從紅豆杉細胞培養(yǎng)液中制備高純度紫杉醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及紫杉醇的制備方法，尤其是涉及從紅豆杉細胞培養(yǎng)液中制備高純度紫杉醇的方法，其包括將細胞培養(yǎng)液過濾、經大孔樹脂吸附富集，得粗提物、經常壓堿性氧化鋁柱層析、經過C18反相高效制備液相分離，分部收集組分、離心獲取沉淀、將沉淀冷凍干燥后得高純度紫杉醇單體。本發(fā)明選用紫杉醇高產細胞系培養(yǎng)液作為原材料，與紅豆杉枝葉、樹皮等提取相比，所含色素、脂質等雜志更少，相比于真菌和細菌發(fā)酵液，其所含紫杉醇更高，該材料方便提?。煌瑫r從紅豆杉細胞培養(yǎng)液中直接用大孔樹脂富集紫杉醇，省去大量有機溶劑使用，工藝簡單，節(jié)約環(huán)保，回收率高，獲得的紫杉醇純度高。
【專利說明】從紅豆杉細胞培養(yǎng)液中制備高純度紫杉醇的方法
【技術領域】[0001]本發(fā)明涉及紫杉醇的制備方法，尤其是涉及從紅豆杉細胞培養(yǎng)液中制備高純度紫杉醇的方法。
【背景技術】[0002]紫杉醇是紅豆杉屬植物中的一種復雜的次生代謝產物，也是目前所了解的惟一一種可以促進微管聚合和穩(wěn)定已聚合微管的藥物。紫杉醇是全球最暢銷的抗腫瘤藥物，同時也是世界上公認的廣譜強活性抗癌藥物，隨著臨床用途的急劇擴大，國際醫(yī)藥市場對紫杉醇原料藥有巨大的需求。[0003]近年來，國內外對紫杉醇制備多從植物的樹皮、枝葉等組織提取，工藝復雜，溶劑能量消耗較多，成本較高。野生紅豆杉受到法律保護后，只能從人工栽培的紅豆杉獲取樹皮，但紅豆杉生長緩慢，限制了樹皮原料來源。目前，還有一些方法:如通過半合成方法制備紫杉醇，但其必需先從植物材料中獲取紫杉醇前提化合物，所以也會受到資源限制；還如紫杉醇全合成方法，但其制備步驟及其復雜，成本很高，至今無法工業(yè)化生產；再如從真菌和細菌發(fā)酵液提取紫杉醇，因其含量太低，目前沒有實現工業(yè)化生產。美國與意大利在利用細胞培養(yǎng)法直接生產紫杉醇原料藥發(fā)展較快，迄今為止，全球利用紅豆杉細胞培養(yǎng)法生產紫杉醇的總規(guī)模每年仍只有數千升，在目前全球紫杉醇原料總產量中，細胞培養(yǎng)法生產的紫杉醇所占份額極小。但由于細胞培養(yǎng)法不會消耗寶貴的紫杉樹或紅豆杉樹資源，故這一方法屬于“綠色生產新工藝”并代表著紫杉醇原料藥產業(yè)的未來，具有有廣闊的發(fā)展前景和市場增長空間。[0004]目前，植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產紫杉醇的一個顯著特點是培養(yǎng)液體積龐大，紫杉醇在培養(yǎng)液中的含量比較低，一般在20mg/L左右，它既有一部分分泌到培養(yǎng)液中，還有一大部分存留在細胞中?，F有技術中，出現了從細胞內提取紫杉醇的方法，其是將收獲期的細胞與培養(yǎng)液分離，然后將細胞烘干后提取，在這種方法中，那些因分泌或部分細胞破裂流失到培養(yǎng)液中的的紫杉醇將被丟棄，導致回收率較低；還出現了從紅豆杉細胞培養(yǎng)液濾液中富集提取紫杉醇的方法，其是用大量有機溶劑對培養(yǎng)液進行液-液萃取。這種方法必然會導致大量有機溶劑耗費和環(huán)境憂患，還要投入大量資金用于購置大尺寸的液-液萃取設備；還出現了采用膜分離濃縮技術從從紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)液分離紫杉醇的方法，盡管該方法可省去溶劑萃取步驟，能除去一部分雜質，但該方法操作麻煩，回收率不高。

【發(fā)明內容】
[0005]針對上述技術問題，本發(fā)明的目的在于提供一種從紅豆杉細胞培養(yǎng)液中制備高純度紫杉醇的新方法，該方法不僅工藝簡單，而且回收率高。[0006]本發(fā)明解決上述技術問題采用的技術方案為:從紅豆杉細胞培養(yǎng)液中制備高純度紫杉醇的方法，其包括以下步驟:(1)將紅豆杉細胞培養(yǎng)液進行固液分離，得到原液和細胞；然后將細胞破壁后過濾，得到濾液和濾渣；再將所述原液與濾液混合；
(2)將上述混合液體通過非極性大孔樹脂吸附層析柱富集，然后用蒸餾水沖洗，再用乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，并將洗脫液中的乙醇蒸干；
(3)向上述蒸干乙醇的洗脫液中加入萃取劑，進行兩次液液萃取，收集有機溶劑層，低溫真空干燥，得到大孔樹脂柱富集紫杉醇粗品；
(4)將上述粗品轉載于用堿性氧化鋁做填料的層析柱，用洗脫溶液進行洗脫，分部收集洗脫部分，并真空干燥，得到樣品；
(5)將上述樣品通過C18高效液相色譜柱純化，然后用含甲醇溶液作流動相洗脫，分部收集紫杉醇洗脫部分，將收集的組分置于通風廚，揮發(fā)有機相，待出現結晶后轉至4°C冰箱放置24h，離心收集一部分晶體，然后將上清液繼續(xù)放置使結晶完全，離心收集另一部分晶體，再將收集的全部晶體冷凍干燥，得到高純度紫杉醇單體。
[0007]作為優(yōu)選，步驟(1)中將所述培養(yǎng)液離心，獲得細胞，然后將細胞用勻漿機勻漿，再將勻漿后的糊狀流體加入等體積的乙醇進行超聲提取，并離心過濾后得到所述濾液。
[0008] 作為另一種優(yōu)選，步驟(1)中將所述培養(yǎng)液經砂芯漏斗抽濾或經板框過濾，得到細胞，然后將細胞用勻漿機勻漿，再將勻漿后的糊狀流體加入等體積的乙醇進行超聲提取，并用砂芯漏斗抽濾，得到所述濾液。
[0009]進一步地，步驟(2)中采用體積濃度為75~85%乙醇溶液進行洗脫。
[0010]進一步地，向蒸干乙醇的洗脫液中加入等體積的萃取劑，萃取劑為1:1的二氯甲烷與水或為1:1的三氯甲烷與水。
[0011]進一步地，步驟(4)采用三氯甲烷:甲醇體積比為96:4的洗脫液 本發(fā)明與現有技術相比，具有以下優(yōu)點:
(I)本發(fā)明選用紫杉醇高產細胞系培養(yǎng)液作為原材料，與紅豆杉枝葉、樹皮等提取相t匕，所含色素、脂質等雜質更少，相比于真菌和細菌發(fā)酵液，其所含紫杉醇更高，該材料方便提取，所含雜質更少。
[0012](2)從紅豆杉細胞培養(yǎng)液中直接用大孔樹脂富集紫杉醇，相對于溶劑提取，節(jié)約了大量有機溶劑使用；相對于膜分離技術，操作更簡便，回收率更高；且大量有機溶劑采用乙醇，環(huán)保安全；
(3)本發(fā)明的總回收率在90%以上，利用高效制備液相能很好控制產品純度，獲得的紫杉醇純度高，可大于99.5% ；
(4)高效制備液相分離紫杉醇的同時，可以分部收集其他紫杉烷類化合物；
(5)整個工藝流程簡便，易于放大產業(yè)化生產。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為本發(fā)明的流程框圖。
【具體實施方式】
[0014]下面結合圖1對本發(fā)明的方法作進一步地詳細說明:
本方法是:(I)將紅豆杉細胞培養(yǎng)液進行固液分離，得到原液和細胞，固液分離可采用用離心、板框過濾、砂芯漏斗抽濾等方式，大規(guī)模生產一般用板框過濾或者離心方式；然后將細胞破壁后過濾，得到濾液和濾渣；再將所述原液與濾液混合；細胞培養(yǎng)液中的紫杉醇幾乎完全溶解在最后混合液中，通過離心或過濾可以除去破碎的細胞成分，所得濾液所含雜質更少，便于后續(xù)的大孔吸附樹脂富集。
[0015](2)將上述混合液體通過非極性大孔樹脂吸附層析柱富集，非極性大孔吸附樹脂可為D-101，HP-30, D4020的一種；然后用蒸餾水沖洗,再用乙醇溶液洗脫,收集洗脫液,并將洗脫液中的乙醇蒸干；這樣能夠從大量液體中富集紫杉醇，濃縮后紫杉醇含量可達I~
5% ο
[0016](3)向上述蒸干乙醇的洗脫液中加入萃取劑，進行兩次液液萃取，收集有機溶劑層，低溫真空干燥，得到大孔樹脂柱富集紫杉醇粗品；萃取后可以除去一部分雜質，并且能除去水分，便于后續(xù)氧化鋁柱層析。
[0017](4)將上述粗品轉載于用堿性氧化鋁做填料的層析柱，用洗脫溶液進行洗脫，分部收集洗脫部分，并真空干燥，得到樣品；堿性氧化鋁層析柱在分離紫杉醇同時可以催化7-表-紫杉醇等紫杉烷類化合物向紫杉醇轉化，除去較難分離的雜質同時提高回收率。
[0018](5)將上述樣品通過C18高效液相色譜柱純化，然后用含甲醇溶液作流動相洗脫，分部收集紫杉醇洗脫部分，將收集的組分置于通風廚，揮發(fā)有機相，待出現結晶后轉至4°C冰箱放置24h，離心收集一部分晶體，然后將上清液繼續(xù)放置使結晶完全，離心收集另一部分晶體，再將收集的全部晶體冷凍干燥，得到高純度紫杉醇單體。由于利用C18高效液相色譜柱，能高效分離紫杉醇，重復性好，便于控制。具體實施例如下:
實施例1
紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)液300mL，經H PLC檢測培養(yǎng)液中和細胞內共含紫杉醇27mg。
[0019](I)將培養(yǎng)液5000r/min離心5min，獲得82mL細胞固體，將細胞用勻漿機在10000r/min的轉速下勻漿2min，將勻漿后的糊狀流體加入等體積的95%乙醇超聲提取30min, 5000r/min離心過濾后得129mL,與之前液體混合共得347mL。
[0020](2)取國產D-101大孔吸附樹脂，濕法裝成1.5X30cm的層析柱，將混合液加載到大孔樹脂色譜柱頂(上樣量約為3mg紫杉醇/mL樹脂)，用蒸餾水沖洗，除去水溶性雜質和色素，用體積百分比含乙醇75%的水溶液洗脫，收集30mL洗脫液，將洗脫液中的乙醇蒸干，加入等體積的三氯甲烷:水(1:1)進行液液萃取，收集有機溶劑層，低溫真空干燥得到1.150g大孔樹脂柱富集紫杉醇粗品，經HPLC分析含紫杉醇2.3% (25.9mg)，紫杉醇收率為95.9%。
[0021](3)將上述1.150g大孔樹脂柱分離粗品，轉載于用堿性氧化鋁做填料的層析柱，三氯甲烷:甲醇體積比為96:4的洗脫液做流動相，分部收集洗脫部分，低溫真空干燥得樣品0.116g ;經HPLC分析含紫杉醇21.7% (25.2mg)，紫杉醇回收率為97.3%.[0022](4)樣品通過C18高效液相色譜柱純化，用含甲醇55%的甲醇水溶液作流動相洗脫，分部收集紫杉醇洗脫部分，將收集的組分置于通風廚，揮發(fā)有機相，待出現結晶后轉至4°C冰箱放置24h，離心獲取晶體，上清液繼續(xù)放置使結晶盡量完全，將收集的晶體冷凍干燥后，得高純度紫杉醇單體。獲得純度為99.6%的精分離紫杉醇24.8mg，回收率為98.4%，總回收率為91.5%。
[0023]實施例2
紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)液IL J^HPLC檢測培養(yǎng)液中和細胞內共含紫杉醇92mg。[0024](1)將培養(yǎng)液經砂芯漏斗抽濾后得260mL細胞固體，將細胞用勻漿機在1000Or/min的轉速下勻衆(zhòng)2min,將勻衆(zhòng)后的糊狀流體加入等體積的95%乙醇超聲提取30min,砂芯漏斗抽濾后得405mL,與之前液體混合后共得1145mL。
[0025](2)取進口 HP-30大孔吸附樹脂，濕法裝成2 X 30cm的層析柱，將混合液加載到大孔樹脂色譜柱頂(上樣量約為3mg紫杉醇/mL樹脂)，用蒸餾水沖洗，除去水溶性雜質和色素，用體積百分比含乙醇80%的水溶液洗脫，收集IOOmL的洗脫液，將洗脫液中的乙醇蒸干，加入等體積的二氯甲烷:水(1:1)進行液液萃取，收集有機溶劑層，低溫真空干燥得到3.351g大孔樹脂柱富集紫杉醇粗品，經HPLC分析含紫杉醇2.6% (88.5mg)，紫杉醇回收率為96.2%。
[0026](3)將上述3.351g大孔樹脂柱分離粗品，轉載于用堿性氧化鋁做填料的層析柱，三氯甲烷:甲醇體積比為96:4的洗脫液做流動相，分部收集洗脫部分，50°C真空干燥，得樣品0.349g ;經HPLC分析含紫杉醇24.8% (86.7mg)，紫杉醇回收率為98.0%。
[0027](4)樣品通過C18高效液相色譜柱純化，用含甲醇55%的甲醇水溶液作流動相洗脫，分部收集紫杉醇洗脫部分，將收集的組分置于通風廚，揮發(fā)有機相，待出現結晶后轉至4°C冰箱放置24h，離心獲取晶體，上清液繼續(xù)放置使結晶盡量完全，將收集的晶體冷凍干燥后，得高純度紫杉醇單體85.63mg，純度為99.5%，回收率為98.3 %，總回收率為92.6%。
[0028]實施例3
紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)液3L，經HPLC檢測培養(yǎng)液中和細胞內共含紫杉醇265mg。
[0029](I)將培養(yǎng)液經砂芯漏斗抽濾后得775mL細胞固體，將細胞用勻漿機在1000Or/min的轉速下勻衆(zhòng)2min,將勻衆(zhòng)后的糊狀流體加入等體積的95%乙醇超聲提取30min,過濾后得1210mL，與之前液體混合共得3435mL。
[0030](2)取國產D-101大孔吸附樹脂，濕法裝成3X30cm的層析柱，將混合液加載到大孔樹脂色譜柱頂(上樣量約為3mg紫杉醇/mL樹脂)，用蒸餾水沖洗，除去水溶性雜質和色素，用體積百分比含乙醇85%的水溶液洗脫，收集300mL的洗脫液，將洗脫液中的乙醇蒸干，加入等體積的三氯甲烷:水(1:1)進行液液萃取，收集有機溶劑層，低溫真空干燥得到12.130g大孔樹脂柱富集紫杉醇粗品，經HPLC分析含紫杉醇2.1% (251mg)，紫杉醇收率為94.7%。
[0031](3)將上述12.130g大孔樹脂柱分離粗品，裝載于用堿性氧化鋁做填料的層析柱，三氯甲烷:甲醇體積比為96:4的洗脫液做流動相，分部收集洗脫部分，低溫真空干燥，得樣品1.098g,經HPLC分析含紫杉醇22.3% (245mg)，紫杉醇回收率為97.6%。
[0032](4)樣品通過C18高效液相色譜柱純化，用含甲醇50%的甲醇水溶液作流動相洗脫，分部收集紫杉醇洗脫部分，將收集的組分置于通風廚，揮發(fā)有機相，待出現結晶后轉至4°C冰箱放置24h，離心獲取晶體，上清液繼續(xù)放置使結晶盡量完全，將收集的晶體冷凍干燥后，得高純度紫杉醇單體。獲得純度為99.5%的精分離紫杉醇242mg，回收率為98.5%，總回收率為90.9%
上述實施方式僅供說明本發(fā)明之用，而并非是對本發(fā)明的限制，有關【技術領域】的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的情況下，還可以作出各種變化和變型，因此所有等同的技術方案也應屬于本發(fā)明的范疇。
【權利要求】
1.從紅豆杉細胞培養(yǎng)液中制備高純度紫杉醇的方法，其包括以下步驟: (1)將紅豆杉細胞培養(yǎng)液進行固液分離，得到原液和細胞；然后將細胞破壁后過濾，得到濾液和濾渣；再將所述原液與濾液混合； (2)將上述混合液體通過非極性大孔樹脂吸附層析柱富集，然后用蒸餾水沖洗，再用乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，并將洗脫液中的乙醇蒸干； (3)向上述蒸干乙醇的洗脫液中加入萃取劑，進行兩次液液萃取，收集有機溶劑層，低溫真空干燥，得到大孔樹脂柱富集紫杉醇粗品； (4)將上述粗品轉載于用堿性氧化鋁做填料的層析柱，用洗脫溶液進行洗脫，分部收集洗脫部分，并真空干燥，得到樣品； (5)將上述樣品通過C18高效液相色譜柱純化，然后用含甲醇溶液作流動相洗脫，分部收集紫杉醇洗脫部分，將收集的組分置于通風廚，揮發(fā)有機相，待出現結晶后轉至4°C冰箱放置24h，離心收集一部分晶體，然后將上清液繼續(xù)放置使結晶完全，離心收集另一部分晶體，再將收集的全部晶體冷凍干燥，得到高純度紫杉醇單體。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中將所述培養(yǎng)液離心，獲得細胞，然后將細胞用勻漿機勻漿，再將勻漿后的糊狀流體加入等體積的乙醇進行超聲提取，并離心過濾后得到所述濾液。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中將所述培養(yǎng)液經砂芯漏斗抽濾或經板框過濾，得到細胞，然后將細胞用勻漿機勻漿，再將勻漿后的糊狀流體加入等體積的乙醇進行超聲提取，并用砂芯漏斗抽濾，得到所述濾液。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于:步驟(2)中采用體積濃度為75~85%乙醇溶液進行洗脫。
5.根據權利要求4所述的方`法，其特征在于:在步驟(3)中，向蒸干乙醇的洗脫液中加入等體積的萃取劑，萃取劑為1:1的二氯甲烷與水或為1:1的三氯甲烷與水。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于:步驟(4)采用三氯甲烷:甲醇體積比為96:4的洗脫液。
【文檔編號】C07D305/14GK103570647SQ201310546214
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月6日 優(yōu)先權日:2013年11月6日
【發(fā)明者】熊興耀, 楊星星, 蘇小軍, 王仁才 申請人:湖南農業(yè)大學