一種單克隆抗體IgG質(zhì)譜測序方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種單克隆抗體IgG質(zhì)譜測序方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，單克隆抗體IgG的制備多是通過雜交瘤細(xì)胞制備得到，送樣就需要通過高 通量的篩選得到能產(chǎn)生高特異性和靈敏度的雜交瘤細(xì)胞株，并用此雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生高質(zhì) 量的單克隆抗體IgG。雜交瘤細(xì)胞的高通量篩選工作量龐大，同時要保證篩選到的雜交瘤細(xì) 胞的穩(wěn)定性，需要嚴(yán)格的儲存條件。因此可借用基因工程的手段，獲取高特異性和靈敏度的 單克隆抗體，送就需要通過測序獲取優(yōu)質(zhì)單克隆抗體IgG的蛋白序列，從而推導(dǎo)出其基因 序列，借此，通過基因重組的方式制備高品質(zhì)的單克隆抗體IgG。鑒于質(zhì)譜技術(shù)在蛋白領(lǐng)域 的應(yīng)用越來越廣泛，同時單抗制備技術(shù)發(fā)展趨勢的需求，需要一種準(zhǔn)確的高效測定單克隆 抗體IgG序列的新方法，因而需要開發(fā)一種合適的單克隆抗體測序技術(shù)，用于優(yōu)質(zhì)單克隆 抗體IgG的制備。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了解決W上技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種單克隆抗體IgG質(zhì)譜測序方法，將單克 隆抗體IgG的測序簡化為CDR1/2/3序列測定時，單克隆抗體IgG測序難度迅速下降。
[0004] 本發(fā)明通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0005] -種單克隆抗體IgG質(zhì)譜測序方法，包括W下步驟：
[0006] (1)將單克隆抗體IgG還原烷基化；
[0007] (2)通過電泳方法將還原烷基化的所述單克隆抗體IgG分離重鏈和輕鏈；
[000引（3)膠內(nèi)酶切單克隆抗體IgG的重鏈和輕鏈得到多膚片段；
[0009] (4)酶切得到的多膚片段加樣到LC-MS/MS儀器；
[0010] (5)通過NanoLC指紋圖譜分析找出CDR1/2/3序列；
[0011] (6)CDRl/2/3 序列測序。
[0012] 在上述技術(shù)方案中，所述步驟（1)中的還原烷基化采用DTT-IAM模式。
[0013] 在上述技術(shù)方案中，所述步驟（2)中的電泳方法為常規(guī)SDS-PAGE電泳法。
[0014] 在上述技術(shù)方案中，所述步驟（3)中的膠內(nèi)酶切單克隆抗體IgG的重鏈和輕鏈采 用常規(guī)in-geldigestion方法。
[0015] 在上述技術(shù)方案中，所述步驟（4)中加入質(zhì)譜儀的酶切多膚樣本量為5-15μL。
[0016] 本發(fā)明通過LC-MS/MS法結(jié)合納升級液相色譜法（NarwLC)將單克隆抗體IgG的測 序簡化為CDR1/2/3序列測定，通過NanoLC指紋圖譜的分析可W把CDR1/2/3潛在的多膚譜 圖鎖定到某些區(qū)域，然后詳細(xì)分析送些譜圖而獲得最終的CDR1/2/3多膚序列信息，然后將 單克隆抗體IgG中的保守序列與最終的CDR1/2/3多膚序列進(jìn)行拼接即可得到完整的單克 隆抗體IgG氨基酸序列，使單克隆抗體IgG測序難度迅速下降。
【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)描述。
[001引 實施例一
[001引NGAL抗體質(zhì)譜測序：
[0020]NGAL抗體質(zhì)譜測序包括W下步驟；1、將自制的NGAL單克隆抗體（抗體的重鏈氨 基酸序列見序列表1，抗體的輕鏈氨基酸序列見序列表2)進(jìn)行還原烷基化；2、SDS-PA(iE電 泳經(jīng)過還原烷基化的NGAL單克隆抗體IgG，分離重鏈和輕鏈；3、分別膠內(nèi)酶切NGAL單克隆 抗體IgG的重鏈和輕鏈得到多膚片段；4、酶切得到的多膚上LC-MS/MS儀器；5、nanoLC指紋 圖分析；6、譜圖鑒定和CDR1/2/3鑒定。具體每個步驟的操作如下：
[0021] 1、NGAL單克隆抗體還原烷基化
[0022] 單克隆抗體IgG還原烷基化采用DTT-IAM模式，孤T值ithiot虹eitol，二硫蘇糖 醇）用于還原二硫鍵，而IAM(賄己醜氨）用于封閉琉基。該方法具體的操作步驟如下： ①取20μL的IgG抗體溶液（即20μg)用于還原烷基化操作；②加入0. 2μLDTT，56°C 水浴45min;⑨冰浴5min;徹底降溫到室溫；④黑暗條件下，加入2μLIAM,反應(yīng)60min; ⑤1300化pm,離必5min，去掉沉淀；⑧取出上清，上清用于后續(xù)的SDS-PAGE電泳。
[002引 2、SDS-PAGE電泳分離抗體的重鏈和輕鏈
[0024]SDS-PAGE電泳經(jīng)過還原烷基化的單克隆抗體IgG,分離重鏈和輕鏈中，SDS-PAGE 電泳采用常規(guī)的SDS-PAGE電泳方法。
[0025] 3、膠內(nèi)酶切NGAL單克隆抗體IgG的重鏈和輕鏈
[0026] 電泳分離完成之后分別用膜酶、胃蛋白酶和彈性蛋白酶對電泳分離得到的重鏈和 輕鏈進(jìn)行膠內(nèi)酶切，其具體的酶切過程及參數(shù)如下：
[0027] 膜酶膠內(nèi)酶切：采用膜酶對單克隆抗體IgG的重鏈和輕鏈進(jìn)行膠內(nèi)酶切得到多膚 片段時，膠內(nèi)酶切單克隆抗體IgG采用常規(guī)的in-geldigestion方法。該方法具體的操作 步驟如下；①清洗和脫色：將蛋白質(zhì)點(diǎn)用切膠儀切膠，置于96孔板中。在含有膠粒的每個孔 中加入200/A1脫色液（lOOmmol/L硫代硫酸鋼和30mmol/L鐵氯化鐘溶液按照1 ;1混合而 成），靜置30min后，棄去上清液。然后加200/μL水清洗，靜置30min后棄上清液。重復(fù)該 步驟直至膠粒變?yōu)闊o色；②脫水干燥；在膠粒中加入200μL己臘靜置30min后，棄上清液。 重復(fù)該步驟至凝膠完全脫水變白。將己臘吸出舍棄后，將膠粒置于37°C至完全干燥；⑨酶 液泡脹；測序級的膜蛋白酶用20mmol/L碳酸氨倭溶液配制為濃度12. 5ng/mL后，加入適量 酶液于膠粒中，并于4°C放置30min使膠粒完全泡漲。然后吸出多余的酶液棄去，W防止質(zhì) 譜檢測時出現(xiàn)過多的膜蛋白酶自身降解的膚段；④酶解：加約5μL的25mmol/L碳酸氨倭 溶液覆蓋膠粒，W防止溶液在酶解過程中干澗。置于37°C控溫箱內(nèi)保溫12~16h;⑤提 ?。好附夂蟮哪z粒用60μL的0. 1 %TFA和50%己臘提取3次，每次20min，合并提取液；⑧ 濃縮；真空濃縮儀條件下抽干。
[0028] 采用胃蛋白酶和彈性蛋白酶對單克隆抗體IgG的重鏈和輕鏈進(jìn)行膠內(nèi)酶切得到 多膚片段時，其與采用膜酶進(jìn)行膠內(nèi)酶切時不同點(diǎn)在于：在④酶解時采用的緩沖液不同，胃 蛋白酶在④酶解時采用的是5%TFA;采用彈性蛋白酶進(jìn)行④酶解時所用的緩沖液是抑= 9的化isbuffer。膜酶、胃蛋白酶和彈性蛋白酶膠內(nèi)酶切時除了④酶解時緩沖液不同外， 其余的參數(shù)和操作步驟均一樣。
[0029] 4、酶切得到的多膚上LC-MS/MS儀器
[0030] 采用各種酶完成膠內(nèi)酶切過程之后，將酶切得到的多膚片段分別上LC-MS/MS儀 器，所述的質(zhì)譜儀為各種型號的質(zhì)譜儀，優(yōu)選ABSCIEX公司的化ipleT0F5600-plus質(zhì)譜 儀，進(jìn)入質(zhì)譜儀的酶切多膚樣本量為5-15μL優(yōu)選為10μL。
[0031] 5、NanoLC指紋圖分析
[0032]NanoLC指紋圖分析在于多膚樣本進(jìn)入質(zhì)譜儀并獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)W后需分析IgG的 重鏈和輕鏈的指紋圖，將IgG中保守序列的保留時間、電荷、峰強(qiáng)度和上樣量進(jìn)行一一對 應(yīng)，然后確定單克隆抗體IgG的指紋圖。指紋圖的分析可W鎖定IgGl/2/3的亞型。IgG至少 有四種亞型，比如人類的IgGl/2/3/4、小鼠的IgGl/2a/2b/3等。不同亞型的差異在于-C00H 端序列。因此，單抗測序的特殊性在于IgG僅僅只有CDR1/2/3區(qū)域的序列是可變的，其它 區(qū)域的序列都是保守的。因此，IgG蛋白質(zhì)測序相比普通的蛋白質(zhì)測序難度低很多。IgG 包含重鏈（VDJ重組）和輕鏈（VJ重組）兩個長鏈多膚，兩條多膚通過二硫鍵連接到一起 產(chǎn)生完整的IgG抗體。IgG酶解后，產(chǎn)生很多的多膚，因為保守區(qū)是一樣的，因此，同一物種 的保守區(qū)酶切結(jié)果是一致的（至少非常相似）。不同的多膚序列來自CDR1/2/3區(qū)域的多 膚，送些多膚在NanoLC的圖譜上表現(xiàn)出偏移，送些偏移的多膚就是CDR1/2/3多膚。送是 多膚NanoLC指紋圖的關(guān)鍵信息，通過NanoLC指紋圖可W獲取到潛在的CDR1/2/3序列的保 留時間、峰強(qiáng)度和m/z信息（保留時間數(shù)據(jù)見表一和表二），然后可W?？谔暨x送些多膚進(jìn) 行MS/MS鑒定。
[0033] 表一NGAL單克隆抗體IgG重鏈各酶解譜圖保留時間
[0034]


[0039]
[0040] 6、譜圖鑒定和CDRl/2/3鑒定
[0041] 譜圖鑒定和CDR1/2/3鑒定時，將單克隆抗體IgG的測序簡化為CDR1/2/3序列測 定時，單克隆抗體IgG測序難度迅速下降。通過NanoLC指紋圖的分析可W把CDR1/2/3潛 在的多膚譜圖鎖定到某些區(qū)域，然后詳細(xì)分析送些譜圖而獲得最終的CDR1/2/3多膚序列 信息。然后將單克隆抗體IgG中的保守序列與最終的CDR1/2/3多膚序列進(jìn)行拼接即可得 到完整的單克隆抗體IgG氨基酸序列。各種酶切NGAL單克隆抗體的重鏈及輕鏈譜圖鑒定 結(jié)果及多膚拼接結(jié)果如下表Η和表四所示：
[0042] 表ΗNGAL單克隆抗體IgG重鏈各酶解譜圖鑒定結(jié)果
[0043]

[0045] 表四NGAL單克隆抗體IgG輕鏈各酶解譜圖鑒定結(jié)果
[0046]

[0048] 使用proteincoveragesummarize!·軟件進(jìn)行多膚（p巧tide)和IgG抗體序列進(jìn) 行覆蓋率分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)重鏈序列幾乎完全配對成功（除Fc端有一個氨基酸未能配對，但 是Fc是已知序列，對測序毫無影響），即可變區(qū)被完全測通；而輕鏈序列覆蓋率在97. 66%， 未能匹配成功的也是保守區(qū)的序列，該序列也是已知序列，而可變區(qū)也完全被測通。
[0049] 最后所應(yīng)說明的是，W上實施例僅用W說明本材料的技術(shù)實施方案而非限制，盡 管參照較佳實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W對本 發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng) 涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
【主權(quán)項】
1. 一種單克隆抗體IgG質(zhì)譜測序方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將單克隆抗體IgG還原烷基化； (2) 通過電泳方法將還原烷基化的所述單克隆抗體IgG分離重鏈和輕鏈； (3) 膠內(nèi)酶切單克隆抗體IgG的重鏈和輕鏈得到多肽片段； (4) 酶切得到的多肽片段加樣到LC-MS/MS儀器； (5) 通過NanoLC指紋圖譜分析找出⑶R1/2/3序列； (6)CDRl/2/3序列測序。2. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體IgG質(zhì)譜測序方法，其特征在于，所述步驟（1)中的 還原烷基化采用DTT-IAM模式。3. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體IgG質(zhì)譜測序方法，其特征在于，所述步驟（2)中的 電泳方法為常規(guī)SDS-PAGE電泳法。4. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體IgG質(zhì)譜測序方法，其特征在于，所述步驟（3)中的 膠內(nèi)酶切單克隆抗體IgG的重鏈和輕鏈采用常規(guī)in-geldigestion方法。5. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體IgG質(zhì)譜測序方法，其特征在于，所述步驟⑷中加 入質(zhì)譜儀的酶切多肽樣本量為5-15μL。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種單克隆抗體IgG質(zhì)譜測序方法，包括以下步驟：將單克隆抗體IgG還原烷基化；通過電泳方法將還原烷基化的所述單克隆抗體IgG分離重鏈和輕鏈；膠內(nèi)酶切單克隆抗體IgG的重鏈和輕鏈得到多肽片段；將酶切得到的所述多肽片段加入到LC-MS/MS質(zhì)譜儀獲取指紋圖譜；通過指紋圖譜分析找出CDR1/2/3序列；CDR1/2/3序列測序。
【IPC分類】G01N30/72, G01N30/06
【公開號】CN105277638
【申請?zhí)枴緾N201410350750
【發(fā)明人】沈鶴霄, 華權(quán)高
【申請人】沈鶴霄
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2014年7月22日