本發(fā)明屬于多肽藥物制備方法技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種辛卡利特的純化方法。
背景技術(shù)：
中文名：辛卡利特
英文名：Sincalide Acetate
結(jié)構(gòu)式：Asp-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2
分子式：C49H62N10O16S3
分子量：1143.27
辛卡利特（Sincalide）是一種人工合成的膽囊素八肽(Octapeptide)，主要用于促膽囊收縮，膽囊診斷試劑，臨床用于治療慢性胰腺炎，發(fā)現(xiàn)胰分泌功能明顯改善，癥狀明顯減輕。徐滿英（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生理教研室，哈爾濱，150086）通過大鼠實驗得出，辛卡利特的抗電針鎮(zhèn)痛作用在中樞痛反應(yīng)神經(jīng)元電活動和整體行為反射水平上是協(xié)調(diào)一致的，表明辛卡利特能有效提高臨床針刺的鎮(zhèn)痛療效。
目前國內(nèi)外關(guān)于辛卡利特的合成報道不多，CN201410105423.X中采用鹽浴的方法切割來防止磺酰基團的脫落，最終辛卡利特純品的收率為42%，并且切割方法復(fù)雜，辛卡利特的合成制備周期長，不利于規(guī)?；a(chǎn)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種純度高、收率高的辛卡利特的純化方法。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
一種辛卡利特的純化方法，該方法包括以下順序的制備純化步驟：
（1）、將溶脹、脫保護并洗滌后的氨基樹脂與活化的保護氨基酸溶液于30℃的恒溫震蕩器中反應(yīng)40-90min，依次接入從樹脂端起第1-8個氨基酸相對應(yīng)的保護氨基酸，得到Fmoc-辛卡利特前體肽Ⅰ-氨基樹脂：
Fmoc-Asp(otBu)-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp(Boc)-Met-Asp(otBu)-Phe-氨基樹脂：
（2）、將上述制得的辛卡利特前體肽Ⅰ-氨基樹脂脫保護并洗滌后抽干至顆粒狀，加入切割試劑，進行切割反應(yīng)、沉降后，得到辛卡利特粗肽Ⅱ：
（3）、將辛卡利特粗肽Ⅱ溶于溶劑中，經(jīng)反相高效液相色譜法純化、凍干，得到辛卡利特純品多肽。
步驟（1）中所述的氨基樹脂為Rink Amide-MBHA Resin，其取代度為0.35～0.5mmol/g；所述的溶脹是指將氨基樹脂浸沒在DCM溶劑中2h。
步驟（1）中活化的保護氨基酸溶液制備方法為：將保護氨基酸和HOBT加入到離心管中，加入DMF將其溶解，再用滴管向溶液中加入DIC，混合使其完全溶解得到活化的保護氨基酸溶液。
步驟（1）中所述的保護氨基酸為：Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Tyr(SO3H)-OH.Na、Fmoc-Asp(otBu)-OH。
步驟（1）和步驟（2）中所述的脫保護并洗滌是指：將溶液抽干后，加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的20%哌啶/DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上振搖反應(yīng)20min，然后用真空泵將溶液抽干；再加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的DMF溶液，置于脫色搖床上振搖1min，用真空泵將溶液抽干，再次加入DMF溶液洗滌樹脂，重復(fù)操作3次。
步驟（2）中所述的切割試劑100ml配置為：94ml TFA+2.5ml TIS+2.5ml H2O+1ml EDT；切割反應(yīng)條件為：置于20r/min的脫色搖床上，于-20℃條件下冰浴切割反應(yīng)20min；所述的沉降選用-20℃低溫預(yù)冷的無水乙醚，離心沉降3次。
步驟（3）所述的溶劑為15%乙腈和水的混合溶液。
步驟（3）所述的純化選用C4填料制備柱進行反相高效液相色譜純化，以A相：0.2%乙酸/水，B相：0.2%乙酸/乙腈為流動相，以B.Cone/%（2→70），0→70min的梯度程序，9ml/min的流速進行多肽的分離提純。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明采用冰浴切割的方法進行多肽-樹脂的切割，同樣避免了磺?；鶊F的脫落，并采用優(yōu)化的純化工藝進行辛卡利特粗肽的純化，產(chǎn)品純度達到99%，產(chǎn)品收率達到60%以上，大大縮短了生產(chǎn)周期，降低了生產(chǎn)成本，產(chǎn)品收率大幅度提高，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)描述。
本發(fā)明固相合成制備辛卡利特，以氨基樹脂為起始樹脂載體，氨基樹脂為Rink Amide-MBHA Resin，其取代度為0.35～0.5mmol/g；通過固相合成法依次縮合辛卡利特氨基酸序列中相對應(yīng)的Fmoc-保護氨基酸，經(jīng)活化劑和縮合劑縮合反應(yīng)及脫保護劑的脫保護反應(yīng)，得到辛卡利特前體肽Ⅰ-氨基樹脂，之后脫掉天冬氨酸的Fmoc保護基，洗滌樹脂并進行切割、沉降后，得到辛卡利特粗肽Ⅱ，粗肽經(jīng)過純化及凍干后得到辛卡利特純品多肽。
固相合成法依次縮合的Fmoc-保護氨基酸為：Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Tyr(SO3H)-OH.Na、Fmoc-Asp(otBu)-OH，縮合反應(yīng)中氨基酸投料量為所投氨基樹脂摩爾數(shù)的2-4倍，縮合反應(yīng)溫度為20-40℃?？s合反應(yīng)所使用的活化劑和縮合劑分別為DIC、HOBT，縮合反應(yīng)時間為40-90min；脫保護劑為20%哌啶/DMF的混合溶液，洗脫時間為15-30min。
實施例1
氨基樹脂的溶脹：稱量取代度為0.38mmol/g的Rink-MBHA-Resin 0.1g，從開口端加入至多肽合成反應(yīng)器中，取DCM試劑加入至反應(yīng)器中，使樹脂完全浸沒在DCM溶劑中，與溶劑充分接觸，溶脹2h。
1、Fmoc-辛卡利特樹脂的合成
Fmoc-辛卡利特前體肽Ⅰ-氨基樹脂為：
Fmoc-Asp(otBu)-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp(Boc)-Met-Asp(otBu)-Phe-氨基樹脂
本實施例使用的保護氨基酸從樹脂起算第1-8個氨基酸相對應(yīng)的保護氨基酸及分子量如下表1所示：
表1
本發(fā)明中一些常用的縮寫具有以下含義：
保護氨基酸的活化方法
以Fmoc-Phe-氨基樹脂的縮合為例，按照計算的理論投料量稱取24mgFmoc-Phe-OH和13mg HOBT于離心管中，加2ml DMF將其溶解，再用滴管向溶液中加10ul DIC，混合均勻得到活化的保護氨基酸溶液。
樹脂的脫保護以及洗滌方法
將氨基樹脂溶液抽干后，加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的20%哌啶與DMF混合溶液，置于30r/min的脫色搖床上振搖反應(yīng)20min，然后用真空泵將脫保護溶液抽干；再加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的DMF溶液，置于脫色搖床上振搖1min，用真空泵將溶液抽干，再次加入DMF溶液洗滌樹脂，重復(fù)操作3次。
茚三酮顯色檢測合格后，將上述的保護氨基酸溶液加到抽干的反應(yīng)器中，再將反應(yīng)器置于30℃的恒溫震蕩器中反應(yīng)40-90min。采用上述同樣方法，依次接入第2-8個氨基酸對應(yīng)的Fmoc-保護氨基酸，即得到Fmoc-辛卡利特前體肽Ⅰ-氨基樹脂。
2、辛卡利特粗肽Ⅱ的合成
將Fmoc-辛卡利特前體肽Ⅰ-氨基樹脂溶液抽干后，加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的20%哌啶與DMF混合溶液，置于30r/min的脫色搖床上振搖反應(yīng)20min，然后用真空泵將溶液抽干；再加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的DMF溶液，置于脫色搖床上振搖1min，用真空泵將溶液抽干，再次加入DMF溶液洗滌Fmoc-辛卡利特前體肽Ⅰ-氨基樹脂，重復(fù)操作3次。
將反應(yīng)器中的樹脂用真空泵抽干至顆粒狀，配置10ml切割試劑：9.4ml TFA+0.25ml TIS+0.25ml H2O+0.1ml EDT，加入到反應(yīng)器中，反應(yīng)器置于20r/min的脫色搖床上，于-20℃冰浴條件下切割反應(yīng)20min。多肽的沉降選用-20℃低溫預(yù)冷的無水乙醚，離心沉降3次，得到乳膠狀的粗肽樣品。
將粗品凍干后稱重，得到粉末狀樣品36mg，根據(jù)粗品的量和合成測定實際取代度（SD=0.3mmol/g）計算的理論量，計算粗品收率達到90.3%，比現(xiàn)有技術(shù)僅40-60%的收率有大幅度成倍的提高。
3、辛卡利特純品多肽的純化
用15%乙腈和水的混合溶液溶解辛卡利特粗品Ⅱ，經(jīng)反相高效液相色譜法純化得到辛卡利特多肽，純化條件為：C4填料制備柱，流動相為A相：0.2%乙酸/水，B相：0.2%乙酸/乙腈，流速9ml/min，檢測波長210nm，制備梯度程序
收集樣品峰溶液，凍干后稱重得樣品為23.1mg，經(jīng)分析計算，辛卡利特產(chǎn)品純度達到99%，其純品收率達到61.3%。本發(fā)明中通過降低流動性PH值以提高離子配對能力，有利于純化并提高純度，并且優(yōu)化了純化梯度，縮短了純化時間，節(jié)省了純化流動相的使用，降低了生產(chǎn)成本。
實施例2
氨基樹脂的溶脹：稱量取代度為0.45mmol/g的Rink-MBHA-Resin 2g，從開口端加入至多肽合成反應(yīng)器中，取DCM試劑加入至反應(yīng)器中，使樹脂完全浸沒在DCM溶劑中，浸泡過夜。
1、Fmoc-辛卡利特樹脂的合成
Fmoc-辛卡利特前體肽Ⅰ-氨基樹脂為：
Fmoc-Asp(otBu)-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp(Boc)-Met-Asp(otBu)-Phe-氨基樹脂
保護氨基酸的活化方法
以Fmoc-Phe-氨基樹脂的縮合為例，按照計算的理論投料量稱取510mgFmoc-Phe-OH和260mgHOBT于離心管中，加12ml DMF將其溶解，再用滴管向溶液中加200ul DIC，混合均勻得到活化的保護氨基酸溶液。
樹脂的脫保護以及洗滌方法
將氨基樹脂溶液抽干后，加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的20%哌啶與DMF混合溶液，置于30r/min的脫色搖床上振搖反應(yīng)20min，然后用真空泵將脫保護溶液抽干；再加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的DMF溶液，置于脫色搖床上振搖90s，用真空泵將溶液抽干，再次加入DMF溶液洗滌樹脂，重復(fù)操作3次。
茚三酮顯色檢測合格后，將上述的保護氨基酸溶液加到抽干的反應(yīng)器中，再將反應(yīng)器置于30℃的恒溫震蕩器中反應(yīng)40-90min。采用上述同樣方法，依次接入表1中第2-8個氨基酸對應(yīng)的Fmoc-保護氨基酸，即得到Fmoc-辛卡利特前體肽Ⅰ-氨基樹脂。
2、辛卡利特粗肽Ⅱ的合成
將Fmoc-辛卡利特前體肽Ⅰ-氨基樹脂溶液抽干后，加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的20%哌啶與DMF混合溶液，置于30r/min的脫色搖床上振搖反應(yīng)20min，然后用真空泵將溶液抽干；再加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的DMF溶液，置于脫色搖床上振搖90s，用真空泵將溶液抽干，再次加入DMF溶液洗滌Fmoc-辛卡利特前體肽Ⅰ-氨基樹脂，重復(fù)操作3次。
將反應(yīng)器中的樹脂用真空泵抽干至顆粒狀，配置100ml切割試劑：94ml TFA+2.5ml TIS+2.5ml H2O+1ml EDT，加入到反應(yīng)器中，反應(yīng)器置于20r/min的脫色搖床上，于-20℃冰浴條件下切割反應(yīng)30min。多肽的沉降選用-20℃低溫預(yù)冷的無水乙醚，離心沉降3次，得到乳膠狀的粗肽樣品。
將粗品凍干后稱重，得到粉末狀樣品761mg，根據(jù)粗品的量和合成測定實際取代度（SD=0.36mmol/g）計算的理論量，計算粗品收率達到90.1%。
3、辛卡利特純品多肽的純化
用15%乙腈和水的混合溶液溶解辛卡利特粗品Ⅱ，經(jīng)反相高效液相色譜法純化得到辛卡利特多肽，純化條件為：C4填料制備柱，流動相為A相：0.2%乙酸/水，B相：0.2%乙酸/乙腈，流速9ml/min，檢測波長210nm，制備梯度程序
收集樣品峰溶液，凍干后稱重得樣品為447.7mg，經(jīng)分析計算，辛卡利特產(chǎn)品純度達到99%，其純品收率達到61.1%。
本發(fā)明利用Fmoc固相合成原理，開發(fā)了固相合成技術(shù)，采用常見易得、低成本的試劑縮合反應(yīng)，采用冰浴切割技術(shù)進行多肽-樹脂的切割，通過優(yōu)化純化工藝條件，使得辛卡利特粗品收率高達90%以上，其純品收率達到60%，大大提高了辛卡利特的收率；本發(fā)明操作簡單，反應(yīng)過程取樣方便，易于中控，并且合成周期短，生產(chǎn)成本低，副產(chǎn)物少，產(chǎn)品收率高，利于工業(yè)化生產(chǎn)。
以上內(nèi)容僅僅是對本發(fā)明所作的舉例和說明，所屬本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，只要不偏離發(fā)明或者超越本權(quán)利要求書所定義的范圍，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護范圍。