專利名稱：大腸桿菌TolC抗原及其抗體與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗大腸桿菌TolC片段的抗體。
背景技術(shù)：
近年來(lái)細(xì)菌耐藥日趨嚴(yán)峻，成為醫(yī)藥界倍受關(guān)注的問(wèn)題。由于抗生素濫用造成細(xì) 菌耐藥性問(wèn)題尤為突出。我國(guó)臨床分離的一些細(xì)菌對(duì)某些藥物的耐藥性已居世界首位。除 耐青霉素的肺炎鏈球菌、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌、腸球菌、真菌等多種耐藥菌外，進(jìn) 入我國(guó)僅20多年的喹諾酮類抗生素的耐藥率已經(jīng)達(dá)60%-70%。據(jù)報(bào)道，包括廣州在內(nèi)的 國(guó)內(nèi)一些大城市人群感染的金黃色葡萄球菌中，80%已經(jīng)產(chǎn)生了對(duì)青霉素G的耐藥性。凱 福隆、頭孢三嗪等第三代的頭孢類菌抗生素的應(yīng)用已日趨普遍，抗生素品種的選用明顯超 前?？股氐臑E用主要是由于抗生素生產(chǎn)和銷(xiāo)售管理薄弱、臨床的誤用和濫用、以及將抗生 素作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑在動(dòng)物養(yǎng)殖中廣泛使用所導(dǎo)致。由于在抗生素使用與病原菌耐藥水平之 間存在著一種宏觀的量化關(guān)系，即一定范圍內(nèi)的抗生素使用可以導(dǎo)致病原菌整體耐藥水平 以及耐藥菌感染率的變化。由此，人和動(dòng)物的腸道正常菌群暴露于抗生素而普遍產(chǎn)生耐藥 性，并通過(guò)糞便直接污染環(huán)境、水、食品，導(dǎo)致耐藥菌不斷增加，也使人體接觸耐藥菌的機(jī)會(huì) 不斷增加。因此耐藥菌的種類非常廣泛。這樣一來(lái)，人體如果再獲得耐藥菌的感染治療起 來(lái)就比較困難。因此，控制目前已經(jīng)廣泛存在的耐藥菌已成為一個(gè)重要的社會(huì)和科學(xué)問(wèn)題。耐藥菌的防制尚不能完全寄托在新抗生素的發(fā)現(xiàn)和發(fā)明，因?yàn)榭股氐纳a(chǎn)與發(fā) 展伴隨著細(xì)菌耐藥性的不斷發(fā)展，一種新的抗生素投入使用后，很快就發(fā)現(xiàn)有相應(yīng)的抗性 菌株出現(xiàn)。在細(xì)菌中普遍存在的抗藥性是對(duì)抗菌藥物的生產(chǎn)開(kāi)發(fā)及對(duì)細(xì)菌性疾病防治的一 個(gè)巨大挑戰(zhàn)，直接危害食品安全和人類健康。對(duì)細(xì)菌耐藥機(jī)理的深入研究，發(fā)現(xiàn)其作用靶點(diǎn) 是解決這一難題的關(guān)鍵。業(yè)已報(bào)道，大腸桿菌外膜蛋白TolC是耐藥關(guān)鍵蛋白，是AcrAB-TolC藥物外排系統(tǒng) 中重要組成組分。我們先前證明，采用抗TolC可以負(fù)調(diào)TolC的耐藥作用，起到靶向抑制耐 藥菌生長(zhǎng)的目的，但其作用的靶序列不清楚。我們先前采用的抗TolC的抗體，是針對(duì)整個(gè) TolC蛋白。根據(jù)生物信息分析，整個(gè)TolC蛋白具有線性B細(xì)胞表位27個(gè)，此外還有非線 性B細(xì)胞表位。由于每個(gè)表位均能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，故針對(duì)整個(gè)TolC蛋白至少可 以產(chǎn)生27個(gè)各自表位特異性的抗體。由于各表位氨基酸序列不同，其生物學(xué)功能亦具有差 異，抗體作用后產(chǎn)生的效應(yīng)亦存在差異。此外，抗體也存在一定的交叉反應(yīng)，可以跨物種進(jìn) 行反應(yīng)，即所謂的抗體異嗜性現(xiàn)象。因此，采用針對(duì)整個(gè)蛋白的特異性抗體，具有靶序列特 異性不明確、副反應(yīng)不清楚的不足，不利于其有關(guān)成藥特性的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種針對(duì)TolC耐藥關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域 的抗體，以克服目前的抗體具有靶序列特異性不明確、副反應(yīng)不清楚的的缺陷，提高抗體的 有效性和安全性。
本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的發(fā)明提供了一種大腸桿菌(E. coli) TolC抗原，包括如SEQ ID NO :1(SEQ ID NO: 1 :SNGYRDANGI)所示的序列。本發(fā)明也提供了一種抗原，由上述大腸桿菌TolC抗原與血藍(lán)蛋白偶連。)同時(shí)發(fā)明保護(hù)了編碼如權(quán)利要求1所述大腸桿菌TolC抗原的基因片段，具有SEQ ID NO :2 所不的序歹丨J0 SEQ ID NO :2 :agca acggctaccg cgacgcgaac ggcatc。上述兩種抗原可用于制備抗體，所產(chǎn)生的抗體可以與大腸桿菌外膜蛋白TolC特 異結(jié)合，從而抑制細(xì)菌的耐藥性。該抗體具有針對(duì)SEQ ID NO :1氨基酸序列的多肽，由以下 方法獲得根據(jù)NCBI公布的E. coli K-12 TolC氨基酸序列，合成SNGYRDANGI片段(簡(jiǎn)稱 TolC-十肽)，合成多肽產(chǎn)物與血藍(lán)蛋白偶連以提高免疫原性。將人工合成SNGYRDANGI片段 和血藍(lán)蛋白的偶連物與福氏完全佐劑混合均勻形成油包水乳劑，注射免疫動(dòng)物，注射量100 微克-1毫克/只；其后采用福氏不完全佐劑；每次間隔10-20周，第3-5次免疫后的第7-10 天取血，于低溫下靜置，使血清自然析出?？梢詢?yōu)選以下方法制備將人工合成SNGYRDANGI 片段TolC-十肽和血藍(lán)蛋白的偶連物與福氏完全佐劑1 1 (ν/ν)混合均勻形成油包水，采 用背部多點(diǎn)注射免疫動(dòng)物家兔，注射量每千克動(dòng)物體注射為500 μ g/只；其后采用福氏不 完全佐劑，每次間隔2周，第3次免疫后的第10天，心臟取血，擺成最大斜面后在4°C冰箱中 靜置過(guò)夜，使血清自然析出。以未與血藍(lán)蛋白偶連的合成多肽產(chǎn)物為抗原，采用Dot-ELISA 技術(shù)測(cè)定效價(jià)為1 4000。本發(fā)明提供的抗體，可用于制備抑制細(xì)菌耐藥性藥物；所述的 細(xì)菌為大腸桿菌、痢疾桿菌、沙門(mén)氏菌、克氏檸檬酸桿菌、戴阿利斯特桿菌屬、肺炎克雷伯菌 或鏈霉菌。通過(guò)大量的試驗(yàn)證明，本發(fā)明的針對(duì)SEQ ID NO :1氨基酸序列的多肽特異性抗體 (即抗TolC-十肽)，可以與大腸桿菌TolC基因編碼蛋白TolC的關(guān)鍵耐藥結(jié)構(gòu)域結(jié)合，具 有非常特異、穩(wěn)定的靶向性作用，從而抑制耐藥菌的耐藥性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)明的有效性和抗耐藥機(jī)理，本發(fā)明采用基因突變技術(shù)，構(gòu)建了 大腸桿菌TolC片段SNGYRDANGI的突變體TolCl。通過(guò)抑菌試驗(yàn)，證明該突變體的耐藥功能 較野生型明顯下降。這些結(jié)果表明，TolC片段SNGYRDANGI對(duì)TolC的耐藥功能至關(guān)重要。接著制備了 TolC片段SNGYRDANGI的抗體(命名為抗TolC-十肽)，采用體外抗體 靶向療法，證明抗TolC-十肽能夠在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中明顯抑制包括耐藥大腸桿菌在內(nèi) 的該種細(xì)菌的生長(zhǎng)。經(jīng)抗TolC-十肽處理后的細(xì)菌，其生長(zhǎng)被抑制的程度與同條件培養(yǎng)下 抗TolC處理的生長(zhǎng)情況一致。此結(jié)果說(shuō)明TolC片段SNGYRDANGI是抗TolC負(fù)調(diào)TolC耐 藥功能的作用靶點(diǎn)。進(jìn)一步建立了大腸埃希菌外陰感染小鼠模型，通過(guò)抗TolC-十肽配合低濃度慶大 霉素可以明顯抑制小鼠外陰細(xì)菌感染的試驗(yàn)，進(jìn)一步證明TolC片段SNGYRDANGI是抗TolC 負(fù)調(diào)TolC作用的靶點(diǎn)。研究結(jié)果表明，抗TolC-十肽靶向療法能夠明顯抑制耐藥菌的生長(zhǎng)，為耐藥菌抗 體靶向療法提供了一個(gè)有效的作用靶點(diǎn)。本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建TolC片段的突變體TolCl，以及制備針對(duì)此片段即SNGYRDANGI的 抗血清，尋找到最為關(guān)鍵的TolC抗體靶向抑制耐藥菌生長(zhǎng)的作用靶點(diǎn)——SNGYRDANGI，從 而建立針對(duì)性強(qiáng)、目標(biāo)明確的抗體靶向作用提高耐藥菌對(duì)抗生素敏感性的技術(shù)方法。同時(shí)針對(duì)該結(jié)果，提供了抗TolC-十肽，作為抗大腸桿菌TolC的抗體，該抗體所針對(duì)的氨基酸序 列僅為10個(gè)氨基酸，經(jīng)預(yù)測(cè)不含有B細(xì)胞表位。我們制備的針對(duì)該序列的特異性抗體可靈 敏而特異地結(jié)合到靶向位點(diǎn)上，從而克服了現(xiàn)有技術(shù)中的多個(gè)B細(xì)胞表位容易產(chǎn)生抗體異 嗜性、靶序列特異性不明確、副反應(yīng)不清楚等缺陷，使用更安全。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果(1)本發(fā)明所提供的抗TolC片段SNGYRDANGI的抗體，明確了所作用的靶序列位 點(diǎn)，消除了原有針對(duì)整個(gè)蛋白質(zhì)所有位點(diǎn)抗體可能存在的副作用，可以特異而有效地抑制 細(xì)菌的耐藥性蛋白的耐藥功能，從而克服細(xì)菌耐藥性問(wèn)題。(2)本發(fā)明所提供的抗體，比現(xiàn)有的抗體在作為藥物的應(yīng)用上，具有更高的安全性 和操作性。


圖1為大腸桿菌K12的tolC基因PCR擴(kuò)增(A)、重組子雙酶切(B)及其誘導(dǎo)表達(dá) (C)。圖2為大腸桿菌K12 tolCl基因PCR擴(kuò)增(A、B)、重組子雙酶切(C)及其誘導(dǎo)表 達(dá)⑶。圖3為T(mén)olC短片段結(jié)構(gòu)域SNGYRDANGI突變體tolCl基因功能研究。圖A和B為 TolCl基因在基因補(bǔ)救菌株(AtolC-pET-28a-tolCl)中的表達(dá)研究，A為聚丙烯凝膠電泳 分析，B為Western blotting分析。圖C為最低抑菌濃度分析，圖D為生存率分析。(注 A tolC為tolC基因缺失菌株)圖4為抗TolC-十肽對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用。A，免疫前血清、抗TolC和抗TolC-十 肽分別處理對(duì)TC-R，TC-R-0和A tolC在加和不加四環(huán)素培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的影響。B，A的抑 制率比較圖5為抗TolC-十肽對(duì)小鼠外陰感染的治療作用。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī) 條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1TolC基因的克隆、原核表達(dá)、蛋白純化及兔抗血清的制備在該實(shí)施例中，將全長(zhǎng)的大腸桿菌TolC編碼序列或片段構(gòu)建入大腸桿菌蛋白質(zhì) 原核表達(dá)載體之中，以達(dá)到表達(dá)和提純目的蛋白。TolC基因編碼序列如SEQ ID NO 3所示。SEQ ID NO 3 1 atgaagaaat tgctccccat tcttatcggc ctgagccttt ctgggttcag ttcgttgagc61 caggccgaga acctgatgca agtttatcag caagcacgcc ttagtaaccc ggaattgcgt121 aagtctgccg ccgatcgtga tgctgccttt gaaaaaatta atgaagcgcg cagtccatta
181ctgccacagctaggtttaggtgcagattacacctatagcaacggctaccgcgacgcgaac
241ggcatcaactctaacgcgaccagtgcgtccttgcagttaactcaatccatttttgatatg
301tcgaaatggcgtgcgttaacgctgcaggaaaaagcagcagggattcaggacgtcacgtat
361cagaccgatcagcaaaccttgatcctcaacaccgcgaccgcttatttcaacgtgttgaat
421gctattgacgttctttcctatacacaggcacaaaaagaagcgatctaccgtcaattagat
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1441cgcactaccal ccagtaacgg;tcataaccct:ttccgtaact‘ga
TolC氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。
SEQID NO 4
1mkkllpiliglslsgfsslsqaenlmqvyqqarlsnpelrksaadrdaafekinearspl
61lpqlglgadytysngyrdanginsnatsaslqltqsifdmskwraltlqekaagiqdvty
121qtdqqtlilntatayfnvlnaidvlsytqaqkeaiyrqldqttqrfnvglvaitdvqnar
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301mgqnkvglsfslpiyqggmvnsqvkqaqynfvgaseqlesahrsvvqtvrssfnninasi
361ssinaykqavvsaqssldameagysvgtrtivdvldatttlynakqelanarynylinql
421niksalgtlneqdllalnnalskpvstnpenvapqtpeqnaiadgyapdspapvvqqtsa
481rtttsnghnpfrn
1. TolC基因的克隆
根據(jù)NCBI公布的大腸桿菌K12的基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物。引物序列如下正義引物(SEQ ID NO 5) :5，hCGA GAA TTC ATG CAA ATG AAG AAA-3，，反義引物(SEQ ID NO:
6) :5，-GGT AAG CTT TCA GTT ACG GAA AGG G_3，。為便于克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建，在引物 上分別引入限制性內(nèi)酶位點(diǎn)EcoR I和Hindlll。引物由大連寶生物工程公司合成。以熱變 性法獲得的大腸桿菌K12全基因組為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)獲得目的條帶(圖1A，泳道1為
6DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為目的條帶)。用限制性內(nèi)酶EcoR I和Hindlll分別酶切回收的 DNA片斷和pET-His (Novagen)表達(dá)載體，參照Takara公司的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行連接反應(yīng)，連 接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5 a感受態(tài)，通過(guò)雙酶切(圖1B，泳道1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為 目的條帶)和序列測(cè)定重組子的正確性，結(jié)果證明與數(shù)據(jù)庫(kù)公布序列完全一致。2.TolC基因的表達(dá)將正確的重組質(zhì)粒以熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21表達(dá)菌，37°C培養(yǎng)12_16小時(shí)。接 種單菌落于含氨芐青霉素(Amp)的LB液體培養(yǎng)基中，同時(shí)接種含有pET-HIS質(zhì)粒的BL21 作為對(duì)照，于30°C培養(yǎng)至0D(600nm)值0.6，加入IPTG 100 u g/mL 35°C誘導(dǎo)2個(gè)小時(shí)，離心 收集菌體，用SDS-PAGE檢測(cè)插入片段是否表達(dá)蛋白，以及表達(dá)蛋白的分子量大小。接著，進(jìn) 行蛋白表達(dá)產(chǎn)物為可溶組分抑或是不溶組分(包涵體)的鑒定。具體過(guò)程如下將離心后 沉淀重懸于1/10體積的PBS或50mmol/L Tris緩沖液(pH8. 0)中；加入溶菌酶至100 u g/ mL，保溫30分鐘；反復(fù)凍融數(shù)次以破壞細(xì)胞壁，用超聲波處理剪切DNA(超聲波的強(qiáng)度以不 能產(chǎn)生氣泡為適宜；裂解的時(shí)間根據(jù)實(shí)際情況掌握，一般將云霧狀的細(xì)菌懸浮物裂解至比 較清朗即可)；離心(12，OOOrpm) 15分鐘后將培養(yǎng)物分為可溶部分和不溶部分；將15 y L上 清與4yL 4XSDS樣品緩沖液混合，將沉淀物重懸于1XSDS樣品緩沖液；將表達(dá)樣品(上 清及沉淀)和非表達(dá)對(duì)照物進(jìn)行SDS-PAGE電泳并以考馬斯亮藍(lán)染色以便在預(yù)計(jì)分子量范 圍內(nèi)觀察表達(dá)蛋白帶。經(jīng)鑒定表達(dá)產(chǎn)物為可溶蛋白。表達(dá)后的圖譜如圖1C(泳道1為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2和3分別為pET_28a 和目的基因誘導(dǎo)表達(dá))所示。由圖可見(jiàn)，E. coli K-12 tolC基因確實(shí)已經(jīng)連接到pET-28a 載體上，并能在E. coli BL21中成功表達(dá)，其重組蛋白大小約為53. 9kDa，與其實(shí)際分子量 相符。3. TolC基因產(chǎn)物的純化大量培育菌體，離心后超聲處理，離心收集上清用Ni-NTA His親和柱純化。采用 pH5. 9 (buffer F)和pH4. 5 (buffer G)兩個(gè)不同pH值的緩沖液純化蛋白。用沖洗緩沖液 buffer E(8mol/L 尿素，0. lmol/L NaH2P04，lOmmo 1/LTr is-He l，pH 6. 3)洗滌 5 次，每次 lmL; 用洗脫緩沖液 buffer F(8mol/L 尿素，0. lmol/LNaH2P04,10mmol/LTris-HCl, pH 5.9)洗脫 目的蛋白4次，每次lmL，收集洗脫液；用洗脫緩沖液buffer G(8M尿素，0. lmol/L NaH2P04, 10mmol/LTris-HCl,pH 4. 5)洗脫蛋白4次，每次lmL，收集洗脫液。取收集液進(jìn)行SDS-PAGE 分析。純化蛋白進(jìn)行紫外檢測(cè)，測(cè)定蛋白含量。4.兔抗血清的制備將純化蛋白溶液與福氏完全佐劑1 l(v/v)混合均勻形成油包水，采用背部多點(diǎn) 注射免疫家兔，注射量為500 u g/只；其后采用福氏不完全佐劑，每次間隔2周，第3次免疫 后的第10天，心臟取血，將得到的血擺成最大斜面后在4°C冰箱中靜置過(guò)夜，使血清自然析 出。通過(guò)Dot-ELISA測(cè)定效價(jià)為1 8000。分裝，_80°C保存。實(shí)施例2TolC片段SNGYRDANGI突變基因(tolCl)的克隆1. TolC片段突變基因tolCl引物的設(shè)計(jì)以疏水氨基酸替換為其它疏水氨基酸、親水氨基酸替換為其它親水氨基酸為原 則，對(duì)TolC氨基酸序列中片段SNGYRDANGI進(jìn)行氨基酸替換，替換結(jié)果為RQCATKFHCL。在
7tolC基因的核苷酸序列中，找到該氨基酸序列相應(yīng)的核苷酸序列(SEQ ID N0:7) 5' -AGC AAC GGC TAC CGC GAC GCG AACGGC ATC-3’，根據(jù)氨基酸的密碼子，該核苷酸序列相應(yīng)地被 替換為(SEQ IDN0 8) :5，-CGT CAG TGC GCT ACT AAG TTC CAT TGC CTG-3，。因此，根據(jù) tolC基因的核苷酸序列進(jìn)行短片段突變tolC基因(命名為tolCl)5’端和3’端兩對(duì)引物 的設(shè)計(jì)(表1)，同時(shí)分別在5’正向引物及3’端反向引物中引入EcoRI和Hindlll酶切位 點(diǎn)(橫線所示)，以進(jìn)行融合PCR。tolCl-5’端反向引物的3’端從197位核苷酸處開(kāi)始， tolCl-3，端正向引物5，端從216位核苷酸處開(kāi)始，因此tolCl-5，端和tolCl-3，端兩條引 物共有27個(gè)核苷酸的重疊，以利于融合PCR的進(jìn)行。表ltolCl引物序列
權(quán)利要求
大腸桿菌TolC抗原，其特征在于包括如SEQ ID NO1所示的序列。
2.一種抗原，其特征在于由權(quán)利要求1所述的抗原與血藍(lán)蛋白偶連。
3.編碼如權(quán)利要求1所述大腸桿菌TolC抗原的基因片段。
4.如權(quán)利要求3所述的基因片段，其特征在于具有SEQID NO :2所示的序列。
5.如權(quán)利要求1或2所述的抗原在制備抗體方面的應(yīng)用，所述抗體用于抑制細(xì)菌耐藥性。
6.與權(quán)利要求1所述的大腸桿菌TolC抗原特異結(jié)合的抗體。
7.如權(quán)利要求6所述的抗體，其特征在于由以下方法獲得根據(jù)NCBI公布的E.coli K-12TolC氨基酸序列，合成SNGYRDANGI片段，合成多肽產(chǎn)物與血藍(lán)蛋白偶連以提高免疫原 性；將人工合成SNGYRDANGI片段和血藍(lán)蛋白的偶連物與福氏完全佐劑混合均勻形成油包 水乳劑，注射免疫動(dòng)物，注射量100微克-1毫克/只；其后采用福氏不完全佐劑；每次間隔 10-20周，第3-5次免疫后的第7-10天取血，于低溫下靜置，使血清自然析出。
8.如權(quán)利要求6所述的抗體在制備抑制細(xì)菌耐藥性藥物中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的細(xì)菌為大腸桿菌、痢疾桿菌、沙門(mén)氏 菌、克氏檸檬酸桿菌、戴阿利斯特桿菌屬、肺炎克雷伯菌或鏈霉菌。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大腸桿菌TolC抗原及抗體，該抗體具有特異性針對(duì)SEQ ID NO1所示的序列。本發(fā)明同時(shí)提供了編碼該大腸桿菌TolC抗原的基因序列；以及該抗體在制備抑制細(xì)菌耐藥性藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的抗TolC片段SNGYRDANGI的抗體，提高了細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感度，可以特異而有效地抑制大腸桿菌的耐藥外膜蛋白TolC的功能，從而克服細(xì)菌耐藥性問(wèn)題。本發(fā)明所提供的抗體，比現(xiàn)有的抗體在作為抗細(xì)菌耐藥性藥物的應(yīng)用上，具有更高的安全性和操作性。
文檔編號(hào)C07K14/795GK101974072SQ20101051322
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月12日
發(fā)明者彭宣憲, 李惠 申請(qǐng)人:中山大學(xué)