專利名稱：抑制igf－i和－ii和gh－rh拮抗性相似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的完成部分地獲得來(lái)自老兵事務(wù)局醫(yī)學(xué)研究部的政府資助。政府對(duì)本申請(qǐng)具有某些權(quán)利。
本發(fā)明是關(guān)于抑制哺乳動(dòng)物垂體釋放生長(zhǎng)激素的新型合成肽，以及含有這種新型肽的治療組合物。
背景技術(shù)：
生長(zhǎng)激素(“GH”)是一種具有191個(gè)氨基酸的肽，它刺激產(chǎn)生多種不同的生長(zhǎng)因子例如胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I)，并因此促進(jìn)多種組織(骨骼、結(jié)締組織、肌肉和內(nèi)臟)生長(zhǎng)，以及引起一些生理活性(促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)合成及脂解，但降低尿素分泌)。
GH的釋放受下丘腦分泌的釋放和抑制因子的控制。主要的釋放因子是生長(zhǎng)激素釋放激素(“GH-RH”)，人生長(zhǎng)激素-釋放激素(“hGH-RH”)是一種具有44個(gè)氨基酸的肽。本發(fā)明的新型肽涉及僅具有殘基1至29的hGH-RH(“hGH-RH(1-29)NH2”)的相似物，即具有如下氨基酸序列的肽相似物Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile5-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys-Val-Leu-Gly15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp25-Ile-Met-Ser-Arg29-NH2已發(fā)現(xiàn)GH與幾種疾病有關(guān)。一種涉及GH的疾病是肢端巨大癥，是由于存在過(guò)量水平的GH。通過(guò)給予GH-RH拮抗劑可治療這種疾病中表面和肢端骨的異常增長(zhǎng)。
另一類涉及GH的疾病是糖尿病性視網(wǎng)膜病和糖尿病性腎病。認(rèn)為這類疾病中分別由GH引起的視網(wǎng)膜和腎的損傷可導(dǎo)致失明或腎功能障礙。通過(guò)給予有效的GH-RH拮抗劑可阻止或延緩這種損傷。
但是，GH-RH拮抗劑的主要應(yīng)用是在癌癥領(lǐng)域(A.V.Schally等，生長(zhǎng)激素促分泌素的臨床應(yīng)用。Bercu，B.B和Walker，R.F編著，Dekker，New York，pp 145-162，1998)。對(duì)于各種癌癥，IGF-I和-II是強(qiáng)有力的促細(xì)胞分裂劑。通過(guò)抑制GH分泌，GH-RH拮抗劑可降低IGF-I在肝和其它組織中的合成。GH-RH拮抗劑還降低各種腫瘤自體分泌和旁路分泌產(chǎn)生IGF-I和/或IGF-II。對(duì)于幾種實(shí)驗(yàn)性癌癥，用GH-RH拮抗劑治療可導(dǎo)致IGF-I和-II減少，伴隨著對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制。
在治療這類疾病和其它一些狀態(tài)的努力中，某些研究者試圖通過(guò)使用一種GH釋放抑制劑，生長(zhǎng)激素釋放抑制因子來(lái)控制GH的水平。但是如果單獨(dú)給予生長(zhǎng)激素釋放抑制因子，不能將GH或IGF-I抑制到所希望的程度。如果與GH-RH拮抗劑合并給藥，生長(zhǎng)激素釋放抑制因子將更好地改善對(duì)IGF-I水平的抑制作用。
為了闡明GH-RH的結(jié)構(gòu)與其活性的關(guān)系，科研工作者研究了GH-RH的各種修飾，致力于提供具有改進(jìn)的激動(dòng)劑或拮抗劑特性的人工合成同類物。因此早已確定，含有殘基1-29的GH-RH片段，或GH-RH(1-29)是生物活性所必需的最小序列。此片段保留了天然GH-RH的50％或更多的效力。
第一個(gè)被描述的GH-RH拮抗劑[Ac-Tyr1，D-Arg2]hGH-RH(1-29)NH2，在文獻(xiàn)中通常被稱為“標(biāo)準(zhǔn)拮抗劑”，已發(fā)現(xiàn)它可阻止hGH-RH(1-29)NH2對(duì)大鼠垂體前葉腺苷酸環(huán)化酶的激活作用。這種肽在垂體和下丘腦中可阻斷GH-RH對(duì)其受體的作用，并且抑制生長(zhǎng)激素的脈動(dòng)式分泌。
在已發(fā)表的文獻(xiàn)中有相當(dāng)數(shù)量的專利和論文公開了一些GH-RH相似物，它們或者具有GH-RH激動(dòng)劑的作用(即刺激GH釋放的作用)，或者具有GH-RH拮抗劑的作用(即抑制GH釋放的作用)。這些肽的大多數(shù)都來(lái)源于GH-RH(1-29)肽序列，并具有增強(qiáng)它們激動(dòng)劑或拮抗劑特性的特定結(jié)構(gòu)修飾。
例如美國(guó)專利4,659,693公開了一些GH-RH拮抗劑相似物，它們?cè)谄銰H-RH(1-29)序列的位置2含有某些N，N′-二烷基-ω-胍基α-氨?；鶜埢?。
已公開的專利申請(qǐng)WO91/16923回顧了通過(guò)修飾其氨基酸序列來(lái)改變hGH-RH二級(jí)結(jié)構(gòu)的早期嘗試。這些早期嘗試包括以它們的D-異構(gòu)體取代Tyr1，Ala2，Asp3或Asn8；以L-或D-Ser，D-Arg，Asn，Thr，Gln或D-Lys取代Asn8；以Ala取代Ser9以便增強(qiáng)此區(qū)域的兩親性；以及以Ala或Aib取代Gly15。據(jù)說(shuō)當(dāng)此相似物中的R2是D-Arg，以及按上面的提示取代R8，R9和R15，可導(dǎo)致形成拮抗劑活性。據(jù)說(shuō)這些拮抗性肽適合于作為藥物組合物給藥，用于治療與GH過(guò)度水平有關(guān)的疾病狀態(tài)如肢端巨大癥。
美國(guó)專利5,084,555中hGH-RH相似物“[Ser9-ψ[CH2-NH]-Tyr10]hGH-RH(1-29)的拮抗劑活性據(jù)說(shuō)是由于R9和R10殘基之間偽肽鍵(即被還原成[CH2-NH]鍵的肽鍵)的結(jié)果。但是，據(jù)說(shuō)[Ser9-ψ[CH2-NH]-Tyr10]hGH-RH(1-29)的拮抗劑特性不如標(biāo)準(zhǔn)拮抗劑[N-Ac-Tyr1，D-Arg2]GH-RH(1-29)-NH2。
被轉(zhuǎn)讓給與本專利申請(qǐng)相同受讓人的美國(guó)專利5,550,212和美國(guó)專利申請(qǐng)08/642,472公開了幾種hGH-RH(1-29)NH2的相似物，它們具有增強(qiáng)的拮抗劑特性和延長(zhǎng)的作用期。據(jù)認(rèn)為這些特性是由于在GH-RH(1-29)NH2的N-末端以芳香酸或非極性酸取代多個(gè)氨基酸并酰基化的結(jié)果。應(yīng)注意的是，在上述美國(guó)專利和美國(guó)專利申請(qǐng)中，R9通常是Ser，R16是Gln或形成內(nèi)酰胺橋的氨基酸(即Glu)，R28是Ser，Asn，Asp，Ala或Abu，以及R29是Agm，Arg-NH2，Arg-OH，Cit-NH2，Cit-OH，Har-NH2，Har-OH，或形成內(nèi)酰胺橋的氨基酸(即Lys或Orn)。
發(fā)明概述在此提供了一系列hGH-RH(1-29)NH2的新型合成相似物。這些相似物可抑制內(nèi)源性hGH-RH的活性，因此可阻止生長(zhǎng)激素的釋放。同以前所描述的相似物比較，此新型相似物較強(qiáng)的抑制能力是由于對(duì)多個(gè)氨基酸取代的結(jié)果。
具體地說(shuō)，本發(fā)明是關(guān)于包含如下結(jié)構(gòu)式的肽及其可藥用的鹽X-R1-R2-Asp-Ala-R5-R6-Thr-R8-R9-R10-Arg-R12-R13-R14-R15-R16-Leu-R18-R19-Arg-R21-R22-Leu-Gln-Asp-Ile-R27-R28-R29-NH2其中X是PhAc，IndAc，Ibu，Nac，1-或2-NPr，或者Fpr，R1是Tyr或His，R2是D-Arg或D-Cit，
R5是Ile或Val，R6是Phe，Nal或Phe(Y)，在此Y＝F，Cl，Br，R8是Asn，Gln，Ser，Thr，Ala，D-Asn，D-Gln，D-Ser，D-Thr，Abu，D-Abu，或Aib，R9是Arg，Har，Lys，Orn，D-Arg，D-Har，D-Lys，D-Orn，Cit，Nle，Tyr(Me)，Ser，Ala或Aib，R10是Tyr或Phe(Y)，在此Y＝H、F、Cl、Br，或OCH3，R12是Lys，D-Lys，或Orn，R13是Val或Nle，R14是Leu或Nle，R15是Gly，Ala，Abu，Nle或Gln，R16是Gln或Arg，R18是Ser或Nle，R19是Ala或Abu，R21是Lys或Orn，R22是Leu，Ala或Aib，R27是Met，Leu，Nle，Abu，或D-Arg，R28是Arg，D-Arg，Ser，Asn，Asp，Ala或Abu，R29是Arg，D-Arg，Har或D-Har。
此肽在優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中X是PhAc，IndAc或Nac，R1是Tyr或His，R2是D-Arg，R5是Ile，R6是Phe(pCl)，R8是Asn或Abu，R9是Arg或Har，Lys，Orn，D-Arg，D-Har，D-Lys，D-Orn，Cit，Nle或Tyr(Me)，R10是Tyr或Tyr(Me)，R12是Lys，R13是Val或Nle，R14是Leu或Nle，R15是Abu，Ala或Nle，R16是Gln或Arg，R18是Ser或Nle，R19是Ala或Abu，R21是Lys，R27是Nle或D-Arg，R28是D-Arg，Arg或Ser，R29是D-Arg，Har或D-Har。
要指出的是，天然GH-RH分子中的氨基酸殘基30-44看來(lái)對(duì)活性不是必不可少的，它們的具體種類也不是關(guān)鍵的。因此，看來(lái)對(duì)本發(fā)明hGH-RH(1-29)-NH2相似物的C-末端加入另外這些氨基酸殘基的某些或全部將不會(huì)影響這些相似物作為GH-RH拮抗劑的效力。如果要對(duì)此hGH-RH(1-29)-NH2相似物的C-末端加入這些氨基酸的某些或全部，則所加入的氨基酸殘基可以是與天然hGH-RH序列中殘基30-44相同的殘基，或者是適當(dāng)?shù)南嗟任?。合成方法可通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ǐ@得合成肽，例如完全的固相技術(shù)，部分的固相技術(shù)，片段縮合法或經(jīng)典的液相合成法。
當(dāng)借助于固相法合成本發(fā)明的相似物，先以適當(dāng)?shù)姆椒▽⑵銫-末端殘基(在此是R29)連接(錨定)于一種惰性支持物(樹脂)，此殘基同時(shí)支承著其α-氨基(在適當(dāng)?shù)那闆r下是其側(cè)鏈功能基)的保護(hù)基。完成此步驟之后，從被錨定的氨基酸殘基除去α-氨基保護(hù)基，并加入其α-氨基(以及任何適當(dāng)?shù)膫?cè)鏈功能基)已被適當(dāng)保護(hù)的下一個(gè)氨基酸殘基R28，然后照此繼續(xù)。加入每個(gè)殘基之后除去N-末端保護(hù)基，但是還不除去側(cè)鏈保護(hù)基。在將全部所需的氨基酸，以合適的順序連接之后，在對(duì)序列中的殘基具有最小破壞作用的條件下使肽從支持物上斷開下來(lái)，并除去所有的側(cè)鏈保護(hù)基。隨之對(duì)此合成產(chǎn)物小心地進(jìn)行純化并作仔細(xì)的鑒定，以便確保所獲得的序列確實(shí)是所需要的結(jié)構(gòu)。
在偶聯(lián)步驟中以酸或堿敏感性保護(hù)基保護(hù)氨基酸的α-氨基功能是特別優(yōu)選的。這類保護(hù)基具有在肽鍵形成的條件下是穩(wěn)定的特點(diǎn)，同時(shí)易被除去而不破壞形成的肽鏈，不外消旋化其中包含的任何手性中心。適合的α-氨基保護(hù)基是Boc和Fmoc。醫(yī)學(xué)應(yīng)用可將這種hGH-RH拮抗劑肽或這種肽的鹽配制成含有其有效量的藥物制劑形式，用于為治療或診斷的目的對(duì)人或動(dòng)物給藥。這種肽可被用于抑制GH水平，治療與過(guò)量GH水平有關(guān)的疾病，例如糖尿病患者的視網(wǎng)膜病和腎病，以及肢端巨大癥。還可以通過(guò)對(duì)需要這種治療的個(gè)人給予本發(fā)明的組合物，提供治療這類疾病的方法。但是，GH-RH拮抗劑的主要用途是在癌癥領(lǐng)域，例如人類的乳腺癌，肺癌，結(jié)腸癌，腦癌，胰腺癌和前列腺癌，這些癌癥都存在對(duì)于IGF-I或IGF-II的受體。
附圖簡(jiǎn)述圖I是在用某些GH-RH拮抗劑治療的過(guò)程中，相對(duì)于治療天數(shù)MXT小鼠乳腺癌體積改變的曲線圖。
圖II是在用某些GH-RH拮抗劑治療過(guò)程中，相對(duì)于治療天數(shù)在裸鼠MDA-MB-468人乳腺癌體積改變的曲線圖。
圖III是在用某些GH-RH拮抗劑治療過(guò)程中，相對(duì)于治療天數(shù)在裸鼠HT-29人結(jié)腸癌體積改變的曲線圖。
圖IV是在用一種GH-RH拮抗劑治療過(guò)程中，相對(duì)于治療天數(shù)在裸鼠U87MG人神經(jīng)膠質(zhì)瘤(glioblastomas)體積改變的曲線圖。
圖V是在用某些GH-RH拮抗劑治療過(guò)程中，相對(duì)于治療天數(shù)在裸鼠PC-3人前列腺癌體積改變的曲線圖。
對(duì)優(yōu)選實(shí)施方案的詳述A.縮寫用于定義這些肽的專門術(shù)語(yǔ)是由生物化學(xué)術(shù)語(yǔ)IUPAC-IUB委員會(huì)規(guī)定的術(shù)語(yǔ)，其中根據(jù)常規(guī)的表示法，在N-末端其氨基出現(xiàn)在左側(cè)，在C-末端其羧基出現(xiàn)在右側(cè)。在此使用的名詞“天然氨基酸”意指如下一種在天然存在的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的天然存在的L-氨基酸Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Lys、Arg、Asp、Asn、Glu、Gln、Cys、Met、Phe、Tyr、Pro、Trp和His。當(dāng)天然的氨基酸殘基具有異構(gòu)體形式時(shí)，在此表示的是此氨基酸的L-構(gòu)型，除非另有特定的指示。
非編碼氨基酸，或氨基酸相似物也被摻入GH-RH拮抗劑中(非編碼氨基酸是不在天然存在的肽中發(fā)現(xiàn)的大約20種天然氨基酸中的那些氨基酸)。如下氨基酸包括在可能用于hGH-RH拮抗性肽的非編碼氨基酸或氨基酸相似物中以Abu表示α-氨基丁酸，以Aib表示α-氨基異丁酸，以Har表示高精氨酸，以Nal表示2-萘基-丙氨酸，以Nle表示正亮氨酸，以及以O(shè)rn表示鳥氨酸。當(dāng)這些非編碼氨基酸或氨基酸相似物具有異構(gòu)體形式時(shí)，所表示的是此氨基酸的L-構(gòu)型，除非另有特定的指示。
在此所采用的縮寫有Abu α-氨基丁酸Ac 乙酰基AcOH乙酸Ac2O乙酸酐Aib α-氨基異丁酸Boc 叔丁氧羰基Bom 芐氧甲基2BrZ2-溴-芐氧羰基cHx 環(huán)己基Cit 瓜氨酸(2-氨基-5-脲基戊酸)2CIZ2-氯-芐氧羰基DCM 二氯甲烷DIC N，N′-二異丙基碳化二亞胺DIEA二異丙基乙胺DMF 二甲基甲酰胺Fmoc芴基甲氧羰基Fpr 3-苯丙酰基GH 生長(zhǎng)激素GH-RH GH釋放激素Har 高精氨酸HBTU2-(1H-苯并疊氮-1-基)-1，1，3，3-四甲基uronium六氟磷酸鹽hGH-RH 人GH-RHHOBt1-羥基苯并三唑HPLC高效液相色譜Ibu 異丁?；鵌ndAc 吲哚-3-乙酰基MBHA對(duì)-甲基二苯甲基胺MeOH甲醇MeCN乙腈Nac 1-萘基乙?；鵑al 2-萘基丙氨酸NMM N-甲基嗎啡Npr 萘基丙酰基PAM 苯乙酰氨甲基Phe(pCl)對(duì)-氯-苯丙氨酸PhAc苯乙?；鵵GH-RH 大鼠GH-RHRP-HPLC 反相HPLCTFA 三氟乙酸Tos 對(duì)甲苯磺酰基Tyr(Me) 酪氨酸甲基醚Z 芐氧羰基B.GH-RH相似物本發(fā)明的hGH-RH相似物被設(shè)計(jì)成對(duì)受體具有增高的肽親和性，具有改進(jìn)的代謝穩(wěn)定性，以及具有最大的雙親性分子二級(jí)結(jié)構(gòu)。這些相似物中的許多在體外和體內(nèi)對(duì)由hGH-RH(1-29)NH2刺激的GH釋放可引起非常有效的和長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)的抑制作用。
因?yàn)榫哂酗@著的生物活性，如下實(shí)施方案是特別優(yōu)選的[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽1[IndAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽2[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Har9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽3[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Har9，Abu16，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽4[Nac0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽5[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽6[PhAc0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu16，Nle27，D-Arg28，Har29)hGH-RH(1-29)NH2肽7[Nac0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽8[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽9[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu15，Arg16，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29]NH2肽10[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽11[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Nle9，Abu15，Nle27，D-Arg28]hGH-RH(1-29)NH2肽12[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Nle13，Nle14，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽13[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Nle15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽14[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu15，Nle18，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽15[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽16[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽17[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽18[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Tyr(Me)10，Abu15， D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-缺席RH(1-29)NH， 肽19[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Tyr(Me)9， Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽20[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽21[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽22[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽23[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，Lys9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽24[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Orn9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽25[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽26[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Har9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽27[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Lys9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽28[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Orn9，Abu115，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽29[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，Cit9，Abu16，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽30六個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案具有如下的結(jié)構(gòu)式
PhAo0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10-Arg11-Lys12-Val11-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2肽1IndAc0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln10-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2肽2PhAc0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Har9-Tyr(Me)10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2肽3PhAc0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr(Me)10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2肽6PhAc0-His1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2肽7Nac0-His1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2肽8按照已確定的慣例，這些肽可簡(jiǎn)寫成如下形式[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽1[IndAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽2[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Har9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽3[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽6[PhAc0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽7[Nac0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽8C.制備方法1.合成法概述可借助于適當(dāng)?shù)姆椒ê铣蛇@種肽，例如完全的固相技術(shù)，部分的固相技術(shù)，片段縮合法或經(jīng)典的液相合成法。例如在教科書“肽固相合成法”，J.M.Stewart和J.D.Young，Pierce化學(xué)公司，Rockford，111，1984(第二版)，以及M.Bodanszky，“肽合成原理”，Springer Verlag，1984中闡述了完全的固相合成技術(shù)。優(yōu)選地可應(yīng)用固相合成法制備這種hGH-RH拮抗性肽，例如由Merrifield，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志85 p.2149(1963)所概述的方法，雖然如前面所述還可以應(yīng)用本領(lǐng)域已知的其它等效的化學(xué)合成法。
以在其α-氨基被保護(hù)的氨基酸進(jìn)行這種合成。尿烷型保護(hù)基(Boc或Fmoc)優(yōu)選地被用于保護(hù)α-氨基。優(yōu)選的保護(hù)基是Boc。
按照固相合成法，是借助于化學(xué)鍵將在C-末端形成最終肽氨酰基的N-α-保護(hù)氨基酸部分附著在多聚樹脂支持物上。在偶聯(lián)反應(yīng)完成之后，選擇性地除去此α-氨基保護(hù)基，以便能在氨基末端進(jìn)行后續(xù)的偶聯(lián)反應(yīng)，當(dāng)N-α-保護(hù)基是Boc時(shí)優(yōu)選地可用在DCM中配制的50％TFA。逐步將具有相同Boc-保護(hù)α-氨基的其余氨基酸偶聯(lián)于樹脂上前面氨基酸的自由氨基，以便獲得所需的肽序列。因?yàn)榘被釟埢桥悸?lián)于C-末端殘基的α-氨基，所以合成hGH-RH相似肽的延長(zhǎng)是在C-末端開始并向N-末端延伸。當(dāng)獲得了所需的序列，在N-末端將此肽酰化，并從多聚支持物上分離下來(lái)。
過(guò)量地使用每種被保護(hù)的氨基酸(2.5或3當(dāng)量)，并通常在DCM，DMF或它們的混合物中進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。借助于茚三酮反應(yīng)在每個(gè)階段監(jiān)測(cè)偶聯(lián)反應(yīng)完成的程度。在被確定為不完全偶聯(lián)的情況下重復(fù)此偶聯(lián)步驟，或者在除去α-氨基保護(hù)基，然后偶聯(lián)下一個(gè)氨基酸之前，通過(guò)乙?；捶磻?yīng)的氨基進(jìn)行封端。
表1中顯示了一個(gè)典型的合成周期。
表1用于應(yīng)用Boc-法的典型合成周期方案步驟試劑混合時(shí)間(分鐘)1.保護(hù) DCM配制的50％TFA5＋25DCM洗滌液 12-丙醇洗滌液12.中和 DCM配制的5％DIEA1DCM洗滌液 1MeOH洗滌液 1DCM配制的5％DIEA3MeOH洗滌液 1DCM洗滌液(3次) 1-13.偶聯(lián) DCM配制的3當(dāng)量Boc-氨基酸或者DMF＋3當(dāng)量DIC或預(yù)先形成的Boc氨基酸的HOBt酯60MeOH洗滌液 2DCM洗滌液 24.乙?；疍CM配制的Ac2O(30％)10＋20(如果適當(dāng)時(shí))MeOH洗滌液(3次) 2DCM洗滌液(3次) 2合成完成之后，應(yīng)用熟知的肽化學(xué)方法可使肽從樹脂上斷開。
此肽的某些氨基酸殘基具有與用于偶聯(lián)或去保護(hù)的試劑易反應(yīng)的側(cè)鏈功能基。當(dāng)存在這種側(cè)鏈功能基時(shí)，為了防止在用于形成肽的反應(yīng)過(guò)程中發(fā)生不希望有的化學(xué)反應(yīng)，可使適合的保護(hù)基與這些功能基接合。在選擇特定的側(cè)鏈保護(hù)基時(shí)應(yīng)遵守如下一般性規(guī)則(a)在偶聯(lián)反應(yīng)條件下此保護(hù)基可優(yōu)選地保持其保護(hù)特性，并不會(huì)被斷開，(b)在每一合成步驟除去α-氨基保護(hù)基的條件下這種保護(hù)基應(yīng)該是穩(wěn)定的，(c)當(dāng)所需氨基酸序列的合成完成時(shí)，在不使肽鏈發(fā)生不良改變的反應(yīng)條件下這種側(cè)鏈保護(hù)基必須可被除去。
優(yōu)選地可按如下保護(hù)反應(yīng)性側(cè)鏈功能基芐基用于保護(hù)Thr和Ser，2-溴-芐氧羰基用于保護(hù)Tyr，對(duì)-甲苯磺?；蛳趸糜诒Ｗo(hù)Arg和Har，2-氯芐氧羰基或芴基甲氧羰基用于保護(hù)Lys和Orn，芐氧甲基用于保護(hù)His，以及環(huán)己基或芴基甲基用于保護(hù)Asp和Glu。Asn和Gln側(cè)鏈不需保護(hù)。
3.使氨基酸殘基逐步偶聯(lián)于多聚體支持物可以在多種多聚體支持物即MBHA，Merrifield，PAM或Wang樹脂上合成這種hGH-RH拮抗性肽。當(dāng)N-α-Boc保護(hù)的氨基酸被用于合成時(shí)，優(yōu)選的樹脂是MBHA。在此情況下，當(dāng)從此支持相斷開時(shí)可獲得具有酰胺化C-末端的肽。
首先將此C-末端氨基酸附著于被中和的MBHA樹脂，然后進(jìn)行隨后的氨基酸偶聯(lián)。以相對(duì)于樹脂-結(jié)合的自由氨基殘基大約3倍克分子量的過(guò)剩量偶聯(lián)每種被保護(hù)的氨基酸，可在介質(zhì)如DMFCH2Cl2(1∶1)中，或者單獨(dú)在DMF或CH2Cl2中進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。選擇適合的偶聯(lián)劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。特別適合作為偶聯(lián)劑的是N，N′-二異丙基碳化二亞胺(DIC)，或者是與HOBt組合的HBTU。在合成的每個(gè)階段，優(yōu)選地可借助于茚三酮反應(yīng)監(jiān)測(cè)偶聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果。在發(fā)生不完全偶聯(lián)的情況下，重復(fù)此偶聯(lián)步驟，或者用Ac2O/DCM乙酰化樹脂-結(jié)合的未反應(yīng)的氨基殘基，然后除去α-氨基保護(hù)基。
以同前面偶聯(lián)步驟相同的方式對(duì)肽的N-末端作最后的?；?，不同之處是用適當(dāng)?shù)聂人岫皇前被帷?br> 4.使肽與多聚體支持物分離合成完成之后使肽與支持相分離。通過(guò)用試劑如液體氟化氫處理可使肽與樹脂分離，同時(shí)還斷開其余所有的側(cè)鏈保護(hù)基。
適合的方法是，用間甲酚和無(wú)水氟化氫組成的混合物處理干燥的和被保護(hù)的肽-樹脂，每克肽-樹脂用1.0ml間甲酚和10ml無(wú)水氟化氫在0℃處理60分鐘，使肽與樹脂斷開并且分離所有的側(cè)鏈保護(hù)基。在氮?dú)饬骱驼婵諚l件下除去氟化氫之后，用乙醚沉淀游離的肽，過(guò)濾，用乙醚和乙酸乙酯洗，用50％乙酸提取并冷凍干燥。
5.純化可應(yīng)用肽化學(xué)領(lǐng)域熟知的程序純化此粗制肽。例如，可在MacRabbit HPLC系統(tǒng)(Rainin儀器公司，Woburn.MA)上進(jìn)行純化，此系統(tǒng)帶有Knauer UV光度檢測(cè)器和Kipp及Zonen BD40記錄儀，使用Vydac 218TP5010反相柱(10×250mm，裝填300孔徑，5μm顆粒尺寸的C18硅膠)(Separations集團(tuán)公司，Hesperia，CA)。用由(A)0.1％TFA水溶液和(B)在70％MeCN水溶液中配制的0.1％TFA組成的溶劑系統(tǒng)，按線性梯度方式(例如在120分鐘內(nèi)30-55％B)對(duì)柱進(jìn)行洗脫。在220nm監(jiān)測(cè)洗出液，借助于應(yīng)用Hewlett-Packard型HP-1090液相層析的分析HPLC對(duì)組分進(jìn)行檢測(cè)，并合并獲得最高的純度。以由上述的(A)和(B)組成的溶劑系統(tǒng)，應(yīng)用等度洗脫在Vydac 218TP52反相柱(2×250mm，C18，300，5μm)上實(shí)施分析HPLC。在220和280nm監(jiān)測(cè)洗脫峰。通過(guò)分析HPLC可斷定此肽基本上是純的(＞95％)。還可通過(guò)氨基酸分析證實(shí)預(yù)期的氨基酸組成。D.藥物組合物可將本發(fā)明的肽以可藥用的無(wú)毒性鹽的形式給藥，例如以酸式加成鹽的形式。作為這種酸式加成鹽的例證有如下多種鹽氫氯化物、氫溴化物、硫酸鹽、磷酸鹽、富馬酸鹽、葡糖酸鹽、單寧酸鹽、馬來(lái)酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、苯甲酸鹽、琥珀酸鹽、藻酸鹽、雙羥萘酸鹽、蘋果酸鹽、抗壞血酸鹽和酒石酸鹽等。特別優(yōu)選的拮抗劑是低溶解度的鹽，例如Pamoate鹽等。這些鹽表現(xiàn)出較長(zhǎng)的活性持續(xù)時(shí)間。
本發(fā)明的化合物適合對(duì)受試的人或動(dòng)物給藥，通過(guò)皮下注射，肌肉注射或靜脈注射；鼻內(nèi)給藥或通過(guò)肺吸入，或者由可生物降解的適合多聚體(如D，L-丙交酯-共乙交酯)制成的儲(chǔ)囊形式(例如微膠囊，微?；驁A柱棒樣植入物)，前二種儲(chǔ)囊方式是優(yōu)選的。其它等效的給藥方式也屬于本發(fā)明的范疇，即連續(xù)滴注，depot注射，輸注泵給藥和延遲釋放的方式如微膠囊等?？稍谌魏我环N生物學(xué)允許的注射載體中給藥，生理鹽水是可接受的，雖然還可以使用本領(lǐng)域已知的其它載體。
這種肽優(yōu)選地是通過(guò)注射給藥，隨同藥劑學(xué)允許的載體如等滲鹽水作肌內(nèi)注射，皮下注射或靜脈內(nèi)注射。另外，這種肽還可用適當(dāng)?shù)妮d體作為鼻內(nèi)噴霧劑給藥或通過(guò)肺內(nèi)吸入給藥。一種適合的給藥途徑是儲(chǔ)囊形式(depot form)，是由生物可降解的適合多聚體如聚D，L-丙交酯-共乙交酯制備成含有分散的拮抗性化合物的微膠囊，微?；驁A柱形植入物。
所需肽的劑量取決于給藥方式和預(yù)期的結(jié)果。一般來(lái)說(shuō)其劑量范圍是每天每公斤體重1-100μg。E.GH-RH拮抗劑的治療用途hGH-RH拮抗劑可用于治療由過(guò)量的生長(zhǎng)激素引起的疾病，例如肢端巨大癥，表現(xiàn)為表面和肢端骨的異常增長(zhǎng)。此GH-RH拮抗劑還可以用于治療糖尿病患者的腎病(是糖尿病患者失明的主要原因)和糖尿病患者的視網(wǎng)膜病，認(rèn)為其中是由于GH分別引起了眼和腎的損傷。
這種hGH-RH拮抗劑被設(shè)計(jì)成能阻斷GH-RH的結(jié)合，因此阻斷GH-RH的作用，GH-RH刺激GH的分泌，GH又刺激產(chǎn)生IGF-I。GH-RH拮抗劑可被單獨(dú)給藥，或者與生長(zhǎng)激素釋放抑制因子相似物一同給藥，后者是一種可更有效地抑制IGF-I水平的組合形式。給予GH-RH拮抗劑而不是生長(zhǎng)激素釋放抑制因子是有利的，因?yàn)镚H-RH拮抗劑可能被用在其靶標(biāo)位點(diǎn)沒有生長(zhǎng)激素釋放抑制因子受體的部位。
但是，GH-RH拮抗劑的主要應(yīng)用是在癌癥范圍內(nèi)。這是基于如下的考慮GH-RH拮抗劑是被設(shè)計(jì)成能阻斷GH-RH的結(jié)合，因此阻斷GH-RH的作用，GH-RH刺激GH的分泌，GH又刺激產(chǎn)生胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I)，也被稱為促生長(zhǎng)因子-C。已充分地證實(shí)IGF-I(促生長(zhǎng)因子-C)與乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、骨腫瘤和其它一些惡性腫瘤有關(guān)，并且生長(zhǎng)激素釋放抑制因子相似物單獨(dú)不能充分地抑制GH和IGF-I的水平。為了更好地抑制腫瘤生長(zhǎng)需要完全抑制IGF-I的水平或分泌。多種腫瘤自體分泌產(chǎn)生IGF-I也可能是在GH-RH的控制之下，因此可被GH-RH拮抗劑抑制。GH-RH拮抗劑還可抑制IGF-I的產(chǎn)生。GH-RH在腫瘤學(xué)(癌癥)領(lǐng)域內(nèi)應(yīng)用的更精確的理論基礎(chǔ)是在人原發(fā)性乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、腦癌、胰腺癌以及在腎細(xì)胞癌癥中都存在對(duì)IGF-I的受體。
這些腫瘤中IGF-I受體的存在看來(lái)與這些癌癥的惡性轉(zhuǎn)移的增殖有關(guān)。對(duì)于多種人類癌癥，IGF-I可起內(nèi)分泌、旁路分泌或自體分泌生長(zhǎng)因子的作用，也就是說(shuō)，這些腫瘤的生長(zhǎng)取決于IGF-I。GH-RH拮抗劑通過(guò)抑制GH分泌而減少IGF-I的產(chǎn)生。因?yàn)镮GF-l刺激多種腫瘤(癌)的生長(zhǎng)，所以降低血液循環(huán)中IGF-I的水平將導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)的抑制。GH-RH拮抗劑還可能降低腫瘤旁路分泌或自體分泌產(chǎn)生IGF-I，這也應(yīng)該導(dǎo)致癌腫增殖的抑制。這些觀點(diǎn)符合臨床腫瘤學(xué)和現(xiàn)代概念。GH-RH拮抗劑可單獨(dú)給藥或與生長(zhǎng)激素釋放抑制因子相似物一同給藥，這種組合將導(dǎo)致對(duì)IGF-I水平更完全的抑制，更完全地降低組織中的IGF-I水平，例如排除人骨肉瘤中的，以及乳癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和非-小細(xì)胞肺癌(非-SCLC)中的IGF-I。
GH-RH拮抗劑優(yōu)于生長(zhǎng)激素釋放抑制因子相似物是基于如下事實(shí)GH-RH拮抗劑可用于抑制沒有生長(zhǎng)激素釋放抑制因子受體的腫瘤，例如人骨原性肉瘤。
已表明GH-RH的拮抗性相似物在體內(nèi)可抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)。部分地是通過(guò)抑制GHRH-GH-IGF-I軸心來(lái)行使這種作用。盡管如此，IGF-II對(duì)增殖的自體分泌/旁路分泌控制在許多腫瘤也是主要的因素。干擾這種自體分泌性生長(zhǎng)-刺激途徑提供了一種控制腫瘤的方法。如通過(guò)比色測(cè)定和[3H]-胸苷摻入試驗(yàn)所顯示的，在體外GH-RH的拮抗性相似物MZ-4-71{[Ibu0，Tyr1，D-Arg2，Abu15，Nle27]hGH-RH(1-28)Agm}和MZ-5-156{[PhAc0，D-Arg2，Abu15，Nle27]hGH-RH(1-28)Agm}顯著地抑制了乳腺癌(MDA-MB-468，ZR-75-1)、前列腺癌(PC-3和DU-145)和胰腺癌(MiaPaCa-2，SW-1990和Capan-2)細(xì)胞系增殖的速度，降低了這些細(xì)胞中IGF-II mRNA的表達(dá)和lGF-II分泌進(jìn)入培養(yǎng)基的濃度。同樣這二種GH-RH拮抗劑在體內(nèi)對(duì)前列腺腫瘤(PC-3，DU-145)，腎臟腺癌(Caki-1)和非-小細(xì)胞肺癌(H157)也產(chǎn)生了類似的結(jié)果(抑制增殖和減少IGF-II產(chǎn)生)。這些發(fā)現(xiàn)提示，GH-RH和拮抗性相似物不但可以通過(guò)抑制GHRH-GH-IGF-I軸心，而且可以通過(guò)減少某些腫瘤細(xì)胞中IGF-II的產(chǎn)生從而中斷它的自體分泌調(diào)節(jié)途徑來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)。
將結(jié)合下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行論述，提出這些實(shí)施例僅僅是為了說(shuō)明的目的。在這些實(shí)施例中，所使用的都是被保護(hù)的L-構(gòu)型旋光活性氨基酸，除非另有特別注明。
下面的實(shí)施例提供了通過(guò)固相技術(shù)合成這種新型GH-RH拮抗劑的適當(dāng)方法。
實(shí)施例IPhAc0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2(肽1){[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2}應(yīng)用手工操縱的固相肽合成裝置，以逐步進(jìn)行的方式實(shí)施此肽的合成。簡(jiǎn)單地說(shuō)，按照表1中所述的方案以CH2Cl2配制的5％DIEA中和對(duì)-甲基二苯甲基胺(MBHA)樹脂(Bachem，California)(720mg，0.50mmole)并洗滌。在手工操縱的固相肽合成儀中，將DMF-CH2Cl2(1∶1)配制的Boc-Har(NO2)-OH(500mg，1.5mmole)溶液與中和的樹脂和DIC(235μl，1.5mmole)一起震搖1小時(shí)。通過(guò)陰性茚三酮試驗(yàn)證明偶聯(lián)反應(yīng)完成之后，以CH2Cl2配制的50％TFA去保護(hù)基，并用CH2Cl2配制的5％DIEA中和，通過(guò)在樹脂上按所指明的順序偶聯(lián)下面的被保護(hù)氨基酸以便獲得所需的肽序列，逐步構(gòu)成了此肽鏈Boc-D-Arg(Tos)-OH，Boc-Nle-OH，Boc-Ile-OH，Boc-Asp(OcHx)-OH，Boc-Gln-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Lys(2CIZ)-OH，Boc-Arg(Tos)-OH，Boc-Ala-OH，Boc-Ser(Bzl)-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Gln-OH，Boc-Abu-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Val-OH，Boc-Lys(2CIZ)-OH，Boc-Arg(Tos)-OH，Boc-Tyr(2Brz)-OH，Boc-Arg(Tos)-OH，Boc-Asn-OH，Boc-Thr(Bzl)-OH，Boc-Phe(pCl)-OH，Boc-Ile-OH，Boc-Ala-OH，Boc-Asp(OcHx)-OH，Boc-D-Arg(Tos)-OH，Boc-Tyr(2BrZ)-OH 。
上面按照普遍接受的慣例提供了這些被保護(hù)的氨基酸殘基(通常也可從Bachem公司購(gòu)得)。對(duì)于特定氨基酸的側(cè)鏈功能基的適當(dāng)保護(hù)基顯示在圓括弧中。上面結(jié)構(gòu)式中的OH基表明每個(gè)殘基的羧基末端是自由的。
除了以它們預(yù)先形成的HOBt酯偶聯(lián)的Boc-Asn-OH和Boc-Gln-OH之外，其余被保護(hù)的氨基酸(各1.5mmole)都是以DIC(235μl，1.5mmole)偶聯(lián)。在從Tyr1除去N″-Boc保護(hù)基之后，用DIC(313μl，2mmole)，以苯乙酸(PhAc)(272mg，2mmole)?；穗?。
為了使此肽從樹脂上斷開并使它去保護(hù)基，在0℃將干燥的肽樹脂(2.18g)與2ml間-甲酚和20ml氟化氫(HF)一起攪拌1小時(shí)。在真空下蒸發(fā)HF之后，用無(wú)水二乙醚和乙酸乙酯洗此殘留物。將被斷開和去保護(hù)的肽溶解于50％乙酸中，借助于過(guò)濾使其與樹脂分離。用水稀釋并冷凍干燥后得到1.51g粗制產(chǎn)品。
通過(guò)分析性HPLC審核此粗制肽應(yīng)用Hewlett Packed HP-1090液相色譜儀，以Vydac 218TP52反相柱(2×250mm，裝填C18硅膠，硅膠孔徑300，顆粒大小5μm)(The Separations集團(tuán)公司，Hesperia，CA)進(jìn)行層析，并用由(A)0.1％TFA水溶液和(B)在70％MeCN水溶液中配制的0.1％TFA組成的溶劑系統(tǒng)作線性梯度洗脫(例如40-70％B)。將500mg粗制肽溶解于AcOH/H2O中，攪拌、過(guò)濾后施加于Beckman Vltraprep ODS柱(21.1×150mm，裝填C18硅膠，此硅膠孔徑300，顆粒大小10μm)上。用上述的溶劑系統(tǒng)以線性梯度方式(例如30-55％B，120分鐘)洗脫此柱，流速6ml/分鐘。在220nm監(jiān)測(cè)洗出液，通過(guò)分析性HPLC對(duì)組分進(jìn)行檢測(cè)。合并純度高于95％的組分，冷凍干燥獲得98mg結(jié)晶。此分析性HPLC是在上述的Vydac C18反相柱上進(jìn)行，用上述的溶劑系統(tǒng)作等度洗脫，流速0.2ml/分鐘。在220和280nm監(jiān)測(cè)洗脫峰。通過(guò)分析性HPLC斷定此產(chǎn)品基本上是純的(＞95％)。借助于電噴射質(zhì)譜法檢查分子量，并通過(guò)氨基酸分析證實(shí)預(yù)期的氨基酸組成。
實(shí)施例IIPhAc0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Har9-Tyr(Me)10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2(肽3){[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Har9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2}應(yīng)用手工操縱的固相肽合成裝置，以逐步進(jìn)行的方式實(shí)施此肽的合成。簡(jiǎn)單地說(shuō)，按照表1中所述的方案以CH2Cl2配制的5％DIEA中和對(duì)-甲基二苯甲基胺(MBHA)樹脂(Bachem，California)(100mg，0.070mmole)并洗滌。在手工操縱的固相肽合成裝置中，將DMF-CH2Cl2(1∶1)配制的Boc-Har(NO2)-OH(83mg，0.25mmole)溶液與中和的樹脂和DIC(44μl，0.275mmole)一起震搖1小時(shí)。通過(guò)陰性茚三酮試驗(yàn)證明偶聯(lián)反應(yīng)完成之后，以CH2Cl2配制的50％TFA去保護(hù)基，并用CH2Cl2配制的5％DIEA中和，通過(guò)在樹脂上按所指明的順序偶聯(lián)下面的被保護(hù)氨基酸以便獲得所需的肽序列，逐步構(gòu)成了此肽鏈Boc-D-Arg(Tos)-OH，Boc-Nle-OH，Boc-Ile-OH，Boc-Asp(OcHx)-OH，Boc-Gln-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Lys(2CIZ)-OH，Boc-Arg(Tos)-OH，Boc-Ala-OH，Boc-Ser(Bzl)-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Gln-OH，Boc-Abu-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Val-OH，Boc-Lys(2CIZ)-OH，Boc-Arg(Tos)-OH，Boc-Tyr(Me)-OH，Boc-Har(NO2)-OH，Boc-Asn-OH，Boc-Thr(Bzl)-OH，Boc-Phe(pCl)-OH，Boc-Ile-OH，Boc-Ala-OH，Boc-Asp(OcHx)-OH，Boc-D-Arg(Tos)-OH，Boc-Tyr(2BrZ)-OH。
上面按照普遍接受的慣例提供這些被保護(hù)的氨基酸殘基(通常也可從Bachem公司購(gòu)得)。對(duì)于特定氨基酸的側(cè)鏈功能基的適當(dāng)保護(hù)基顯示在圓括弧中。上面結(jié)構(gòu)式中的OH基表明每個(gè)殘基的羧基末端是自由的。
除了以它們預(yù)先形成的HOBt酯偶聯(lián)的Boc-Asn-OH和Boc-Gln-OH之外，其余被保護(hù)的氨基酸(各0.25mmolr)都是以DIC(44μl，0.275mmole)偶聯(lián)。在從Tyr1除去N″-Boc保護(hù)基之后，使用DIC(70μl，0.44mmole)以苯乙酸(PhAc)(54mg，0.4mmole)?；穗?。
為了使此肽從樹脂上斷開并使它去保護(hù)基，在0℃將干燥的肽樹脂(206mg)與0.5ml間-甲酚和5ml氟化氫(HF)一起攪拌1小時(shí)。在真空下蒸發(fā)HF之后，用無(wú)水二乙醚和乙酸乙酯洗此殘留物。將此被斷開和去保護(hù)的肽溶解于50％乙酸中，借助于過(guò)濾使其與樹脂分離。用水稀釋并冷凍干燥后得到112mg粗制產(chǎn)品。
通過(guò)分析性HPLC審核此粗制肽應(yīng)用Hewlett Packed HP-1090液相層析儀，以Vydac 218TP52反相柱(2×250mm，裝填孔徑300，顆粒大小5μm的C18硅膠)(The Separations集團(tuán)公司，Hesperia，CA)進(jìn)行層析，并用由(A)0.1％TFA水溶液和(B)在70％MeCN水溶液中配制的0.1％TFA組成的溶劑系統(tǒng)作線性梯度洗脫(例如40-70％B)。將80mg粗制肽溶解于AcOH/H2O中，攪拌、過(guò)濾后施加于以C8硅膠裝填的Vydac 218TP5010柱(10×250mm)上。用上述的溶劑系統(tǒng)以線性梯度方式(例如30-55％B，120分鐘)洗脫此柱，流速2ml/分鐘。在220nm監(jiān)測(cè)洗出液，并通過(guò)分析性HPLC對(duì)組分進(jìn)行檢測(cè)。合并純度高于95％的組分，冷凍干燥獲得9.6mg結(jié)晶。此分析性HPLC是在上述Vydac C18反相柱上進(jìn)行，用上述的溶劑系統(tǒng)以0.2ml/分鐘的流速作等度洗脫。在220和280nm監(jiān)測(cè)洗脫峰。通過(guò)分析性HPLC斷定此產(chǎn)品基本上是純的(＞95％)。借助于電噴射質(zhì)譜法檢查分子量并通過(guò)氨基酸分析證實(shí)預(yù)期的氨基酸組成。
以同肽1和肽3相同的方式合成肽2和肽4至肽30，不同的是這些肽還含有其它取代基，將產(chǎn)生下列肽[IndAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽2[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Har9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽4[Nac0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽5[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽6[PhAc0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽7[Nac0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)8，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽8[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽9[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu15，Arg16，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽10[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽11[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，Nle9，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽12[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)0，Nie13，Nle14，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽13[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Nle15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽14[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu15，Nle18，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽15[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽16[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽17[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽18[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Tyr(Me)10，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽19[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，Tyr(Me)9，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽20[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽21[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29[hGH-RH(1-29)NH2肽22[PhAc0，D.Arg2，Phe(pCl)6，D-Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29[hGH-RH(1-29)NH2肽23[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Lys9，Abu16，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽24[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Orn9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽25[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2， 肽26[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Har9，Abu16，Nle27，D-Arg28，Har29[hGH-RH(1-29)NH2肽27[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，D-Lys9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-
29)NH2肽28[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Orn9，Abu16，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH[1-29)NH2肽29[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，Cit9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽30實(shí)施例III生物活性以體外和體內(nèi)測(cè)定法測(cè)定了本發(fā)明的肽，測(cè)定它們抑制hGH-RH(1-29)NH2誘發(fā)的GH釋放的能力。過(guò)冷大鼠垂體系統(tǒng)按照以前描述的一種測(cè)定法(S.Vigh和A.V.Schally，肽5241-347，1984)的修改形式(Z.Rekasi和A.V.Schally，P.N.A.S.902146-2148，1993)對(duì)這些肽相似物進(jìn)行了體外測(cè)定。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，細(xì)胞與多種濃度的肽(3ml)預(yù)溫育9分鐘。溫育后立即加入1nM hGH-RH(1-29)NH2(1ml)作用3分鐘
。為了檢測(cè)此相似物拮抗性作用的持續(xù)時(shí)間，在30、60、90和120分鐘后加入1nM hGH-RH(1-29)NH2，作用3分鐘[30、60、90、120分鐘的應(yīng)答]。估算GH應(yīng)答的凈整數(shù)值。將GH應(yīng)答與1nM hGH-RH(1-29)NH2誘發(fā)的最初GH應(yīng)答相比較，并以最初應(yīng)答的百分?jǐn)?shù)表示。將新拮抗劑的作用與“標(biāo)準(zhǔn)拮抗劑”[Ac-Tyr1，D-Arg2]hGH-RH(1-29)NH2的作用相比較。生長(zhǎng)激素放射免疫測(cè)定法采用由National Hormone and Pituitary Program，Baltimore，Maryland供給的材料，通過(guò)雙抗體放射免疫測(cè)定法測(cè)定了等分量未稀釋的和稀釋的過(guò)冷樣品(Superfusion Samples)中大鼠GH的含量。用我們研究所建立的計(jì)算機(jī)程序分析此RIA結(jié)果(V.Csernus和A.V.Schally，神經(jīng)分泌研究方法，Harwood(Greenstein，B.D.編著，London，pp 71-109，1991。特此引入作為參考)。每次檢測(cè)間的差異小于15％，一次檢測(cè)內(nèi)的差異小于10％。GH-RH結(jié)合測(cè)定法為了測(cè)定GH-RH拮抗劑的結(jié)合特征建立了靈敏的放射受體結(jié)合測(cè)定法(G.Halmos，A.V.Schall等，受體3，87-97(1993))，特此引入作為參考。此測(cè)定法是基于標(biāo)記的[His1，Nle27] hGH-RH(1-32)NH2與大鼠垂體前葉膜勻漿的結(jié)合。通過(guò)氯胺-T法(F.C.Greenwood等，生物化學(xué)89114-123，1963，特此引入作為參考)制備[His1，Nle27]hGH-RH(1-32)NH2的碘化衍生物。用來(lái)自雄性Sprague-Dawley大鼠(250-300g)的垂體制備粗制膜。為了進(jìn)行飽和結(jié)合分析，在存在和不存在過(guò)量未標(biāo)記肽(1μM)時(shí)，將膜勻漿與0.005-0.35 nM范圍內(nèi)的至少6個(gè)濃度的[His1，125I-Tyr10，Nle27]hGH-RH(1-32)NH2共溫育。
在γ-計(jì)數(shù)器內(nèi)對(duì)沉淀作放射活性計(jì)數(shù)。以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)定待測(cè)拮抗性肽對(duì)大鼠垂體GH-RH受體的親和性。以Ki(抑制劑-受體復(fù)合物解離常數(shù))評(píng)估最終的結(jié)合親和性，并可借助于Munson和Rodbard的Ligand PC和McPherson計(jì)算機(jī)程序(P.J.Munson和D.Rodbard，分析生物化學(xué)，107，220-239，1980)測(cè)定。與標(biāo)準(zhǔn)拮抗劑[Ac-Tyr1，D-Arg2]hGH-RH(1-29)NH2相比較的相對(duì)親和性被計(jì)算為所測(cè)定GH-RH拮抗劑的Ki對(duì)標(biāo)準(zhǔn)拮抗劑的Ki之比。體內(nèi)試驗(yàn)對(duì)Sprague-Dawley雄性幼大鼠(200-250g)試驗(yàn)了這些相似物的GH-RH拮抗作用。每次實(shí)驗(yàn)用5組動(dòng)物，每組7只動(dòng)物。將這些化合物(80μg/kg)和GH-RH(1-29)NH2(3μg/kg)溶解于5.5％甘露醇，在戊巴比妥鈉麻醉下對(duì)大鼠頸靜脈作靜脈內(nèi)注射。根據(jù)如下方案，不同組之間給予拮抗劑和給予GH-RH之間的時(shí)間間隔不同。第一組動(dòng)物在給予拮抗劑之后5分鐘接受GH-RH注射；對(duì)于第二、第三和第四組動(dòng)物，注射拮抗劑和注射GH-RH之間的時(shí)間間隔分別是15、30和60分鐘。對(duì)照組先只注射溶劑不注射拮抗劑，5分鐘之后注射GH-RH。
給予拮抗劑之前(“血液0”)，以及注射GH-RH之后5分鐘(“血液1”)各采血樣0.4ml用于GH RIA測(cè)定。每組中的GH應(yīng)答被計(jì)算為rGH＝(GH血液1/GH血液0)，以個(gè)體差異的平均數(shù)±S.E.M表示。每個(gè)處理組中對(duì)GH應(yīng)答的相對(duì)抑制作用被計(jì)算為100×(rGH處理組-1)/(rGH對(duì)照組-1)。體外試驗(yàn)結(jié)果對(duì)過(guò)冷的大鼠垂體系統(tǒng)測(cè)定的拮抗活性和結(jié)合測(cè)定的體外試驗(yàn)結(jié)果分別被概括在表II和表III中。從這些數(shù)據(jù)可以看到，當(dāng)與標(biāo)準(zhǔn)拮抗劑相比較，分子中存在取代基可導(dǎo)致巨大地增加體外試驗(yàn)中的受體結(jié)合以及對(duì)GH釋放的抑制作用。體外試驗(yàn)中最強(qiáng)有力的拮抗劑肽1，在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)條件下導(dǎo)致對(duì)GH-RH誘發(fā)的GH釋放的完全抑制達(dá)90分鐘。在暴露于此相似物之后120分鐘檢測(cè)到GH-RH響應(yīng)性恢復(fù)的第一個(gè)信號(hào)。
表II在過(guò)冷的大鼠垂體系統(tǒng)中對(duì)GH釋放的抑制作用拮抗劑 劑量對(duì)GH釋放的抑制作用(％)(nM) 0分鐘 30分鐘 60分鐘 90分鐘 120分鐘標(biāo)準(zhǔn)拮抗劑100 62.1 2.519肽1 30100100100100 94肽2 30100100100100 91肽3 3085 98 91 92 87肽4 3083 86 80 79 68肽5 3079 77 59 58 50肽6 3093 93 97 95 90肽7 3097 92 82 77 65肽8 3010010098 97 90肽9 3091 87 79 72 59肽103075 69 46 24 22肽113096 89 80 56 42肽123068 75 48 52 52肽163065 87 83 56 65肽193058 47 59 23 39
表IIIhGH-RH拮抗劑的Ki值和相對(duì)親和性(R.A)肽 Ki(nM) R.A.標(biāo)準(zhǔn)拮抗劑 2.94 1肽10.00467肽20.04664肽30.06843肽40.08734肽50.03682肽90.05851肽10 0.10727肽11 0.07141肽12 0.07042肽16 0.07042體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表IV顯示對(duì)于用GH-RH拮抗劑預(yù)先處理的大鼠其血清GH應(yīng)答和它們的相對(duì)抑制作用。所有被測(cè)定的相似物(肽1、肽2、肽3、肽4、肽8、肽9、肽11和肽16)對(duì)由hGH-RH(1-29)NH2激發(fā)的GH釋放可產(chǎn)生很強(qiáng)的和長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)的抑制作用。在短期肽1和肽2是最強(qiáng)有力的，當(dāng)在給予hGH-RH(1-29)NH2之前5分鐘給予肽1和肽2抑制GH應(yīng)答達(dá)95％和91％。這二個(gè)肽的作用持續(xù)至少30分鐘。另一方面，在短期作用稍微弱點(diǎn)的肽11和肽3具有非常長(zhǎng)時(shí)間的作用它們的作用持續(xù)至少60分鐘。
表IV在給予hGH-RH(1-29)NH2之前不同的時(shí)間間隔用GH-RH拮抗劑預(yù)處理的大鼠血清GH的應(yīng)答和對(duì)GH應(yīng)答的相對(duì)抑制作用拮抗劑 時(shí)間間隔 GH應(yīng)答相對(duì)抑制作用(分鐘)平均數(shù)±S.E.M ％肽1 5 1.13±0.139515 1.87±0.136830 1.97±0.166460 3.89±0.65-8對(duì)照 3.68±0.78 0肽2 5 1.40±0.299115 3.45±0.134530 3.64±0.714160 5.41±1.35 2對(duì)照 5.47±0.97 0肽3 5 3.01±0.416815 3.63±0.806130 4.89±0.954160 5.36±0.6334對(duì)照 7.65±0.66 0肽4 5 3.08±0.588215 7.73±1.12433012.00±2.54 76011.88±0.90 8對(duì)照12.82±1.38 0肽8 5 2.3±0.3 7415 3.6±0.4 4630 5.5±0.6 860 5.8±0.7 1對(duì)照 5.8±0.5 0肽95 2.75±0.757515 3.85±0.505930 3.34±0.306760 7.32±1.1610肽11 5 5.15±1.11841513.64±1.41503016.04±4.36406016.61±6.0238對(duì)照26.17±3.92 0肽16 5 2.89±0.657715 3.44±0.627030 5.24±1.364860 9.19±1.89 0對(duì)照 9.13±1.69 0實(shí)施例IV腫瘤學(xué)試驗(yàn)對(duì)多種癌癥模型試驗(yàn)了本發(fā)明肽的抗腫瘤活性。將這些新型的抗腫瘤作用同以前的相似物(MZ-4-71和MZ-5-156，屬于美國(guó)專利5,550,212和美國(guó)專利申請(qǐng)08/642,472)進(jìn)行比較。GH-RH拮抗劑對(duì)MXT小鼠乳腺腫瘤的作用對(duì)雌性BDF小鼠皮下移植雌激素非依賴性MXT腫瘤。移植后的第一天將小鼠分組，每組10只動(dòng)物，并開始治療。第1、2、3和4組小鼠以每天20μg的劑量接受不同GH-RH拮抗劑的皮下注射，每日一次持續(xù)18天。第5和6組小鼠以每日20μg肽的劑量通過(guò)Alzet滲透泵釋放給予這二種肽。定期測(cè)量腫瘤，計(jì)算腫瘤的體積。在第18天處死這些小鼠，測(cè)定腫瘤的重量。結(jié)果肽1和肽3對(duì)MXT小鼠乳腺癌具有相似的強(qiáng)抑制作用。以MZ-5-156治療也導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)的顯著抑制，但是它的作用比肽1和肽3的作用弱(見表V和

圖1)。
表V用GH-RH拮抗劑對(duì)MXT小鼠乳腺腫瘤的治療作用分組 腫瘤體積(mm3) 腫瘤重量殘活小鼠第14天第18天 (mg) 的數(shù)目1.對(duì)照 4051±1007 7040±646 7269±29252.MZ-5-156 2717±773 5368±408*4885±480*43.肽1每日注射2924±6544373±381**6964±67664.肽3每日注射1902±349**3465±607**5266±90685.肽1泵 1329±327**3403±584**4810±645*76.肽3泵 1688±220**4272±295**5939±4538*p＜0.05**p＜0.01GH-RH拮抗劑對(duì)裸小鼠中MDA-MB-468人乳腺癌異種移植物的作用將帶有MDA-MB-468激素非依賴性人乳腺癌異種移植物的裸小鼠分成每10只動(dòng)物一組。治療組接受每日一次皮下注射20μg GH-RH拮抗劑。第一組用肽1治療，第二組用MZ-5-156治療作為比較。對(duì)照組注射賦形劑溶劑。治療持續(xù)5周。每周測(cè)量腫瘤一次，計(jì)算腫瘤體積。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死小鼠，測(cè)量腫瘤的重量。結(jié)果二種肽都對(duì)MDA-MB-468異種移植物發(fā)揮了顯著的腫瘤抑制作用。在注射肽1的組，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中4個(gè)腫瘤顯著出持續(xù)的退化。同樣MZ-5-156導(dǎo)致3個(gè)腫瘤退化。治療5周之后，這些癌癥退化成小的疤痕狀組織殘余物。對(duì)這些組織的組織學(xué)檢查揭示出具有廣泛壞死的未分化上皮腫瘤，只有狹窄的活腫瘤組織邊緣線。相反，在對(duì)照動(dòng)物的所有腫瘤都穩(wěn)定地發(fā)展了。在治療組最后的腫瘤體積和重量都顯著減少了(見表VI和圖II)，肽1具有較強(qiáng)的作用。
表VI用GH-RH拮抗劑對(duì)裸小鼠中MDA-MB-468人乳腺癌異種移植物的治療作用分組 腫瘤的最后體積腫瘤重量 退化腫瘤(mm3) (mg) 的數(shù)目對(duì)照 477.5±41.2440.7±37.70肽1 82.4±29.1**64.0±28.7**4MZ-5-156 104.4±32.2**77.7±31.7**3*p＜0.05**p＜0.01GH-RH拮抗劑對(duì)裸小鼠中HT-29人結(jié)腸癌異種移植物的作用將HT-29人結(jié)腸癌皮下注射移植進(jìn)入雄性裸小鼠。移植后19天將小鼠分組，每組10只動(dòng)物，并開始治療。小鼠以每天20μg的劑量每天接受一次不同GH-RH拮抗劑皮下注射，持續(xù)6周。定時(shí)測(cè)量腫瘤，計(jì)算腫瘤的體積。實(shí)驗(yàn)最后處死小鼠，測(cè)量腫瘤的重量。結(jié)果肽1和MZ-5-156對(duì)HT-29人結(jié)腸癌具有同等強(qiáng)度的抑制作用。用肽9治療導(dǎo)致了較小但仍有顯著性的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用。肽11和MZ-4-71只具有很小的非顯著性作用。(結(jié)果概括在表VII和圖III中)。
表VII用GH-RH拮抗劑對(duì)裸小鼠中HT-29人結(jié)腸癌異種移植物的治療作用分組 腫瘤最后的體積(mm3) 腫瘤重量(mg)對(duì)照2117±751 2364±835MZ-4-71 1953±400 2189±458MZ-5-156 908±195*1012±174*肽111663±610 1849±681肽9 1194±506*1383±576*肽1 890±322*1354±480**p＜0.05GH-RH拮抗劑肽1對(duì)裸小鼠內(nèi)U87MG人神經(jīng)膠質(zhì)瘤異種移植物的作用以U87MG神經(jīng)膠質(zhì)瘤植入小鼠皮下，當(dāng)腫瘤達(dá)到大約70mm3體積時(shí)將小鼠隨機(jī)分成2個(gè)實(shí)驗(yàn)組。一組用肽1治療，每日皮下注射一次20μg，持續(xù)28天，而另一組作為對(duì)照。結(jié)果與對(duì)照組比較，用肽1治療4周后抑制腫瘤生長(zhǎng)達(dá)77％(見表VIII和圖IV)。
表VIII用GH-RH拮抗劑肽1對(duì)裸小鼠內(nèi)U87MG人神經(jīng)膠質(zhì)瘤異種移植物的治療作用分組腫瘤的最后體積(mm3) 腫瘤重量(g)對(duì)照 3425±7234.7±1.3肽1 817±323**1.4±0.7****p＜0.01GH-RH拮抗劑對(duì)裸小鼠內(nèi)PC-3人前列腺癌異種移植物的作用以3mm3小片PC-3人激素-非依賴性前列腺癌組織皮下植入雄性裸小鼠的腹部二側(cè)。當(dāng)腫瘤達(dá)到大約40-50mm3體積時(shí)將小鼠分成3個(gè)實(shí)驗(yàn)組。第一組和第二組分別用肽3和MZ-5-156治療，每日皮下注射一次20μg，持續(xù)21天，而第三組用作對(duì)照組。每隔一周測(cè)量腫瘤的體積，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)量腫瘤重量。結(jié)果二種GH-RH拮抗劑都抑制PC-3腫瘤生長(zhǎng)(見表IX和圖V)。肽3具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用(抑制腫瘤體積65％，腫瘤重量62)，MZ-5-156較弱(分別為52％和46％)。
表IX用GH-RH拮抗劑對(duì)裸小鼠內(nèi)PC-3人前列腺癌異種移植物的治療作用分組腫瘤最后體積(mm3) 腫瘤的重量(mg)對(duì)照 307.9±64.5 191.8±42.6肽3 107.9±12.5*73.7±11.9*MZ-5-156 148.9±41 104.3±27.2*p＜0.0權(quán)利要求
1.一種選自具有如下結(jié)構(gòu)式的肽及其可藥用的鹽X-R1-R2-Asp-Ala-R5-R6-Thr-R8-R9-R10-Arg-R12-R13-R14-R15-R16-Leu-R18-R19-Arg-R21-R22-Leu-Gln-Asp-Ile-R27-R28-R29-NH2其中X是PhAc、IndAc、Ibu、Nac、1-或2-NPr、或者Fpr，R1是Tyr或His，R2是D-Arg或D-Cit，R5是Ile或Val，R6是Phe、Nal或Phe(Y)、在此Y＝F、Cl、Br，R8是Asn、Gln、Ser、Thr、Ala、D-Asn、D-Gln、D-Ser、D-Thr、Abu、D-Abu或Aib，R9是Arg、Har、Lys、Orn、D-Arg、D-Har、D-Lys、D-Orn、Cit、Nle、Tyr(Me)、Ser、Ala或Aib，R10是Tyr或Phe(Y)，在此Y＝H、F、Cl、Br或OCH3，R12是Lys、D-Lys或Orn，R13是Val或Nle，R14是Leu或Nle，R15是Gly、Ala、Abu、Nle或Gln，R16是Gln或Arg，R18是Ser或Nle，R19是Ala或Abu，R21是Lys或Orn，R22是Leu、Ala或Aib，R27是Met、Leu、Nle、Abu或D-Arg，R28是Arg、D-Arg、Ser、Asn、Asp、Ala或Abu，R29是Arg、D-Arg、Har或D-Har。
2.權(quán)利要求1的化合物，是選自下列的肽[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽1[IndAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽2[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Har9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽3[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽6[PhAc0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽7[Nac0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽8。
3.權(quán)利要求1的化合物，具有如下結(jié)構(gòu)式[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽1。
4.權(quán)利要求1的化合物，具有如下結(jié)構(gòu)式[IndAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽2。
5.權(quán)利要求1的化合物，具有如下結(jié)構(gòu)式[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Har9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽3。
6.權(quán)利要求1的化合物，具有如下結(jié)構(gòu)式[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽6。
7.權(quán)利要求1的化合物，具有如下結(jié)構(gòu)式[PhAc0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽7。
8.權(quán)利要求1的化合物，具有如下結(jié)構(gòu)式[Nac0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽8。
9.一種對(duì)需要抑制過(guò)量GH水平的病人抑制過(guò)量GH水平的方法，包括給予該病人有效劑量權(quán)利要求1的化合物。
10.一種治療患有癌癥病人的方法，其癌癥攜帶有對(duì)IGF-1或-II的受體，此方法包括給予該病人有效劑量權(quán)利要求1的化合物。
11.一種抑制腫瘤(癌)中IGF-II水平和這種腫瘤中IGF-IImRNA表達(dá)的方法，此方法包括給予該病人有效劑量權(quán)利要求1的化合物。
全文摘要
在此提供了一系列新型的hGH－RH(1－29)NH
文檔編號(hào)C07K14/60GK1328570SQ99813735
公開日2001年12月26日 申請(qǐng)日期1999年11月23日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月25日
發(fā)明者A·V·沙利, J·瓦格加, M·扎蘭蒂 申請(qǐng)人:圖蘭恩教育基金管理人