專利名稱：：用作蛋白激酶抑制劑的吡唑藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及吡唑類化合物，以及新發(fā)現(xiàn)的吡唑類化合物作為蛋白激酶尤其是酪氨酸激酶抑制劑、作為激酶及其底物的分析中的試劑的用途、以及作為抑制依賴激酶的過程(例如細(xì)胞生長)的藥物組合物。背景酪氨酸特異性蛋白激酶(酪氨酸激酶)代表一族催化三磷酸腺苷的末端磷酸基向蛋白底物上的酪氨酸殘基轉(zhuǎn)移的酶。該類型中的第一組成員是與負(fù)責(zé)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的病毒基因(術(shù)語為癌基因)有關(guān)的酪氨酸激酶(即pp60v-src和pp98v-fps)。后來發(fā)現(xiàn)對于這些病毒基因的產(chǎn)物有正常的細(xì)胞對應(yīng)物(即pp60v-src和pp98v-fps)。第三類認(rèn)識的酪氨酸激酶其術(shù)語為生長因子受體，包括胰島素、表皮生長因子(EGF)、血小板源生長因子(PDGF)、纖維細(xì)胞生長因子(FGF)和p185HER-2受體。據(jù)信所有這些酪氨酸激酶均是通過底物磷酸化的方式在多種細(xì)胞功能的信號傳導(dǎo)中起重要作用。雖然信號傳導(dǎo)的確切機制尚未闡明，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶是細(xì)胞增殖、癌發(fā)生和細(xì)胞分化過程中的重要參與因子。細(xì)胞復(fù)制可通過細(xì)胞接觸一種或多種生長因子(例如FGF、EGF、和PDGF)而引發(fā)。這些生長因子特異地與其相應(yīng)的受體相互作用，所述受體包括細(xì)胞外部分、跨膜部分和胞漿部分，其中的胞漿部分具有酪氨酸激酶的酶活性。據(jù)信當(dāng)生長因子與其受體在細(xì)胞表面的細(xì)胞外部分結(jié)合時引發(fā)細(xì)胞增殖。這種生長因子和受體的結(jié)合引起受體的二聚作用，從而導(dǎo)致受體的自身磷酸化、受體酶活性的增加和底物磷酸化。最近，發(fā)現(xiàn)了一條從細(xì)胞表面向胞核傳遞信號的共同通路，并發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶生長因子受體利用該通路。該通路涉及生長因子介導(dǎo)的碎片蛋白的激活，引發(fā)蛋白激酶級聯(lián)放大，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，所述轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)與細(xì)胞分化有關(guān)的基因的表達。受體自身磷酸化和細(xì)胞內(nèi)底物的磷酸化是生長因子的信號傳導(dǎo)和細(xì)胞增殖所必需的生化過程。這已通過用點突變(可導(dǎo)致受體生物活性完全丟失)消除多種受體的蛋白酪氨酸激酶活性得到證實，所述受體包括EGF受體(EGFR)、FGF受體(FGFR)和PDGF受體(PDGFR)。而且，可阻斷受體酪氨酸激酶酶活性的蛋白激酶抑制劑例如星形孢菌素，K252a和酸氨酸磷酸酶抑制劑能夠阻止細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)和細(xì)胞增殖。這些研究證實酪氨酸磷酸化通過生長因子受體在信號傳導(dǎo)中的重要作用，并證明抑制酪氨酸激酶活性的化合物可用于調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。許多疾病狀態(tài)以失控的細(xì)胞增殖為特征。這些疾病涉及各種細(xì)胞類型，包括多種疾病，例如癌癥、銀屑病、肺纖維化、腎小球腎炎、動脈粥樣硬化和血管成形術(shù)后再狹窄。酪氨酸激酶抑制劑在這些疾病治療中的用途已在許多體內(nèi)研究中證實。已發(fā)現(xiàn)對EGFR類具有選擇性的酪氨酸激酶抑制劑能阻斷動物體內(nèi)的腫瘤形成，因而顯示出其在人類癌癥、尤其是乳腺癌的治療中直接抑制腫瘤細(xì)胞生長的潛在用途。而且，已發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移及其相關(guān)的血管生成可通過阻止血管內(nèi)皮生長因子受體酪氨酸激酶的激活得到抑制，表明酪氨酸激酶抑制劑可用于阻斷癌發(fā)生過程中出現(xiàn)的不同階段。在腎小球腎炎的試驗?zāi)Ｐ椭?，PDGFR表達增加20倍與腎小球膜細(xì)胞增殖有關(guān)。防止酪氨酸激酶受體激活的PDGF的中和作用可以限制通常發(fā)生的腎變性的數(shù)量。這些研究證明，阻斷PDGFR的酪氨酸激酶抑制劑有可用于治療人類的腎小球腎炎。介入心臟病學(xué)的一個重要的尚未解決的問題是冠狀動脈血管成形術(shù)后再狹窄。在美國目前每年進行的近400000例血管成形術(shù)中，有30-40％由于再狹窄而在第一年內(nèi)失敗。再狹窄的過程涉及粥樣硬化的動脈的再閉合，這在許多情況下是由于生長因子如PDGF和FGF介導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞的增殖造成的。在再狹窄的動物模型中，阻斷PDGF或FGF受體酪氨酸激酶活性激活的抗體可預(yù)防平滑肌細(xì)胞的增殖和新內(nèi)膜的形成。這些研究表明阻斷PDGF或FGF受體功能的酪氨酸激酶抑制劑可能用于治療人的再狹窄。目前，癌癥的化療使用DNA合成抑制劑(如阿霉素、氟尿嘧啶)和破壞細(xì)胞骨架的化合物(長春花堿)。這些化合物由于其抑制活性不僅限于癌細(xì)胞而毒性較高，但其特征性是腫瘤細(xì)胞更易于遭受前述抑制劑的攻擊，因為這些細(xì)胞分裂更快，其DNA的代謝因而更活躍。有幾種類型的癌癥用特定的激素衍生物治療。但這些情況屬于例外，各種癌癥中的大多數(shù)的化療是非特異性的。在20世紀(jì)80年代初，發(fā)現(xiàn)20-30％的癌癥表達特征性的癌基因產(chǎn)物，是生長因子受體或其突變類似物且抑制蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性。PTK活性是受體或其癌基因類似物所固有的，可通過其PTK部分影響細(xì)胞增殖。而且，每個受體(正常的或突變的)都顯示出具有明確的底物特異性的特征性的PTK活性。其中的一個受體是EGFR，其癌基因類似物是V-ERB-B。由于上述關(guān)于生長因子受體的PTK活性的發(fā)展結(jié)果，有人提出用各種能抑制EGF的PTK活性的化學(xué)物質(zhì)治療癌癥。參見，例如日本專利62-39523、62-39558、62-42923和62-42925。例如，前面提及的日本特開昭專利62-39558公開了在有效的PTK抑制劑組合物中作為活性化合物的α-氰基-2，5-二羥基肉桂酰胺。在Gal等，丙二腈類化合物的生物作用的研究.I.取代丙二腈類化合物對小鼠移植腫瘤生長的影響，癌癥研究，12565-72，1952中公開了用作腫瘤生長抑制劑的肉桂基丙二腈和各種亞芐基丙二腈化合物。Yoshida等，日本專利申請?zhí)?9100080記載了據(jù)稱具有抗炎和止痛效果的3-氨基吡唑衍生物。發(fā)明概述如前所述，本發(fā)明的一個目的是提供新的、用作激酶抑制劑的吡唑類化合物的制劑。本發(fā)明另一個目的是為舊的組合物提供其它用途，并提供新的、用作蛋白激酶抑制劑的吡唑類化合物。本發(fā)明的這些及其它的目的已通過提供一種抑制蛋白激酶的方法得到附圖概述通過結(jié)合附圖參考以下詳細(xì)描述可以更好地理解本發(fā)明，所述附圖為本說明書的一部分，其中圖1表示化合物1對HR5-βR細(xì)胞磷酸化的抑制作用。圖2表示化合物1對32D-αR細(xì)胞有絲分裂活性的影響。具體實施方案的描述本發(fā)明涉及取代的吡唑化合物的新用途，這些吡唑化合物中，一些是已知化合物，一些是新化合物。這些吡唑化合物優(yōu)選為3，5-二取代的吡唑或3，4，5-三取代的吡唑?？捎糜诒景l(fā)明的一個優(yōu)選的化合物在吡唑環(huán)的3位有苯基甲酰胺取代基并在5位有苯基取代基。這類化合物中的許多化合物是已知的，但以前并不知道它們具有激酶抑制劑的活性。一般來說，可用于本發(fā)明的化合物具有結(jié)構(gòu)式(I)其中R1是低級烷基、低級烴基、芳基低級烷基、雜芳基低級烷基、5或6元雜環(huán)芳基、多環(huán)芳基或多環(huán)雜芳基；R2是低級烷基、低級烴基、芳基低級烷基、雜芳基低級烷基、5或6元雜環(huán)芳基、低級酰基、5或6元雜環(huán)芳羰基、多環(huán)芳基、多環(huán)芳酰羰、多環(huán)雜芳基或多環(huán)雜芳羰基；R3是H或低級烷基；R5是H、低級烷基、低級烴基、芳基低級烷基、雜芳基低級烷基、5或6元雜芳基、鹵素或氰基；并且R6是H或低級?；?。這些定義中包括彼此獨立地被最多四個R4基團(優(yōu)選不超過三個、更優(yōu)選不超過兩個，位于結(jié)構(gòu)式的三個R基團中的任意一個上)取代(即一個或多個氫原子被取代)的烷基、烴基、芳烷基、雜芳烷基、酰基、雜環(huán)芳基、多環(huán)芳基和多環(huán)雜芳基基團，其中的各R4彼此獨立地代表鹵素、氰基、硝基、低級烷基(簡單地形成另一個烴基)、羥基、烷氧基、羰基、羧基、氨基、烷氨基、二烷氨基、或酰氨基?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，這些化合物以及含有它們的藥物組合物可用于與激酶區(qū)域結(jié)合并抑制激酶的活性。以下將對這些用途進行更詳細(xì)地說明。術(shù)語的定義若無相反指示，以上及整個說明書中所用的下列術(shù)語應(yīng)理解為具有以下意義“烷基”指含有大約1至大約6個碳原子的直鏈或支鏈的飽和的脂肪烴?！暗图壨榛敝负?至大約4個碳原子的直鏈或支鏈的上述烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基。定義的烷基基團中包括鹵代烷基，特別是氟代烷基例如CF3、CH2CF3和CF2CF3?！胺蓟图壨榛焙汀半s芳基低級烷基”指前述的“低級烷基”分別與芳基或雜芳基結(jié)合。術(shù)語“芳基”指未取代或取代的芳環(huán)，被一個、兩個、三個或四個R4取代基取代。優(yōu)選的芳基基團包括苯基、鹵代苯基、低級烷基苯基、萘基、聯(lián)苯基、菲基、并四苯基和芳雜環(huán)。在此所用的術(shù)語“雜芳基”指任何含有一至四個選自氮、氧和硫的雜原子的芳基?！巴檠趸敝竿榛?氧基團，其中的“烷基”如前所定義。優(yōu)選低級烷基基團。該基團的例子包括，甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基和叔丁氧基?！盁N基”指由烴分子脫除其中的一個氫原子所得到的有機基團。烴基包括脂肪烴和芳香烴。脂肪烴可以是飽和或不飽和的，支鏈或直鏈的。苯基、碳環(huán)芳基是優(yōu)選的芳香烴基。“低級烴基”指6個或更少的脂肪烴碳原子或一個苯環(huán)?！磅；敝赣捎袡C酸(例如羧酸或磺酸)通過脫除酸的羥基基團所得到的有機基團。優(yōu)選的?；堑图壨榛人峄鶊F如乙酰基和丙?；?。也優(yōu)選苯甲酰基?！暗图夣；敝?個或更少的脂肪烴碳原子或一個苯環(huán)，但不算將該基團與分子的其它部分相連接的羰基碳。在本說明書的一些制劑中，使用符號“φ”來代表苯環(huán)。一般不用由磺酸生成的化合物，但它們也包括在酰基所指的范圍內(nèi)，在此情況下，基團中除磺?；獾乃胁糠志翘蓟驓?，除非該化合物是另外所定義的取代的?；?。其例子包括苯磺?；！叭〈摹滨；驘N基指其中的一個或多個氫原子被取代基取代的烴基或?；?，使得到的化合物可以在0.01M的濃度下在水中(如需要，可含有最多10％的乙醇以增加溶解度)保持穩(wěn)定1小時(一般在37℃、pH7.4下測量)。優(yōu)選的取代基是鹵素、低級烷基(簡單地生成另一個烴基基團)、羥基、烷氧基、羰基、氨基、烷氨基、二烷氨基或酰氨基。在芳香族烴基和?；斜仍谥咀逯袃?yōu)選的其它基團包括硝基?！胞u素”指鹵原子。優(yōu)選的鹵素包括氯、溴和氟。“雜芳環(huán)”指含有碳原子和一個或多個N、O或S原子和6電子離域共軛π鍵系統(tǒng)的5或6元環(huán)。所述雜芳環(huán)可以在本文所述的任何結(jié)構(gòu)中代替苯環(huán)。優(yōu)選的雜芳環(huán)是呋喃、噻吩、吡咯、吡唑、三唑、咪唑、惡唑、異惡唑、噻唑、異噻唑、吡啶、嘧啶、噠嗪、吡嗪和三嗪；特別優(yōu)選的基團是呋喃、噻吩、吡咯、噻唑和吡啶?！半s環(huán)芳羰基”指與一個羰基連接的雜芳環(huán)。優(yōu)選通過芳環(huán)的碳原子進行連接，例如2-呋喃羰基和2-噻吩羰基?！岸喹h(huán)芳基”和“多環(huán)雜芳基”指多環(huán)系統(tǒng)，這些系統(tǒng)優(yōu)選含有兩個環(huán)。該術(shù)語包括稠環(huán)基團(例如萘基和喹啉基)和非稠環(huán)基團(例如聯(lián)苯基)?！岸喹h(huán)芳羰基”和“多環(huán)雜芳羰基”指與羰基連接的“多環(huán)芳基”和“多環(huán)雜芳基”。優(yōu)選的式(I)化合物的結(jié)構(gòu)一組優(yōu)選的式(I)化合物具有如下取代基R1是低級烷基、低級烴基、或5或6元雜環(huán)芳基；R2是低級烷基、低級烴基、5或6元雜環(huán)芳基、低級酰基、或5或6元雜環(huán)芳香羰基；R3是H或低級烷基；R5是H、低級烷基、鹵素或氰基；并且R6是H或低級?；Ａ硪唤M優(yōu)選的式(I)化合物具有如下取代基R1是低級烴基或5或6元雜環(huán)芳基；R2是低級?；?或6元雜環(huán)芳羰基；R3是H或低級烷基；R5是H；并且R6是H或低級烷羰基。優(yōu)選的化合物包括其中R1是低級烴基或5或6元雜環(huán)芳基、并且被最多四個R4基團選擇性取代的化合物。更優(yōu)選的化合物包括其中R1是碳環(huán)芳基(例如苯基或取代的苯基)或5元雜環(huán)芳基(例如噻吩基)的化合物。最優(yōu)選的R1基團是苯基或取代的苯基。優(yōu)選的化合物包括其中R2是低級?；?或6元雜環(huán)芳羰基、并且被最多四個R4基團選擇性取代的化合物。更優(yōu)選的化合物包括其中R2是低級酰基(例如碳環(huán)芳?；瑑?yōu)選苯甲?；蛉〈谋郊柞；?的化合物。優(yōu)選的取代基包括硝基和氨基。另外優(yōu)選的化合物是其中R2是6元雜環(huán)芳?；?例如煙?；虍悷燉；?的化合物。最優(yōu)選的化合物是其中R2是苯甲酰基(即苯甲?；?或取代的苯甲?；幕衔铩Ｌ貏e優(yōu)選的R2取代基是含有苯甲?；虮还╇娮踊螂娭行匀〈?相對于苯基上的H)、特別是烷基或烷氧基取代基取代的苯甲酰基的基團。優(yōu)選的化合物包括其中R3是H的化合物。優(yōu)選的化合物包括其中R5是H、低級烷基、鹵素或氰基的化合物，所述化合物服從上述有關(guān)取代的限定。更優(yōu)選的化合物包括其中R5是H的化合物。優(yōu)選的化合物包括其中R6是H的化合物。式(I)化合物的示例性結(jié)構(gòu)列于下表中。在本說明書實施例部分詳述的試驗工作中使用化合物1，該化合物為優(yōu)選的化合物，其中R1是苯基，R2是苯甲?；?，R3、R5和R6是H。表1A</tables>在表1A中使用下列縮寫Me-甲基；Et-乙基；nPr-正丙基；ipr-異丙基；nBu-正丁基；tBu-叔丁基；nPn-新戊基(2，2-二甲基丙基)；iBu-異丁基；MeCO-乙?；?其余的?；苌镆韵嗤姆绞矫?；φ-苯基。下表列出了以與實施例3所述的相似方法合成的本發(fā)明的化合物。這些化合物中的R1-R6取代基是為了說明適用于本發(fā)明的取代基而不是想要進行限定。對它們活性的評價以與實施例1給出的相似方法進行。這些化合物均抑制αPDGFR和βPDGFR的蛋白激酶活性。其中的R3、R5和R6是H的芳香族和雜芳族酰氨基吡唑(包括取代和未取代的)顯示最強的活性化合物37-42、45和46。表1Bp><p>在表1B中使用下列縮寫Me-甲基；ipr-異丙基；nBu-正丁基；MeCO-乙?；?其余的?；苌镆韵嗤姆绞矫?；φtBu-φ叔丁基并且φ-苯基?；衔锏闹苽浜蜕a(chǎn)可用于本發(fā)明的許多氨基吡唑類化合物是公知的，多種化合物的合成已在科技文獻中記載了30年以上。在文獻中的命名存在著一些混亂，但這不會對本領(lǐng)域技術(shù)人員構(gòu)成問題。出現(xiàn)這些問題是由于吡唑環(huán)的對稱性，因為在對環(huán)原子進行計數(shù)時，兩個氮原子均可被認(rèn)為是起始點。在以上及整個申請的結(jié)構(gòu)式中，對化合物的命名保持一致，使氨基取代基出現(xiàn)在吡唑環(huán)上被指定為“3”的碳上。當(dāng)然，以相反的方式對環(huán)計數(shù)時也同樣令人滿意，這樣氨基取代基就出現(xiàn)在碳5而其它取代基出現(xiàn)在碳3。因此，一些科技文獻稱為3-氨基吡唑而另一些稱為5-氨基吡唑，但它們表示同樣的化合物。然而在同一出版物中使用的命名方法是一致的，所以一旦了解這種命名習(xí)慣后就不會對文獻的內(nèi)容感到混亂。本發(fā)明的方法中所用的3-氨基吡唑可以通過已知的方法合成和修飾，因為其中的許多化合物在其它用途方面是公知的。3-氨基吡唑本身也可以購買到，例如，從Aldrich化學(xué)公司，Milwaukee，Wisconsin，Missouri，USA(目錄號16064-4)。吡唑可以通過重氮甲烷和乙炔的反應(yīng)方便地合成。吡唑的合成路線已有近100年的歷史，目前已經(jīng)很成熟。參見，例如vonPechmann，Ber.Deut.Chem.Ges.，312950(1989)，和Hueckel等，Z.Phys.Chem.，A，186159(1940)。各種取代方式的吡唑可以通過選擇帶有所需取代方式的起始的炔和重氮化合物方便地制備。還存在其它的生產(chǎn)3-氨基吡唑的合成路線。例如，美國專利4622330給出了取代的3-氨基吡唑的一般合成方法，其中，式R1-NHNH2的烷基肼與式AlkOCR4＝C(CN)2的化合物進行縮合反應(yīng)生成產(chǎn)物1-R1-3-R4-4-CN-5-氨基吡唑。通過用肼代替烷基肼并(如需要)從產(chǎn)物吡唑中脫除氰基，將其轉(zhuǎn)變?yōu)橥榛?；或選擇只帶有一個氰基的起始原料，可使上述反應(yīng)適于生產(chǎn)本發(fā)明的化合物。例如，化合物3-苯甲酰氨基-5-苯基吡唑(表1A的化合物1)的合成參見Huening，Chem.Ber.，95937-943(1962)，和Checchi等，Gazz.Chim.Ital.，851558-1568(1955)，以上兩篇文獻均引入本文作為參考。一些特別有用的化合物可以從Maybridge化學(xué)有限公司(Trevillett，Tintagel，CornwallPI340HW，英國)購買到，尤其是3-[2’-氟苯甲酰氨基]-5-苯基吡唑、3-[2’-氯苯甲酰氨基]-5-苯基吡唑、3-苯甲酰氨基-5-苯基吡唑和3-[4’-氯苯甲酰氨基]-5-苯基吡唑。在此應(yīng)當(dāng)注意，前句中所給出的名稱并沒有嚴(yán)格按照IUPAC的命名規(guī)則，而是將化合物以吡唑來命名，從而使化合物的名稱與本說明書保持一致。3-苯甲酰氨基-5-苯基吡唑(化合物1)的另一個名稱是N-(5-苯基-1(2)H-吡唑-3-基)-苯甲酰胺。后者是Beilstein中所用的名稱(BeilsteinReg.No.22573；CASReg.No.97620-17-2)。3-氨基基團上或吡唑環(huán)上的各種取代基可以存在于起始化合物中，或在縮合產(chǎn)物形成后通過本領(lǐng)域已知的方法將一個基團取代或轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪粋€基團。如果取代基本身是活潑的，則可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法將其保護?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的各種保護基?？稍凇坝袡C合成中的保護基”(T.W.Green，JohnWiley和Sons，1981)中找到許多這些基團例子?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的氧化劑將伯醇氧化生成羧酸或醛，將仲醇氧化生成酮。因此，可以采用其它反應(yīng)以使起始原料、中間體或最終產(chǎn)物的分子中帶有各種取代基。特別重要的合成路線是將已有的甲酰胺基團水解并通過簡單的酰胺化反應(yīng)用另一個代替。給出制備本發(fā)明化合物的合成方法的詳細(xì)內(nèi)容以及關(guān)于已知用途的討論的科技出版物的其它例子包括如下Sanz等，有機化學(xué)會志PerkinTrans.I，1990，809-810頁；Hammouda等，雜環(huán)化學(xué)雜志，21945-947(1984)；和Sawali等，雜環(huán)化學(xué)雜志，17877-880(1980)，所有這些文獻均引入本文作為參考。用作激酶抑制劑本發(fā)明的化合物可作為激酶抑制劑用于治療用途，以控制哺乳動物的激酶依賴型疾病，尤其是與酪氨酸激酶有關(guān)的疾病。特別合適的是IC50值在10nM-1μM的化合物。吡唑酸衍生物特異性地抑制三種類型蛋白激酶中的一種而不是其它種類(這三種已知的類型將在下面討論)的能力是決定特定化合物的使用方式的一個因素。酪氨酸激酶依賴型疾病包括過度增殖性疾病，該疾病由迷亂的酪氨酸激酶的酶活性引發(fā)/保持。疾病的例子包括癌癥、動脈粥樣硬化和抗血管形成(例如腫瘤生長、糖尿病型視網(wǎng)膜炎)。盡管關(guān)于其它種類的激酶和具體疾病的關(guān)系的信息很少，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，具有治療用途的PTK抑制化合物優(yōu)選應(yīng)是選擇性的，這同樣適用于其它種類的激酶。PTK抑制劑五羥黃酮、染料木黃酮、和星形孢菌除酪氨酸激酶外還抑制許多其它的蛋白激酶，致使它們?nèi)狈μ禺愋远憩F(xiàn)出高的細(xì)胞毒性。因此，可用測定細(xì)胞毒性的常規(guī)分析來識別因缺乏選擇性而可能產(chǎn)生令人討厭的副反應(yīng)的PTK抑制劑(或其它種類的激酶抑制劑)。依據(jù)它們的底物氨基酸已鑒定出三大類蛋白激酶磷酸化酪氨酸的激酶、磷酸化酪氨酸和蘇氨酸的激酶、磷酸化絲氨酸和蘇氨酸的激酶。作為更詳細(xì)的選擇性試驗，應(yīng)測試該化合物抑制一系列蛋白激酶的酶活性的能力。在
背景技術(shù)：
中描述了酪氨酸特異性蛋白激酶。磷酸化絲氨酸和蘇氨酸的激酶(最常見的種類)的例子包括RAF、蛋白激酶A、蛋白激酶C、和轉(zhuǎn)化生長因子β受體。激酶MEK是磷酸化酪氨酸和蘇氨酸的激酶的例子。在以下關(guān)于激酶抑制劑的用途的討論中，討論集中在酪氨酸激酶上，因為它們是最容易通過藥物控制的激酶。然而應(yīng)當(dāng)理解，在此關(guān)于化合物作為酪氨酸激酶抑制劑的用途任何討論同樣適用于對另一種激酶類型為特異性的化合物的用途，只要該作用的特異性是已知的?？梢岳脤嵤├兴o出的酶活性分析(或用另一種激酶代替實施例中討論的激酶的其它相同的分析)方便地測定一個吡唑化合物是否對一種具體類型的激酶是特異性的。為了避免不必要的重復(fù)，下面以酪氨酸為例討論對于其它種類的激酶應(yīng)作的分析。因此，除非另有說明，應(yīng)采取有關(guān)“酪氨酸激酶”或“PTK”的具體應(yīng)用或具體情況的文獻作為對激酶種類的任何一種有特異性的化合物的用途的例子。為了使抑制PTK或其它激酶類型中的一種的化合物能夠用于治療，它們應(yīng)當(dāng)對完整的細(xì)胞有活性。已知依據(jù)其抑制離體酶的能力而確定的PTK抑制劑通常對天然PTK的抑制作用很弱或無效?；钚缘娜狈κ怯捎赑TK抑制劑不能穿透細(xì)胞膜到達其作用位點，或者是它們不能在三磷酸腺苷(ATP)的濃度很高、可能涉及其它因素的細(xì)胞內(nèi)抑制PTK。有多種方法可以測定PTK抑制劑在完整細(xì)胞內(nèi)對生長因子受體酪氨酸激酶的活性。將細(xì)胞用生長因子處理可導(dǎo)致相應(yīng)受體的迅速自身磷酸化以及受體底物的磷酸化，這些情況可以用抗磷酸酪氨酸抗體進行測定。另外，還可以測量其它的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，包括鈣泵、肌醇磷酸酯代謝和細(xì)胞的DNA合成。最后，可用于治療的PTK抑制劑必需能夠阻斷細(xì)胞增殖，這是易于監(jiān)測的生長因子作用的不利結(jié)果。從理論上講，本發(fā)明的化合物在水及中等增水溶劑中的溶解度可以增強其穿透細(xì)胞膜的可能性。然而，多種不溶性化合物在體外試驗中顯示出顯著的激酶抑制作用。本發(fā)明的化合物可以以游離酸或堿(如果存在羧基、酚羥基或氨基基團)的形式、以鹽或水合物的形式使用。各種形式均在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？梢孕纬蓧A性鹽，并且它們一般是較方便的使用形式；在實際應(yīng)用中，鹽形式的用量應(yīng)與酸形式的用量相一致。可用于制備鹽的酸或堿包括與游離的酸或堿混合時可形成可藥用鹽的那些酸或堿，即，在鹽的藥用劑量下，鹽的陽離子或陰離子對動物機體無毒，從而使游離酸或堿所具有的有益性質(zhì)不會因為陽離子的副作用而降低。盡管優(yōu)選酸或堿化合物的可藥用鹽，但所有的鹽均可用作游離酸形式的來源，即使特定的鹽本身僅適于作為中間體產(chǎn)物，例如，僅是為了純化和鑒定的目的而形成的鹽，或是作為通過離子交換的方法制備可藥用鹽的中間體。本發(fā)明范圍內(nèi)的具有特異性的蛋白酪氨酸激酶抑制劑活性的化合物具有醫(yī)療價值，可用作治療特定疾病(包括例如牛皮癬和再狹窄)的抗細(xì)胞增殖藥物。預(yù)期本發(fā)明特別適用于動脈粥樣硬化的治療。關(guān)于某些疾病(例如動脈粥樣硬化)的治療，由于遺傳、環(huán)境或病史等因素，一些人被認(rèn)為是高度危險的。本發(fā)明范圍內(nèi)的化合物可用于預(yù)防或延緩這些疾病的發(fā)生或再發(fā)生，或者治療該疾病。本發(fā)明的化合物可以以多種方式對哺乳動物宿主進行給藥，即，依據(jù)所選擇的給藥途徑(例如口服或胃腸外)可以將它們以片劑、膠囊、錠劑、糖錠、硬糖丸、粉末、噴霧劑、酏劑、注射液或滴眼液的形式與可藥用惰性載體相混合。胃腸外給藥包括以下給藥途徑靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、滑膜內(nèi)、經(jīng)上皮(包括經(jīng)皮、眼、舌下和頰)、局部(包括眼、皮膚、直腸、通過吹入劑和氣霧劑的鼻內(nèi)吸入)、和直腸全身給藥。如前所述，本發(fā)明的另一個目的是用于控制哺乳動物的激酶依賴型疾病的藥物組合物，所述組合物含有激酶抑制量的結(jié)構(gòu)式(I)的化合物和可藥用的載體。如上所述，激酶依賴型疾病可以通過抑制激酶的活性得到控制。盡管用于本發(fā)明的許多氨基吡唑類化合物是已知的，但它們中沒有已知具有抑制激酶活性和任何已知的治療用途。優(yōu)選的藥物組合物含有結(jié)構(gòu)式(I)的化合物，條件是當(dāng)R1是苯基或低級烷基、低級烷氧基或鹵素取代的苯基；R3和R6是H；R5是低級烷基、芳基或低級烷基、低級烷氧基或鹵素取代的芳基時，R2不能是低級烷基?；钚曰衔锟梢酝ㄟ^口服給藥，例如，與惰性稀釋劑或可同化的食用載體一起，或包封于硬或軟殼的膠囊中，或壓成片劑，或?qū)⑵渲苯优c食物混合?？诜o藥時，可以將活性化合物與賦性劑混合并以可消化片、含片、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮劑、糖漿、糯米紙囊等的形式使用。這些組合物和制劑應(yīng)含有至少0.1％的活性化合物。當(dāng)然，組合物和制劑的百分含量可以變動，通常在總量的大約2至大約6％之間。這些治療用組合物中的活性化合物的量為可以得到適當(dāng)劑量的量。根據(jù)本發(fā)明制備優(yōu)選組合物或制劑，使口服劑量單位形式含有大約1至1000mg之間的活性化合物。片劑、錠劑、丸劑、膠囊等還可含有以下成分粘合劑，例如聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠、阿拉伯膠、蔗糖、玉米淀粉或明膠；賦性劑，例如磷酸鈣、枸櫞酸鈉和碳酸鈣；崩解劑，例如玉米淀粉、土豆淀粉、木薯淀粉、某些硅酸鹽配合物、藻酸等；潤滑劑，例如十二烷基硫酸鈉、滑石和硬脂酸鎂；甜味劑，例如蔗糖、乳糖或糖精；或矯味劑，例如薄荷、冬青油或櫻桃香精。還使用相同類型的固體組合物作為軟和硬膠囊的填料；關(guān)于這點的優(yōu)選材料還包括乳糖以及高分子量的聚乙二醇。當(dāng)劑量單位形式是膠囊時，除上述類型的材料外，它還可含有液體載體。還可以含有其它材料例如包衣或修飾劑量單位的外觀。例如，片劑、丸劑或膠囊可用紫膠、糖中的一種或兩種包衣。糖漿或酏劑可以含有活性化合物、蔗糖作為甜味劑、對羥基苯甲酸甲酯和丙酯作為防腐劑、染料、矯味劑如櫻桃或橙香精、乳化劑和/或懸浮劑、以及稀釋劑如水、乙醇、丙二醇、甘油及其各種組合形式。當(dāng)然，制備任何劑量單位形式所用的任何材料均應(yīng)是藥物純的，并且在所用劑量下基本無毒。另外，還可將活性化合物制備成緩釋制劑?；钚曰衔镞€可以通過胃腸外或腹膜內(nèi)給藥。為了胃腸外給藥的目的，可以使用在蓖麻油或花生油或在丙二醇水溶液中的溶液，以及前述的水溶性堿金屬鹽或堿土金屬鹽的無菌水溶液。如需要，應(yīng)將這些水溶液進行適當(dāng)?shù)木彌_，并將稀釋液首先用足夠的鹽或葡萄糖調(diào)至等滲。游離堿或可藥用鹽形式的活性化合物的溶液可以在適當(dāng)混有表面活性劑(例如羥丙基纖維素)的水中制備。分散劑還可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物和油中制備。在普通的貯藏和使用條件下，這些制劑含有防腐劑以防止微生物的生長。這些水溶液劑特別適用于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)注射的目的。在此所用的無菌水溶液基質(zhì)均可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法方便地得到。適于注射使用的藥物劑型包括無菌水溶液或分散液以及用于臨時制備無菌注射用溶液或分散液的無菌粉末。在各種情況下，劑型必需是無菌的并且必需是易于注射的液體。它在生產(chǎn)和貯藏的條件下必需是穩(wěn)定的并且必需防止微生物如細(xì)菌和真菌的污染。載體可以是溶劑或分散基質(zhì)，其中含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)、它們的適當(dāng)混合物、以及植物油。可以維持適當(dāng)?shù)牧鲃有?，例如，通過使用包衣如卵磷脂，在分散劑的情況下通過控制所需的顆粒大小，以及使用表面活性劑?？梢酝ㄟ^各種抗菌劑和抗真菌劑防止微生物的污染，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在許多情況下最好含有等滲劑，例如糖或氯化鈉。可以通過使用延緩吸收的物質(zhì)(例如一硬脂酸鋁和明膠)來延長注射用組合物的吸收。無菌注射液的制備通過將所需量的活性化合物摻入到隨需要而含有各種其它上述成分的適當(dāng)溶劑中，然后進行無菌過濾來完成。通常，分散液的制備通過將無菌活性成分摻入到無菌賦性劑中來完成，所述賦性劑中含有基本的分散基質(zhì)和上述的其它所需成分。關(guān)于制備無菌注射液用的無菌粉末，其制備的優(yōu)選方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，該技術(shù)可從前述的無菌過濾溶液中制得活性成分加任何所需添加成分的粉末。對于局部給藥的目的，在適于對眼進行滴加給藥的容器中制備稀釋的無菌水溶液(通常為大約0.1％至5％的濃度)，或是與上述胃腸外溶液相似的溶液。本發(fā)明的治療用化合物可以對哺乳動物單獨給藥，或是與可藥用的載體聯(lián)合給藥。如上所述，活性成分與載體的相對比例由化合物的溶解度和化學(xué)性質(zhì)、選擇的給藥途徑、以及常規(guī)的藥物實踐決定。特別適用于預(yù)防或治療的本發(fā)明的治療藥物的劑量將依據(jù)給藥方式、所選擇的具體化合物以及接受治療的具體患者的生理特點而變動。通常在開始時使用小劑量，需要時以小量逐漸增加至達到最佳效果。依據(jù)對大鼠的生理學(xué)研究，人的治療劑量一般應(yīng)從大約0.01mg至大約100mg/kg體重/天或從大約0.4mg至大約10g，盡管可以以多個不同的劑量單位從一天一次到一天多次給予更高的劑量?？诜o藥需要高劑量?；衔锟梢砸淮位蚍执瓮ㄟ^口服或胃腸外給藥，或滴眼液的方式局部給藥，劑量從大約0.1至10mg/kg體重/天。當(dāng)然，在特殊情況下，在主治醫(yī)師的指導(dǎo)下，可以使用該范圍以外的劑量。在含有結(jié)構(gòu)式(I)的化合物或其可藥用鹽的藥物組合物中，載體和活性成分的重量比通常在1∶4到4∶1的范圍內(nèi)，并優(yōu)選1∶2到2∶1。然而，在任何情況下，該比例的選擇將依據(jù)活性化合物的溶解度、所需劑量以及具體的給藥途徑等因素。本發(fā)明的化合物還可用于檢測體液(例如血液或血液成分)中酪氨酸激酶或酪氨酸激酶底物的存在。在不含本發(fā)明化合物的條件下測定組合物中酪氨酸激酶的活性并與存在該化合物的條件下測得的活性相比較。然后將這些測得的激酶活性的差別與組合物中酪氨酸激酶或酪氨酸激酶底物的濃度相關(guān)聯(lián)。以上對本發(fā)明進行了概述，通過參考以下實施例可以更好地理解本發(fā)明，除非另有說明，提供這些實施例僅是為了說明的目的而不是想要對本發(fā)明進行限定。實施例1吡唑化合物對蛋白激酶酶活性的抑制在本實施例及以下實施例中使用的吡唑化合物從Maybridge化學(xué)有限公司(Trevillett，Tintagel，CornwallPI34OHW，英國)得到。生長因子(例如PDGF、FGF和EGF)對細(xì)胞增殖的刺激作用依賴于它們對各自受體的酪氨酸激酶的自身磷酸化的誘導(dǎo)作用。因此，PTK抑制劑阻斷這些生長因子誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的能力與其阻斷受體自身磷酸化的能力直接相關(guān)。為了測量α-PDGFR的自身磷酸化，使用前述的鼠造血細(xì)胞系32D-αR，該細(xì)胞系經(jīng)基因工程而過度表達人α-PDGFR。將這些細(xì)胞在RPMI(GibcoBRL)培養(yǎng)液中生長至106個細(xì)胞/ml，所述培養(yǎng)液中含有10％胎牛血清和5％WEHI條件培養(yǎng)液(含有從ATCC得到的WEHI細(xì)胞調(diào)節(jié)的組織培養(yǎng)液)。用低速離心使細(xì)胞沉積并重新懸浮于不含血清的RPMI中，然后以500000個細(xì)胞/孔分布于96孔圓錐形底的微量效價板中(Falcon)。將化合物(0.01-30μM)在室溫下加入各孔中，15分鐘后加入PDGFAA(15ng/ml)并繼續(xù)在冰上孵育90分鐘，最終的孵育體積為100μl。然后在4℃、2000rpm下離心10分鐘使細(xì)胞沉積，然后向各孔中直接加入50μl新制備的溶解緩沖液(20mMpH＝7.3的Tris，150mMNaCl，1％三硝基甲苯X-100，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，1mM原釩酸鈉，10mg/ml抑蛋白酶肽和10mg/ml亮肽素)，繼續(xù)在冰上孵育10分鐘，在培養(yǎng)皿振搖器上劇烈振蕩以促進細(xì)胞溶解。分析前將細(xì)胞溶解產(chǎn)物在2000rpm離心10分鐘使其澄清。為了分析β-PDGFR自身磷酸化，使用中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系HR5-βR，該細(xì)胞系經(jīng)基因工程而穩(wěn)定地過度表達前述的β-PDGFR。將這些細(xì)胞以10000個細(xì)胞/孔接種于微量效價板(Falcon96孔板)并在37℃下、在含有10％胎牛血清的RPMI中孵育3天，在此期間內(nèi)達到細(xì)胞融合。從孔中移去培養(yǎng)液并用100μl不含血清的RPMI代替，繼續(xù)在37℃孵育18小時。將化合物(0.01-30μM)加入各孔中，15分鐘后加入PDGFBB(100ng/ml)并繼續(xù)在37℃孵育10分鐘。移去培養(yǎng)液并向各孔中加入50μl新制備的溶解緩沖液，將該板劇烈振蕩以制備細(xì)胞溶解產(chǎn)物。分析前將細(xì)胞溶解產(chǎn)物在2600rpm離心10分鐘使其澄清。在一個單獨的微量效價板中，通過將0.5μg抗體/孔在4℃下、在23mMpH8.0的Tris、68mMNaCl、14mM碳酸氫銨和0.01％疊氮化鈉中孵育18小時，將直接針對α-PDGFR(MabαR10)或β-PDGFR(Mab1B5B11)的細(xì)胞外區(qū)域的單克隆抗體(在CORTherapeutics，Inc.制備)固定。移去未結(jié)合的抗體，將各孔用25mMN-(2-羥乙基)-N’-(2-乙基磺酸)(HEPES)pH7.6、100mMNaCl和0.2％吐溫20阻斷，然后立即加入用固定緩沖液(含有0.3％明膠的阻斷緩沖液)稀釋2倍的細(xì)胞溶解產(chǎn)物。將32D-αR或HR5-βR細(xì)胞溶解產(chǎn)物分別與固定的MabαR10或Mab1B5B11在室溫下孵育2小時，然后將各孔用200μl洗滌緩沖液(磷酸鹽緩沖液“PBS”，0.01％吐溫20)洗滌3次。為了測定PDGFR的磷酸化水平，以1.25μg/ml加入兔抗磷酸酪氨酸抗體(Upstate生物技術(shù)公司，“UBI”)并在37℃孵育1小時。除去未結(jié)合的抗磷酸酪氨酸抗體后，將效價板與山羊辣根結(jié)合的抗兔IgG(BoehringerMannheim)的1∶1000稀釋液一起孵育，然后加入過氧化物酶的底物(ABTSTM)。用微量效價平板讀數(shù)器(MolecularDevices)在650nm監(jiān)測產(chǎn)物的形成。EGFR自身磷酸化在MDAMB468細(xì)胞(ATCC#HTB132)中測定，該細(xì)胞為過度表達EGFR的人乳房腫瘤細(xì)胞系。將這些細(xì)胞在6孔板中生長至融合，然后在不合血清的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)液(DMEM)中孵育18小時。將細(xì)胞在37℃與各種濃度(0.01-30μM)的化合物接觸15分鐘，然后與EGF(100ng/ml)接觸10分鐘。刮下細(xì)胞并在與32D-αR所述相同的緩沖液中制備溶解產(chǎn)物，然后用常規(guī)SDSPAGE進行分離并進行Western印跡分析。為此，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝基纖維素上并將該膜在pH7.0的Tris緩沖液(TBS)、0.1％吐溫20、5％煉乳中進行阻斷。將該膜在室溫下用抗磷酸酪氨酸抗體(UBI，1μg/ml)在固定緩沖液(TBS、0.1％吐溫20、5％煉乳)中印跡2小時。用山羊抗兔辣根過氧化物酶結(jié)合的IgG(BoehringerMannheim)進行檢測。將印跡用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Amersham)展開。為了測定FGFR-1的自身磷酸化，用常規(guī)技術(shù)將FGFR-1cDNA在CHO細(xì)胞中穩(wěn)定地過度表達。將這些細(xì)胞在含有10％胎牛血清的RPMI中生長至融合，將反應(yīng)液用不含血清的RPMI代替并繼續(xù)孵育18小時，然后用βFGF(75ng/ml)在不含或含有濃度范圍為0.1-30μM的PTK抑制劑的條件下在37℃刺激10分鐘。在與上述EGFR分析相同的條件下制備細(xì)胞溶解產(chǎn)物。將溶解產(chǎn)物與針對FGFR-1的細(xì)胞外區(qū)域的單克隆抗體(Mab1H9D3，在COR制備)一起孵育，然后將免疫沉淀的受體進行SDSPAGE并用4G10辣根過氧化物酶結(jié)合的抗磷酸酪氨酸抗體(UBI)進行Western印跡分析，然后通過化學(xué)發(fā)光(Amersham)進行測定。如圖1所示，化合物1(結(jié)構(gòu)見表1A)在HR5-βR細(xì)胞中有效地阻斷βPDGFR的自身磷酸化，IC50＝220mM并且抑制作用在5μM時最大。當(dāng)在該條件下與其它強效的PTK抑制劑相比時，發(fā)現(xiàn)化合物1與K252a同樣有效，而低于(三倍)星形孢菌素(見下面表2)。另外，還發(fā)現(xiàn)化合物1可以在與觀察β受體所用的相同濃度范圍內(nèi)抑制αPDGFR的自身磷酸化。這些結(jié)果證明，在完整細(xì)胞內(nèi)，化合物1是PDGFR自身磷酸化的強效抑制劑，表明該化合物將在體內(nèi)具有活性并有可能達到治療濃度。為了測定化合物1是否選擇性地抑制PDGFR酪氨酸激酶，評價了其對密切相關(guān)的EGFR和FGFR-1酪氨酸激酶的作用。令人驚奇的是，在化合物1的濃度高達30μM時仍為觀察到對這些受體自身磷酸化作用的明顯抑制。EGFR的自身磷酸化受K252a(IC50＝1μM)的抑制而不受濃度高達30μM的星形孢菌素的抑制(表2)。srcPTK家族在結(jié)構(gòu)上與受體PTK有關(guān)，因為60-80％的氨基酸序列與其酶的酪氨酸激酶區(qū)域相同。另外，這些激酶在功能上也相似，它們均可以調(diào)節(jié)可導(dǎo)致細(xì)胞增殖的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。與受體PTK不同，src蛋白不含有細(xì)胞域外或跨膜區(qū)域，因而對于細(xì)胞外刺激不直接起到受體的作用。為了進一步測試化合物1的特異性，對其抑制重組c-src(UBI目錄#14-117)活性的能力進行評價。為了使該分析與96孔微量效價板的格式相適應(yīng)，將0.5μgsrc-底物多肽-2(UBI目錄#14-140)加入到各孔的23mMpH8.0的Tris、68mMNaCl、14mM碳酸氫銨和0.01％疊氮化鈉中。將肽固定后，將各孔洗滌，然后用25mMpH7.6的HEPES、100mMNaCl和0.2％吐溫20阻斷。向各孔中加入100ml反應(yīng)混合物引發(fā)激酶反應(yīng)，所述反應(yīng)混合物中含有0.03-30μM的試驗化合物、50μM的ATP和溶于50mMTris的10單位的c-src；pH7，25mMMnCl2；5mMMnCl2；0.05mMNa2VO4；100mMpH7的HEPES；5％甘油和0.05％壬基苯氧基聚乙氧基醇(NP-40)。在37℃孵育20分鐘后，加入10μl50％乙酸終止反應(yīng)，洗滌孔并在上述檢測磷酸化的PDGFR所用的相同條件下用抗磷酸酪氨酸抗體檢測酪氨酸磷酸化的底物。如表2所示，化合物1抑制src激酶的IC50＝8.0μM，該濃度為抑制PDGFR自身磷酸化所需濃度的約40倍。相反，星形孢菌素和K252a阻斷src激酶活性的IC50值分別為70nM和20nM。該結(jié)構(gòu)證明，化合物1選擇性地抑制PDGFR激酶的活性，而星形孢菌素和K252a抑制src激酶活性的能力與它們抑制PDGFR激酶活性的能力相等甚至更強。已知星形孢菌素是受體酪氨酸激酶、src家族的酪氨酸激酶以及相差更多的絲氨酸/蘇氨酸激酶的強效抑制劑。因星形孢菌素及其它PTK抑制劑缺乏特異性而大大限制了它們作為治療藥物的可能性。為了研究化合物1抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶的可能性，用UBI的非放射性蛋白激酶分析在廠家(UBI目錄#17-112)描述的條件下對蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)進行分析。將化合物1、星形孢菌素和K252a在0.025-40μM的濃度范圍內(nèi)進行測試，以對化合物1與星形孢菌素和K252a進行比較。如表2所示，在40μM的濃度下，化合物1對PKC或PKA活性的減弱均不到50％，該濃度比抑制PDGFR激酶活性所需的濃度高約200倍。發(fā)現(xiàn)K252a是這些絲氨酸/蘇氨酸激酶的強效抑制劑，其IC50值對PKA為70nM，對PKC為100nM；星形孢菌素對兩種激酶均抑制，IC50＝70-80nM。這些結(jié)果證明，盡管一些抑制劑如星形孢菌素和K252a缺乏選擇性，當(dāng)化合物1對PDGF受體的選擇性比其它受體酪氨酸激酶、src激酶和絲氨酸/蘇氨酸激酶高40-200倍。該選擇性大大提高了化合物1用于治療與PDGF密切相關(guān)的疾病(例如動脈粥樣硬化、某些癌癥、腎小球腎炎和血管成形術(shù)后再狹窄)的醫(yī)療可能性。表2對蛋白激酶的抑制作用IC50[μM]化合物αPDGFRβPDGFREGFRFGFR-1src激酶PKAPKCcmpd.1.170.22＞30＞308.0＞40＞40K252aND0.271.0ND0.020.070.10星形孢菌素ND0.07＞30ND0.070.070.08ND＝未測定實施例2吡唑化合物對細(xì)胞增殖的抑制作用為了測定PTK抑制劑的潛在的醫(yī)療用途，必需證明抑制劑阻斷由介導(dǎo)增殖性疾病的生長因子所引起的細(xì)胞增殖的能力。由于文獻中的許多報道表明PDGF與腎小球腎炎、癌癥、動脈粥樣硬化和再狹窄等疾病有關(guān)，我們對化合物1阻斷PDGF介導(dǎo)的細(xì)胞增殖的能力進行了測試。為此，我們使用了32D-αR細(xì)胞并按照為測定PDGF介導(dǎo)的增殖所發(fā)展的常規(guī)技術(shù)進行。簡言之，將32D-αR細(xì)胞在含有白細(xì)胞介素3(IL-3)和10％胎牛血清的RPMI條件培養(yǎng)液中生長，然后用含10％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)液洗滌兩次，以5×105個細(xì)胞/孔重新懸浮于相同的培養(yǎng)液中，然后以250μl/孔加入24孔板(Falcon)。在含或不含化合物1(0.04-40μM)的條件下以30ng/ml加入PDGFAA，使最終孵育體積為0.5ml。將細(xì)胞孵育43小時，然后與[3H]胸腺嘧啶(10μCi/孔)一起繼續(xù)孵育3小時。用自動細(xì)胞收集器收集細(xì)胞，將濾紙置于液體閃爍合劑中并用β計數(shù)器計數(shù)。如圖2所示，化合物1在700nM時，阻斷PDGF介導(dǎo)的胸腺嘧啶的摻入量達50％，而濃度＞1μM時則完全抑制有絲分裂。為了測定化合物1是否產(chǎn)生非特異性的抗增殖效果或者是否是細(xì)胞毒性的，在常規(guī)的組織培養(yǎng)條件下測定其對人細(xì)胞系(例如HS68、HS27、CCD18和由ATCC得到的WS1)增殖的影響。在含或不合化合物1、星形孢菌素或K252a(濃度范圍為0.01-30μM)的條件下，將細(xì)胞以3.5×103個細(xì)胞/孔松散地接種于96孔微量效價板(Falcon)的常規(guī)組織培養(yǎng)液中，所述培養(yǎng)液中含有10％胎牛血清。將細(xì)胞在常規(guī)的組織培養(yǎng)條件下生長96小時，在此期間內(nèi)將其用3.3％的戊二醛固定，用H2O洗滌并用0.05％的亞甲藍染色(Sigma)。染色后，將細(xì)胞洗滌，將染料用3％HCl稀釋并用平板讀數(shù)器(MolecularDevices)在665nm監(jiān)測吸收值。通過比較存在抑制劑的條件下所觀察到的吸收值與不含抑制劑的條件下所得到的吸收值來測定對細(xì)胞抑制作用的百分率。如表3所示，用化合物1以高達10μM的濃度進行處理時，所有測試的人細(xì)胞系均未觀察到細(xì)胞生長的減弱，在30μM時僅出現(xiàn)微小的減弱(10-20％)。相反，星形孢菌素在0.01μM時完全阻斷所有的人細(xì)胞系的生長，而K252a在1-12μM的濃度范圍內(nèi)以50％抑制細(xì)胞的生長，CCD18細(xì)胞最為敏感(IC50＝1μM)。還在HR5-βR細(xì)胞中評價了這些化合物對正常細(xì)胞生長的影響，該細(xì)胞在前面測定βPDGFR的自身磷酸化時使用過。需要高濃度(28μM)的化合物1以抑制HR5-βR細(xì)胞的生長達50％。相反，星形孢菌素(IC50＜10nM)和K252a(IC50＝130nM)在比抑制PDGFR磷酸化所需濃度更低的濃度下強烈地抑制HR5-βR細(xì)胞的生長。這些結(jié)果證實，非特異性的蛋白激酶抑制劑星形孢菌素在比抑制激酶活性所需濃度更低的濃度下表現(xiàn)出非特異性的抗增殖或細(xì)胞毒效果。相反，化合物1在常規(guī)的組織培養(yǎng)條件下抑制細(xì)胞生長所需的濃度比阻斷PDGFR自身磷酸化所需的濃度高100倍。這些結(jié)果表明，化合物1可以在比產(chǎn)生細(xì)胞毒作用的濃度低的多的濃度下產(chǎn)生抑制PDGFR激酶活性的治療效果。表3在正常的組織培養(yǎng)條件下對細(xì)胞增殖的抑制作用IC50[μM]化合物CCD18HS27WS1HS68HR5-βR化合物1＞30＞30＞30＞3028星形孢菌素＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01K252a1.0125.0.13.13實施例3總述NMR譜在VarianUnityPlus400MHz儀上記錄。IR譜在PerkinElmer1600型FT-IR上記錄。反相HPLC在帶有965型光二極管序列(PhotoDiodeArray)檢測器的Waters600型調(diào)節(jié)器(controller)上進行，用Millenium2020軟件處理數(shù)據(jù)，使用Vydac4.5mm×25cm的C18分析柱或Vydac2.5cm×25cm的C18制備柱。常規(guī)HPLC在帶有965型光二極管序列檢測器的WatersDeltaPrep600型調(diào)節(jié)器上進行，用Millenium2020軟件處理數(shù)據(jù)，使用AlltechEconosil4.5mm×25cm硅膠分析柱或AlltechEconosil22mm×25cm硅膠半制備柱。閃式柱色譜用EMerck硅膠GF進行。質(zhì)譜用電子碰撞或直接化學(xué)電離進樣技術(shù)。(A)3-苯甲酰氨基-5-苯基-2-苯甲酰基吡唑(化合物35)的制備氬氣氛圍下，向在冰浴中攪拌的0.31g(2.0mmol)5-氨基-3-苯基吡唑(由Maybridge或Aldrich提供)的5.0ml吡啶溶液中加入1.4ml(12.1mmol)苯甲酰氯。將溶液在冰浴中攪拌1小時，升至室溫并繼續(xù)攪拌3.5小時。在反應(yīng)中，有吡啶鎓的鹽酸鹽從溶液中分離出來。加入10ml10％(v/v)的鹽酸水溶液終止反應(yīng)，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用25ml二氯甲烷提取兩次。將合并的有機提取液用每份10ml的10％鹽酸洗滌，用飽和氯化鈉溶液洗滌一次，硫酸鎂干燥，真空濃縮。得到白色固體。將固體用WatersDeltaPrep儀器在半制備硅膠柱上進行色譜分離。洗脫梯度在80分鐘內(nèi)從9∶1己烷∶二氯甲烷變到1∶1己烷∶二氯甲烷，流速為10ml/分鐘。得到0.37g(1.0mmol，50％)白色固體狀標(biāo)題化合物。TLC(二氯甲烷)Rf＝0.86IR(液體石蠟)NH在3317cm-1，CO在1689cm-1。NMR(CDCl3)11.67(s，NH)；8.21/8.23(dd，2ArH)；8.00/8.02(dd，2ArH)；7.88/7.90(dd，2ArH)；7.58-7.66(m，2ArH)；7.51-7.56(m，5ArH)；7.38-7.48(m，3ArH)MS(EI)M+＝367(B)3-苯甲酰氨基-5-苯基吡唑(化合物1)的制備將100mg(0.27mmol)5-苯甲酰氨基-3-苯基-1-苯甲?；吝蛟?ml10％(w/v)氫氧化鉀水溶液中的懸浮液在100℃的水浴中加熱5分鐘。在此期間內(nèi)反應(yīng)混合物仍為懸浮液。將冷卻的反應(yīng)液過濾并用水洗滌，然后晾干。得到48mg(0.18mmol，67％)白色固體狀標(biāo)題化合物。TLC(二氯甲烷)Rf＝0.20IR(液體石蠟)NH在3288cm-1，CO在1656cm-1NMR(DMSO-d6)10.80(s，NH)；7.97/7.99(dd，2ArH)；7.71/7.73(d，2ArH)；7.40-7.56(m，5ArH)；7.29-7.33(t，ArH)；7.01(bs，吡唑CH)MS(EI)M+＝263(C)3-芐氨基-5-苯基吡唑(化合物53)的制備向裝有橡膠隔膜、玻璃塞和帶有氬氣入口的回流冷凝器的干燥三頸圓底燒瓶中加入0.17g(0.66mmol)5-苯甲酰氨基-3-苯基吡唑。用注射器加入無水四氫呋喃(5ml)，在室溫下攪拌，生成無色、透明溶液。向該溶液中加入0.93ml(1.86mmol)購買到的(Aldrich)2M硼烷-二甲硫醚配合物的四氫呋喃溶液。將溶液在油浴中回流17小時。將反應(yīng)液冷卻至環(huán)境溫度并用2ml10％(v/v)鹽酸水溶液終止反應(yīng)。將混合物粗品用Waters600型儀器在C18柱上進行色譜分離。在用100％的水(含有0.1％的三氟乙酸“TFA”)以10ml/分鐘的流速沖洗10分鐘后，洗脫梯度在50分鐘內(nèi)從100％的水(含有0.1％TFA)變?yōu)?∶1水∶乙腈(含有0.1％TFA)。將洗脫的餾分在C18分析柱上進行分析，梯度在30分鐘內(nèi)從95∶5水∶乙腈(含有0.1％TFA)到20∶80水∶乙腈(含有0.1％TFA)，流速為1.5ml/分鐘。收集適當(dāng)?shù)酿s分(即38％-44％乙腈洗脫的餾分)并冷凍干燥得到72.3mg(0.29mmol，44％)白色粉末狀標(biāo)題化合物。HPLC(C18柱)Rt＝16.9分鐘NMR(CD3OD)7.56-7.68(m，2ArH)；7.44-7.47(m，3ArH)；7.31-7.38(m，4ArH)；7.23-7.27(m，ArH)；4.42(s，NCH2)MS(EI)M+＝249在此引用的出版物及專利申請均以同等的程度引入本文作為參考，就如同將各出版物或申請單獨地引入本文作為參考一樣。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不僅限于在此描述的具體的實施方案，可以進行各種改變和修飾而不超出所附權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明的范圍。權(quán)利要求1.抑制蛋白激酶的方法，所述方法包括將含有蛋白激酶的組合物與下式化合物接觸其中R1是低級烷基、低級烴基、芳基低級烷基、雜芳基低級烷基、5或6元雜環(huán)芳基、多環(huán)芳基或多環(huán)雜芳基；R2是低級烷基、低級烴基、芳基低級烷基、雜芳基低級烷基、5或6元雜環(huán)芳基、低級?；?、5或6元雜環(huán)芳酰基、多環(huán)芳基、多環(huán)芳羰基、多環(huán)雜芳基或多環(huán)雜芳羰基；R3是H或低級烷基；R5是H、低級烷基、低級烴基、芳基低級烷基、雜芳基低級烷基、5或6元雜芳基、鹵素或氰基；并且R6是H或低級酰基；其中所述的各烷基、烴基、烷芳基、烷基雜芳基、?；螂s環(huán)芳基均彼此獨立地被最多四個R4基團選擇性地取代，其中各R4彼此獨立地代表鹵素、氰基、硝基、低級烷基、羥基、烷氧基、羰基、羧基、氨基、烷氨基、二烷氨基、或酰氨基。2.權(quán)利要求1的方法，其中的R1是低級烴基或5或6元雜環(huán)芳基，被最多四個R4基團選擇性地取代。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述的低級烴基是碳環(huán)芳基并且被最多四個R4基團選擇性地取代。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述的碳環(huán)芳基是苯基或被最多四個R4基團取代的苯基。5.權(quán)利要求1的方法，其中的R2是低級?；?或6元雜環(huán)芳芳基，且可被最多四個R4基團選擇性地取代。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述的低級?；翘辑h(huán)芳羰基并且被最多四個R4基團選擇性地取代。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述的碳環(huán)芳羰基是苯甲酰基或被最多四個R4基團取代的苯甲?；?.權(quán)利要求1的方法，其中R3是H。9.權(quán)利要求1的方法，其中R5是H、低級烷基、鹵素或氰基。10.權(quán)利要求9的方法，其中R5是H。11.權(quán)利要求1的方法，其中R6是H。12.權(quán)利要求1的方法，其中R1是低級烷基、低級烴基或5或6元雜環(huán)芳基；R2是低級烷基、低級烴基、5或6元雜環(huán)芳基、低級?；?或6元雜環(huán)芳羰基；R3是H或低級烷基；R5是H、低級烷基、鹵素或氰基；并且R6是H或低級?；?。13.權(quán)利要求12的方法，其中R1是苯基或取代的苯基，R2是苯甲酰基或取代的苯甲?；?，R3、R5和R6是H。14.權(quán)利要求13的方法，其中R1是苯基，R2是苯甲?；琑3、R5和R6是H。15.權(quán)利要求1的方法，其中R2是苯甲?；虮幌鄬τ诒交系腍為供電子或電中性的取代基取代的苯甲酰基。16.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物中含有哺乳動物的體液。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述體液為血液或血液成分。18.權(quán)利要求16的方法，其中所述蛋白激酶為酪氨酸激酶。19.權(quán)利要求16的方法，其中所述酪氨酸激酶為血小板源生長因子。20.權(quán)利要求16的方法，其中所述方法還包括在所述體液中、在含或不含所述化合物的條件下測定酪氨酸激酶的活性并將所述酶活性與所述組合物中的酪氨酸激酶或酪氨酸激酶的底物的濃度相關(guān)聯(lián)。21.權(quán)利要求1的方法，其中所述接觸發(fā)生在體內(nèi)。22.用于控制哺乳動物激酶依賴型疾病的藥物組合物，所述組合物中含有激酶抑制量的權(quán)利要求1的化合物和可藥用的載體。23.權(quán)利要求22的藥物組合物，條件是當(dāng)R1是苯基或低級烷基、低級烷氧基或鹵素取代的苯基；R3和R6是H；R5是低級烷基、芳基或低級烷基、低級烷氧基或鹵素取代的芳基時，R2不能是低級烷基。24.控制激酶依賴型疾病的方法，所述方法包括向患有激酶依賴型疾病的哺乳動物給予激酶依賴型疾病控制量的權(quán)利要求1的化合物。25.權(quán)利要求24的藥物組合物，條件是當(dāng)R1是苯基或低級烷基、低級烷氧基或鹵素取代的苯基；R3和R6是H；R5是低級烷基、芳基或低級烷基、低級烷氧基或鹵素取代的芳基時，R2不能是低級烷基。全文摘要公開了一種選擇性抑制蛋白激酶的方法，所述方法包括將含有激酶的組合物與式(I)的化合物接觸，其中R文檔編號C07D231/38GK1165482SQ95196127公開日1997年11月19日申請日期1995年11月9日優(yōu)先權(quán)日1994年11月10日發(fā)明者N·A·吉斯,N·洛克爾,A·M·萊貝爾曼,R·M·斯卡伯拉夫申請人:科西雷佩蒂斯公司