本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種紫色紅曲菌菌株。

背景技術(shù)：

中國的黃酒是世界上最古老的飲料酒之一，在世界三大釀造酒(黃酒、葡萄酒和啤酒)中占有重要的一席。紅曲黃酒因添加了紅曲進行發(fā)酵而具有與眾不同的功效。但是，現(xiàn)存的紅曲黃酒釀造也存在諸多不足如：原料利用率低，大量酒糟(20％-30％)不能得到充分有效利用甚至直接被丟棄；傳統(tǒng)工藝菌種類型不明確，發(fā)酵條件及酒質(zhì)不易控制；純種發(fā)酵紅曲黃酒的特色未能得以充分體現(xiàn)等。

紅曲是釀酒用曲中的一種，它作為紅曲黃酒釀造的糖化、發(fā)酵和生香劑，其品質(zhì)對黃酒的質(zhì)量和出酒率都有極大的影響，常有“酒之骨”之稱。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員迫切需要篩選獲得一種高液化、糖化活力的菌株，以提高紅曲黃酒釀造原料的利用率、節(jié)約生產(chǎn)成本、增加酒體穩(wěn)定性并改善紅曲黃酒的風味，同時也為功能性純種復(fù)合曲的創(chuàng)制提供新菌源。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種紫色紅曲菌菌株，其分類命名為紫色紅曲菌FJMR24，學(xué)名為Monascus purpureus FJMR24；由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為NO：M2016192，保藏日期為2016年4月13日，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)。該紫色紅曲菌菌株具有高液化、高糖化活力，能提高紅曲黃酒釀造原料的利用率、節(jié)約生產(chǎn)成本、增加酒體穩(wěn)定性并改善紅曲黃酒的風味。

一、紫色紅曲菌FJMR24的篩選

1材料與方法

1.1材料

1.1.1分離樣品

由本實驗室人員從福建、江西等地收集釀酒常用紅曲、麥曲等曲種并保存。

1.1.2對照菌株來源

(1)紫色紅曲菌(Monascus purpureus)41450：購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，以下簡稱41450；

(2)FM23：由福建古田微生物研究所提供，為紅曲黃酒生產(chǎn)常用菌株之一。

1.1.3培養(yǎng)基

(1)麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽汁8°，瓊脂2％(配固體培養(yǎng)基時加入)，pH5.6。

(2)孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨0.5％，葡糖糖1.0％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.05％，瓊脂1.5％，孟加拉紅0.0033％，氯霉素0.01％。

(3)產(chǎn)淀粉酶、糖化酶發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％，可溶性淀粉3.0％，CaCl₂·2H₂O 0.05％，MnCl₂·4H2O 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，KH₂PO₄ 0.1％，pH7.0-7.2。

1.2方法

1.2.1樣品處理

無菌操作將分離樣品研碎，取5g于45mL無菌水中，150轉(zhuǎn)/分鐘搖床振蕩2h，備用。

1.2.2單菌株分離純化

用對數(shù)稀釋涂布法，將合適的稀釋梯度(使每個平板上的菌落數(shù)在10-50個)樣品涂布于孟加拉紅或麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)1-2天，根據(jù)菌落形態(tài)特征挑出不同菌株，接入另一空白平板中繼續(xù)培養(yǎng)，反復(fù)多次直至菌株完全純化，并轉(zhuǎn)接于麥芽汁瓊脂斜面，30℃培養(yǎng)6-7天，待菌絲長滿后置4℃冰箱保存，備用。

1.2.3孢子懸液制備

挑取斜面孢子至無菌水中，用玻璃珠打散使孢子濃度達到0.5×10⁶個/mL。

1.2.4菌株初篩

采用平板透明圈法。將孢子液進行10倍梯度稀釋，選擇適宜稀釋樣品涂布于等量淀粉酶、糖化酶培養(yǎng)基平板上，30℃恒溫培養(yǎng)1-2天，待剛形成菌落而分生孢子尚未產(chǎn)生時，選擇菌落數(shù)在5-6個的平板，滴加碘液，用游標卡尺測量菌落周圍呈現(xiàn)的透明圈直徑(H)與菌落直徑(C)，并計算比值(H/C值)，分析確定較優(yōu)菌株作為復(fù)篩菌，接于麥芽汁斜面，30℃、6-7天，待菌絲長滿后，于冰箱保存，備用。

1.2.5復(fù)篩菌的活化

將復(fù)篩菌的孢子液以10％接種于種子培養(yǎng)基中，150轉(zhuǎn)/分鐘，30℃培養(yǎng)2至3天，備用。

1.2.6樣品制備及酶活力測定

向500mL三角瓶中分別入150mL淀粉酶、糖化酶選擇性培養(yǎng)基，接入5％活化的種子液，30℃、150轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)6天，用0.45um濾膜過濾發(fā)酵液，濾液即為酶活力檢測的樣品，剩余菌絲烘干至恒重后測定其生物量。

生物量的測定方法：

將過濾后的菌絲體用蒸餾水清洗，80℃干燥至恒重后稱量，計算出菌絲體干重，g/L。

酶活力測定方法：

A、淀粉酶活力測定

采用試劑盒法，具體操作根據(jù)產(chǎn)品說明進行。1g菌絲體所產(chǎn)生的淀粉酶在40℃、pH6.0的條件下，1h液化1mg可溶性淀粉，定義為1個酶活力單位。

B、糖化酶活力測定

試劑配制參照GB 8276-2006進行。取兩支50mL比色管(A、B管)，分別加入可溶性淀粉溶液10mL和乙酸-乙酸鈉緩沖液8mL，搖勻。于40℃恒溫水浴中預(yù)熱5min-10min。在B管中加入待測酶液10.0mL，立即計時，搖勻。在此溫度下準確反應(yīng)60min后，立即向A、B管中各加氫氧化鈉溶液0.2mL，搖勻，同時將兩管取出，迅速用水冷卻，并于A管中補加待測酶液10.0mL作為空白對照。吸取上述A、B兩管中的反應(yīng)液各稀釋一定倍數(shù)，分別取0.5m加入1.5mL天NS試劑，在沸水浴中加熱15min后取出迅速冷卻至室溫，加入10mL蒸餾水，在波長480nm處測定吸光值。

1g菌絲體所產(chǎn)生的糖化酶在40℃、pH4.6的條件下，1h水解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖，定義為1個酶活力單位。

2結(jié)果與分析

2.1霉菌單株的分離與初篩

從收集的樣品中共分離到67株霉菌，編號分別為MR1-MR32、MB1-MB19、MW1-MW16。根據(jù)產(chǎn)淀粉酶、糖化酶菌株能夠利用淀粉而在菌落周圍產(chǎn)生分解透明圈的特性，本文將透明圈直徑與菌落直徑比值(H/C)作為判斷菌株產(chǎn)酶能力的初步指標。結(jié)果表明，不同菌株在平板上的透明圈與菌落大小不一(如圖1)，其H/C值也存在較大變化(如表1)。分離菌株FJMR10、FJMR24、FJMW8、FJMR1、FJMB12、FJMR20、FJMR18、MR32、FJMW15、FJMW13和對照菌FM23的產(chǎn)酶能力均高于另一對照菌紫色紅曲菌41450，且差異顯著；其它菌株產(chǎn)酶能力較弱甚至檢測不到透明圈。

表1分離菌株在平板上的產(chǎn)酶情況

注：1)“－”表示平板上檢測不到透明圈；2)本表僅對H/C值比41450大的菌株進行差異性分析；3)小寫字母“a-j”表示差異顯著(P≤0.05)，下同。

2.2初篩菌株產(chǎn)酶能力的定量分析

2.2.1產(chǎn)淀粉酶、糖化酶能力

以FM23為對照菌，對初篩獲得的10株菌進行酶活力定量分析，結(jié)果如表2。除FJMR1和FJMW13外，其它8株菌的淀粉酶活力均顯著高于FM23；糖化酶活力方面，F(xiàn)JMR24、FJMR10、FJMW8、FJMR32、FJMR20和FJMB12的產(chǎn)酶能力優(yōu)于FM23，其中FJMR24、FJMR10、FJMW8與之差異顯著；整體來看，淀粉酶活力高的菌株其糖化酶活力也較高，兩者具有一致性；FJMR24的淀粉酶、糖化酶活力均最高，分別達2200±18.5U/g與2330.4±31.9U/g。

表2初篩菌株的淀粉酶、糖化酶活力

由上表2可知，紫色紅曲菌FJMR24淀粉酶活力、糖化酶活力最高，表明該菌株具有高液化、高糖化活力，能提高紅曲黃酒釀造原料的利用率，增加紅曲黃酒的出酒率。

將篩選得到的紫色紅曲菌FJMR24(學(xué)名為Monascus purpureus FJMR24)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號為NO：M2016192，保藏日期為2016年4月13日，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)。

二、紫色紅曲菌FJMR24的形態(tài)學(xué)特征、基因序列分析

1培養(yǎng)基與孢子懸液的制備

1.1培養(yǎng)基

1.1.1MEA培養(yǎng)基：粉狀麥芽提取物2％，蛋白胨1％，葡萄糖2％，瓊脂1.5％。

1.1.2麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽汁8°，瓊脂2％(配固體培養(yǎng)基時加入)，pH5.6。

1.2孢子懸液的制備

將FJMR24劃線接種于麥芽汁瓊脂斜面，30℃恒溫培養(yǎng)7天，用10mL無菌生理鹽水將斜面上的孢子洗下，漩渦振蕩器混勻，4層擦鏡紙過濾，并通過血球計數(shù)板法計數(shù)，將濾液調(diào)整成1×10⁶個/mL的孢子懸液。

2FJMR24的形態(tài)學(xué)特征

2.1菌落及顯微形態(tài)觀察法

2.1.1菌落形態(tài)觀察：采用點種法，將活化的FJMR24接種于MEA平板中，于30℃恒溫培養(yǎng)，觀察10天內(nèi)菌落形態(tài)、生長情況，并及時進行記錄。

2.1.2顯微形態(tài)觀察：利用載片培養(yǎng)法，將FJMR24的孢子液接種在MEA瓊脂薄片周圍，30℃恒溫培養(yǎng)6-7天后，用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲形態(tài)、分生孢子、子囊孢子、閉囊殼等形態(tài)特征，并通過圖像處理軟件進行拍照、分析。

2.2菌落形態(tài)特征

在MEA培養(yǎng)基上培養(yǎng)FJMR24，溫度為30℃，培養(yǎng)10天。FJMR24的菌落形態(tài)如圖2所示，菌落圓形，直徑28-30mm，邊緣完整，橙色；表面平坦，中央凸起；質(zhì)地氈絨狀；反面中央淺紅色，周圍橙色；無滲出液體產(chǎn)生，無可溶性色素產(chǎn)生。

2.3個體形態(tài)特征

菌株FJMR24在光學(xué)顯微鏡及掃描電子顯微鏡下的形態(tài)，如圖3所示。菌絲不規(guī)則分支，透明，具有明顯油滴，有橫隔，壁上具疣狀結(jié)晶，寬度為3-5μm；分生孢子單生或鏈生，著生在菌絲頂端或側(cè)枝頂端，倒梨形或球形，7-11μm；子囊孢子橢圓形或卵圓形，(4-6)μm×(3-4.5)μm，壁平滑；閉囊殼近球形，20-50μm，包被褐色。

3FJMR24的基因序列分析

3.1基于ITS rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

FJMR24的ITS rDNA測序長度為501bp，在NCBI上比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹如圖4。FJMR24與Monascus purpureus ATCC 16379(AY498573)、Monascus aurantiacus CICC 5014(AY629435)聚在同一分支上，且同源性高達100％，該菌屬于紅曲菌屬(Monascussp.)。

3.2基于β-tubulin基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

為進一步確認FJMR24的菌種類型，對該菌的β-tubulin進行測序得到901bp的序列，與相關(guān)種β-tubulin序列的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5。FJMR24與Monascus purpureus ATCC 16379(AY498573)聚在同一分支上，且同源性達100％，結(jié)合ITS rDNA分析結(jié)果及形態(tài)學(xué)特征，可以確定FJMR24為紫色紅曲菌(Monascus purpureus)。

附圖說明

圖1部分菌株在平板上產(chǎn)生的透明圈；

圖2 FJMR24菌落形態(tài)；

圖3 FJMR24個體形態(tài)；

圖4基于ITS rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹；

圖5基于β-tubulin基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。

具體實施方式

為詳細說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合具體實施方式詳予說明。

實施例1

FJMR24的發(fā)酵特性

1溫度適應(yīng)性

將FJMR24孢子懸液接種到麥芽汁液體與平板培養(yǎng)基中，分別置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

表3發(fā)酵溫度對FJMR24生長的影響

注：“－”為不生長；“±”為略有生長；“+”為生長一般；“++”為生長良好；“+++”為生長旺盛；生長量測定樣品的體積均為50mL。

從表3可以看出，紫色紅曲菌FJMR24溫度適應(yīng)性強；在溫度為15℃至45℃均能生長，能很好的適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境。

2pH適應(yīng)性

將FJMR24孢子懸液分別接種到pH值(乳酸調(diào)節(jié))為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0麥芽汁液體培養(yǎng)基中，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

表4發(fā)酵pH對FJMR24生長的影響

注：“－”為不生長；“±”為略有生長；“+”為生長一般；“++”為生長良好；“+++”為生長旺盛；生長量測定樣品的體積均為50mL。

從表4可以看出，紫色紅曲菌FJMR24對pH適應(yīng)性強；在pH為2至8均能生長，也就是說紫色紅曲菌FJMR24對強酸性和弱堿性條件下均可生長，能很好的適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境。

3酒精耐受性

將過濾除菌的無水乙醇加入到45℃左右的無菌麥芽汁液體與平板培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基的乙醇濃度分別為8％、10％、12％、15％、18％、20％，接種FJMR24孢子懸液，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

表5酒精度對FJMR24生長的影響

注：“－”為不生長；“±”為略有生長；“+”為生長一般；“++”為生長良好；“+++”為生長旺盛；生長量測定樣品的體積均為50mL。

從表5可以看出，紫色紅曲菌FJMR24對酒精耐受性好，酒精度在8％至18％時，F(xiàn)JMR24都可以生長，能很好的適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境。

實施例2

FJMR24強化發(fā)酵試驗具體工藝方法如下：

1材料

1.1培養(yǎng)基

1.1.1種子培養(yǎng)基：NaNO₃0.2％，KH₂PO₄0.15％，MgSO₄0.1％，葡萄糖5％，蛋白胨1.5﹪，pH自然。

1.1.2麥芽汁培養(yǎng)基：10°波林麥芽汁1L，pH 5.4。

1.2秈米：市售

1.3菌株

1.3.1FM23：由福建古田縣微生物所提供，為紅曲黃酒生產(chǎn)常用菌株之一；

1.3.2釀酒酵母JH301：由本實驗室選育并保存。

2方法

2.1孢子懸液的制備

將FJMR24或FM23劃線接種于麥芽汁瓊脂斜面，30℃恒溫培養(yǎng)7天，用10mL無菌生理鹽水將斜面上的孢子洗下，漩渦振蕩器混勻，4層擦鏡紙過濾，并通過血球計數(shù)板法計數(shù)，將濾液調(diào)整成1×10⁶個/mL的孢子懸液。

2.2種子培養(yǎng)

向250mL三角瓶中裝入50mL種子培養(yǎng)基，10％接種FJMR24或FM23孢子懸液，30℃、150轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)2-3天，4層紗布濾去菌絲后備用。

2.3固體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備

將市售秈米室溫下浸泡3h，淋清、瀝干水分后放于蒸籠中蒸煮30min，攤涼后分裝入250mL三角瓶內(nèi)，每瓶裝30g，包扎8層紗布封口，121℃滅菌20min。取出降溫至40℃左右，搖動三角瓶使米粒松散，同時吸附瓶壁的冷凝水。

2.4FJMR24和FM23純種紅曲米的制備

將活化的FJMR24或FM23以5％接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，將其堆在瓶底一腳，30℃培養(yǎng)至米粒上出現(xiàn)紅曲霉菌絲體，搖瓶1次，吸附瓶壁上的冷凝水，并將米曲攤平；待米粒表面鋪滿紅色菌絲體，搖瓶1次，并根據(jù)米粒表面干燥程度補加適量無菌水；之后每天搖瓶2-3次，以調(diào)整紅曲通氣性狀并使生長均勻。將培養(yǎng)10天的紅曲放于40℃烘箱烘至水分含量＜15％。

2.5酵母菌的活化

將釀酒酵母JH301勾取一環(huán)接種于100mL麥芽汁培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)10-12h，備用。

2.6FJMR24的強化發(fā)酵試驗

以FM23紅曲米為基礎(chǔ)曲種，以FJMR24純種紅曲米為強化曲，以滅菌的糯米為基料，分別做如下處理：

處理1：10g FM23紅曲米+10g FJMR24純種紅曲米(滅活)+2mL酵母活化液，接種于100g糯米中，30℃發(fā)酵15天。

處理2：10g FM23紅曲米+10g FJMR24純種紅曲米+2mL酵母活化液，接種于100g糯米中，30℃發(fā)酵15天。

待發(fā)酵結(jié)束檢測樣品中的酒精度和出酒率等指標。

2.7酒精度的測定

按照GB/T13662-2008《黃酒》進行。

2.8出酒率的測定

標準大氣壓，20℃，一個單位所產(chǎn)出的含量為20％的酒精產(chǎn)量。出酒率計算公式為出酒率％＝(酒精度％×出酒量kg/大米用量kg/20％酒精)。

3結(jié)果

紫色紅曲菌FJMR24在FM23紅曲米發(fā)酵制備紅曲黃酒中的應(yīng)用效果如表6所示，加入紫色紅曲菌FJMR24后，紅曲黃酒的酒精度和出酒率均有提高，且與對照(處理1)相比，酒精度達顯著性差異(α＜0.05)，出酒率達極顯著性差異(α＜0.01)；說明紫色紅曲菌FJMR24的高液化、糖化特性提高了發(fā)酵原料的利用率，進而增加了紅曲黃酒的出酒率。

表6紫色紅曲菌FJMR24強化發(fā)酵效果

以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容或者說明書附圖所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。