專利名稱：一種螺原體菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水生動物的病原微生物，具體為中華絨螯蟹螺原體菌株及其用途。
背景技術(shù)：
中華絨螯蟹顫抖病是近年來危害我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的重大疾病，國內(nèi)許多學(xué)者對此病進(jìn) 行了研究，但結(jié)果不盡相同。我們通過病理學(xué)、流行病學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及微生物柯赫氏 (Koch's Rule)法則的驗(yàn)證，明確了該病的致病體及其傳播途徑；運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)、微 生物學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定出顫抖病病原體為螺原體類(spiroplasma)微生物(Wen Wang*, Bohai Wen， Gail E. Gasparich, Ningning Zhu， Liwen Rong， Jianxiu Chen and Zaikuan Xu. A spiroplasma associated with tremor disease in the Chinese mitten crab (￡>z'oc/ze/r s'ne肌's) Microbiology 2004， 150:3035-3040)，這是國際上首次在水生甲殼動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn) 并分離培養(yǎng)出螺原體類菌株，也是水生動物的一種新型病原微生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種水生動物的病原微生物及其用途。
所說的水生動物的病原微生物，它是中華絨螯蟹螺原體(S/^印te/^ eWoc/ze/r sp. Nov),其保藏號為CCTCC M 207170。
利用中華絨螯蟹螺原體CCTCC M 207170，可以進(jìn)行病原的人工回感實(shí)驗(yàn)從而獲得供研 究用的顫抖病動物模型。
中華絨螯蟹螺原體CCTCC M 207170，用于制備水產(chǎn)動物螺原體病免疫檢測試劑盒。例 如-用中華絨螯蟹螺原體CCTCC M 207170制備抗體并用于中國專利申請200710025337.8 所說的檢測水生動物螺原體的酶聯(lián)免疫試劑盒，該試劑盒包括包被液、洗滌液、小牛血 清、 一抗血清、酶結(jié)合物工作液(二抗)、顯色液、終止液、陽性對照、陰性對照和酶標(biāo) 板條；所說的顯色液分為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液和雙氧水；所說 的陽性對照是含水生動物螺原體的樣本，陰性對照是不含螺原體的樣本， 一抗血清為中 華絨螯蟹螺原體CCTCC M 207170的多克隆抗體，酶結(jié)合物工作液為辣根過氧化物酶(HRP)
標(biāo)記山羊抗兔IgG多克隆抗體。
中華絨螯蟹螺原體CCTCC M 207170具有螺原體屬微生物的五大生物學(xué)特征濾過性、 螺旋性、運(yùn)動性、無細(xì)胞壁及可在人工培養(yǎng)基中生長。在對數(shù)生長期表現(xiàn)為典型的螺旋 及運(yùn)動特性，直徑0.1-0.2pm，長度不一，最適生長溫度為30度，最適pH為7.2-7.6，耐 受滲透壓范圍為0.15-0.7M蔗糖濃度，最高耐鹽度為30%。。在最適培養(yǎng)條件下，達(dá)對數(shù) 生長期的時間為24h，生長代謝產(chǎn)酸，隨著該病原微生物的繁殖生長，用酚紅作指示劑的 培養(yǎng)基由紅逐漸變橘黃，36-48h達(dá)穩(wěn)定生長期，此時菌液濃度可達(dá)108-109/ml。另外，該 病原微生物生長需要血清類物質(zhì)提供營養(yǎng)，能水解尿素，因?yàn)槿狈?xì)胞壁而對青霉素等 抗生素不敏感。
用病原微生物回感中華絨螯蟹可復(fù)制出典型的顫抖病，回感克氏原螯好也會令其病 發(fā)致死。
本發(fā)明公開了一種水產(chǎn)動物病原體，能用于建立動物模型，用于制備免疫檢測試劑 盒，用于防治藥物篩選等，對水產(chǎn)動物疾病，特別中華絨螯蟹顫抖病的防治起到積極的 作用。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明， 一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理 解的含義。
實(shí)施例一菌種的分離、培養(yǎng)、保藏及復(fù)壯 1.患顫抖病病蟹中螺原體的分離
病蟹來源實(shí)驗(yàn)中用于分離螺原體的病蟹來源于安徽全椒、江蘇的南京、宜興、溧 陽、揚(yáng)州等地的養(yǎng)殖塘，體重30-100g，經(jīng)光鏡、電鏡及分子生物學(xué)檢測，確診為顫抖病 病蟹。
從病蟹血淋巴液分離螺原體活體病蟹第三步足基部75%酒精局部消毒， 一次性注 射器抽取蟹血淋巴液與PBS等體積混勻，用孔徑為0.22)im濾器過濾，取5nl濾液負(fù)染， 電鏡觀察。
從病蟹組織分離螺原體病蟹整體75%酒精消毒，解剖，取約0.2g的病蟹組織(肢 肌)放入無菌培養(yǎng)皿中，加入PBS緩沖液2mL，用剪刀及牙簽將病組織搗碎，靜置lh， 用孔徑為0.22|_im濾器過濾。
2.螺原體的人工培養(yǎng)基培養(yǎng)
從病蟹血淋巴液或組織分離的濾液中取50|al接種至lmLR2培養(yǎng)基，30。C溫箱恒溫 培養(yǎng)。逐日觀察培養(yǎng)基的顏色變化，用Nikon相差顯微鏡檢查是否有螺原體生長，同時 通過負(fù)染，透射電鏡觀察螺原體形態(tài)，待培養(yǎng)基變黃或菌體含量不再增多時轉(zhuǎn)管培養(yǎng)。 注培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
R2培養(yǎng)基成分
Distilled water 84 mL; PPLO broth base 1.5 g; Sucrose (8 g); Phenol red (0.2%) 1 mU Bovine serum (15 mL); Penic川in G (1 M U/g) 100 mg 最適pH: 7.2-7.6,最適溫度3(TC, —般接種培養(yǎng)72小后培養(yǎng)基開始變色(由紅變橘黃)，表明 培養(yǎng)物存活并繁殖。
卜調(diào)pH至7.2-7.4后高壓滅菌；
220nm濾器濾過
3.純培養(yǎng)的獲得
梯度稀釋培養(yǎng)法獲得純培養(yǎng)參照微生物的CCU記數(shù)方法(colour change unit,顏 色改變單位法)，將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的螺原體菌液用R2液體培養(yǎng)基作1: 10 (v/v)梯 度稀釋，然后3(TC恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基顏色變化，至最后變色一管生長至對數(shù)生 長期，再將該管作梯度稀釋培養(yǎng)，如此反復(fù)三次，即可作為螺原體純培養(yǎng)。
固體培養(yǎng)基培養(yǎng)及純培養(yǎng)的獲得螺原體經(jīng)分離并由R2液體培養(yǎng)基培養(yǎng)出來后，取 10(Hil對數(shù)生長期的菌液用彎頭玻棒均勻涂布于R2固體培養(yǎng)基，3(TC恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，待 菌落長出后(培養(yǎng)基由紅變黃)，挑取單菌落，放入R2液體培養(yǎng)基，如此反復(fù)三次，可 得螺原體純培養(yǎng)。
由于螺原體固體培養(yǎng)菌落很小，直徑只有0.1-0.21111 ，挑取單菌落誤差較大，所以本 研究所用純培養(yǎng)多由梯度稀釋培養(yǎng)法獲得。
4.菌種保藏
冷凍保藏純培養(yǎng)菌液培養(yǎng)至對數(shù)期后離心(8000rpmX30min)，棄上清，加入適量
的新鮮培養(yǎng)基懸浮，另加入20% (Wv)的甘油作為冷凍保護(hù)劑。
凍干粉保藏純培養(yǎng)菌液培養(yǎng)至對數(shù)期后冷凍干燥成凍干粉，其中添加脫脂奶粉作 保護(hù)劑。此法可用于實(shí)驗(yàn)室長期保種。
該菌種保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2007-11-15;保藏編 號M207170 。
5.菌種復(fù)壯(從凍干粉)
用10mLR2液體培養(yǎng)基將凍千粉溶解成懸濁液(菌原液)，再以空白R2為溶劑，將 菌原液作梯度稀釋培養(yǎng)，h 10 (V/V)梯度稀釋。 一般稀釋5-6個濃度梯度。30度恒溫 培養(yǎng)，2-3天后各濃度梯度培養(yǎng)基逐步由紅變橘黃且澄清沒有沉淀。培養(yǎng)基顏色變黃說明 其中有菌體繁殖生長，從中吸取10ul作光鏡(相差或暗視野)觀察，有螺原體生長且形 態(tài)數(shù)量良好的轉(zhuǎn)接傳代培養(yǎng)。
實(shí)施例二分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究
利用該菌株提取DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，進(jìn)一步明確蟹 螺原體的分類地位以及它與其他螺原體的關(guān)系。
在分子生物學(xué)方面，該菌株16S rRNA基因部分序列(800 bp) BLAST分析證明其 與兔扁虱螺原體Sp/ra;7/asma/w'n^同源序列有98%的相似性，初步確定其是一種螺原體 并可能與S.附!V"m有較近的親緣關(guān)系；為了進(jìn)一步證實(shí)該中華絨螯蟹螺原體菌株在螺原 體屬內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)生地位，我們基于該菌株16S rRNA基因幾乎全部序列，23S rRNA， 16S-23S rRNA間隔區(qū)全部序列和兩個蛋白編碼基因一拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)酶B (gyrB), RNA聚合 酶B (rpoB)部分序列和Genbank內(nèi)下載到的已知螺原體同源序列利用最大簡約法、最 大似然法和貝葉斯法進(jìn)行了分析，所有分析都強(qiáng)烈支持中華絨螯蟹螺原體歸屬于螺原體 屬內(nèi)的Mirum支系，并與S. w77W7菌株呈現(xiàn)姐妹群的關(guān)系。此夕卜，利用已有菌株16S-23S rRNA間隔區(qū)序列設(shè)計(jì)的一對引物能夠特異性的檢測到該中華絨螯蟹螺原體在江蘇和安 徽等病蟹內(nèi)廣泛存在。在全基因DNA大小測定方面，我們利用低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋法提取 到中華絨螯蟹螺原體完整基因組DNA，包埋獲得的全基因組DNA脈沖場電泳結(jié)果表明， 中華絨螯蟹螺原體全基因組大小是1600 kbp， S. w/nw2菌株全基因組大小為1300kbp， 二 者在基因組大小上存在很大的差異，證實(shí)二者屬于兩個不同的種。
此外，我們對中華絨螯蟹螺原體、S. w!ywn、植物螺原體(CR-1 )和蜜蜂螺原體(CH-1 ) 等不同來源菌株的全菌蛋白進(jìn)行了分析，SDS-PAGE結(jié)果顯示中華絨螯蟹螺原體與植物 和蜜蜂螺原體差異較大，而與S. w/n/w差異較小，但可以看出兩者的明顯差異。用人工 回感實(shí)驗(yàn)方法，將以上不同菌株分別感染正常中華絨螯蟹，結(jié)果顯示，只有中華絨螯蟹 螺原體能夠感染蟹，引起顫抖病，而其他菌株均對蟹沒有致病性。生物學(xué)特性研究也證 實(shí)中華絨螯蟹螺原體與S. Am'nm7之間的差異，前者的生長的最適溫度為30度，后者為 37度；在對鹽度的耐受性方面兩者也有很大差異，前者可以耐受3096。的鹽度，而后者只 能在5%。以下鹽度生長，20%。以上的鹽度對S. w/nw7有很大程度的致死效應(yīng)。
從以上的分子生物學(xué)、蛋白組學(xué)、生物學(xué)特性及感染特性等幾個方面都證實(shí)我們分 離的中華絨螯蟹螺原體是一種新型的病原微生物，雖然它與的關(guān)系密切，但完 全不同于S.w'n^z，是螺原體的新種類。
實(shí)施例三中華絨螯蟹顫抖病動物模型的建立
利用中華絨螯蟹螺原體CCTCC M 207170，可以進(jìn)行病原的人工回感實(shí)驗(yàn)從而獲得供研 究用的顫抖病動物模型。
方法健康中華絨螯蟹均購自市場，活力充沛，取少量血液作光鏡、電鏡檢測，選 擇其中無顫抖病原體及其他雜菌寄生的個體為受試動物。對健康中華絨螯蟹第三步足基 部75%酒精局部消毒， 一次性注射器接種分離培養(yǎng)的螺原體活菌體，回感劑量為0.1mL/ 只，10只/組，回感前留取正常血細(xì)胞為陰性對照。同歩注射等劑量R2培養(yǎng)基的健康中 華絨螯蟹作對照?；馗泻蟮闹腥A絨螯蟹及對照組分別置于水族箱內(nèi)飼養(yǎng)，水溫控制在28'C 左右，每三天換一次水，密切關(guān)注其發(fā)病情況，每五天采一次血，光鏡觀察血細(xì)胞感染 情況；血淋巴液戊二醛固定后，負(fù)染，透射電鏡觀察血淋巴液內(nèi)含物情況。 一般回感第 12-15天左右，中華絨螯蟹開始出現(xiàn)顫抖癥狀，其血淋巴液中可以檢測并重新分離培養(yǎng)出 螺原體。
實(shí)施例四檢測水生動物螺原體的酶聯(lián)免疫試劑盒 (1)抗原的制備
抗原制備中華絨螯蟹螺原體CCTCCM 207170為病原，采用0.4%甲醛12-15小時滅 活。滅活病原以12000r/min離心50min，洗滌，離心，重復(fù)3次，制備成抗原，并用電
鏡鑒定抗原純度，紫外分光光度計(jì)測定蛋白濃度。然后置4'C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> (2) —抗血清(多克隆抗血清)的制備
選用2公斤以上健康雄性新西蘭大耳兔作為免疫動物，將中華絨螯蟹螺原體 CCTCCM 207170作為免疫抗原，216pg/ml， 4'C保存；
然后進(jìn)行免疫注射程序，將0. 9ml免疫抗原加0. 9ml弗氏完全佐劑，充分混合，在新 西蘭大耳兔腹部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)0.3ml (第一次免疫)；
一免一周后，用lml免疫抗原加lml弗氏完全佐劑，充分混合，在新西蘭大耳兔腹部 皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)0.4ml (第二次免疫)；
二免一周后，用0. 4ml免疫抗原耳靜脈注射(第三次免疫)；
三免一周后耳靜脈微量取血，間接ELISA測3免抗體效價，若達(dá)不到要求次日繼續(xù) 耳靜脈注射0.5ml (第四次免疫)；
一周后，心臟采血，分離血清，得病原菌純培養(yǎng)物的多克隆抗體，加入O. l%NaN3， 在-7CTC下保存。
(3) 酶結(jié)合物工作液(二抗)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。
(4) 陽性、陰性對照的制備 陽性對照取自具有典型顫抖病癥狀的蟹和患螺原體病的蟲下，病蟹血淋巴液負(fù)染，電
鏡下觀察，可見其含大量的螺原體。
陰性對照來自健康蟹和蝦血淋巴液則觀察到背景干凈，沒有螺原體。
(5) 小牛血清購自中美合資蘭州民海生物工程有限公司。
(6) 其他試劑的配制
包被液pH9.6的碳酸緩沖液；
洗滌液pH7.4，含0.05%吐溫-20的磷酸緩沖液；
顯色液分為擰檬酸-磷酸鹽緩沖液，四甲基聯(lián)苯胺(TMB)固體，30%過氧化氫液
體；
終止液2mol/ml硫酸溶液。
(7) 酶標(biāo)條FEP11096,96孔可拆板，購自南京布克生物技術(shù)有限公司。
(8) 檢測水生動物螺原體的酶聯(lián)免疫試劑盒
l井碳酸緩沖液(包被液)1.2ml (1.5ml離心管)
2弁洗板用洗滌液 50 ml (1個50ml冷凍管)
3弁小牛血清280nl(5ml冷凍管)
4# 一抗3pl(1.5 ml離心管)
5弁二抗0牟(1.5ml離心管)
6弁TMB0.15mg(PCR管)
7井檸檬酸-磷酸鹽緩沖液1.5mJ(1.5ml離心管)
8弁雙氧水7，(PCR管)
9#終止液1.3ml(1.5ml離心管)
腦陽性對照5^1(1.5ml離心管)
11 #陰性對照5^1U.5ml離心管〉
酶標(biāo)條1條12孔
本發(fā)明不限于這些公開的實(shí)施方案，本發(fā)明將覆蓋在專利書中所描述的范圍，以及 權(quán)利要求范圍的各種變型和等效變化。
權(quán)利要求
1、一種水生動物病原微生物，其特征在于，它是中華絨螯蟹螺原體(Spiroplasmaeriocheir sp.Nov)，其保藏號為CCTCC M 207170。
2、 一種權(quán)利要求1所說的病原微生物的用途，其特征在于，通過病原的人工回感 實(shí)驗(yàn)獲得顫抖病動物模型。
3、 一種權(quán)利要求1所說的病原微生物的用途，其特征在于，用于制備水產(chǎn)動物螺 原體病免疫檢測試劑盒。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所說的用途，其特征在于，用中華絨螯蟹螺原體CCTCC M 207170 制備抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型水生動物病原微生物，中華絨螯蟹螺原體(Spiroplasmaeriocheir sp.Nov)CCTCC M 207170以及它的用途。中華絨螯蟹螺原體CCTCC M 207170能用于建立動物模型，用于制備免疫檢測試劑盒，用于防治藥物篩選等，對水產(chǎn)動物疾病，特別中華絨螯蟹顫抖病的防治起到積極的作用。
文檔編號C12N1/20GK101205528SQ20071019026
公開日2008年6月25日 申請日期2007年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月23日
發(fā)明者畢可然, 文 王, 王俊海, 偉 顧, 樺 黃 申請人:南京師范大學(xué)