一種用于預(yù)測(cè)nsclc病人預(yù)后的試劑盒及骨橋蛋白作為特異標(biāo)記物的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于構(gòu)建預(yù)測(cè)NSCLC病人預(yù)后及指導(dǎo)唑來(lái)膦酸臨床應(yīng)用的試劑盒和將骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)作為M2型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記物的應(yīng)用；應(yīng)用本發(fā)明試劑盒是采用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測(cè)組織芯片中OPN在TAMs和腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，對(duì)NSCLC病人預(yù)后進(jìn)行評(píng)估，并針對(duì)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果及時(shí)采取綜合手段干預(yù)，提高病人遠(yuǎn)期生存率，改善預(yù)后，方法簡(jiǎn)單、方便、可廣泛應(yīng)用于臨床。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種用于預(yù)測(cè)NSCLC病人預(yù)后的試劑盒及骨橋蛋白作為特異標(biāo)記物的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種用于預(yù)測(cè)NSCLC病人預(yù)后的試劑盒及骨橋蛋白作為特異標(biāo)記物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肺癌是目前發(fā)病率和死亡率均居第一位的惡性腫瘤。盡管近幾年來(lái)肺癌的綜合治療取得很大進(jìn)展，然而其5年生存率仍然徘徊在15%左右。肺癌的70%?80%為非小細(xì)胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC), NSCLC很容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(腦、骨、腎上腺和肝臟轉(zhuǎn)移)。即使I期肺癌患者，在術(shù)后也有27% -55%的患者將出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的情況。如何早期鑒別這部分高危人群并及時(shí)給予輔助治療是目前研究的焦點(diǎn)。
[0003]目前，包括微小RNA、基因、染色體、和蛋白等用于預(yù)測(cè)預(yù)后或干預(yù)治療的因素已被廣泛研究，其主要研究對(duì)象局限于腫瘤細(xì)胞本身，忽略了腫瘤生存的“土壤” 一微環(huán)境。腫瘤的微環(huán)境指腫瘤細(xì)胞周?chē)睦w維原細(xì)胞、免疫細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)等；微環(huán)境是腫瘤與宿主之間的相互作用的直接接觸面，它在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生演進(jìn)過(guò)程中起重要作用。在腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞中最重要的是巨噬細(xì)胞。浸潤(rùn)腫瘤間質(zhì)中的巨噬細(xì)胞稱(chēng)之為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages, TAMs)。既往認(rèn)為T(mén)AMs只是腫瘤免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中的一種重要細(xì)胞群，可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，或者通過(guò)呈遞腫瘤相關(guān)抗原誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答從而清除腫瘤。
[0004]近年來(lái)，Mantovani等提出了著名的“巨噬細(xì)胞平衡假說(shuō)”，認(rèn)為T(mén)AMs具有殺傷腫瘤和促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的雙重作用。一部分TAMs表現(xiàn)出促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的M2表型；相反另外一種表型為M1，具有抑制腫瘤的功能。NSCLC間質(zhì)中的TAMs功能尚存爭(zhēng)論，不同學(xué)者的研究結(jié)果甚至相互矛盾，目前并無(wú)確切的解釋?zhuān)潢P(guān)鍵因素在于目前關(guān)于M2和Ml巨噬細(xì)胞缺乏特異性的標(biāo)記物。
[0005] 申請(qǐng)人:在研究肺癌標(biāo)本癌巢骨橋蛋白(Osteopontin，0ΡΝ)的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，不僅腫瘤細(xì)胞表達(dá)0ΡΝ，而且部分病例的腫瘤間質(zhì)中浸潤(rùn)的TAMs也表達(dá)0ΡΝ。進(jìn)一步分析顯示伴有OPN陽(yáng)性TAMs浸潤(rùn)的患者較OPN陰性TAMs浸潤(rùn)患者更容易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后更差。這在既往有關(guān)NSCLC的研究中從未報(bào)道過(guò)。
[0006]目前市場(chǎng)上銷(xiāo)售的唑來(lái)膦酸等治療惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移的藥物其機(jī)理都是通過(guò)抑制骨組織的破骨細(xì)胞(巨噬細(xì)胞分化而成)達(dá)到治療作用。大量的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)唑來(lái)膦酸可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，然而這種抑制并非“靶向”，同時(shí)包括了 Ml型和M2型的巨噬細(xì)胞，如果指導(dǎo)唑來(lái)膦酸的“靶向”抑制Ml型將大大促進(jìn)促進(jìn)腫瘤治療的發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，而提供一種鑒別M2型TAMs的標(biāo)記物，并用于構(gòu)建預(yù)測(cè)NSCLC病人預(yù)后及指導(dǎo)唑來(lái)膦酸臨床應(yīng)用的試劑盒。[0008]本發(fā)明的另外一個(gè)目的在于提供一種將骨橋蛋白(Osteopontin, 0ΡΝ)作為M2型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記物的應(yīng)用。
[0009]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案是:一種用于預(yù)測(cè)NSCLC病人預(yù)后的試劑盒，其特征在于包括CD68單克隆抗體、OPN單克隆抗體、熒光二抗和免疫熒光試劑。
[0010]所述熒光二抗為⑶163標(biāo)記M2鼠抗人單克隆抗體和MHCII標(biāo)記Ml鼠抗人單克隆抗體。
[0011]免疫熒光試劑包括pH為7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS，全稱(chēng)Phosphate BufferedSaline)、0.0lmol/L檸檬酸鈉緩沖液、3%的牛血清白蛋白和熒光淬滅抑制劑。
[0012]所述磷酸鹽緩沖液是將8.0Og 的 NaCl、0.20g 的 KC1、2.083g 的 Na2HP04.12H20、0.261g的KH2P04.12Η20放入950ml的蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4，然后蒸餾水定容至1000ml制備而成。
[0013]所述檸檬酸鈉緩沖液是將3g的檸檬酸三鈉、0.4g的檸檬酸加入1000ml的蒸餾水制備而成。
[0014]上述骨橋蛋白(Osteopontin, 0ΡΝ)可作為M2型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記物的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明的原理及有益效果是:本發(fā)明能夠體現(xiàn)OPN陽(yáng)性表達(dá)的TAMs是一預(yù)后預(yù)測(cè)標(biāo)記物，可作為非小細(xì)胞肺癌移復(fù)發(fā)、預(yù)后預(yù)測(cè)提供新的試劑盒，通過(guò)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)OPN陽(yáng)性TAMs可作為唑來(lái)膦酸抗腫瘤治療療效的標(biāo)記物；應(yīng)用本發(fā)明試劑盒是采用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測(cè)組織芯片中OPN在TAMs和腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，對(duì)NSCLC病人預(yù)后進(jìn)行評(píng)估，并針對(duì)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果及時(shí)采取綜合手段干預(yù)，提高病人遠(yuǎn)期生存率，改善預(yù)后，方法簡(jiǎn)單、方便、可廣泛應(yīng)用于臨床。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0017]首先，對(duì)本發(fā)明涉及到的用于預(yù)測(cè)NSCLC病人預(yù)后的試劑盒的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)說(shuō)明如下:
[0018]1.實(shí)驗(yàn)材料
[0019](I)組織芯片
[0020]159例原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC)標(biāo)本選自 2003年I月至2006年12月期間在天津腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)患者并且經(jīng)病理明確的存檔蠟塊，所有標(biāo)本經(jīng)常規(guī)取材，10%甲醛液固定，石蠟包埋，4 μ m厚連續(xù)切片，選取需要部位，將其制成含159個(gè)點(diǎn)陣的組織芯片。
[0021]159例組織芯片的患者均接受以手術(shù)為主的綜合治療。術(shù)后病理確診為II期、III a期的患者均接受術(shù)后輔助化療?；煼桨覆捎肗SCLC的常規(guī)方案，包括長(zhǎng)春瑞濱、紫杉醇、及吉西他濱聯(lián)合順鉬或卡鉬等。
[0022](2)本發(fā)明試劑盒及免疫組化、熒光所需的其他試劑
[0023]一種用于預(yù)測(cè)NSCLC病人預(yù)后的試劑盒，包括⑶68單克隆抗體、OPN單克隆抗體、熒光二抗和免疫熒光試劑。
[0024]所述熒光二抗為⑶163標(biāo)記M2鼠抗人單克隆抗體和MHCII標(biāo)記Ml鼠抗人單克隆抗體。
[0025]具體的分類(lèi)如下:
[0026]I)抗體:
[0027]
OPN (兔抗人單克隆抗體，克隆號(hào):EPR3688)Abcom公司
CD68 (鼠抗人單克隆抗體，克隆號(hào):KPl)Santa Cruz公司
MHCII標(biāo)記Ml (鼠抗人單克隆抗體，克隆號(hào):LN3)Santa Cruz公司
CD 163標(biāo)記M2 (鼠抗人單克隆抗體，克隆號(hào):10D6) Santa Cruz公司
[0028]2) lXPBS(pH7.2-7.4):
[0029]
NaCl8.0Og
KCl0.^Ol
Na1JlPO1.1211,02.08?
[0030]
ΚΠ,ΡΟ,.12Η200.26Ig
[0031]加蒸懼水至950ml, HCL調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4,蒸懼水定容至1000ml。
[0032]3) 0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液
[0033]檸檬酸三鈉3g
[0034]檸檬酸0.4g
[0035]加蒸餾水至1000ml。
[0036]4)正常羊血清封閉液
[0037]5) DAB 北京中杉金橋公司
[0038]6)樹(shù)膠封片劑
[0039]7) 3%的牛血清白蛋白
[0040]8)熒光淬滅抑制劑
[0041]2.具體實(shí)驗(yàn)步驟
[0042](I)免疫組化步驟(SP法)
[0043] I)脫蠟、水化:脫蠟前應(yīng)將組織芯片放于鐵架上，于65°C烤箱中烘干過(guò)夜。次日組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后在浸泡10分鐘；無(wú)水乙醇中浸泡五分鐘；95%乙醇中浸泡五分鐘；75%乙醇中浸泡五分鐘；至清水中浸泡水化完畢。
[0044]2)取出切片，用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。
[0045]3)高溫高壓熱修復(fù)抗原:高壓鍋中加入適當(dāng)0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液(ph6.0)，240°C加熱至沸騰，將組織芯片置入其中，加蓋鍋蓋，至工作壓力持續(xù)加熱150s，停止加熱。
[0046]4)自然冷卻至室溫。
[0047]5)將組織芯片置于10%過(guò)氧化氫溶液避光浸泡20分鐘，去除組織中的過(guò)氧化氫酶。
[0048]6) PBS洗脫3次各5分鐘。
[0049]7)滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體。
[0050]8) PBS洗脫3次各5分鐘，甩去多余液體。
[0051]9)滴加一抗:分別滴加1:1000PN兔抗人單克隆抗體/1:100⑶68鼠抗人單克隆抗體/1:100M1鼠抗人單克隆抗體/1:100M2鼠抗人單克隆抗體100 μ I于組織芯片，并用PBS緩沖液作為一抗抗體陰性對(duì)照，覆蓋組織表面，液面一定要超過(guò)組織周?chē)僭S，4°C濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜。
[0052]10)4°C過(guò)夜后需在37°C復(fù)溫45分鐘。
[0053]11) PBS洗脫3次每次5分鐘，甩去多余液體。
[0054]12)滴加二抗100 μ I覆蓋組織，室溫濕盒內(nèi)孵育30min。
[0055]13) PBS洗3次各5分鐘。
[0056]14)滴DAB顯色劑覆蓋組織室溫避光顯色I(xiàn)?2分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度。
[0057]15)置入蒸懼水中停止顯色反應(yīng)。
[0058]16)蘇木復(fù)染2?4分鐘，蒸餾水洗脫；鹽酸酒精復(fù)紅2分鐘左右，蒸餾水洗脫；氨水返藍(lán)2分鐘，蒸餾水洗脫。
[0059]17)脫水、透明:80 %乙醇IOmin, 90 %乙醇IOmin,無(wú)水乙醇IOmin兩次，二甲苯20min兩次。
[0060]18)樹(shù)膠封片，鏡下觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0061](2)免疫熒光步驟
[0062]I)脫蠟、水化:脫蠟前應(yīng)將組織芯片放于鐵架上，于65°C烤箱中烘干過(guò)夜。次日組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后在浸泡10分鐘；無(wú)水乙醇中浸泡五分鐘；95%乙醇中浸泡五分鐘；75%乙醇中浸泡五分鐘；至清水中浸泡水化完畢。
[0063]2)取出切片，用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。
[0064]3)高溫高壓熱修復(fù)抗原:高壓鍋中加入適當(dāng)0.0lm枸櫞酸鈉緩沖溶液(ph6.0)，240°C加熱至沸騰，將組織芯片置入其中，加蓋鍋蓋，至工作壓力持續(xù)加熱150s，停止加熱。
[0065]4)自然冷卻至室溫。
[0066]5)將組織芯片置于10%過(guò)氧化氫溶液避光浸泡20分鐘，去除組織中的過(guò)氧化氫酶。
[0067]6) PBS洗脫3次各5分鐘。
[0068]7)滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體。
[0069]8) PBS洗脫3次各5分鐘，甩去多余液體。
[0070]9)滴加一抗:分別滴加1:1000PN兔抗人單克隆抗體/1:100⑶68鼠抗人單克隆抗體/1:100M1鼠抗人單克隆抗體/1:100M2鼠抗人單克隆抗體100 μ I于組織芯片，并用PBS緩沖液作為一抗抗體陰性對(duì)照，覆蓋組織表面，液面一定要超過(guò)組織周?chē)僭S，4°C濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜。
[0071]10)4°C過(guò)夜后需在37°C復(fù)溫45分鐘。
[0072]11) PBS洗脫3次每次5分鐘，甩去多余液體。
[0073]12)滴加二抗100 μ I覆蓋組織，室溫濕盒內(nèi)孵育30min。[0074]13) PBS洗3次各5分鐘。
[0075]14)滴DAB顯色劑覆蓋組織室溫避光顯色I(xiàn)~2分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度。
[0076]15)置入蒸餾水中停止顯色反應(yīng)。
[0077]16)蘇木復(fù)染2~4分鐘，蒸餾水洗脫；鹽酸酒精復(fù)紅2分鐘左右，蒸餾水洗脫；氨水返藍(lán)2分鐘，蒸餾水洗脫。
[0078]17)脫水、透明:80 %乙醇IOmin, 90 %乙醇IOmin,無(wú)水乙醇IOmin兩次，二甲苯20min兩次。 [0079] 18）樹(shù)膠封片，鏡下觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果。[0080](3)免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定
[0081]對(duì)照組用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知的扁桃腺組織作為T(mén)AMs及M1、M2亞組的陽(yáng)性對(duì)照，巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)清晰的黃褐色至棕黃色顆粒者為CD68陽(yáng)性的TAMsj!察癌巢周?chē)徑g質(zhì)中TAMs表達(dá)最密集的區(qū)域(hot spot)，在400倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野中的TAMs，取平均值記為該樣本中TAMs的表達(dá)。
[0082](4)免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定
[0083]對(duì)照組用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知的扁桃腺組織作為T(mén)AMs熒光的陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性為紅色熒光，OPN陽(yáng)性為綠色熒光，TAMs表達(dá)OPN陽(yáng)性者為黃色。
[0084]3.結(jié)論
[0085]綜上，根據(jù)觀察結(jié)果得知，TAMs主要浸潤(rùn)在腫瘤間質(zhì)，特別是靠近血管的地方；骨橋蛋白的表達(dá)在腫瘤細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)巨噬細(xì)胞都有表達(dá)；免疫熒光雙染進(jìn)一步確定了 OPN陽(yáng)性表達(dá)TAMs的存在。
[0086]實(shí)施例1:
[0087]一種用于預(yù)測(cè)NSCLC病人預(yù)后的試劑盒，其特征在于包括⑶68單克隆抗體、OPN單克隆抗體、熒光二抗和免疫熒光試劑。
[0088]應(yīng)用上述試劑盒預(yù)測(cè)NSCLC癌病人預(yù)后及指導(dǎo)唑來(lái)膦酸的方法如下:
[0089]1、選取需要預(yù)測(cè)的NSCLC病人，從標(biāo)本庫(kù)找到其已行石蠟包埋組織塊，并行組織切片
[0090]2、免疫熒光步驟
[0091]I)組織切片常規(guī)脫蠟、水化。
[0092]2)取出切片，用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。
[0093]3)高溫高壓熱修復(fù)抗原:0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)，高溫高壓熱修復(fù)抗原。
[0094]4)自然冷卻至室溫。
[0095]5)將組織芯片置于10%過(guò)氧化氫溶液避光浸泡20分鐘，去除組織中的過(guò)氧化氫酶。
[0096]6) PBS洗脫3次各5分鐘。
[0097]7)滴加3%的牛血清白蛋白封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體。
[0098]8) PBS洗脫3次各5分鐘。
[0099]9)⑶68鼠抗人單克隆抗體(1: 100)室溫孵育過(guò)夜。
[0100]10) PBS洗脫3次各5分鐘。[0101]ll)AlexaFluor555抗鼠免疫熒光二抗(1:100)室溫孵育I小時(shí)。
[0102]12) PBS洗脫3次各5分鐘。
[0103]13) OPN兔抗人單克隆抗體(1:100)室溫孵育過(guò)夜。
[0104]14)AlexaFluor488抗兔熒光二抗(1:100)室溫孵育I小時(shí)。
[0105]15)滴加熒光催眠抑制劑。
[0106]16)細(xì)胞核副染。
[0107]17)共聚焦激光掃描顯微鏡下進(jìn)行結(jié)果判定。
[0108]結(jié)果分析=NSCLC間質(zhì)可見(jiàn)大量OPN陽(yáng)性表達(dá)的巨噬細(xì)胞，則這部分患者容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，預(yù)后差，即使早期的NSCLC患者也應(yīng)該給予輔助治療，不管目前是否存在骨轉(zhuǎn)移，都應(yīng)該給予唑來(lái)膦酸治療。
[0109]實(shí)施例2
[0110]選取需要預(yù)測(cè)的NSCLC病人，按實(shí)施例1步驟,如果結(jié)果顯示腫瘤間質(zhì)中很少OPN陽(yáng)性表達(dá)的巨噬細(xì)胞，提示這部分病人預(yù)后較好，出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的可能性較小，輔助治療應(yīng)該適度。
[0111]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種用于預(yù)測(cè)NSCLC病人預(yù)后的試劑盒，其特征在于:包括CD68單克隆抗體、OPN單克隆抗體、熒光二抗和免疫熒光試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于預(yù)測(cè)NSCLC病人預(yù)后的試劑盒，其特征在于所述熒光二抗為CD163標(biāo)記M2鼠抗人單克隆抗體和MHCII標(biāo)記Ml鼠抗人單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于預(yù)測(cè)NSCLC病人預(yù)后的試劑盒，其特征在于所述免疫熒光試劑包括pH為7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS，全稱(chēng)Phosphate Buffered Saline)、0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液、3%的牛血清白蛋白和熒光淬滅抑制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于預(yù)測(cè)NSCLC病人預(yù)后的試劑盒，其特征在于所述磷酸鹽緩沖液是將 8.0Og 的 NaCU0.20g 的 KCl,2.083g 的 Na2HPCM.12H20、0.261g 的ΚΗ2Ρ04.12Η20放入950ml的蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4，然后蒸餾水定容至IOOOml制備而成。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于預(yù)測(cè)NSCLC病人預(yù)后的試劑盒，其特征在于所述檸檬酸鈉緩沖液是將3g的檸檬酸三鈉、0.4g的檸檬酸加入IOOOml的蒸餾水制備而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的一種用于預(yù)測(cè)NSCLC病人預(yù)后的試劑盒中所述的0ΡΝ，其特征在于應(yīng)用于M2型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103926408SQ201410182829
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】孫冰生 申請(qǐng)人:天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院