本發(fā)明屬于海洋微生物資源領(lǐng)域，具體的說是由海藻分離獲得的假單胞菌(Pseudomonas thivervalensis)，菌株號TBF-165，通過人工培養(yǎng)發(fā)酵，可產(chǎn)生用途廣的間苯三酚。該菌種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2015年5月29日，保藏編號CGMCC No.10934，分類命名賽維瓦爾假單胞菌Pseudomonas thivervalensis。

背景技術(shù)：

間苯三酚用途廣，是重要的化工和醫(yī)藥中間體，可用于化工、醫(yī)藥、材料領(lǐng)域，如染料偶合、合成橡膠、輪胎增粘、紡織品與皮革染色等；同時也是性能優(yōu)越的抗氧化劑和化學(xué)防腐劑，還可用于檢驗香草素、木質(zhì)素、糖醛、多縮戊糖等；間苯三酚還是重要的制備心血管系統(tǒng)、抗癌、抗艾滋病及肝炎藥物中間體，尤其是近幾年黃酮類藥物的興起，更是凸顯了間苯三酚的供需矛盾。

間苯三酚市場需求量大，經(jīng)濟價值較高，目前國內(nèi)外生產(chǎn)主要靠化學(xué)合成，常用的2，4，6-三硝基甲苯為原料，經(jīng)間苯三胺途徑工業(yè)化生產(chǎn)間苯三酚的方法，污染環(huán)境且存在安全隱患；苯鹵化物為原料成本高，工藝復(fù)雜，難于工業(yè)化生產(chǎn)；而以1，3，5-三異丙基苯為原料的工藝路線，雖然污染小，成本較低，但氧化階段產(chǎn)物復(fù)雜，分離精制較困難。亟待探索對環(huán)境友好的生物生產(chǎn)途徑來解決該難題。

與其它生物途徑獲得間苯三酚相比，微生物具有可人工培養(yǎng)發(fā)酵，成本低，產(chǎn)物的得率和純度較高，容易工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)勢。微生物生產(chǎn)最重要的是種質(zhì)資源，因此獲得產(chǎn)品的新種質(zhì)資源是各國爭奪自主知識產(chǎn)權(quán)的目標(biāo)。

有報道推測熒光假單胞菌，產(chǎn)生2，4-二乙?；g苯三酚的同時也產(chǎn)生間苯三酚，但未見熒光假單胞菌產(chǎn)生間苯三酚的科研證實，也未見有關(guān)假單胞菌屬其它種類菌產(chǎn)生間苯三酚的報道，更沒有關(guān)于海洋生境微生物產(chǎn)生間苯三酚的科研報道。

我國是海洋大國，海洋微生物資源很豐富，而相對于開發(fā)時間較久的陸地微生物，這一生境寶貴資源的開發(fā)時間較短，發(fā)現(xiàn)有用化合物的機率相對較大，我們由渤海采集的海藻分離獲得一株假單胞菌可以產(chǎn)生間苯三酚，該菌株對環(huán)境沒有污染，菌株人 工培養(yǎng)容易，所需培養(yǎng)材料價格低廉，各地市場可隨處購買，培養(yǎng)周期短，容易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，開發(fā)前景好。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一株新發(fā)現(xiàn)的海洋生境假單胞菌Pseudomonas thivervalensis，該菌能通過人工培養(yǎng)方法生產(chǎn)間苯三酚。發(fā)明充分利用了海洋微生物這一新開發(fā)的天然資源，菌株經(jīng)測定生物學(xué)及化學(xué)特性穩(wěn)定，容易培養(yǎng)，培養(yǎng)周期短，操作方法簡便可行，對環(huán)境沒有污染，所用原料廉價，生產(chǎn)成本低，容易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，開發(fā)前景好。

本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，由渤海潮間帶海藻分離獲得了一株產(chǎn)間苯三酚新資源菌株，賽維瓦爾假單胞菌Pseudomonas thivervalensis菌株，菌株編號TBF-165，保藏編號為：CGMCC No.10934。

1)培養(yǎng)基配方為：蛋白胨15-20g/L，甘油7-10mL/L，K₂HPO₄，1.5-2.0g/L；MgSO₄.7H₂O 1.5-2.0g/L，NaCl 8.0-10.0g/L，pH 7.0-7.5，瓊脂16-18g；保藏編號為：CGMCC No.10934的TBF-165菌株，接入在上述培養(yǎng)基置25℃-28℃培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)40-48小時，菌落表面光滑不透明，濁黃紅色，在MPDA培養(yǎng)基上菌落呈藍色，菌體桿狀，直或微彎曲，革蘭氏染色陰性，0.4-1.3μm×1.4-5.0μm，無莢膜與芽胞，極生鞭毛。生理生化特征：TBF-165菌株能在5％-10％NaCl的環(huán)境生長，明膠酶試驗、硝酸鹽還原、接觸酶試驗為陽性；淀粉水解、VP試驗、吲哚反應(yīng)為陰性，能利用檸檬酸鹽和丙酸鹽，氧化葡萄糖產(chǎn)酸，不能水解尿素；

2)用常規(guī)誘變育種與馴化方法對TBF-165菌株進行改造，采用死亡率大于90％紫外(250nm)氯化鋰(氯化鋰2.0％)復(fù)合誘變處理條件，通過生物學(xué)菌落特征對比從誘變平板中初步選取菌株，選擇的菌株經(jīng)高效液相色譜HPLC與親本菌株比較峰值確定產(chǎn)量高的菌株，選出的菌株，加入海藻粉10-12g/L，蛋白胨5-7g/L，甘油7-10mL/L；K₂HPO₄ 1.5-2.0g/L；MgSO₄.7H₂O 1.5-2.0g/L，NaCl，15.0-20.0g/L，pH 7.0-7.5，25℃-28℃，馴化培養(yǎng)30小時，加入55℃水浴熱激活10分鐘，轉(zhuǎn)入相同的固體培養(yǎng)基純化為單克隆菌落，連續(xù)傳代10代，選擇生物學(xué)與化學(xué)性狀穩(wěn)定的菌株做為選育的高產(chǎn)菌株；

3)改造好的TBF-165菌株加入海藻粉10-12g/L，蛋白胨5-7g/L，甘油7-10mL/L；K₂HPO₄ 1.5-2.0g/L；MgSO₄.7H₂O 1.5-2.0g/L，NaCl 15.0-20.0g/L，pH 7.0-7.5，25℃-28℃，瓊脂16-18g，培養(yǎng)40-48小時，將固體培養(yǎng)基生長好的菌體刮下，接入不加瓊脂的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)速150rpm，振蕩培養(yǎng)35-40小時為種子液，再將種子液接入所需體積 的上述培養(yǎng)液中(根據(jù)需要可逐級放大)，25℃-28℃，150rpm，振蕩培養(yǎng)65-72小時，獲得發(fā)酵液，培養(yǎng)好的發(fā)酵液加入3倍的乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯減壓濃縮，即得到間苯三酚。選育的高產(chǎn)菌株產(chǎn)量由野生菌株原來的150mg/L提高到1126mg/L，提高了800.8％，菌株生物學(xué)與化學(xué)性狀穩(wěn)定

本發(fā)明有益效果：

1從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)一個產(chǎn)間苯三酚的新種質(zhì)資源，為我國綠色生產(chǎn)國民經(jīng)濟需求量大的間苯三酚提供一個新途徑；

2為基因控制產(chǎn)間苯三酚提供一個新基因資源。目前雖然有多種產(chǎn)間苯三酚基因報道，但海洋生境微生物生存環(huán)境特殊，此菌株具有明顯的海洋環(huán)境生長特性，其控制間苯三酚產(chǎn)生的基因也是新的基因資源；

3與已報道的產(chǎn)間苯三酚菌株相比，該菌株生長溫度低，可節(jié)省能源，能利用資源豐富廉價的海藻，生產(chǎn)成本低，操作簡單，開發(fā)前景好，容易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

附圖說明

圖1是野生菌株與高產(chǎn)菌株產(chǎn)生間苯三酚HPLC測試峰比較圖。

具體實施方式

本發(fā)明的保護范圍不僅局限于以下實施例中，本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下：

實施例1：TBF-165菌株的培養(yǎng)性狀及生理生化測試

以保藏編號為：CGMCC No.10934的TBF-165菌株，經(jīng)蛋白胨15-20g/L，甘油7-10mL/L；K₂HPO₄ 1.5-2.0g/L；MgSO₄.7H₂O 1.5-2.0g/L，NaCl 20.0-30.0g/L，瓊脂16-18g，pH 7.0-7.5，25℃-28℃，培養(yǎng)40-48小時，前期濁白色，后轉(zhuǎn)變?yōu)闈峒t色，菌體桿狀，直或微彎曲，革蘭氏染色陰性，0.4-1.3μm×1.4-5.0μm，無莢膜與芽胞，極生鞭毛，常規(guī)生理生化測試結(jié)果如下表，結(jié)合16SrDNA測試結(jié)果，鑒定TBF-165菌株為假單胞菌屬的賽維瓦爾Pseudomonas thivervalensis種。

菌株TBF-165生理生化特征

菌株培養(yǎng)40-48小時為一代，連續(xù)在相同培養(yǎng)基傳代接種10代后，與原始菌株進行對比，各種性狀相同，證明菌株生物學(xué)性狀穩(wěn)定。

實施例2：高產(chǎn)菌株的選育

為提高產(chǎn)量，降低成本，用常規(guī)誘變育種與馴化方法對TBF-165菌株進行，采用選取死亡率90％的處理條件為誘變合適條件，常規(guī)的紫外(250nm)氯化鋰(氯化鋰2.0％)復(fù)合誘變，通過生物學(xué)菌落特征對比從誘變平板中初步選取菌株，然后發(fā)酵提取，高效液相色譜HPLC確定選擇產(chǎn)量高的菌株，選出的高產(chǎn)菌株加入海藻粉10-12g/L，蛋白胨5-7g/L，甘油7-10mL/L；K₂HPO₄ 1.5-2.0g/L；MgSO₄.7H₂O 1.5-2.0g/L，NaCl 15.0-20.0g/L，pH 7.0-7.5，25℃-28℃，馴化培養(yǎng)30小時，加入55℃水浴熱激活10分鐘，轉(zhuǎn)入相同的固體培養(yǎng)基，純化培養(yǎng)為單克隆菌落，連續(xù)傳代培養(yǎng)10代，用上述方法觀察比較其生物學(xué)指標(biāo)及間苯三酚產(chǎn)量是否變化，選擇生物學(xué)與化學(xué)性狀穩(wěn)定的菌株做為選育菌株，經(jīng)選擇獲得一株高產(chǎn)菌株，產(chǎn)量由野生菌株原來的150mg/L提高到1126mg/L，提高了800.8％，(參見圖1)高產(chǎn)菌株生物學(xué)與化學(xué)性狀穩(wěn)定.

實施例3：TBF-165菌株的人工培養(yǎng)及提取

以保藏編號為：CGMCC No.TBF-165菌株在海藻粉10-12g/L，蛋白胨5-7g/L，甘油7-10mL/L；K₂HPO₄ 1.5-2.0g/L；MgSO₄.7H₂O 1.5-2.0g/L，NaCl，15.0-20.0g/L，瓊脂16-18g，pH 7.0-7.5，固體培養(yǎng)基25℃-28℃培養(yǎng)45-48小時，將固體培養(yǎng)基生長好的菌體刮下，接入與上配方相同不加瓊脂的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)速150rpm，振蕩培養(yǎng)35-40小時為種子液，再將種子液接入所需體積的上述培養(yǎng)液中(根據(jù)需要可逐級放大)，25℃-28℃，150rpm，振蕩培養(yǎng)65-72小時，獲得發(fā)酵液。培養(yǎng)好的發(fā)酵液用常規(guī)方法加入3倍體積的乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯減壓濃縮，即得到間苯三酚。