專利名稱：抗體組合物的制作方法
抗體組合物
技術領域：
本發(fā)明涉及可由血漿免疫球蛋白，尤其是血漿IgG的分級分離，由在西洋接骨木(Sambucus nigra)親和性柱上親和層析獲得的抗體群,及其用途。
背景技術：
免疫球蛋白，也被稱為抗體，是免疫系統(tǒng)的主要分泌產(chǎn)物。它們一般由各具有2個重鏈和2個輕鏈的基本結構單元形成而形成具有一個該單元的單體，具有2個單元的二聚體，具有5個單元的五聚體，或具有6個單元的六聚體。抗體在先天性免疫中起到顯著作用。在針對病原體的天然的免疫應答中，在病原體和抗體之間形成復合物。這些免疫復合物活化廣范圍的效應子功能，由此導致病原體的殺死，移出和破壞?？贵w也可與身體的自身抗原反應，其可導致自身免疫疾病，及貢獻于慢性炎性癥狀?？贵w可，例如通過在炎性級聯(lián)中靶向及中和各種介質而具有抗-炎性活性。有免疫球蛋白的5種主要同種型，其實施不同作用。IgG提供大多數(shù)針對侵襲病原體的基于抗體的免疫，且在以下更細討論。IgM以膜結合形式及在溶液中發(fā)生。在溶液中，其一般形成五聚體，在結合抗原中提供高親合力。其常常是在產(chǎn)生足夠的特定IgG之前針對感染的第1，立即防御。IgA通常作為二聚體發(fā)生及見于粘膜區(qū)，例如腸，肺和泌尿生殖道。其保護這些表面免于由病原體定居。IgE主要涉及過敏性反應。其結合過敏原及引發(fā)組胺自肥大細胞和嗜堿性粒細胞釋放。IgD主要見于未暴露于抗原的B淋巴細胞表面。在人中，根據(jù)它們的在正常血清中相對濃度定義及編號4種亞類的IgG:IgGl，IgG2，IgG3和IgG4，其分別占血清IgG的大致60%，25%，10%和5%，各IgG亞類具有獨特效應子功能。一般而言，各個體單體免疫球蛋白單元，例如IgG分子，由2個同一輕鏈和2個同一重鏈組成，其進而包含大致Iio個氨基酸殘基的重復結構基序。輕和重鏈的結構域以共價和非-共價關聯(lián)配對，由此形成通過柔性的接頭，所謂的鉸鏈區(qū)連接的3個獨立蛋白部分。這些部分之2個指稱為Fab (抗原-結合片段)區(qū)，且是同一結構。各Fab區(qū)形成相同的特異性抗原-結合位點。第3部分是Fe (可結晶化的片段)區(qū)，其形成活化清除及運輸機理的配體的相互作用位點。IgG在疾病中起到重要作用。IgGl-型抗體是在癌免疫治療中最通常使用的抗體，其中抗體-依賴性細胞-介導的細胞毒性(ADCC)常常被認為是重要的。此外，IgG已知通過由它們的Fe片段介導的相互作用介導促炎和抗炎活性。一方面，F(xiàn)e和其相應受體之間的相互作用負責免疫復合物和細胞毒性抗體的促-炎性性質。另一方面，靜脈內Y球蛋白(IVIG)和其Fe片段是抗-炎性的，及廣泛使用以抑制炎性疾病。該矛盾的性質的精確的機理是不清楚的，但已建議IgG的糖基化對于調節(jié)IgG的細胞毒性和炎性潛力是關鍵的。至今，對于由IgG介導的細胞毒性和炎性效應的調節(jié)中糖基化的作用的研究主要聚焦于Fe區(qū)。IgG的糖基化對于通過維持2個重鏈的開放構象結合全部FcyR是必要的。此FcyR結合對IgG糖基化的需求解釋去-糖基化的IgG抗體不能介導體內引發(fā)的炎性應答，諸如抗體-依賴性細胞-介導的細胞毒性(ADCC)，炎性介質的吞噬和釋放。自身免疫狀態(tài)和IgG抗體的特定糖基化模式之間的聯(lián)系已在患類風濕性關節(jié)炎和幾自身免疫血管炎的患者中觀察到，其中已報道IgG抗體的降低的半乳糖基化和唾液酸化(Parekh et al. , Nature316, 452 (1985) ; Rademacher et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91，6123 (1994) ; Matsumotoet al.，128，621 (2000))。國際專利申請WO 2007/117505公開含有至少I個IgG Fe區(qū)的多肽，所述多肽相比未純化的抗體具有更高抗-炎性活性及更低細胞毒性活性。在本申請中發(fā)現(xiàn)，就增加的Fe片段上N-聯(lián)糖基化位點的唾液酸化富集的IgG制備物顯示增強的體內抗-炎性活性。相反，得出Fab片段顯示在此體內測定中無抗-炎性活性。由與WO 2007/117505相同的發(fā)明人的國際申請WO 2008/057634公開含有至少I個IgG Fe區(qū)的多肽，其中所述至少I個IgG Fe區(qū)用至少I個由α -2，6連接與相應末端唾液酸部分連接的半乳糖部分糖基化。WO 2008/057634的多肽相比未純化的抗體具有更高抗-炎性活性。也在本申請中發(fā)現(xiàn)，就增加的Fe片段上N-聯(lián)糖基化位點的唾液酸化富集 的IgG制備物顯示增強的體內抗-炎性活性。相反，得出Fab片段顯示在此體內測定中無抗-炎性活性。由相同的發(fā)明人的國際申請WO 2009/079382提供進一步證據(jù)顯示，抗-炎性活性是由于Fe片段，而非Fab片段上增加的唾液酸化。在由Nimmerjahn & Ravetch 的注釋(JEM 204，11 15 (2007))中，作者明顯教導，F(xiàn)e區(qū)中的唾液酸化對于IVIG的抗-炎性活性是關鍵的。此外，它們陳述，位于Fab區(qū)的抗原結合結構域，在IgG的抗-炎性活性中的一般化的作用是不可能的，給定在它們的掌握中，完整IVIG和其Fe片段具有相當?shù)目?炎性活性。國際申請WO 2007/005786針對控制含有Fe的分子的性質的方法，所述方法包括改變Fe區(qū)中寡糖的唾液酸化。在本申請中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e寡糖的唾液酸化的水平改變重組-產(chǎn)生的治療性抗體對Fe Y受體的親和性，導致這些抗體的各種方面的生物學作用的調節(jié)。還發(fā)現(xiàn)，唾液酸自Fe寡糖的移出增強重組-產(chǎn)生的治療性抗體對它們的靶分子的親合力。但是，效應被認為完全是Fe介導的，因為觀察到在各Fab臂和靶之間的固有親和性中無差異。WO 2007/005786的發(fā)明人假定，帶電的靜態(tài)基團自Fe寡糖的移出允許總體抗體結構中更多柔性，由此提供彼此關聯(lián)的2個結合結構域的更高相互作用潛力。由 Jefferis 的新近綜述(Jefferis，R.;Nat Rev DrugDiscov. 2009Mar;8(3) :226-34)討論糖基化為改善基于抗體的治療劑的策略。根據(jù)Jefferis，大致30%的多克隆人IgG分子在IgG Fab區(qū)中帶有N-聯(lián)寡糖，和對于IgG Fab相比IgG Fe觀察到更高水平的半乳糖基化和唾液酸化。當存在時，糖基化附接于可變區(qū)，且不清楚多克隆IgG的IgGFab糖基化的功能意義?；趯慰寺】贵w的研究，推測抗體的Fab區(qū)的糖基化可對抗原結合具有中性，陽性或陰性影響。無對此進一步研究的動機，也無對富集Fab區(qū)中糖基化的抗體群的進一步研究的動機。由此，已加強地研究具有增加的量的抗體Fe區(qū)中的唾液酸化的抗體制備物用于預防和治療各種疾病，也已討論抗體Fab區(qū)的糖基化的潛在作用。在國際專利申請PCT/US2010/028889中，我們報道了抗體由西洋接骨木(Sambucus nigra)親和層析的分級分離,其中全部結合的物質用單級分(+SA)中的酸性乳糖洗脫。我們顯示，洗脫的具有增加的Fab區(qū)中的唾液酸化的級分具有驚人免疫調節(jié)效應。
但是，然而許多抗體產(chǎn)物目前用于治療，仍有對于提供在臨床應用中具有更有益有效性的替代性的和/或改善的抗體制備物的需求。
對于此技術問題的解決方案通過提供權利要求中表征的實施方式來達到。在本文中，我們公開結合到西洋接骨木(Sambucus nigra)親和性柱的物質的進一步分離,用中性 PH的碳水化合物第I次洗脫，之后是用酸性pH的碳水化合物洗脫。我們顯示，在用中性碳水化合物預洗脫之后用酸性碳水化合物洗脫的抗體意外地增強了免疫調節(jié)活性。
發(fā)明概述
本發(fā)明的一方面是產(chǎn)生具有增強的免疫調節(jié)活性的抗體群的方法，包括以下步驟
(a)使抗體制備物在西洋接骨木(Sambucus nigra)凝集素或其相當體上經(jīng)歷親和層析，
(b)任選地收集非_結合抗體群(-SNA級分)，
(c)任選地洗滌親和性基質；
(d)用中性pH的碳水化合物洗脫結合的抗體群(El級分)，
(e)用酸性pH的碳水化合物洗脫余下的結合的抗體群(E2級分)，
其中E2級分相比SNA基質的總洗出液(+SNA級分)具有增強的免疫調節(jié)活性。
優(yōu)選地，碳水化合物是糖，更優(yōu)選，糖是乳糖。
優(yōu)選地，中性pH是6 8的范圍內的pH，更優(yōu)選在6. 5 7. 5的范圍內，甚至更優(yōu)選，pH是約7. 5。
優(yōu)選地，酸性pH是5以下的pH，更優(yōu)選4以下的pH，甚至更優(yōu)選3. 5以下的pH，最優(yōu)選約3的pH。
抗體制備物優(yōu)選是自人血漿分離的IgG制備物，更優(yōu)選自從至少1000個供體合并的人血漿分離的IgG制備物，甚至更優(yōu)選抗體制備物是IVIG或SCIG制備物。
免疫調節(jié)活性可通過使用用于測量抗_炎性活性的體外測定來測定。優(yōu)選地，測定測量炎性刺激對血細胞或細胞系的效應的抑制，例如由植物凝集素，干擾素_ Y，脂多糖 (LPS)，TLR激動劑或其他劑對外周血單核細胞(PBMC)或細胞系諸如U937或類似細胞系的刺激。炎性效應可，例如，通過測量細胞表面標記物或細胞因子的產(chǎn)生來測定。優(yōu)選地，免疫調節(jié)活性通過測量由單核細胞的植物凝集素-誘導的或LPS-誘導的CD54表達或血細胞的細胞因子分泌的抑制來測定。
優(yōu)選地，可在步驟e中獲得的抗體群(E2級分)的免疫調節(jié)活性至少10%大于總結合的及洗脫的級分(+SNA級分)或可在步驟d中獲得的抗體群(El級分)的免疫調節(jié)活性。
本發(fā)明的另一方面是可由上述方法獲得的抗體群。
優(yōu)選地，在以上描述的方法的步驟d中可由用中性pH的碳水化合物洗脫獲得的抗體群(El級分)
(a)具有與親和層析之前的抗體制備物約相當?shù)腇e區(qū)中的唾液酸化；和/或
(b)具有相比親和層析之前的抗體制備物至少50%,優(yōu)選至少60%,甚至更優(yōu)選至少70%，甚至更優(yōu)選至少80%，最優(yōu)選大于90%更高的Fab區(qū)中總聚糖的唾液酸化。
優(yōu)選地，在以上描述的方法的步驟e中可由用酸性pH的碳水化合物洗脫獲得的抗體群(E2級分)
(a)具有相比親和層析之前的抗體制備物或相比步驟d的級分至少15%，優(yōu)選至少 20%，甚至更優(yōu)選至少22，24，25，26，27，28，29，30%更高的Fe區(qū)中的唾液酸化；和/或
(b)具有相比親和層析之前的抗體制備物至少50%,優(yōu)選至少60%,甚至更優(yōu)選至少70%，甚至更優(yōu)選至少80%，最優(yōu)選大于90%更高的Fab區(qū)中總聚糖的唾液酸化；和/或
(C)具有相比步驟d的抗體群至少4%,優(yōu)選至少5%,甚至更優(yōu)選至少6%更高的Fab 區(qū)中總聚糖的唾液酸化。
本發(fā)明的再一方面是藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗體群，及藥學可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明的再一方面是本發(fā)明的抗體群，其用作藥物。
本發(fā)明的仍再一方面是本發(fā)明的抗體群，其用于治療或預防炎性病情。優(yōu)選地， 炎性病情是自身免疫疾病或神經(jīng)退行性疾病。更優(yōu)選，自身免疫或神經(jīng)退行性疾病選自 類風濕性關節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，抗磷脂綜合征，免疫血小板減少癥(ITP)，川崎病，GuillainBarr6綜合征(GBS)，多發(fā)性硬化(MS)，慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病 (CIDP)，皮膚發(fā)皰病，皮肌炎，多發(fā)性肌炎，阿爾茨海默病，帕金森病， 與唐氏綜合征相關的阿爾茨海默病，腦淀粉樣血管病，癡呆伴列維小體，額顳葉退化和血管性癡呆。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及產(chǎn)生抗體群的方法，以及得到的具有增強的免疫調節(jié)活性的抗體群。 方法基于由在西洋接骨木(Sambucus nigra)凝集素(SNA)親和性基質或其相當體上親和層析分級分離。抗體群具有相比分級分離之前的抗體制備物或甚至相比自親和性基質洗脫的抗體的總級分(+SNA)增強的免疫調節(jié)活性。免疫調節(jié)活性可通過使用，例如，用于測量抗-炎性活性的體外測定來測定。本領域技術人員熟知該測定。優(yōu)選地，測定測量炎性刺激對血細胞或細胞系的效應的抑制，例如由植物凝集素，LPS;干擾素-Y，TLR激動劑或其他劑刺激對外周血單核細胞(PBMC)或細胞系諸如U937或類似細胞系。炎性效應可，例如， 通過測量細胞表面標記物或細胞因子的產(chǎn)生來測定。優(yōu)選地，免疫調節(jié)活性通過測量植物凝集素_誘導的或LPS-誘導的由單核細胞的CD54表達的抑制來測定。
抗體群的免疫調節(jié)活性增強至少10%，優(yōu)選至少12%，13%14%，或15%，更優(yōu)選至少 18%，甚至更優(yōu)選至少20%,甚至更優(yōu)選21，22，23，24，25，26，27，28，29，30%,最優(yōu)選大于30% (相比總+SNA IVIG)。
本發(fā)明的另一實施方式是抗體群，其可由以下步驟自抗體制備物獲得
(a)使抗體制備物經(jīng)歷在西洋接骨木(Sambucus nigra)凝集素基質或其相當體上親和層析，
(b)任選地收集非_結合群(-SNA級分)，
(c)任選地包括洗滌的步驟，以及
(d)用中性pH的碳水化合物洗脫結合的群(El級分)，以及
(e)用酸性pH的碳水化合物洗脫仍結合的群(E2級分)，
其中E2級分具有相比SNA柱的總洗出液(+SNA級分)增強的免疫調節(jié)活性。
本發(fā)明的進一步實施方式是產(chǎn)生具有增強的免疫調節(jié)活性的抗體群的方法，包括以下步驟
(a)使抗體制備物在西洋接骨木(Sambucus nigra)凝集素或其相當體上經(jīng)歷親和層析，
(b)任選地收集非_結合群(-SNA級分)，
(C)任選地包括洗滌的步驟，
(d)用中性pH的碳水化合物洗脫結合的群(El級分)，
(e)用酸性pH的碳水化合物洗脫余下的結合的群(E2級分)，
其中E2級分具有相比SNA柱的總洗出液(+SNA級分)增強的免疫調節(jié)活性。
用于洗脫的碳水化合物優(yōu)選是糖，更優(yōu)選其是乳糖或唾液酸乳糖，最優(yōu)選的是乳糖。
抗體制備物優(yōu)選分離自人血漿，優(yōu)選自至少1000個供體合并的人血漿，更優(yōu)選抗體制備物富集IgG，甚至更優(yōu)選，其是純化的IgG。最優(yōu)選，其是配制用于靜脈內或皮下施用給患者的人IgG制備物，諸如IVIg或SCIg，尤其是治療性產(chǎn)品諸如Sandoglobulin， Privigen或Hizentra。一般抗體制備物的IgA和IgM含量會在2%以下,優(yōu)選在I. 5%以下， 更優(yōu)選在1%以下。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的抗體群的組合物。
術語〃組合物〃根據(jù)本發(fā)明，涉及包含本發(fā)明的抗體群的組合物。由于本發(fā)明的抗體群可由在結合唾液酸殘基的親和性基質上分級分離來獲得，其也是自抗體制備物富集的抗體群，其中富集的抗體群相比富集之前的抗體制備物在抗體的Fab區(qū)內具有改變的唾液酸化模式，或其包含至少抗體群，其中抗體群相比富集之前的抗體制備物在抗體Fab區(qū)內具有改變的唾液酸化模式。組合物可，任選地，還包含能改變本發(fā)明的抗體群的特征，由此，例如，減少，穩(wěn)定化，延遲，調節(jié)和/或活化抗體功能的分子。組合物可為固體，或液體形式，和可為，尤其，粉，片劑，溶液或氣霧劑形式。
在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的組合物是藥物組合物，其任選地還包含藥學可接受的載體，賦形劑和/或稀釋劑。
根據(jù)本發(fā)明，術語“藥物組合物”涉及用于施用給患者，優(yōu)選人患者的組合物。本發(fā)明的藥物組合物包含以上敘述的抗體群。本發(fā)明的藥物組合物可，任選地和另外地，包含藥學可接受的載體。“藥學可接受的載體”是指非_毒性固體，半固體或液體填料，稀釋劑，包裹材料或任何類型的輔助制劑。適合的藥學載體的例為本領域所熟知及包括氯化鈉溶液，磷酸鹽緩沖的氯化鈉溶液，水，乳劑，諸如油/水乳劑，各種類型的潤濕劑，無菌溶液， 有機溶劑等。優(yōu)選載體是腸胃外載體，更優(yōu)選與受者血等滲的溶液。載體適宜地含有少數(shù)量的添加劑諸如增強等滲性和化學穩(wěn)定性的物質。該物質以所采用的劑量和濃度對受者是非_毒性的，及包括緩沖劑諸如磷酸，檸檬酸，琥珀酸，乙酸，及其他有機酸或它們的鹽；抗氧化劑諸如抗壞血酸；低分子量(小于約10個殘基)(聚)肽，例如，聚精氨酸或三肽；蛋白， 諸如血清白蛋白，明膠或還有免疫球蛋白；親水聚合物諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸，脯氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，或精氨酸；單糖，二糖和其他碳水化合物包括纖維素或其衍生物，葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合劑諸如EDTA ;糖醇諸如甘露糖醇或山梨糖醇；對離子諸如鈉；和/或非離子表面活性劑諸如聚山梨酯，泊洛沙姆或PEG。
包含該載體的組合物可由熟知的常規(guī)方法配制。一般而言，制劑通過使藥物組合物的組分與液體載體或精致地細分的固體載體或二者均勻和密切地接觸來制備。然后，如果必需，產(chǎn)物塑形為期望的制劑。
可將這些藥物組合物以適合的劑量施用于受試者。劑量方案會由主治醫(yī)師和臨床因素確定。如在醫(yī)療領域熟知，任何一個患者的劑量依賴于許多因素，包括患者的大小，身體表面積，齡，待施用的特定化合物，性別，時間和施用途徑，一般健康和同時施用的其他藥物。給定情況的治療有效量會通過常規(guī)實驗容易確定，且在普通臨床醫(yī)師或醫(yī)師的技能和判斷之內。藥物組合物可為用于一次施用或用于規(guī)則施用延長的時間。一般而言，藥物組合物的施用應在對于單劑量例如 ο μ g/kg的體重 2g/kg的體重的范圍內。但是，更優(yōu)選的劑量可在對于單劑量100 μ g/kg I. 5g/kg的體重,甚至更優(yōu)選lmg/kg lg/kg的體重和甚至更優(yōu)選10mg/kg 500mg/kg的體重的范圍內。本發(fā)明的藥物組合物的施用可由不同方式實現(xiàn)，例如，由靜脈內，腹膜內，皮下，肌內，真皮內，口腔，鼻內或支氣管內施用。
待用于治療性施用的藥物組合物的組分必需是無菌的。無菌性由通過無菌過濾膜 (例如，O. 2 μ m膜)過濾容易實現(xiàn)。
藥物組合物的組分通常會作為水溶液或作為用于再構成的凍干制劑存儲于單元或多-劑量容器，例如，密封的安瓿或瓶中。作為凍干制劑的一例，IOml瓶用5ml的無菌過濾的1% (w/v)水溶液填充，并將得到的混合物冷凍干燥。輸注溶液通過使用抑菌注射用水重建冷凍干燥的化合物來制備。也可存在防腐劑和其他添加劑諸如，例如，抗微生物劑，抗氧化劑，螯合劑和惰性氣體等。藥物組合物可依賴于旨在的藥物組合物的用途包含其他劑。
另一實施方式是本發(fā)明的抗體群，或組合物，優(yōu)選包含本發(fā)明的抗體群的藥物組合物的醫(yī)療用途?！?br> 也包括在本發(fā)明中的是本發(fā)明的抗體群，其用于治療或預防炎性病情，例如自身免疫疾病和/或神經(jīng)退行性疾病，諸如類風濕性關節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，抗磷脂綜合征，免疫血小板減少癥(ITP)，川崎病，Guillain Barre綜合征(GBS)，多發(fā)性硬化(MS)， 慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(CIDP)，皮膚發(fā)皰病，皮肌炎，多發(fā)性肌炎，阿爾茨海默病，帕金森病，與唐氏綜合征相關的阿爾茨海默病，腦淀粉樣血管病，癡呆伴列維小體，額顳葉退化或血管性癡呆。優(yōu)選地，用于這些病情的抗體群具有增加的唾液酸含量，優(yōu)選在抗體的Fab或Fe區(qū)，更優(yōu)選Fab區(qū)內增加的唾液酸含量。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明的抗體群，其用于預防和/或治療動脈粥樣硬化，癌和感染諸如細菌，病毒或真菌感染。
本發(fā)明的抗體群可用于不依從于傳統(tǒng)處理方案(例如由于針對抗生素的抗性的發(fā)生)的感染的預防和/或治療是特別優(yōu)選的。
本文所述的全部疾病為本領域技術人員所熟知，及根據(jù)本領域技術人員的現(xiàn)有技術和公知常識定義。
如上所述,本發(fā)明的抗體群可由抗體制備物在西洋接骨木(Sambucus nigra)親和性基質上分級分離獲得。西洋接骨木(Sambucus nigra)凝集素是特異于末端α 2，6_連接的唾液酸殘基的凝集素。因此，抗體群與親和性柱的結合與本發(fā)明的抗體群相比見于親和性柱的流通的抗體群和甚至用中性PH的碳水化合物洗脫的抗體群的增強的唾液酸化關聯(lián)是可能的。增強的唾液酸化可能見于Fab區(qū)，但增強的唾液酸化也可見于Fe區(qū)。術語〃唾液酸化的量〃和〃唾液酸的量〃在本文互換使用。如下定義，改變的量的唾液酸化可為抗體的Fab區(qū)或Fe區(qū)內唾液酸化的量的增加或減小。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體群不同于親和層析之前的抗體制備物在于具有相比親和層析之前的抗體制備物中Fab區(qū)內唾液酸化的量至少I. 25倍更高或更低，更優(yōu)選至少I. 5倍更高或更低，更優(yōu)選至少2倍更高或更低諸如至少3倍或至少4倍更高或更低的量的唾液酸化。更優(yōu)選，唾液酸化的量相比親和層析之前的抗體制備物中的Fab區(qū)內的唾液酸化的量至少5倍更高或更低。術語"倍更高或更低 "指稱當測量總聚糖的％唾液酸化的聚糖時相比原材料相對增加或減小。例如，如果抗體群在親和層析之前具有聚糖的15%的唾液酸的量，則抗體群具有3倍更高或更低量的唾液酸會分別具有45%或5%聚糖有唾液酸。在IgG的情況中，F(xiàn)e片段的唾液酸化通過用蛋白酶諸如胰蛋白酶消化，之后是分析得到的Fe-特異性糖肽(例如描述于實施例2，方法(a))來測定，及本文引述的富集數(shù)指稱總Fe-特異性糖肽中具有一個或更多唾液酸殘基的Fe-特異性糖肽的富集倍數(shù)或百分率。IgG分子的總唾液酸化(包括Fab和Fe唾液酸化)可通過用 N-糖苷酶F消化胰蛋白酶肽，之后是分析釋放的聚糖(例如描述于實施例2，方法(b))來測定。在此情況中，數(shù)指稱總聚糖中具有一個或更多唾液酸殘基的聚糖的數(shù)或百分率。
本發(fā)明的抗體群可為分離的和/或純化的抗體群，依賴于抗體制備物作為用于親和層析的原材料的選擇。
根據(jù)本發(fā)明的全部實施方式，抗體可從血漿提取，或可由本領域知道的各種過程中的任何一種產(chǎn)生，例如如描述于Harlow和Lane (1988)和(1999), loc. cit。由此,抗體可，例如，合成產(chǎn)生，及也可包括擬肽。而且，可應用為單鏈抗體的產(chǎn)生所描述的技術(見， 尤其，US專利4，946，778)。而且，轉基因動物或植物(見，例如，US專利6，080，560)可用于表達(人源化的)抗體。為制備單克隆抗體，可使用提供由連續(xù)細胞系培養(yǎng)產(chǎn)生的抗體的任何技術。本領域知道的該技術的例，例如描述于Harlow和Lane (1988)和(1999)，Ioc. cit.及包括雜交瘤技術(Kiihler和 Milstein Nature 256 (1975)，495 497)，三源雜交瘤技術，人B細胞雜交瘤技術(Kozbor, Immunology Today4 (1983), 72)和EBV-雜交瘤技術，以產(chǎn)生人單克隆抗體(Cole 等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc (1985)，77 96)。在本發(fā)明的情景中也面對，術語“抗體”包含可在細胞中表達的抗體構建體，例如可經(jīng)，尤其是，病毒或質粒載體轉染和/或轉導的抗體構建體。
因為根據(jù)本發(fā)明，在Fab區(qū)內具有低水平的唾液酸化或無唾液酸化的抗體會不被親和層析結合，在步驟(a)中不結合的及在步驟(b)中收集的抗體群是相比親和層析之前的制備物具有降低的量的抗體的Fab區(qū)內的唾液酸化的群。換言之，此抗體群是唾液酸耗竭的群。在步驟(a)中結合的及自親和性基質用碳水化合物洗脫的抗體群是相比親和層析之前的制備物具有增加的量的抗體的Fab區(qū)內的唾液酸化的群，由于具有高水平的Fab區(qū)內的唾液酸化的抗體與親和層析的結合。由此，起始的抗體群的抗體分離到具有增加的或降低的量的抗體的Fab區(qū)內的唾液酸化的富集的群。
在本發(fā)明的方法的優(yōu)選的實施方式中，在裝載柱及起始洗脫之間實施至少一個洗滌步驟(權利要求I中的步驟C)。適合的洗滌溶液為本領域技術人員所熟知，可使用例如， Tris-緩沖的鹽水(TBS)或磷酸鹽緩沖液(PBS)。
在本發(fā)明的方法的更優(yōu)選的實施方式中，親和層析對于唾液酸化的抗體Fe區(qū)相比對于唾液酸化的抗體Fab區(qū)具有更低親和性，即親和性對于Fab唾液酸化超過Fe唾液酸化是選擇性的。由此，在本發(fā)明的方法中采用的親和性基質會優(yōu)先結合抗體Fab區(qū)中含有的唾液酸但不，或僅以更小程度，結合抗體Fe區(qū)中含有的唾液酸。因而，由于分離基于Fab 唾液酸化，由洗脫(權利要求I中的步驟d和e)獲得的抗體群相比具有Fe唾液酸化的抗體，更富集具有Fab唾液酸化的抗體及，類似地，在步驟(b)中獲得的抗體群更富集無或幾乎無 Fab唾液酸化的抗體，無關于它們的Fe唾液酸化。優(yōu)選地，F(xiàn)e唾液酸化會不同小于100%， 更優(yōu)選小于50%，甚至更優(yōu)選小于30%，最優(yōu)選小于20%，當測量總糖肽的％唾液酸化的糖肽時。
本發(fā)明還涉及抗體群，其中抗體群具有相比親和層析之前的抗體制備物改變的量的抗體的Fab區(qū)內的唾液酸化。
可如以上描述實施確定是否抗體群具有相比富集之前的抗體制備物改變的量的抗體的Fab區(qū)內的唾液酸化。改變的量的唾液酸化被認為是與在目前可利用的方法的多血癥的檢測限之內的IVIG的唾液酸化的量不同的任何量的唾液酸化。優(yōu)選地，抗體群的唾液酸化量相比富集之前的抗體制備物中的抗體中Fab區(qū)內的唾液酸化的量至少I. 25倍更高或更低，更優(yōu)選至少I. 5倍更高或更低，更優(yōu)選至少2倍更高或更低諸如至少3倍或至少4 倍更高或更低。更優(yōu)選，唾液酸化的量相比富集之前的抗體制備物中的抗體中Fab區(qū)內的唾液酸化的量至少5倍更高或更低。如上所述，術語〃倍更高或更低〃指稱相比富集之前的抗體制備物中的唾液酸的量相對增加或減小。
也面對的是，本發(fā)明的抗體的Fab區(qū)的唾液酸化的量可進一步修飾。
例如，唾液酸化的量可修飾使得獲得抗體的Fab區(qū)內的唾液酸化的進一步增加或減小，導致相應抗體群的唾液酸化的總量的進一步修飾。面對抗體Fab區(qū)中唾液酸量的增加以及減小。當本發(fā)明的抗體群在抗體Fab區(qū)中具有增加的量的唾液酸時是優(yōu)選的，進一步修飾是抗體Fab區(qū)中唾液酸量的另外的增加。當本發(fā)明的抗體群在抗體Fab區(qū)內具有降低的量的唾液酸時其也是優(yōu)選的，進一步修飾是抗體Fab區(qū)內唾液酸量的另外的減小。
也面對進一步修飾唾液酸化的模式，即唾液酸類型和/或抗體Fab區(qū)內它們的位置。
唾液酸化模式的修飾酶學地實現(xiàn)。酶促修飾可，例如，通過使用唾液酸轉移酶和唾液酸的供體實施，以便增加抗體Fab區(qū)內的唾液酸量?；蛘?例如,通過使用唾液酸酶，由此移出唾液酸可達到抗體Fab區(qū)內唾液酸量的減小。
唾液酸轉移酶的非限制性例是ST3Gal III，也被稱為α -(2，3)唾液酸轉移酶(EC 2. 4. 99.6)，及α-(2，6)唾液酸轉移酶(EC 2.4.99.1)。α - (2，3)唾液酸轉移酶催化唾液酸向 Gal-β-1，3GlcNAc 或 Gal-β-1，4GlcNAc 糖苷的 Gal 的轉移(Wen et al. , J. Biol. Chem. 267:21011(1992) ; Van denEijnden et al. , J. Biol. Chem. 256:3159 (1991))及負責糖肽中天冬酰胺_連接的寡糖的唾液酸化。α -(2，6)唾液酸轉移酶的活性導致6-唾液酸化的寡糖，包括6-唾液酸化的半乳糖。存在不同形式的α_(2，6)唾液酸轉移酶及可從不同組織分離，或可通過使用重組技術產(chǎn)生。
唾液酸酶(也被稱為神經(jīng)氨酸酶，N-乙酰神經(jīng)氨酸糖原水解酶)的非限制性例是唾液酸酶 Au，α -(2-3, 6, 8, 9) (EC 3. 2. I. 18);唾液酸酶 Cp，α -(2-3, 6) (EC3. 5. I. 18)和唾液酸酶 Sp α -(2-3) (EC 3. 5. I. 18)。
為了達到抗體的Fab區(qū)內的唾液酸化的量的選擇性修飾，可由本領域知道的任何各種方法保護抗體Fe區(qū)免于酶促活性。例如，可采用特異性Fe-結合配體來掩罩Fe區(qū)。 該Fe-特異性配體的非限制性例包括化學合成的配體諸如上述那些，或生物學配體諸如可溶性Fe受體，F(xiàn)e特異性抗體或蛋白A/G。
此外，可改變細胞培養(yǎng)條件，以變化細胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的抗體的唾液酸化的量。例如，當生產(chǎn)率降低時獲得增加的量的唾液酸，及同滲質量摩爾濃度通常維持在約 250m0sm 約450m0sm。此和其他適合的細胞培養(yǎng)條件描述于，例如，US專利No. 6，656，466。 此外，已由Patel等人(Patel等人，Biochem J, 285，839 845 (1992))報道，如果抗體作為腹水或在無血清或含血清的培養(yǎng)基中產(chǎn)生，連接糖側鏈的抗體中的唾液酸含量顯著不同。而且，也顯示，用于細胞生長的不同生物反應器的使用和培養(yǎng)基中溶解的氧的量影響連接糖部分的抗體中半乳糖和唾液酸的量(Kunkel等人，Biotechnol. Prog.，I. 6，462 470 (2000))。
改變的量的唾液酸化可為Fab區(qū)內的唾液酸化的量的減小，如上所述。改變的量的唾液酸化可替代性地是Fab區(qū)內的唾液酸化的量的增加，如上所述。
具有改變的量的抗體的Fab區(qū)內的唾液酸化的抗體群可，例如，用于治療疾病諸如炎性和自身免疫病情，例如動脈粥樣硬化，多發(fā)性硬化，SLE和以上所列的其他。
定義
貫穿本發(fā)明使用的術語〃抗體〃包括，例如，多克隆或單克隆抗體。術語“抗體” 也包含仍保留抗原結合特異性的衍生物或其片段。由此，也包括的是實施方式諸如嵌合(人恒定區(qū)，非_人可變結構域)，單鏈及人源化的(人抗體，例外是非_人CDR)抗體，以及抗體片段，如，尤其，F(xiàn)ab或Fab’片段?？贵w片段或衍生物還包含F(xiàn)d，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)v或scFv片段； 見，例如，Harlow 和 Lane〃Antibodies, A LaboratoryManual〃，冷泉港實驗室出版，1988 和 Harlow 和 Lane “UsingAntibodies: A Laboratory Manual ” 冷泉港實驗室出版，1999。
根據(jù)本發(fā)明的全部實施方式，術語〃抗體群〃指稱均質，即包含僅一種特異性抗體的幾個分子的一組抗體，或異源，即包含多種不同抗體。在各情況中，抗體群優(yōu)先由IgG類的抗體組成或包含IgG類的抗體(也見下文)。但是，其也可包含IgM或IgA類的抗體或IgG， IgM和/或IgA類的免疫球蛋白的混合物或由IgM或IgA類的抗體或IgG，IgM和/或IgA 類的免疫球蛋白的混合物組成。
貫穿本發(fā)明使用的術語"Fab區(qū)〃指稱由自抗體的各重和輕鏈的一個恒定及一個可變結構域組成的抗體區(qū)，及其含有涉及抗原結合的位點。各完整天然的IgG抗體包含2 個Fab區(qū)。根據(jù)本發(fā)明，術語"Fab片段"用于通常當抗體用木瓜蛋白酶消化時獲得的抗體的那些片段。木瓜蛋白酶消化導致抗體在連接2個重鏈的二硫橋上切割及，由此，釋放2個個體Fab片段。用胃蛋白酶消化，另一方面，導致由抗體的鉸鏈區(qū)連接在一起的2個Fab片段，所謂的〃F (ab’)2片段〃的釋放。關于不被這些酶消化消化的抗體，術語"Fab區(qū)〃指稱如果實施用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶的消化，會形成Fab和/或F(ab’) 2片段的抗體的那些部分。關于由木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化獲得的抗體片段，F(xiàn)ab區(qū)對應于Fab片段。在Fab 片段的情況中，對應的分子與Fab區(qū)相同。
但是，由于Fab區(qū)中的糖基化位于抗體的可變區(qū)，在本發(fā)明的情景中，F(xiàn)v區(qū)，單鏈 Fv片段或其他含有抗體的可變區(qū)的片段被認為是相當體。
根據(jù)本發(fā)明使用的術語"改變的量的唾液酸化"指稱抗體群中唾液酸量的變化， 其中唾液酸位于所述群的Fab區(qū)和/或抗體Fe區(qū)。由此，如果富集的抗體群的Fab區(qū)和/ 或抗體Fe區(qū)內的唾液酸總量不同于富集之前的抗體制備物的Fab區(qū)和/或抗體Fe區(qū)內的唾液酸總量，就富集的抗體群的唾液酸化的量被改變。唾液酸量的變化可為增加的量的唾12液酸或降低的量的唾液酸。確定是否抗體群具有相比富集之前的抗體制備物改變的量的抗體的Fab區(qū)內的唾液酸化可使用本領域知道的任何各種方法實施。例如，可測定富集之前的抗體制備物和目標抗體群的唾液酸化的量，且可直接比較由此獲得的結果。測定唾液酸化的量的方法為本領域所熟知。非限制性例包括如在實施例部分中細節(jié)化的方法或目標抗體的胃蛋白酶消化，之后是分離得到的F(ab’)2和自Fe片段的胃蛋白酶片段(例如使用 Centricon管)和定量這些級分中的唾液酸(例如用HPLC或MS或基于酶的光度測定，可自 QA-bio LLC, Palm Desert, Ca: qa-bio. com利用的)，如描述于,例如，Current Protocols in Protein Science:Unit 12. 4 (Hudson et al), 12. 6 (Royle et 已1)及12.7 (Harvey et al), John Wiley和Sons (2006)。這些方法可用于確定本文所述的全部實施方式的改變的量的唾液酸化。唾液酸化的增加或減小的量通常表達為總聚糖中％唾液酸化的聚糖，或對于Fe唾液酸化，表達為總糖肽中％唾液酸化的糖肽。
根據(jù)本發(fā)明，術語〃唾液酸〃指稱神經(jīng)氨酸的N-或O-取代的衍生物，具有9-碳主鏈的單糖。神經(jīng)氨酸衍生物的此家族的最常見的成員是N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac或 NANA)ο家族的其他成員是N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NGNA或Neu5Gc)，其中Neu5Ac的N-乙?；涣u化。也由術語唾液酸包括的是2-酮基-3-脫氧壬酮糖酸(KDN) (Nadano etal. (1986)J. Biol. Chem. 261:11550-11557;Kanamori et al.，J. Biol. Chem. 265:21811-21819 (1990))以及9-取代的唾液酸諸如9-0-C-C6?；鵑eu5Ac，如9_0_乳酰_Neu5Ac或9_0_乙酸-Neu5Ac, 9-脫氧-9-氟 _Neu5Ac 和 9 疊氣基-9-脫氧 _Neu5Ac (Varki, Glycobiology 2:25-40 (1992);Sialic Acids:Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer,Ed. (Springer Verlag, New York(1992)))。
根據(jù)本發(fā)明，術語“免疫調節(jié)性質”指稱抗體群對免疫系統(tǒng)發(fā)揮的效應。免疫調節(jié)效應可為免疫抑制或免疫刺激。本領域技術人員可利用各種體外或體內方法來測量物質如抗體群的免疫調節(jié)性質。例如，源于單核細胞的細胞系，例如。U937細胞，可用視黃酸或維生素D生長及分化。它們可然后，例如用干擾素-Y或植物凝集素，在測試物質的存在和缺失下刺激。在適當?shù)臏赜?，可在細胞的上清液中測量炎性標記物諸如IL-8的量，及可由熒光活化的細胞分析(FACS分析)測定U937細胞上的細胞表面標記物，例如⑶54，⑶14 或CD45，例如。具有免疫抑制，例如抗-炎性，性質的物質會導致相比對照樣品降低量的炎性標記物。物質也可就它們的用該測定的抗-炎性效應排序；產(chǎn)生越低量的炎性標記物，越高抗_炎性效應。另一例是使用自人血分離的外周血單核細胞(PBMC)的方法，其用特定物質諸如洛索立賓或CpG在測試物質的缺失或存在下刺激。由測試物質的干擾素-α產(chǎn)生的抑制會指示免疫抑制，例如抗-炎性效應。類似測定，測量免疫刺激，也可利用。例如，可使用上述相同的方法，但不使用由例如干擾素或植物凝集素或類似刺激物刺激。
根據(jù)本發(fā)明，術語〃(血)血漿免疫球蛋白G制備物〃指稱自(血)血漿分離的免疫球蛋白G制備物。待從(血)血漿分離的免疫球蛋白G可已由循環(huán)B細胞(抗體分泌漿細胞)分泌。(血)血漿免疫球蛋白G制備物可從哺乳動物諸如例如人得到， 但也由非限制性例的方式自表達人免疫球蛋白G庫的轉基因動物，諸如例如豬，山羊， 綿羊或牛得到(見綜述 Echelard Y and Meade H.，"Toward a new cash cow. "Nat Biotechnol. 2002Sep; 20 (9) :881-2)。為回避懷疑，“血衆(zhòng)(bloodplasma)”常常簡單稱之為 “血漿(plasma)” -兩者互換使用。
根據(jù)本發(fā)明，〃靜脈內免疫球蛋白G(IVIG)"，為本領域技術人員所熟知及指稱含有合并的自超過1000個血供體的血漿提取的IgG免疫球蛋白的血漿制備物。IVIG在醫(yī)學中用作用于治療疾病諸如免疫缺陷，炎癥和自身免疫疾病以及急性感染的靜脈內施用的產(chǎn)品。IVIG的優(yōu)選的例是Privigen 。
根據(jù)本發(fā)明，“皮下免疫球蛋白G (SCIG) ”為本領域技術人員所熟知及指稱類似于 IVIG的血漿制備物，僅其在醫(yī)學中用作皮下施用的產(chǎn)品。SCIG的優(yōu)選的例是Hizentra 。
本文所用的〃純化的抗體群〃指稱包含僅一類抗體，諸如IgG的抗體群。抗體群也可純化以實現(xiàn)其含有或基本上含有(即大于90%)僅特定亞類的抗體諸如IgGl，IgG2，IgG3 或IgG4或其含有或基本上含有僅對于抗原定義的特異性的抗體。本文所用的術語"分離的抗體群"指稱不包含任何非抗體分子的抗體群。
術語“炎性病情”指稱與發(fā)炎關聯(lián)的異常，其成為大量的人疾病的基礎。發(fā)炎是對有害刺激的復合生物學應答，切實身體的旨在移出有害刺激及起始治愈的嘗試。但是，異常可發(fā)生，導致炎性病情，諸如慢性發(fā)炎或自身免疫疾病。
術語“自身免疫疾病”指稱免疫系統(tǒng)攻擊自身抗原的病情。例包括類風濕性關節(jié)炎，多發(fā)性硬化，狼瘡，重癥肌無力，銀屑病。
術語“神經(jīng)退行性疾病”指稱觀察到神經(jīng)元的結構或功能的進行性損失的病情，包括神經(jīng)元死亡。神經(jīng)退行性疾病的例包括阿爾茨海默病，帕金森病，多發(fā)性硬化，亨廷頓病。
根據(jù)本發(fā)明，"動脈粥樣硬化"指稱影響動脈血管的慢性疾病。其是動脈壁中的慢性炎性應答，大部分由于巨噬細胞白細胞的蓄積，及被低密度脂蛋白促進，無由功能高密度脂蛋白(HDL)的脂肪和膽留醇自巨噬細胞充足的移出。其通過動脈內多噬斑的形成導致。 發(fā)炎在動脈粥樣硬化的全部階段是中心，及涉及先天性和適應性免疫_炎性機理。疾病進展相關于針對氧化的脂蛋白的自身抗體的形成和循環(huán)細胞因子和炎性標記物的增加。
根據(jù)本發(fā)明，〃癌〃指稱由細胞的不受控的分裂和這些擴展的能力表征的一類疾病或病癥，其由通過侵入直接生長到相鄰組織，或由通過轉移移植到遠處的位點表征(其中癌細胞通過血流或淋巴系統(tǒng)運輸)。
根據(jù)本發(fā)明，〃感染〃是宿主生物被外源物種的有害定居。在感染中，感染的生物尋求利用宿主的資源，以便倍增(通常消費宿主)。宿主針對感染的應答是發(fā)炎。
細菌感染，根據(jù)本發(fā)明包括但不限于細菌腦膜炎，霍亂，白喉，利斯特菌病，百日咳 (Whooping Cough),肺炎球菌肺炎，沙門氏菌病，破傷風，斑疹傷寒，結核，金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)或尿道感染。
病毒感染，根據(jù)本發(fā)明包括但不限于單核細胞增多癥，AIDS，雞痘，普通感冒，巨細胞病毒感染，登革熱，埃博拉出血熱，手_ 口蹄疫，肝炎，流感，風疹，脊髓灰質炎，狂犬病， 天花，病毒腦炎，病毒胃腸炎，病毒腦炎，病毒腦膜炎，病毒肺炎或黃熱病。真菌感染根據(jù)本發(fā)明包括但不限于曲霉菌病，芽生菌病，念珠菌病，球孢菌病，隱球菌病，組織胞漿菌病或腳癬。

圖I :使用凝集素親和層析(SNA)的IVIG的分級分離。顯示典型層析譜(A)。在用 SDS-PAGE分離期間用凝集素印跡使用非-還原性條件(B和C)或還原性條件(D)監(jiān)測IgG中的總唾液酸含量。顯示的是考馬斯染色的凝膠(B)和SNA-生物素探查的印跡(C和D)。 可檢測重和輕鏈唾液酸化(D )。
圖2 :由LC-MS分析測量IVIG中的唾液酸化的N-聚糖(如在實施例2中描述)。對不同IVIG級分計算總N-聚糖，F(xiàn)e-特異性糖肽和F(ab’)2_聚糖的相對量。F(ab’)2_聚糖從IVIG，-SA IVIG和+SA IVIG由胃蛋白酶消化產(chǎn)生。
圖3 :在改變濃度的IVIg，-SNA, +SNA, El和E2級分的存在下用PHA刺激的全血。 由流式細胞術(FACS)測量單核細胞上的⑶54。
圖4 :在改變濃度的IVIg，-SNA, +SNA,El,E2，唾液酸酶-處理的IVIg(NA酶IVIg)， 及唾液酸酶-處理的E2 (NA酶E2)的存在下用PHA刺激的全血。由流式細胞術(FACS)測量單核細胞上的⑶54 (A)，及由ELISA測量上清液中的MCP-I (B)。實施例
下列實施例旨在例證但不限制本發(fā)明。
實施例I:使用2，6唾液酸特異性西洋接骨木(Sambucus nigra)凝集素(SNA)的 IVIG的分級分離
將100ml Tris-緩沖的鹽水(TBS)，0. ImM CaCl2, ρΗ7· 5 中的 Ig IVIG 裝于 IOOml 西洋接骨木(Sambucus nigra)凝集素(SNA)柱上。收集流通。在用含有O. ImM CaClJA 300ml的TBS洗滌之后，將與SNA柱結合的級分(+SNA IVIG)用200ml的TBS中的O. 5M乳糖洗脫(El )，隨后是用50ml的O. 2M乙酸中的O. 5M乳糖洗脫(E2)。在柱上第2次運行流通級分，以獲得-SNA IVIG (圖I)。
用SDS PAGE (非-還原性條件)和凝集素印跡監(jiān)測IgG中的總唾液酸含量(圖I)。 將得到的IVIG級分用SDS PAGE使用Nupage10%BisTris Gels分離。將凝膠用考馬斯染色及印跡到硝酸纖維素上。將印跡用生物素-SNA和AP-鏈霉親和素探查，及用發(fā)色底物可視化。在圖ID中，將重和輕鏈用SDS PAGE在還原性條件下分離。在用SNA-生物素探查的凝集素印跡中，兩條鏈是明顯可見的，指示輕鏈唾液酸化。因此，在+SNA IVIG中可檢測顯著 Fab唾液酸化。
唾液酸的定量
唾液酸由酸性水解釋放，和衍生化用1，2-二氨基-4，5-亞甲基二氧基苯二鹽酸鹽 (DMB)進行。定量用反相高效液相層析(RP-HPLC)使用N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)作為標準物來實施，及表達為唾液酸/IgG (重量/重量或Mol/Mol)。
實施例2:聚糖分析
為了研究在分離之前及之后IVIG的糖基化特征，鑒定源于典型IVIG制備物的Fe 區(qū)的胰蛋白酶糖肽及表征，及通過聚糖釋放和分析表征IVIG的總N-聚糖群。
方法
[(a)由肽譜的IgGl和IgG2/3Fc聚糖特征的確定
由液相層析-質量光譜法(LC-MS)在胰蛋白酶消化之后分析IVIG樣品，以測定特異于IgGl和IgG2/3Fc區(qū)的聚糖特征。監(jiān)測糖肽的IgG2Fc區(qū)也可見于IgG3Fc區(qū)，由于此原因，它們被稱為IgG2/3?；谘逯蠭gG亞類的知道的相對豐度，對IgG2/3肽見的大多數(shù)信號預期來源于IgG2分子。變性，還原(用胍鎗-HCl和DTT加熱)和烷基化(用碘乙酰胺)之后是使用1:50酶對底物比的胰蛋白酶消化。分離胰蛋白酶肽及在C18固相提取(SPE) 旋柱上純化，及在真空下在管中干燥。在使用用于肽分離的Agilent Proshell 300SB-C18 柱的Agilent Q-TOF系統(tǒng)上實施LC-MS分析。提取層析譜及對各IgGl和IgG2/3糖肽整合，總和[M+2H]2+和[M+3H]3+信號，及使用預測的結構的計算的單同位素質量。通過使用 Agilent MassHunter 軟件，版本 B. 02. 00 分析及處理數(shù)據(jù)(Huddleston et al. Anal Chem 65, 877, 1993)。
IgG糖肽的鑒定
胰蛋白酶消化的LC-MS分析導致復合層析譜。在鑒定潛在糖肽的努力下，從Entrez蛋白數(shù)據(jù)庫得到IgG亞類I 4的重鏈恒定區(qū)的序列(分別登錄號 No. 12054072, 12054074, 12054076和12054078)。虛擬消化序列。由N-聯(lián)糖基化共有序列的存在將表I中列的肽鑒定為潛在糖肽。也計算偶聯(lián)到常見的IgG聚糖GOF的這些肽的理論重量，及預測的[M+3H]3+離子。
表I.自4種IgG亞類的預測的糖肽的列表。N-聯(lián)糖基化共有序列以粗體凸顯。 給裸肽，與GOF聚糖連接的肽的計算的單同位素質量，及[M+3H]3+離子
權利要求
1.產(chǎn)生具有增強的免疫調節(jié)活性的抗體群的方法，包括以下步驟 (a)使抗體制備物在西洋接骨木(Sambucusnigra)凝集素或其相當體上經(jīng)歷親和層析， (b)任選地收集非-結合抗體群(-SNA級分)， (C)任選地洗滌親和性基質； (d)用中性pH的碳水化合物洗脫結合的抗體群(El級分)， Ce)用酸性pH的碳水化合物洗脫余下的結合的抗體群(E2級分)， 其中E2級分具有相比SNA基質的總洗出液(+SNA級分)增強的免疫調節(jié)活性。
2.權利要求I的方法，其中碳水化合物是糖。
3.權利要求2的方法，其中糖是乳糖。
4.權利要求I 3之任一項的方法，其中中性pH是6 8的范圍內的pH。
5.權利要求I 4之任一項的方法，其中酸性pH是5以下的pH。
6.權利要求I 5之任一項的方法，其中抗體制備物是自人血漿分離的IgG制備物。
7.權利要求6的方法，其中抗體制備物是自從至少1000個供體合并的人血漿分離的IgG制備物。
8.權利要求7的方法，其中抗體制備物是IVIG或SCIG制備物。
9.權利要求I 8之任一項的方法，其中免疫調節(jié)活性通過用于測量抗-炎性活性的體外測定來測定。
10.權利要求9的方法，其中可在步驟e中獲得的抗體群(E2級分)的免疫調節(jié)活性至少10%大于總結合的及洗脫的級分(+SNA級分)或可在步驟d中獲得的抗體群(El級分)的免疫調節(jié)活性。
11.抗體群，其可由權利要求I 10之任一項的方法獲得。
12.權利要求11的抗體群，其中在步驟d中可由用中性pH的碳水化合物洗脫獲得的級分(El級分) (a)具有與親和層析之前的抗體制備物約相當?shù)腇e區(qū)中的唾液酸化；和/或 (b)具有相比親和層析之前的抗體制備物至少50%更高的Fab區(qū)中總聚糖的唾液酸化。
13.權利要求11的抗體群，其中在步驟e中可由用酸性pH的碳水化合物洗脫獲得的級分(E2級分) (a)具有相比親和層析之前的抗體制備物或相比步驟d的級分至少20%更高的Fe區(qū)中的唾液酸化；和/或 (b)具有相比親和層析之前的抗體制備物至少50%更高的Fab區(qū)中總聚糖的唾液酸化；和/或 (c)具有相比步驟d的抗體群至少5%更高的Fab區(qū)中總聚糖的唾液酸化。
14.藥物組合物，其包含權利要求11 13之任一項的抗體群，及藥學可接受的載體或賦形劑。
15.權利要求11 13之任一項的抗體群，其用作藥物。
16.權利要求11 13之任一項的抗體群，其用于炎性病情的治療或預防。
17.權利要求16的抗體群，其中炎性病情是自身免疫疾病或神經(jīng)退行性疾病。
18.權利要求17的抗體群，其中自身免疫或神經(jīng)退行性疾病選自類風濕性關節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，抗磷脂綜合征，免疫血小板減少癥(ITP)，川崎病，Guillain Barre綜合征(GBS)，多發(fā)性硬化(MS)，慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(CIDP)，皮膚發(fā)皰病，皮肌炎，多發(fā)性肌炎，阿爾茨海默病，帕金森病，與唐氏綜合征相關的阿爾茨海默病，腦淀粉樣血管病，癡呆伴列維小體，額顳葉退化和血管性癡呆。
全文摘要
本發(fā)明涉及可由血漿免疫球蛋白，尤其是血漿IgG的分級分離，由在西洋接骨木(Sambucus nigra)親和性柱上親和層析獲得的抗體群，及其用途。
文檔編號C07K16/00GK102947333SQ201180029657
公開日2013年2月27日 申請日期2011年5月4日 優(yōu)先權日2010年5月7日
發(fā)明者F·卡瑟曼, S·梅斯舍爾 申請人:瑞士杰特貝林生物制品有限公司