，經(jīng)擴(kuò)增后的NK細(xì)胞的端粒長度較擴(kuò)增之前加長，通過端粒長度可以推斷NK細(xì)胞的活力與壽命，擴(kuò)增后的NK細(xì)胞具有較之?dāng)U增前更長的壽命和更好的活力，其抗癌、抗衰老的效果也能得到提升。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種體外高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法的應(yīng)用，擴(kuò)增后的NK細(xì)胞在抗衰老、抗病毒、抗癌方面的效果都十分好。

本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：

一種體外高效擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法的應(yīng)用，所述擴(kuò)增后的NK細(xì)胞在抗衰老中應(yīng)用具體表現(xiàn)為清除體內(nèi)衰老細(xì)胞、病變細(xì)胞的一種或多種；所述擴(kuò)增后的NK細(xì)胞在抗衰老中應(yīng)用在抗病毒中的應(yīng)用具體表現(xiàn)為治療皰疹病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、巨細(xì)胞病毒、流感病毒、人乳頭瘤病毒的一種或多種；所述擴(kuò)增后的NK細(xì)胞在抗腫瘤中的應(yīng)用具體表現(xiàn)為治療慢性髓系淋巴細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、子宮肌瘤、前列腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、骨肉瘤中的一種或多種。

通過采用上述技術(shù)方案，擴(kuò)增后的NK細(xì)胞在抗衰老、抗病毒、抗癌方面有著多種用處，且其殺傷效應(yīng)無MHC限制性，這種特性使得NK細(xì)胞在抗腫瘤反應(yīng)和免疫監(jiān)視病變細(xì)胞、癌變細(xì)胞過程中發(fā)揮著巨大的作用。

綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果：

1、該種NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法以輻照mb.IL21+CD137L細(xì)胞株作為飼養(yǎng)細(xì)胞，添加低劑量白介素2的RPMI 1640作為培養(yǎng)基，以此擴(kuò)增NK細(xì)胞，相較于現(xiàn)有技術(shù)，NK細(xì)胞擴(kuò)增后的純度和細(xì)胞量都有著較大的提升；

2、經(jīng)過輻照后的mb.IL21+CD137L細(xì)胞株還具有增強(qiáng)NK細(xì)胞端粒的效果，使擴(kuò)增后的NK細(xì)胞回復(fù)活性，并增長了NK細(xì)胞的壽命，減緩了NK細(xì)胞的衰老過程；

3、該種擴(kuò)增后的NK細(xì)胞除了對腫瘤細(xì)胞以及病毒細(xì)胞有著突出的清除率之外，在抗衰老方面同樣有著極佳的效果。

附圖說明

圖1是全基因合成的mb.IL21＋CD137L的基因序列示意圖；

圖2是mb.IL21+CD137L細(xì)胞株在K562細(xì)胞上表達(dá)的流式細(xì)胞圖；

圖3是擴(kuò)增前后NK細(xì)胞純度的流式細(xì)胞圖，主要示出了擴(kuò)增21天后，擴(kuò)增細(xì)胞中CD3和CD56的表達(dá)；

圖4是NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)圖，主要示出了NK細(xì)胞在K562-mb.IL21+CD137L細(xì)胞株和低劑量白介素2共同刺激下細(xì)胞數(shù)目的變化；

圖5是擴(kuò)增后NK細(xì)胞表面受體流式細(xì)胞圖；

圖6是NK細(xì)胞殺死腫瘤細(xì)胞系的殺傷圖；

圖7是擴(kuò)增后NK細(xì)胞端粒長度的變化。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

密度梯度離心法分離PBMC

Step1.抽取40歲中年志愿者的外周血5mL置于無菌離心管中，加入0.5mL的檸檬酸鈉混勻；

Step2.加入5mL1640細(xì)胞培養(yǎng)液再次混勻，稀釋；

Step3.取5mL淋巴細(xì)胞分離液置于離心管中，用滴管將Step1中稀釋的血液沿管壁緩慢加入分離液上，并使血液與分離液保持兩相分離；

Step4.將離心管1800rpm/min離心25min；

Step5.用毛細(xì)吸管沿管壁插入單個(gè)核細(xì)胞層，洗出單個(gè)核細(xì)胞置于另一無菌離心管內(nèi)；

Step6.加入5倍體積的1640細(xì)胞培養(yǎng)液，1500rpm/min，離心10分鐘，取沉淀；

Step7.重復(fù)Step6兩次后，用1640細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液備用。

＋CD137L細(xì)胞株的構(gòu)建

參見圖1，以K562細(xì)胞株作為載體，選取包含GM-CSF signal peptide完整氨基酸序列的GM-CSF signal peptide、包含IgG4完整氨基酸序列的IgG4、包含CD4完整氨基酸序列的CD4與包含白介素21完整氨基酸序列的白介素21（IL-21）相連形成融合蛋白，該融合蛋白為細(xì)胞膜結(jié)合型的白介素21。選取包含CD137配體(CD137L)完整氨基酸序列的CD137配體，通過T2A連接細(xì)胞膜結(jié)合型的白介素21和CD137配體，合成mb.IL21＋CD137L的基因。

GM-CSF signal peptide 為出膜信號肽，引導(dǎo)白介素21出細(xì)胞膜； IgG4 Hinge+Fc 段連接白介素21，使其在細(xì)胞膜外具有一定靈活性；CD4中包含有跨膜段CD4TM，負(fù)責(zé)將白介素21固定在細(xì)胞膜上；T2A連接白介素21和CD137配體，當(dāng)mb.IL21＋CD137L的基因在細(xì)胞內(nèi)翻譯時(shí)，T2A會斷裂使mb.IL21＋CD137L形成2個(gè)獨(dú)立的片段；CD137配體能夠與表達(dá)在NK細(xì)胞、T細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞表面上的公刺激分子CD137結(jié)合，促進(jìn)NK細(xì)胞、T細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞的活化。

全基因合成mb.IL21＋CD137L的基因之后，將基因裝載到慢病毒載體，包裝慢病毒，感染K562細(xì)胞，培養(yǎng)4天后，通過Puro、Neo、GFP等標(biāo)記基因，流式細(xì)胞儀檢測mb.IL21和CD137配體在K562細(xì)胞細(xì)胞膜表面表達(dá)情況，參見圖2，篩選具有穩(wěn)定表達(dá)mb.IL21蛋白和CD137配體蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞株，液氮保存篩選的K562-mb.IL21＋CD137L細(xì)胞株。

細(xì)胞的擴(kuò)增方法

Step1.通過傳統(tǒng)的Ficoll-Paque密度梯度離心法從人的外周血中分離出PBMC；

Step2.將K562-mb.IL21＋CD137L細(xì)胞株經(jīng)100Grays輻照處理后，液氮凍存；

Step3. 在T75的細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)制備50IU/mL白介素2的RPMI 1640培養(yǎng)基；

Step4.將PBMC與輻照處理后的K562-mb.IL21＋CD137L細(xì)胞株按質(zhì)量比為1:2的比例在添加到T75的細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)共培養(yǎng)，每2-3天更換新鮮培養(yǎng)基；

Step5.每隔7天，計(jì)算T75的細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的總細(xì)胞數(shù)目，添加等細(xì)胞數(shù)目的輻照處理后的人工抗原遞呈細(xì)胞再次刺激，連續(xù)培養(yǎng)21天，得到擴(kuò)增后的NK細(xì)胞。

擴(kuò)增后的NK細(xì)胞的純度檢測

參見圖3，在輻照后的K562-mb.IL21＋CD137L細(xì)胞株和低劑量白介素2的共同作用下，連續(xù)培養(yǎng)21天，得到擴(kuò)增后的NK細(xì)胞用流式細(xì)胞儀對擴(kuò)增細(xì)胞進(jìn)行檢測，從圖3可知，擴(kuò)增前的CD3-CD56⁺NK細(xì)胞比例僅占2.09%，擴(kuò)增后，CD3-CD56⁺NK細(xì)胞的比例約占97%。

擴(kuò)增后的NK細(xì)胞的數(shù)量檢測

參見圖4，在輻照后的K562-mb.IL21＋CD137L細(xì)胞株和低劑量白介素2的共同作用下，連續(xù)培養(yǎng)21天，得到擴(kuò)增后的NK細(xì)胞用以自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行檢測，從圖4可知，CD3^-CD56⁺NK細(xì)胞平均擴(kuò)增的倍數(shù)為15000倍。

擴(kuò)增后的NK細(xì)胞的表型檢測

參見圖5，在輻照后的K562-mb.IL21＋CD137L細(xì)胞株和低劑量白介素2的共同作用下，連續(xù)培養(yǎng)21天，得到擴(kuò)增后的NK細(xì)胞用流式細(xì)胞儀對NK細(xì)胞表面受體中激活型受體和抑制性受體的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，從圖5可知，幾乎所有的擴(kuò)增后的NK細(xì)胞都表達(dá)激活型受體，包括有NKG2D, DNAM-1, NKp46 和 NKp30。

擴(kuò)增后的NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的裂解作用

參見圖6，在輻照后的K562-mb.IL21＋CD137L細(xì)胞株和低劑量白介素2的共同作用下，連續(xù)培養(yǎng)21天，得到擴(kuò)增后的NK細(xì)胞通過鈣黃綠素釋放試驗(yàn)檢測NK細(xì)胞殺死K562(人慢性髓系白血病細(xì)胞系)，A549(人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系)，MCF-7（人乳腺癌細(xì)胞系），HCT116（人結(jié)直腸癌細(xì)胞系）能力，由圖可知，擴(kuò)增后的NK細(xì)胞在效：靶比為10:1時(shí)，對K562、A549的細(xì)胞溶解率均達(dá)到了85%以上，對MCF-7、HCT116的細(xì)胞溶解率也達(dá)到了70%以上，由此可知，擴(kuò)增后的NK細(xì)胞對上述腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的清除效果。

擴(kuò)增后的NK細(xì)胞端粒長度檢測

參見圖7，在輻照后的K562-mb.IL21＋CD137L細(xì)胞株和低劑量白介素2的共同作用下，連續(xù)培養(yǎng)21天，得到擴(kuò)增后的NK細(xì)胞檢測NK細(xì)胞端粒長度的變化，檢測如圖7中的實(shí)驗(yàn)組所示，結(jié)果表明本發(fā)明擴(kuò)增后的NK細(xì)胞的端粒長度要比擴(kuò)增之前的NK細(xì)胞的端粒長度長10倍；

按照現(xiàn)有技術(shù)，將只使用200IU/ml白介素2的培養(yǎng)基作為對照組，在不添加輻照后的K562-mb.IL21＋CD137L細(xì)胞株的情況下，連續(xù)培養(yǎng)21天，得到擴(kuò)增的NK細(xì)胞端粒長度如圖7中對照組所示，要比擴(kuò)增之前的NK細(xì)胞的端粒長度短15倍。

通過上述擴(kuò)增方法得到的擴(kuò)增后的NK細(xì)胞，具有高純度的特點(diǎn)，CD3-CD56⁺NK細(xì)胞的比例可以達(dá)到97%以上，且具有擴(kuò)增效率高，21天左右的擴(kuò)增的CD3^-CD56⁺NK細(xì)胞平均擴(kuò)增的倍數(shù)能夠達(dá)到15000倍以上，且擴(kuò)增后的NK細(xì)胞的端粒長度比擴(kuò)增之前的NK細(xì)胞的端粒長度長10倍，從端粒長度可以推斷，擴(kuò)增后的NK細(xì)胞具有較之?dāng)U增前活性更強(qiáng)，對衰老細(xì)胞、病毒細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞有著較佳的清除率。

本具體實(shí)施例僅僅是對本發(fā)明的解釋，其并不是對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀完本說明書后可以根據(jù)需要對本實(shí)施例做出沒有創(chuàng)造性貢獻(xiàn)的修改，但只要在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)都受到專利法的保護(hù)。