專利名稱：對大腸桿菌o155型的o－抗原特異的核苷酸的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及大腸桿菌O155型(Escherichia coli O155)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特別是涉及大腸桿菌O155型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用這些對O-抗原特異的寡核苷酸快速、準確地檢測人體及環(huán)境中的大腸桿菌O155型并鑒定這些致病菌中的O-抗原。
背景技術：
O-抗原是革蘭氏陰性細菌脂多糖中的O特異性多糖成分，它由許多重復的寡糖單位組成。O-抗原的合成過程研究得較清楚先由糖基轉移酶將核苷二磷酸單糖轉移到一個固定在細胞內膜的脂分子上，然后在內膜的內側合成寡糖單位，O-抗原的寡糖單位再通過轉運酶被轉移到內膜外側，而后通過聚合酶聚合成多糖，再被連接到一個糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends inMicrobiology.3178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics oflipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.MicrobiologicalReviews，57(3)655-682]。編碼負責O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色體上相鄰排列，形成一個基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1981)“Bacterialpolysaccharide synthesis and gene nomenclazture”Trends in Microbiology，4495-503]。在志賀氏菌、大腸桿菌和沙門氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之間[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigenlociimplication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，116923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coliO111 and Salmonella enterica O35 gene clustersgene clusters encoding the samecolitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.1825256-5261]。O-抗原基因簇含有三類基因糖合成路徑基因，糖基轉移酶基因，寡糖單位處理基因，其中糖合成路徑基因編碼的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸單糖；糖基轉移酶基因編碼的酶將核苷二磷酸單糖及其它分子轉到單糖上從而使單糖聚合成寡糖單位；寡糖單位處理基因包括轉運酶基因和聚合酶基因，它們將寡糖單位轉移到細菌內膜外側，再聚合成多糖。糖基轉移酶基因和寡糖單位處理基因只存在于攜帶這些基因的基因簇里。O-抗原中單糖的不同，單糖間聯(lián)結鍵的不同和寡糖單位之間聯(lián)結鍵的不同構成了O-抗原的多樣性，而單糖的組成、單糖間的聯(lián)結鍵及寡糖單位之間的聯(lián)結鍵是由O-抗原基因簇中的基因控制著，所以O-抗原基因簇決定了O-抗原的合成，也決定了O-抗原的多樣性。
因為O-抗原是極強的抗原，是大腸桿菌重要的致病因素之一，同時它又具有極強的多樣性，這啟示我們能研究一種快速、準確地檢測大腸桿菌及其O-抗原的特異性好、靈敏度高的方法。以表面多糖為目標的血清學免疫反應自上世紀30年代以來一直被用于對細菌的分型和鑒定，是鑒定致病菌的唯一的手段。這種診斷方法需要大量的抗血清，而抗血清一般種類不全，數(shù)量不足，大量的抗血清在制備和儲存中也存在一些困難。另一方面此法耗時長、靈敏度低、漏檢率高、準確性差，所以，現(xiàn)在普遍認為這種傳統(tǒng)的血清學檢測方法將為現(xiàn)代分子生物學方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙門氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特異核苷酸序列通過PCR方法鑒定了沙門氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose andparatose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification ofS.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.312118-2123]。Luk，et.al的方法是將相應于沙門氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原內的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到對不同血清型的沙門氏菌特異的寡核苷酸。1981年，Paton，A.W et.al用對E.coli O111的O-抗原特異的源于wbdI基因的寡核苷酸鑒定了一株產毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.3411552-11557]，但是后來的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鑒定E.coli O111的血清型的方法有假陽性結果出現(xiàn)。Bastin D.A.and Reeves，P.R.認為，這是由于wbdI基因是一個推測的糖合成路徑基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster ofEscherichia coli O111.Gene 16417-23]，而在其它細菌的O-抗原的結構中也可能有這個糖，所以糖合成路徑基因對于O-抗原并不是高度特異的志賀氏菌有46種血清型，但只有33種不同的O-抗原，大腸桿菌有166種不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，niche specificselection and bacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett，100509-516]，二者親緣關系非常近，并且有12種是大腸桿菌和志賀氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenicrelationships between the enteroinvasive Escherichia coli antigensO28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and and Shigella O antigens”J.clinMicrobiol，17(4)681-684]發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供了一種對大腸桿菌O155型的O-抗原特異的核苷酸。它是大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基轉移酶基因和轉運酶基因及聚合酶基因的特異的核苷酸。
本發(fā)明的次一目的是提供了大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇的全長核苷酸序列。
本發(fā)明的另一目的是提供了構成大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇的基因轉運酶的基因即wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉移酶基因，包括orf2、orf4、orf5基因；乙?；D移酶基因，包括orf8基因；葡萄糖酸合成酶基因，包括ugd基因；半乳糖酸合成酶基因，包括gla基因；鏈長控制基因，包括wzz基因。
本發(fā)明的又一目的是提供了寡核苷酸，它們分別源于大腸桿菌O155型源于編碼轉運酶的基因即wzx基因或與wzx有相似功能的基因；源于編碼聚合酶的基因即wzy基因或與wzy有相似功能的基因；它們是上述基因內的寡核苷酸，長度在10-20nt；它們對大腸桿菌O155型的O-抗原是特異的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它們對大腸桿菌O155型的O-抗原是高度特異的，而且這些寡核苷酸還可重新組合，組合后的寡核苷酸對大腸桿菌O155型的O-抗原也是高度特異的。
本發(fā)明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作為引物用于核酸擴增反應，或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列，從而通過這些方法檢測和鑒定大腸桿菌O155型的O-抗原及檢測和鑒定大腸桿菌O155型。
本發(fā)明的還一目的是提供了分離大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以獲得其他細菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以獲得編碼其他多糖抗原的細菌的基因簇的全序列。
本發(fā)明的目的是由以下技術方案實現(xiàn)的。
本發(fā)明對大腸桿菌O155型的O-抗原特異的核苷酸，其是如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長12755個堿基；或者具有一個或多個插入、缺失或取代的堿基，同時保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
前述的對大腸桿菌O155型的O-抗原特異的核苷酸，其由orf2，wzy，orf4，orf5，wzx，orf8，ugd，gla，wzz9個基因組成，都位于galF基因和hisI基因之間。
前述的對大腸桿菌O155型的O-抗原特異的核苷酸，其中所述基因中具有高度特異性的基因是；轉運酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉移酶基因，包括orf2、orf4、orf5基因；乙酰基轉移酶基因，包括orf8基因；葡萄糖酸合成酶基因，包括ugd基因；半乳糖酸合成酶基因，包括gla基因；鏈長控制基因，包括wzz基因；其中所述的基因wzx是SEQ ID NO1中的6827至8113堿基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO1中的2232至3185堿基的核苷酸；orf2是SEQ ID NO1中的1213至2229堿基的核苷酸；orf4是SEQ IDNO1中的3195至4244；基因orf5是SEQ ID NO1中的4358至5173堿基的核苷酸；orf8是SEQ ID NO1中的8123至8590堿基的核苷酸；ugd是SEQID NO1中的8689至9855堿基的核苷酸；gla是SEQ ID NO1中的9921至10925堿基的核苷酸；wzz是SEQ ID NO1中的11331至12311堿基的核苷酸。
前述的對大腸桿菌O155型的O-抗原特異的核苷酸，其中它還包括源于所述的wzx基因、wzy基因以及它們的混合或它們的重組。
前述的對大腸桿菌O155型的O-抗原特異的核苷酸，源于wzx基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的7226至7243堿基的核苷酸和8053至8072堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的7131至7148堿基的核苷酸和7862至7881堿基的核苷酸。源于wzy基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的2295至2312堿基的核苷酸和2776至2794堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2234至2251堿基的核苷酸和2864至2881堿基的核苷酸。
前述的對大腸桿菌O155型的O-抗原特異的核苷酸在檢測表達O-抗原的細菌、鑒定細菌的O-抗原和細菌的其它多糖抗原中的應用。
前述的對大腸桿菌O155型的O-抗原特異的核苷酸的重組分子，在通過插入表達而提供表達大腸桿菌O155型的O-抗原，以及制備細菌疫苗中的應用。
前述的對大腸桿菌O155型的O-抗原特異的核苷酸的應用，其特征在于，它作為引物用于PCR、作為探針用于雜交反應與熒光檢測、或者用于制造基因芯片或微陣列，供檢測細菌的應用。
前述的對大腸桿菌O155型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，其包括下述步驟(1)基因組的提取在培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌O155型，離心收集細胞；得到的基因組DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)通過PCR擴增大腸桿菌O155型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O155型的基因組為模板通過Long PCR擴增其O-抗原基因簇，將得到的PCR產物，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及其特異性，合并該long PCR產物，并用DNA純化試劑盒純化PCR產物；(3)構建O-抗原基因簇文庫將Long PCR純化產物應用鳥槍法構建O-抗原基因簇文庫；
(4)對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的克隆用實驗室常用的DNA自動測序儀對克隆中的插入片段進行測序，序列達到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析應用生物信息學軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列；(6)特異基因的篩選針對大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf8、orf11、orf12基因設計引物；在每個基因內各設計了兩對引物，每對引物分布在相應基因內的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進行PCR，確定wzx、wzy、orf8、orf11、orf12基因對大腸桿菌O155型的O-抗原的高度特異性；(7)引物靈敏度的檢測培養(yǎng)大腸桿菌O155，細菌計數(shù)后分別將5×103，5×102，5×101，5個和0個活菌加入到一定量的某種待檢測物中，混入細菌的待檢測物作為檢測用樣品，將樣品加入LB培養(yǎng)基，取一些與樣品混合過的LB培養(yǎng)基過濾，將過濾液進行培養(yǎng)，從培養(yǎng)好的菌液中取數(shù)毫升處理后作為PCR模板用寡核苷酸進行PCR反應，檢測其對大腸桿菌O155的靈敏度。
前述的對大腸桿菌O155型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，其包括下述步驟(1)基因組的提取在5mL的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)大腸桿菌O155型，離心收集細胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細胞，37℃溫育20分鐘，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘，加等體積酚抽提混合物，取上清再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提兩次，取上清再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚。上清用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，將DNA重懸于30ul TE中；基因組DNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)通過PCR擴增大腸桿菌O155型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O155型的基因組為模板通過Long PCR擴增其O-抗原基因簇，首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇啟動子區(qū)的JumpStart序列設計上游引物(#1523-ATT GTGGCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設計下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法擴增O-抗原基因簇，PCR反應程序如下在94℃預變性2分鐘；然后94℃變性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分鐘，這樣進行30個循環(huán)，最后，在68℃繼續(xù)延伸7分鐘，得到PCR產物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及其特異性，合并5管long PCR產物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產物；(3)構建O-抗原基因簇文庫用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構建O-抗原基因簇文庫，反應體系是300ng PCR純化產物，0.9ul 0.1MMnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應在室溫中進行，酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應。合并4管同樣的反應體系，用等體積的酚抽提一次，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等體積的乙醚抽提一次后，用2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中，隨后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mMDTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃30分鐘，將酶切產物補成平端，75℃終止反應后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應的緩沖液并將體系擴大為80ul，70℃反應20分鐘，使DNA的3′端加dA尾。此混合物經(jīng)等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等體積乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接10小時，總體積為90ul。其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶，最后用1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉淀連接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到連接產物；用Bi0-Rad公司的電轉化感受態(tài)細胞的制備方法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α細胞，取2-3ul連接產物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5α混合后，轉到Bi0-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時間為5.0毫秒至6.0毫秒，電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復蘇，然后將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃過夜培養(yǎng)，次日得到藍白菌落，將得到的白色菌落即白色克隆轉到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時從每個克隆中提取質粒，并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群構成了大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇文庫；(4)對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的81個克隆用本實驗室ABI3730型DNA自動測序儀對克隆中的插入片段進行測序，序列達到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析用英國劍橋MRC(Medical Research Council)分子生物學實驗室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列；序列的質量主要由兩個方面來保證1)對大腸桿菌O155型的基因組作5個Long PCR反應，然后混合這些產物以產生文庫，2)對每個堿基，保證3個以上高質量的覆蓋率，在得到大腸桿菌O155型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國國家生物技術信息學中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到7個開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質序列間的精確比對，最后得到大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇的結構；(6)特異基因篩選針對痢大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因設計引物；在每個基因內各設計了兩對引物，每對引物分布在相應基因內的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進行PCR，除在第11組中得到了預期大小的一條帶外，在其他組中都沒有擴增到任何產物，所以wzx、wzy基因對大腸桿菌O155型的O-抗原都是高度特異的。
也就是，本發(fā)明的第一個方面，提供了大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇的全長核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO1所示，全長14879個堿基；或者具有一個或多個插入、缺失或取代的堿基，同時保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。通過本發(fā)明的方法得到了大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇的結構，如表3所示，它總共由orf2，wzy，orf4，orf5，wzx，orf8，ugd，gla，wzz9個基因組成，都位于galF基因和hisI基因之間。
本發(fā)明的第二個方面，提供了大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇中的基因，即轉運酶基因(wzx基因或與wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或與wzy有相似功能的基因)；糖基轉移酶基因(orf2、orf4、orf5基因)；乙?；D移酶基因(orf8基因)；葡萄糖酸合成酶基因(ugd基因)；半乳糖酸合成酶基因(gla基因)；鏈長控制基因(wzz基因)。本發(fā)明尤其涉及到糖基轉移酶基因、轉運酶基因和聚合酶基因，因為糖合成路徑基因即合成核苷二磷酸單糖的基因現(xiàn)在被預示對較多胞外多糖是常見的、共同的，對細菌的O-抗原并不是很特異的，而本發(fā)明涉及到的轉運酶基因和聚合酶基因對大腸桿菌O155型的O-抗原是高度特異的。
本發(fā)明的第三個方面，提供了源于大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇中的wzx基因或與wzx有相似功能的基因，wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉移酶基因，包括orf2、orf4、orf5基因；乙酰基轉移酶基因，包括orf8基因；葡萄糖酸合成酶基因，包括ugd基因；半乳糖酸合成酶基因，包括gla基因；鏈長控制基因，包括wzz基因，它們是這些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，優(yōu)先被用的是列于表1中的寡核苷酸對，在表1中也列出了這些寡核苷酸對在O-抗原基因簇中的位置及以這些寡核苷酸對為引物所做的PCR反應的產物的大小，這些PCR反應可用表中的退火溫度進行。這些引物除在第19組中得到了預期大小的一條帶外，在其他組中都沒有擴增到任何產物，所以wzx、wzy基因對大腸桿菌O155型的O-抗原都是高度特異的。
所述的對大腸桿菌O155型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法包括下述步驟1)基因組的提??；2)PCR擴增大腸桿菌O155型中的O-抗原基因簇；3)構建O-抗原基因簇文庫；4)對文庫中的克隆測序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特異基因的篩選。
本發(fā)明的其他方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
如本發(fā)明所用，“寡核苷酸”主要指來源于O-抗原基因簇中的編碼糖基轉移酶的基因、編碼轉運酶的基因和編碼聚合酶的基因內的一段核苷酸分子，它們在長度上可改變，一般在10到20個核苷酸范圍內改變；更確切說這些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1中的6827至8113堿基的核苷酸)；wzy基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1中的2232至3185堿基的核苷酸)；源于以上基因內的寡核苷酸對大腸桿菌O155型是高度特異的。
此外，有時兩個遺傳相似的編碼不同O-抗原的基因簇通過基因重組或突變產生新的O-抗原，從而產生新的細菌類型，新的突變株。在這種環(huán)境中，需要篩選出多對寡核苷酸同重組基因雜交以提高檢測的特異性。因此，本發(fā)明提供了一整套多對寡核苷酸的混合物，它們源于糖基轉移酶基因；源于轉運酶和聚合酶基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因。這些基因的混合物對一個特殊的細菌多糖抗原來說是特異的，從而使這套寡核苷酸對這個細菌的多糖抗原是特異的。更具體地說，這些寡核苷酸的混合物是源于糖基轉移酶基因、wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的組合。
在另一方面，本發(fā)明涉及寡核苷酸的鑒定，它們可以用于檢測表達O-抗原的細菌和在診斷中鑒定細菌的O-抗原。
本發(fā)明涉及到一種檢測食品中的一個或多個細菌多糖抗原的方法，這些抗原可以使樣品能與以下至少一個基因的寡核苷酸特異性雜交，這些基因是(i)編碼糖基轉移酶的基因(ii)編碼轉運酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因。在條件許可的情況下至少一個寡核苷酸能與至少一個表達特殊的O-抗原的細菌的一個以上的那樣的基因特異性雜交，這些細菌是大腸桿菌O155型?？捎肞CR方法檢測，更可以將本發(fā)明方法中的核苷酸標記后作為探針通過雜交反應如southern-blot或熒光檢測，或者通過基因芯片或微陣列檢測樣品中的抗原及細菌。
本發(fā)明設計者考慮到以下情況當單個的特異的寡核苷酸檢測無效時，寡核苷酸的混合物能與靶區(qū)域特異性雜交以檢測樣品。因此本發(fā)明提供了一套寡核苷酸用于本發(fā)明所述的檢測方法。這里所說的寡核苷酸是指源于編碼糖基轉移酶的基因、編碼轉運酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。這套寡核苷酸對一個特殊的細菌的O-抗原來說是特異的，這一特殊的細菌O-抗原是由大腸桿菌O155型表達的。
另一方面，本發(fā)明涉及到一種檢測排泄物中的一個或多個細菌多糖抗原的方法，這些抗原可以使樣品能與以下至少一個基因的寡核苷酸特異性雜交，這些基因是(i)編碼糖基轉移酶的基因(ii)編碼轉運酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因。在條件許可的情況下至少一個寡核苷酸能與至少一個表達特殊的O-抗原的細菌的一個以上的那樣的基因特異性雜交。這些細菌是大腸桿菌O155型?？捎帽景l(fā)明中的寡核苷酸作引物通過PCR的方法檢測樣品，也可將本發(fā)明中的寡核苷酸分子標記后作為探針通過雜交反應如southern-blot或熒光檢測，或者通過基因芯片或微陣列檢測樣品中的抗原及細菌。
一般一對寡核苷酸可能與同樣的基因雜交也可與不同的基因雜交，但它們中必須有一個寡核苷酸能特異性雜交到特殊抗原型的特異序列上，另一個寡核苷酸可雜交于非特異性區(qū)域。因此，當特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新組合時，至少能選出一對寡核苷酸與多糖抗原基因簇中特異基因混合物雜交，或者選出多對寡核苷酸與特異基因的混合物雜交。甚至即使當一個特殊的基因簇中所有基因都獨一無二時，此方法也能應用于識別此基因簇內的基因混合物的核苷酸分子。因此本發(fā)明提供了一整套用于檢測本發(fā)明方法的多對寡核苷酸，在這里多對寡核苷酸是源于編碼糖基轉移酶的基因、編碼轉運酶和聚合酶的基因包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因，這套寡核苷酸對一個特殊的細菌多糖來說是特異的，這套寡核苷酸可能是糖合成中必須基因的核苷酸。
另一方面，本發(fā)明也涉及到一種檢測源于病人的樣品中的一個或多個細菌多糖抗原的方法。樣品中的一個或多個細菌多糖抗原可以使樣品能與以下至少一個基因中的一對寡核苷酸中的一個特異性雜交，這些基因是(i)編碼糖基轉移酶的基因(ii)編碼轉運酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因。在條件許可的情況下至少一個寡核苷酸能與樣品中的至少一個表達特殊的O-抗原的細菌的一個以上的那樣的基因特異性雜交，這些細菌是大腸桿菌O155型?？捎帽景l(fā)明中的寡核苷酸作引物通過PCR的方法檢測樣品，也可將本發(fā)明中的寡核苷酸標記后作為探針通過雜交反應，或者通過基因芯片或微陣列檢測樣品中的抗原及細菌。
更詳細地說，以上描述的方法可以理解為當寡核苷酸對被使用時，其中的一個寡核苷酸分子能雜交到一個并不是來源于糖基轉移酶基因、wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因的序列上。此外，當兩個寡核苷酸都能雜交上時，它們可能雜交于同一基因也可能雜交到不同基因上。也即，當交叉反應出現(xiàn)問題時，可選擇寡核苷酸的混合物來檢測混合的基因以提供檢測的特異性。
本發(fā)明者相信本發(fā)明不必限于以上所提的核苷酸序列編碼的特定的O-抗原，而且廣泛應用于檢測所有表達O-抗原和鑒定O-抗原的細菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如細菌胞外抗原)合成之間的相似性，本發(fā)明的方法和分子也應用于這些其他的多糖抗原。
本發(fā)明首次公開了大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇的全長序列，而且可從這個未被克隆的全長基因簇的序列中產生重組分子，通過插入表達可產生表達大腸桿菌O155型的O-抗原，并成為有用的疫苗。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件。
實施例1基因組的提取在5mL的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)大腸桿菌O155型，離心收集細胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細胞，37℃溫育20分鐘，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提兩次，取上清再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚，上清用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ul TE中?；蚪MDNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
實施例2通過PCR擴增大腸桿菌O155型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O155型的基因組為模板通過Long PCR擴增其O-抗原基因簇。首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇啟動子區(qū)的JumpStart序列設計上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設計下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCTGGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long TemplatePCR方法擴增O-抗原基因簇，PCR反應程序如下在94℃預變性2分鐘；然后94℃變性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分鐘，這樣進行30個循環(huán)。最后，在68℃繼續(xù)延伸7分鐘，得到PCR產物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及其特異性。合并5管long PCR產物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產物。
實施例3構建O-抗原基因簇文庫首先是連接產物的獲得用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構建O-抗原基因簇文庫。反應體系是300ng PCR純化產物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應在室溫中進行。酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應。合并4管同樣的反應體系，用等體積的酚抽提一次，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等體積的乙醚抽提一次后，用2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中。隨后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mMDTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃30分鐘，將酶切產物補成平端，75℃終止反應后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應的緩沖液并將體系擴大為80ul，70℃反應20分鐘，使DNA的3′端加dA尾。此混合物經(jīng)等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等體積乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接10小時，總體積為90ul。其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶。最后用1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉淀連接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到連接產物。
其次是感受態(tài)細胞的制備參照Bio-Rad公司提供的方法制備感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5α。取一環(huán)大腸桿菌DH5α單菌落于5ml的LB培養(yǎng)基中，180rpm培養(yǎng)10小時后，取2ml培養(yǎng)物轉接到200ml的LB培養(yǎng)基中，37℃250rpm劇烈振蕩培養(yǎng)到OD600 0.5左右，然后冰浴冷卻20分鐘，于4℃4000rpm離心15分鐘。傾盡上清，用冷的冰預冷的去離子滅菌水200ml吹散菌體，于4℃4000rpm離心15分鐘。再用冷的冰預冷的去離子滅菌水100ml吹散菌體，于4℃4000rpm離心15分鐘。用冷的冰預冷的10％的甘油懸浮細胞，4℃6000rpm離心10分鐘，棄上清，最后沉淀用1ml冰預冷的10％的甘油懸浮細胞，即為感受態(tài)細胞。將制得的感受態(tài)細胞分裝為50ul一管，-70℃保存。
最后是電轉化感受態(tài)細胞取2-3ul連接產物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5α混合后，轉到Bio-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時間為5.0毫秒-6.0毫秒。電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復蘇。然后立即將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37℃倒置過夜培養(yǎng)，次日得到藍白菌落。將得到的白色菌落即白色克隆轉到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時從每個克隆中提取質粒并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群構成了大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇文庫。
實施例4對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的81個克隆用本實驗室ABI3730型DNA自動測序儀對克隆中的插入片段單向進行測序，使序列達到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列。
實施例5核苷酸序列的拼接及分析用英國劍橋MRC(Medical Research Council)分子生物學實驗室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列(見序列列表)。序列的質量主要由兩個方面來保證1)對大腸桿菌O155型的基因組作5個Long PCR反應，然后混合這些產物以產生文庫。2)對每個堿基，保證3個以上高質量的覆蓋率。在得到大腸桿菌O155型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國國家生物技術信息學中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到9個開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用ClustralW軟件做DNA和蛋白質序列間的精確比對，最后得到大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇的結構，如表3所示。通過檢索和比較，發(fā)現(xiàn)orf9，orf10，orf11編碼的蛋白與Escherichia coli O-抗原基因簇中ugd，gla，wzz基因編碼的蛋白有很高的氨基酸序列一致性(92-99％)。我們命名orf9，orf10，orf11為ugd，gla，wzz，并推測大腸桿菌O155的O-抗原中有葡萄糖酸和半乳糖酸的存在。
Orf7和orf3是大腸桿菌O155種僅有的兩個編碼存在跨膜片段的蛋白的基因。Orf7編碼的蛋白與Yersinia enterocolitica的O-抗原轉移酶有28％的序列一致性，通過HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓撲結構發(fā)現(xiàn)其含有12個均勻的跨膜片段，這是Wzx蛋白的典型特征。所以命名orf7為wzx。Orf3編碼的蛋白與Shigella boydii的O-抗原聚合酶有24％的一致性，45％的相似性，通過HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓撲結構發(fā)現(xiàn)其含有9個跨膜片段，并且有一個大的(61個氨基酸)胞質內親水環(huán)(loop)，這是Wzy蛋白的典型特征。所以命名orf3為wzy。
orf2，4，5四個基因編碼的蛋白與其他已知的糖基轉移酶有24-58％的序列一致性和52-76％的序列相似性。因此我們推測這四個基因編碼糖基轉移酶，而且由于每個糖基轉移酶特異性催化形成一種二糖鍵，因此我們推測大腸桿菌O155的O-抗原的寡糖單位可能由四個單糖組成。由于這三個基因的確切功能還不能確定，因此我們將這三個基因暫命名為orf2，orf4和orf5。
實施例6特異基因的篩選針對大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因設計引物，這些基因在核苷酸序列中的位置見表1。
實施例7引物靈敏度的檢測。
購買市場上的生豬肉餡，攪拌均勻，分成20g一份，存在-40℃冰箱中備用。將10μl大腸桿菌O155的凍存菌液接種到有20ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37℃，200轉/分，培養(yǎng)12小時至飽和，取少量培養(yǎng)好的菌液作106和107倍的稀釋，其余的菌液放于4℃的冰箱中備用，取50μl稀釋菌液涂布LB瓊脂平板，37度，培養(yǎng)12h，對所涂平板計數(shù)，計算原液中活菌濃度。在5份生豬肉餡中分別摻入5×103，5×102，5×101，5個和0個活菌，攪拌均勻，加入200ml LB培養(yǎng)基，經(jīng)6層紗布過濾，過濾液于37℃，200轉/分，培養(yǎng)12h。從培養(yǎng)好的菌液中取3ml菌液于6,000g離心5分鐘，去上清，加100μl MQ超純水吹開沉淀并混勻，放入100度沸水中煮15分鐘，裂解液于12,000g離心8分鐘，取1μ上清做為PCR模板。用3對寡核苷酸對，SEQ ID NO1中的7641至7658堿基的核苷酸和8081至8098堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的10451至10468堿基的核苷酸和10736至10753堿基的核苷酸；SEQ IDNO1中的6289至6308堿基的核苷酸和7198至7216堿基的核苷酸，進行PCR反應，PCR反應體系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反應條件為95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30個循環(huán)。反應結束后，取10μl反應產物電泳，若有與預期大小相符的擴增帶，則結果為陽性，若沒有，則結果為陰性。參入了5×103，5×102，5×101，和5個活菌的每份豬肉餡均在3對引物的PCR反應中得到陽性結果。參入0個活菌的豬肉餡在3對引物的PCR反應中得到陰性結果。說明使用上述方法時，這3對引物對豬肉餡中的大腸桿菌O155的檢測靈敏度均為0.25個菌/g。
通過對O抗原基因簇的克隆和在減毒的疫苗菌株中的表達，可以組建重組疫苗。O抗原為最主要的革蘭氏陰性菌的表面抗原，可以引起強烈的免疫反應，是制造重組疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret實驗室成功的將志賀氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙門氏菌Tyziai疫苗菌中表達，動物實驗證明可以引起兔子的免疫反應(Molecular Microbiology 1993，7239-252)。中國軍事醫(yī)學科學院的小組也在從事與Viret實驗室類似的工作。王磊實驗室在1999年成功的將大腸桿菌O111的O抗原基因簇在沙門氏菌疫苗STM-1中表達，并證明組建成的菌株可以引起小鼠的血液和體液反應(Microbial Pathogenesis 1999，2755-59)。所以本發(fā)明O155的O抗原特異基因序列可以應用于組建重組疫苗。
根據(jù)本發(fā)明的對大腸桿菌O155型的O-抗原特異的核苷酸序列(SEQ IDNO1所示)，構造特異核酸探針，將其固定到芯片的載體上制成生物芯片，將要檢測的樣品適當處理后，與生物芯片進行雜交反應，然后利用生物芯片信號分析設備就可以得到樣品中相應的細菌情況。這種大腸桿菌O抗原鑒定的DNA芯片將可以直接用于臨床和其它檢驗場所(如食品加工和生產行業(yè)，畜牧獸醫(yī)行業(yè)海關檢疫等的微生物檢驗)。這種芯片只需要擴大產量，在完全相同的條件下就可以產業(yè)化。
表1列出了大腸桿菌O155型的O抗原基因簇中糖基轉移酶基因和寡糖單位處理基因及基因內的引物及PCR數(shù)據(jù)。在表中列出了大腸桿菌O155型的O抗原基因簇的糖基轉移酶基因、轉運酶基因和聚合酶基因及它們的相應的功能和大小。在每個基因內，我們各設計了兩對引物，每對引物分布在相應基因內的不同地方以確保其特異性。在表中還列出了每個引物在SEQ IDNO1中的位置和大小。以每對引物用表中所列的相應的退火溫度以表2中的所有菌的基因組為模板進行PCR，得到了相應的PCR產物，其大小也列于表中。
表2是用于篩選特異基因的166株大腸桿菌和43株志賀氏菌及它們的來源，為了檢測的方便，我們將它們每8-10個菌分為一組，總共28組，它們的來源都列于表中。
在第11組中含有大腸桿菌O155型的基因組DNA作為陽性對照。以每組菌做模板，用表1中的每對引物按如下條件做PCR在95℃預變性5分鐘后，95℃變性30秒，退火時間是30秒，溫度見表1，72℃延伸2分鐘，這樣進行25個循環(huán)。最后在72℃繼續(xù)延伸5分鐘，反應體系是25ul。模板為1∶20稀釋，取1μl。反應完畢后，取10ulPCR產物通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增出的片段。
對于wzx、wzy基因，每個基因都有兩對引物被檢測，每對引物除了在第11組中做PCR后得到了預期大小的正確的一條帶外，在其他組中都沒有擴增到任何大小正確的帶，也就是說，在大多數(shù)組中沒有得到任何PCR產物帶，所以wzx、wzy基因對大腸桿菌O155型及其O-抗原是高度特異的。
最后，通過PCR從大腸桿菌O155型中篩選到對大腸桿菌O155型的O-抗原高度特異的基因wzx、wzy和三個糖基轉移酶基因。而這些基因內的任何一段10-20nt的寡核苷酸對大腸桿菌O155型的O-抗原是特異的，尤其是上述每個基因中的引物即寡核苷酸對經(jīng)PCR檢測后證實對大腸桿菌O155型是高度特異的。所有的這些寡核苷酸都可用于快速準確地檢測人體和環(huán)境中的大腸桿菌O155型，并能鑒定它們的O-抗原。
表3是大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇的結構表，在表中列出了大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇的結構，共由9個基因組成，每個基因用方框表示，并在方框內寫入基因的名稱，數(shù)字表示的是O-抗原基因簇中的開放閱讀框(orf)的順序。在O-抗原基因簇的兩端是galF基因和hisI基因，它們不屬于O-抗原基因簇，我們只是用它們的一段序列設計引物來擴增O-抗原基因簇的全長序列。
表4是大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇中的基因的位置圖，在圖中列出了大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇中的所有開放閱讀框在全序列中的準確位置，在每個開放閱讀框的起始密碼子和終止密碼子的下面劃線。在大腸桿菌中開放閱讀框的起始密碼子為ATG和GTG。
SEQ ID NO1序列(SEQUENCE LISTING)<110>南開大學<120>對大腸桿菌O155型的O抗原特異的核苷酸<130>對大腸桿菌O155型的O抗原特異的核苷酸<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>12755<212>DNA<213>Escherichia coli<400>1attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc atgcgtccaa gaacgcggtc 60gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgaacagcg cgtgaagcgt 120caactactgg cggaagtgca atctatctgc ccgccgggcg tgactattat gaacgtgcgt 180cagggcgaac ctttaggttt aggtcactcc attttgtgtg cacgacccgc cattggtgac 240aatccatttg tcgtggtgct gccagacgtt gtgatcgacg acgccagcgc cgacccgcta 300cgctacaacc ttgctgccat gattgcgcgc ttcaatgaaa cgggccgtag ccaggtgctg 360gcaaaacgta tgccgggtga cctctctgaa tactccgtca tccagaccaa agaaccgctg 420gaccgtgaag gcaaagtcag ccgcattgtt gaatttatcg aaaaaccgga tcagccgcag 480acgttggact cagacatcat ggccgtaggt cgttatgtgc tttctgctga tatttggccg 540gaacttgaac gcacgcagcc aggggcatgg ggacgtattc agctgacaga tgccatcgct 600gaactggcga aaaaacaatc tgttgatgca atgctgatga ctggtgacag ctacgactgc 660ggtaaaaaaa tgggctatat gcaggcgttt gtgaagtatg ggctacgtaa cctgaaagaa 720ggggcgaagt tccgcaaagg tattgagaag ctgttaagcg aataatgaaa atctgaccga 780
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tggaaaaaga cctgaaagac aacatcgcgc tgcgtatgaa aaacttgcag gattcgctga 11880aaacccagga agtagtcgcg caggagcaga aagatctgcg tatccgtcag attcaggaag 11940cgttgcagta tgcgaatcag gcgcaggtga caaagccaca ggttcagcag actgaagatg 12000tgacacaaga tacgttgttc cttttgggga gcgaagcgct ggagtcgatg attaagcatg 12060aggcgacccg tccgttggtg ttctcatcaa actactatca gactcgtcaa aacctgctgg 12120atatcgacaa tcttgacgtt gataaacttg atattcatgc ttaccgctat gtaatgaaac 12180cgacgttacc tattcgtcgc gatagcccga aaaaggcaat taccttgatt ctggcggtgc 12240tgctgggcgg catggttggc gcggggattg tgctggggcg taacgctctg cgtaattaca 12300acgcgaagta atcttttcgg ttttaaagaa aaagggcagg gtggtgacac cttgcccgtt 12360ttttttgccg gatgcgacaa caatatcgca tccgcttacc ccgcaactca ctgatgccgt 12420ttacgcaggt tctcaattac cgtagttaaa tccagatcct gatcttgcaa cagcaccagc 12480aggtgataca tcaaatcaga cgcctcgttg gtcagctcaa agcggtcatg tacagtcgcg 12540gccagtgcgg tttccacgcc ttcttcgccc actttctgcg caatgcgttt ggtgccgctg 12600gcatacagtt tggcggtgta ggaggtttcc gggtcggcag atttgcgttc ggcgagcagt 12660tgttccagtt gatacaggaa cagccactgg tgagcggtgt cgccgaagca gctgctggtg 12720cctttgtggc aggttggtcc gataggattc gccag 12755表1大腸桿菌O155型的O抗原基因簇中的糖基轉移酶基因和寡糖單位處理基因及其中的引物及PCR數(shù)據(jù)

*只在大腸桿菌O155型中得到正確的一條帶表2 166株大腸桿菌和43株志賀氏菌及它們的來源組號 該組中含有的菌株 來源1、野生型大腸桿菌O1，O2，O5，O7，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O19ab，O20，IMVSaO21，O22，O23，O24，O59，O3，O112、野生型大腸桿菌O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O31，O33，O35，O36，O37， IMVSaO38，O40，O41，O42，O43，O39，O593、野生型大腸桿菌O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56， IMVSaO57，O58，O60，O61，O62，O64，O734、野生型大腸桿菌O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78， IMVSaO79，O80，O81，O82，O83，O96，O955、野生型大腸桿菌O84，O85，O86，O87，O88，O89，O91，O92，O98，O99，O101， IMVSaO102，O103，O104，O105，O106，O100，O1516、野生型大腸桿菌O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113， IMVSaO115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O1287、野生型大腸桿菌O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137，IMVSaO138，O139，O140，O141，O142，O143，O144，O145
8、野生型大腸桿菌O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158， IMVSaO159，O160，O161，O163，O164，O165，O166b9、野生型大腸桿菌O168，O169，O170，O171，O172，O173，O155，O124 cD1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12 d10、野生型大腸桿菌 B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15， dB16，B17，B1811、野生型大腸桿菌 F1a，F(xiàn)1b，F(xiàn)2a，F(xiàn)2b，F(xiàn)3，F(xiàn)4b，F(xiàn)5(v4)，F(xiàn)5(v7)，F(xiàn)6，F(xiàn)X變，F(xiàn)Y變，DS，DR， d12、第8組菌株加上大腸桿菌標準菌株O155a.Institute of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australia(IMVS)b.O123 from IMVS；the rest from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmarkc.O172 and O173 from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，the rest from IMVSd.中國預防醫(yī)學科學院流行病學研究所表3大腸桿菌O155型O抗原基因結構圖 表4大腸桿菌O155型O抗原基因簇基因位置ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ATGCGTCCAA GAACGCGGTC 60GAAAACCACT TCGACACCTC TTATGAATTA GAATCTCTCC TTGAACAGCG CGTGAAGCGT 120CAACTACTGG CGGAAGTGCA ATCTATCTGC CCGCCGGGCG TGACTATTAT GAACGTGCGT 180CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT AGGTCACTCC ATTTTGTGTG CACGACCCGC CATTGGTGAC 240AATCCATTTG TCGTGGTGCT GCCAGACGTT GTGATCGACG ACGCCAGCGC CGACCCGCTA 300CGCTACAACC TTGCTGCCAT GATTGCGCGC TTCAATGAAA CGGGCCGTAG CCAGGTGCTG 360GCAAAACGTA TGCCGGGTGA CCTCTCTGAA TACTCCGTCA TCCAGACCAA AGAACCGCTG 420GACCGTGAAG GCAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTTATCG AAAAACCGGA TCAGCCGCAG 480ACGTTGGACT CAGACATCAT GGCCGTAGGT CGTTATGTGC TTTCTGCTGA TATTTGGCCG 540GAACTTGAAC GCACGCAGCC AGGGGCATGG GGACGTATTC AGCTGACAGA TGCCATCGCT 600GAACTGGCGA AAAAACAATC TGTTGATGCA ATGCTGATGA CTGGTGACAG CTACGACTGC 660GGTAAAAAAA TGGGCTATAT GCAGGCGTTT GTGAAGTATG GGCTACGTAA CCTGAAAGAA 720GGGGCGAAGT TCCGCAAAGG TATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGA 780ATGTTACGGT TGATAAGAAA ATTATAACGG CAGTGAAGAT TCGTGGCGAG AGTAATTTGT 840TGCGAATATT CCTGCCGTTA TTTTATATAA ACAATCAGAA TAACAACGAG TTAGCAATAG 900GATTTTAGTC AAAGTTTTCC AGGATTTTCC TTGTTTCCAG AGCGGATTGG TAAGACAATT 960AGCGTTTGAA TTTTTCGGGT TTAGCGCGAG TGGGCAACGC TCGTCACATC GTAGACATGC 1020ATGCAGTGCT CTGGTAGCTG TAAAGCCAGG GGCGGTAGCG TGAAAATTAA GGATGCTAAT 1080AAATAATTGG TTGTATGTAT ACCACAACTT ATTAACTTAT TTATGTGTAA GTCTAAATAG 1140TGTGGTAATT CTTATCAGTT GGAAGATTTT TACACATATA AACTGAAAAC ATCACAATAT 1200orf2起始AGTAAAGTTA AAGTGGGCTT TATTTTATTG TCATTTTTGG TTGCAACAGC ATATTATGCT 1260
ACCTTTAAAA GAGGAAACGA CATGGGGTTA AATATAGAAT TAATAAGTGT TGTGATTACT1320TTCTTTAGTA ATGATGAATC TTCGGGTACA TATTTAAATA ATAGTGTTTT AAGCGCATTA1380AACCAAACAT ATAGAAACAT TGAAGTCTTG GTCATTGATG ATTGCTCCCC AATAAAAGCA1440ACTAGCTGTC TTAATGGTAT TAATGATAGT AGATTGTCAA TTATAAGACT TCCACAAAAT1500GGTGGAATGG CCGCAGCTAT TAATCATGGA ATTGGTCTGT CATCTGGAAG TTTTATTGCA1560TTTCTTGATT TTGATGACCT TTGGTACGAT TTCAAACTTA AAGAGCAAGT TGAGTTGATC1620AAAGATTATA TTGATAAAAA GCTGGCTGAA CCTGAAAAAA TATGTTGCTA TTCTAAGGTT1680TTAATAAAAC ATGATAATTA CGAATATACT AAACCTTACA GAAGTATAGA GGAGGGTGAG1740CACGTAGCAG ATTATTTGTT TGCTAATGGA CAATTTATGC AAACAAGTGG GATGCTTATA1800TCAAAATCAT TACTTATAAA AGTCAAAGGA ATGGATTCTT ATAAAAGACA TACGGATTAT1860CAGTTAGTAT TAAAACTATA TCAAGAAAAT GCTGTGTTTA TTTATTATGA TCGAGTTTCA1920TATATGTATA AAATAACTGA CAAAAAAGGA GATTACAAAT TTTCGCAAGA TTGGCTTTGT1980GCAAATAAGT GGATGATGAC AAAACGTTCT ATAAGATATT TCAAAATTAA TACAATATTA2040AGAAGCATGA TTGATAATCA TGCTTTTGGT ACTGCGTTTA TATATTCAGT ATCTAACAGA2100TTTATATGGT CTTTTGGCTC GTATTTAATA CGATTTTCTT TAAAAAAATT ATTACCTACA2160CGCTTATTAT CAACGCTGAT TAAACATAAA AATAAAGCAG CGTTTTCTGT AAAAGGAAGA2220orf2終止 wzy起始GAGTATTGAA AATGGGAGGC TTTATTACAA GATTAGTTTT ATTGCTGCCA TTATTTTTAT2280TATTTTATTT TCCTGCGGAC CATAACAAAG ATTATTTTAA TTATCAAACA GATTATGACT2340ATGCCATAGG GCAATTTGAT TACCTATATG AGCTATCCGT GAGATTTTTT AGAGATATAT2400TGAACTATAG TTTTAGTTCA TTTTGGGTGA TTGTGATTAT AGTAGAAATT ATTTTCTTGA2460CGATATATTA TAACAAGGTG AAATATATCC TTATTGCATA CCCGGGTATA ATTTCGATGA2520GCCAGTTTTT TTATGGCACT CAAATACGTT ATGCTTTGGC AATGTTAATT GGATTAGTAG2580TATTAAAAAA TAGTAGACGC TTTATTAAAG TTTTTGGAGT GTTAATTGCT TCATTATTCC2640ACTATGGCGC CGTGATATCA TTATTACCAT TATTTATTTG TAGGTATATA AATGAAAGAT2700ATTTCATTTT TTTGTCTAAA CGAAATATAT TCTTGATTAT ATCTGTATTA ACATTACTGT2760TTTTTTTCTT CTATTCTTTC GAGTCATTTG TTTCAATGAC TCGTTTTTCT TATTATTTAG2820GTGCTGAAAA ATTTTCCGAT TCAAAATCGA CTTCATCTAT AATATATGCG GTTGTGAGTC2880TATTGTTTAT TCTGTTTTTA TATTCAAAAA ATACAGCGTT CAGAACCAAT ATAAGTAAAC2940AATCTATAGT AATACTGATT TTAGTTTTGA TTTTTTCACC TATAGCAGTG CTATCAGGTC3000GCACGATGCT CGTTTATTTT ATAATGGAAC CTTTGTTAAT AGCATCTGCA TTCACCTCTA3060TAAAGAAAAA TAGTCCTGAT TATTTTATAT CTTTATCGTT ATCTTTGTCT TTATTTTTAT3120TCTATATTGC GAGATGTATT TATTATATCG TAACGGCAGA TTTTTATTTT TATGATTTCT3180wzy終止 orf4起始TATAAGGAGA ACAAATGAGG ATAGCTCATA TATATAAAAA ACATTATGAT AGCGGAGATG3240GTATCACTAA TGTTGTTGAG AATTTATATA AACTTCAAAA AAACAATAAT GCAGATGAAT3300ATATAGATTT ACCATTCATG TTTGATAATT GCTCAAAAGG TAAGGCTCAA TATAGATATT3360CAGGGTTTAT TGGGATGCTA TATCATTTGT TCAAATGCAA GCCAAATGTA ATATACTTGC3420ATGGTTTCTA CTATTTGCAT TATATTATTC TTGGTGTTTG TTTTTATTTT ATCAAATCAA3480AAGTTGTTTT AATACCACAT TGCTCTCTTT TAAATAGAGC AATTACTTAT AAAAAAATAA3540GAAAGTTGAT ATATTATAAA ATATTCTCAT TAATTTATTA TGATTCTATA ATATTGATTC3600AGTATTTGAA CCACGAAGAG CAAATAGGTT CAAAAAAATT TTTATTCTCA CCTCCTGAAT3660CCATTATACC AAATGGTGTT AACTATACTG AAAAACAATG TCGATCTTTT GATTTTCTAT3720CTCTATTCTA TTTAGGGCGA TGTGATATAA ATCATAAAGG TATTGACATA CTATTTGAGT3780ATCTTACTAA GATTAATCAA AAAATAAAAT TATATGGTGC AGATCCAAAT GAAAAAATAA3840AACTAAAGAA ATTAATTCAA TTAAAGAAAT TAGAGCAAAA AGTTGAAATA TATGATCCTG3900
TCTTTAATGA GGATAAGGAG AGGGTATTCT TGAATAATAA TATATTTATA TTACTTTCGA3960GATATGAAGG ATTACCTATT AGTGTGCTTG AAGCACTTTC TTATGGATGT ATTTGTCTAG4020TTTCATCTGG AACAAATATG GCTGATGAAA TTGTAGCTGC GAACTGCGGA TTTAAAATTG4080ATTCTGTAGA GGATCTTATT TCAGTATGGA ATAAGCTACG GGTAATGAGT ATATATGAAT4140TAAAAGAAAT GTCTGAAAAT TCAAAAGCAT TAATTAAACA TAAATACGCT TGGCAAAAAA4200orf4終止TAATCATATC TTCTGAGATT GAATTAAGAA AATATGTAAC ATAAGTCTTT GTGCGTAGAT4260TTTGAATGTT CTATTTATTC TGGTTAGAAT TTTATAGTCA ATTCGATGAC ATATATTCAC4320orf5起始ACAATATTTC ATACAGAAGA TTAATTAGGA ACTTAATGTG AAATTTACTG TTTTACTTTC4380CTTATATAAT AGAGAGTCTA AACACAACTT GTTCGATTGT CTTGAAAGTA TTAAGTCAAA4440CACTATAAAG CCAGAACAGA TAGTCATAGT TTATGATGGA CCGATCAGTG AAGAACTGGA4500TAGTATTGTT ACTGGTTTTA TCAAATACTT ACCGATTGAG AAAATAAAAA TATCAGAAAA4560TATTGGACTA GGCAACGCAC TTAATTATGG CTTGAATTTT TGTAGACATG AAATTGTTTT4620CAGGATGGAT ACAGACGATA AATGTAAAAG CACAAGATTT GAACGGCAAC TTGAAATTAT4680AAAAATAAAA AATGATATCG TGTTGATGGG GAGTGCTATA GAAGAATTTA ACGAATCGAT4740GACAGTCTCT CATGGTGTAA GATTTTCAGC CGAATATCAT GATGATATAA TAAATTATGC4800AAAAAGAAGA AACCCATTTA ATCATATGTC AGTGGTTTTT AAAAAATCAA TAATACAGGG4860GCTAGGAGGG TATCAGCATC ATTATTTTAT GGAAGATTAT AACTTGTGGC TTCGGGTTAT4920CGCTGCTGGG TATAAAACTT ATAATATTCC AGAAGTGCTT GTCTATGTTC GAGGTGGAGA4980TAAAATGCTT GGGCGTAGAA AAGGAATTCC CTATGTGATT AGTGAGGTAA AATTGGCTAA5040ATTAAAATAT AACTTAAAAA TTGACAGTAA TGCAGGTGTT ATTATTTCTG CAACCATGAG5100GATTTTACCT CGTTTATTGC CCGTCTTTTT GTTAAAACAA ATATATAAAG TTTTAAGGAA5160orf5終止AAGCAAGTCT TGAATTCTCT GTGAAATTTA TGAATACAAT CCACATTGAT TACATATACT5220GAACATTATC CGTTTGTTAT AATACCGCAC AATTCTAAGT CAATTCCCCT GACAGGAGTA5280gnd起始AACAATGTCA AAGCAACAGA TCGGCGTCGT CGGTATGGCA GTGATGGGGC GCAACCTTGC5340GCTTAATATC GAAAGCCGTG GTTATACCGT CTCTATTTTC AACCGTTCTC GTGAAAAGAC5400GGAAGAAGTG ATTGCCGAAA ATCCAGAGAA GAAACTGGTT CCTTACTATA CGGTAAAAGA5460GTTTGTTGAA TCTCTGGAAA CACCTCGTCG CATCCTGTTA ATGGTGAAAG CAGGTGCAGG5520CACGGATGCT GCTATTGATT CCCTCAAGCC ATATCTCGAT AAAGGCGACA TCATCATTGA5580TGGTGGTAAT ACCTTCTTCC AGGACACCAT TCGTCGTAAC CGTGAGCTTT CTGCGGAAGG5640CTTTAACTTC ATTGGTACCG GTGTTTCCGG TGGTGAAGAG GGTGCGCTGA AAGGTCCTTC5700CATTATGCCG GGTGGTCAGA AAGAAGCCTA TGAGCTGGTT GCTCCGATCC TGACCAAAAT5760CGCTGCTGTG GCTGAAGACG GTGAGCCATG CGTTACCTAT ATCGGTGCTG ATGGCGCAGG5820TCACTATGTG AAGATGGTTC ACAACGGTAT TGAATACGGC GATATGCAGT TGATTGCTGA5880ATCCTATTCT CTGTTGAAAG GTGGCCTAAA CCTCTCCAAC GAAGAACTGG CGCAGACCTT5940TACCGAGTGG AATAACGGTG AACTGAGCAG CTACCTGATC GACATCACCA AAGACATCTT6000CACTAAAAAA GATGAAGACG GTAATTACCT GGTTGATGTA ATTCTGGATG AAGCGGCTAA6060CAAAGGTACC GGTAAATGGA CCAGCCAGAG TGCGCTGGAT CTCGGCGAAC CGCTGTCGCT6120GATCACCGAG TCTGTGTTTG CACGTTATAT CTCTTCTTTG AAAGAGCAGC GTGTTGCCGC6180GTCTAAAGTT CTCTCTGGTC CACAAGCACA GCCAGCAGGC GATAAGGCTG AGTTTATCGA6240GAAAGTTCGT CGTGCGCTGT ATCTGGGCAA AATCGTTTCT TACGCTCAGG GCTTCTCTCA6300GCTGCGTGCT GCGTCTGAAG AGTACAACTG GGATCTGAAT TACGGCGAAA TCGCGAAGAT6360TTTCCGTGCT GGCTGCATCA TCCGTGCGCA GTTCCTGCAG AAAATCACCG ATGCATATGC6420
CGAAAATCCG CAGATCGCTA ACCTGCTGCT GGCTCCGTAC TTTAAACAAA TTGCCGATGA6480TTACCAGCAG GCGCTGCGCG ATGTCGTTGC TTATGCAGTA CAAAACGGTA TCCCGATTCC6540GACCTTTTCC GCTGCGGTTA CCTATTACGA CAGCTACCGT GCGGCTGTTC TGCCTGCAAA6600CCTGATCCAG GCACAGCGTG ACTATTTCGG TGCGCATACT TATAAGCGCA TTGATAAAGA6660gnd終止AGGTGTGTTC CATACCGAAT GGCTGGATTA ATTTTTTTCT AGTTTTTAAA GAGCCTGCTT6720ACGCGGCTCT TTAATATATA TAAAAATTAT AATTCAGTCG ATTCAATCTA GATAAAACTA6780wzx起始TTATTTTTAT TATTTCTTAG TTCTAAGAGT CTACGTGAGA TATTAGATGT CTAACTATAT6840CAAAAATGCT GGTTGGATTT TTTGCGAAAA ATTTGTACGA ATAGCCGTAG GCTTTATATT6900ATTTGCATTA ATTTCAAGAG TTTTGAATCC TGGTGAATTT GGCTTGCTAT CTTATTATCA6960AACAATAGCA ACCATGTTTT TAGCAATAAC CAATTTAGGT TTCGATAATG TTCTGATTAA7020CGAGTTTAAT CAGAATAAAA AGCATAATGA AATATTTTCA ACGGCATTTT GGTCAAGAAT7080TATAGTTTCA GTATTTGTAA TAATGTTATT TGCTGTGGGA TTGTATTTTG ATGATGTCGT7140GCTGAAGAAT AAATTGGTTT TGCTGTTGTG TATAAGTAGC TTGGTTTTTC AAAGTCAAAA7200TACATACATA CCATTTTTTC AATCTCAGTT ACAAGCCTCA GTTGTCACGA AAATTAGTTT7260TTGCGCACTT ATTATATCCT CGGTATTTAA AGTCTATTTG TTGTTAATCA ATGGGGATAT7320AATGTGGTTT GCTTTTTCAT ATAGTTTTGA TTTTGCTGTG TCTTTTTTAT TTTTCGCTTT7380TTTTTCATAT AAAAGAAATT ATATATCAAT TAATCCAAAA CATTTCCGGT TAAGTGTGCT7440AAAACGTTTA TTACGCTCGT CTTGGCCAAT TATTGCATCA TCAATAATTA TTGTTCTCTA7500TACTCGATTA GATCAATTAA TGATTATGCG AATGTTAGGG GCTGATTCAG TTGCAATATT7560TAGTGTTGCT TTGAAAATAT CAGAGGCATA TTTATTTGTC CCTGCAGCAT TAGTTACATC7620ATATTATCCA CTGATTTCAA AGTCACCTAC CAGAGAAAAT ATTAGATTTT ATTTTGATGT7680TGTTTTTTCA AGCTCTGTAA TAATGGCTGT AGTGGTAGCT ATAGCGTCTT ATTTTGTAAT7740ACCATATATG TTTGGGGCTA ATTATATCAC CTCATATAAT ATATTAATTA TTTTGCTATT7800TGGTTCAATA TTTTCTATAC TCGGCTCAGC GTGTACAAAT TTAATGATAG TGTATGACTT7860ATCTTATTTA CGGTTAGTTC GAGCCGTTTA TGGGCTATTA ATAAATTTCT CCCTGAATAT7920TTTACTTATT CCTAAATATG GTATTATTGG TGCTGCTTAT GCGTCTTTTG TAAGTCAGAT7980CTTTGCAAGT TGGTTAAGCA ATAGCCTTAA TAAAAAAACG ATTGAATGCT TCAGAATACA8040GTCAATGACA GTTGTATCTT TGGGACTAAT AGGATTTAGA CAATTATTTA TCATGCTATT8100wzx終止 orf8起始TAGAAGGGGG TAGGCATATT ATATGTTTGA CAGTTATGAA AGAAAGAAAG GTATAATGCA8160AAGGATAATC TTTTATTTTA AAACGAAATT GAGAGGATGT CGTGAATACT ATTACAGTCT8220TAAATATTAT CATCAGTTTA AAATTCCAAT CTCGAATCAT CTTACCATCG GCATTAAGAC8280ATTAGGGGAA AACAAAACTA CTTTACCTCA CCCGGTAGGT ATAGTTATAG GTAAGAACGT8340TAACATCGGT AAAAAATGTA TTGTTTATCA AAATGTCACT ATAGGGGTGA GTAATAATAA8400ATTTGAGGAT TATCCTGTTA TTGGAAATAA TGTTACTATT TATGCCGGAG CAATCATAAT8460AGGTAAAGTA ATTATAGGGG ATAATGCAAT AATTGGTGCA GGTTGCATCG TTACTAAAGA8520TGTACCTGAA GGAAAGATTG CAATTGGTTC ACCAATGAAA ATTATGGATA AAAAACATAA8580orf8終止TAACTACTAA TTATCTCAGT GAATTCTTAA TAATTTTAAA ATGTGTTGAC TGTAATGTTC8640GTTTTTTGCT ATTAATGTGA AAAAACTTCA TTAAAAAAGA ATGCAAATAT GAAAATAACA8700ATTTCAGGAA CAGGTTATGT TGGTCTTTCA AATGGTATTC TGATTGCGCA AAATCACGAA8760GTGGTTGCAC TGGATATCGT TCAGGCC AA GTGGACATGC TTAACAAGAG GCAGTCACCG8820ATTGTTGATA AGGAGATTGA AGAGTATCTG GCGACTAAAG ATCTCAATTT CCGCGCTACG8880ACAGATAAGT ATGAGGCGTA TAAAAATGCC GATTACGTTA TTATTGCCAC ACCTACCGAT8940
TATGATCCGA AAACAAATTA TTTTAATACC TCAAGTGTGG AAGCGGTCAT TCGTGATGTG9000ACAGAAATTA ATCCCAACGC GGTAATGATT ATAAAATCAA CTATCCCTGT TGGTTTTACA9060GAGTCCATTA AAGAACGGTT TGGTATTGAA AATGTGATCT TTTCGCCGGA GTTTTTACGC9120GAAGGGAAAG CACTTTATGA TAACTTGCAT CCATCACGCA TTGTGATTGG TGAGCAATCC9180GATCGCGCTG AACGTTTTGC AGCATTATTA CAAGAAGGAG CTATTAAGCA AGATATTCCA9240ACGTTGTTTA CTGACTCAAC GGAAGCTGAG GCGATTAAAC TTTTTGCCAA CACCTATCTG9300GCGATGCGTG TAGCGTATTT CAATGAACTT GATAGTTATG CTGAAAGCTT GGGGCTTAAT9360TCACGCCAGA TTATTGAGGG CGTATGCCTT GATCCGCGTA TAGGTAATCA CTACAACAAT9420CCGTCATTCG GTTATGGTGG TTATTGTCTG CCAAAAGATA CTAAGCAGTT ACTGGCAAAC9480TATCAGTCAG TACCGAATAA CTTGATCTCA GCAATTGTCG ATGCCAATCG CACGCGAAAA9540GATTTTATTG CCGATTCTAT CCTTGCACGT AAACCGAAAG TTGTTGGCGT CTATCGTCTG9600ATTATGAAGA GTGGTTCGGA CAATTTCCGT GCTTCATCGA TTCAGGGTAT TATGAAGCGA9660ATCAAGGCGA AAGGTGTGCC AGTAATCGTC TATGAGCCAG CGATGAAAGA GGACGATTTT9720TTCCGTTCGC GCGTGGTACG TGATCTGGAT GCGTTCAAAC AAGAAGCTGA TGTTATTATT9780TCTAACCGTA TGTCTGCCGA TCTGGCTGAT GTAGCAGATA AGGTTTATAC GCGCGACTTG9840TTTGGCAATG ATTAATTATT TTGTTTCATA CTAAGAAAAG GCCCTAATAA ATTAGGGCCT9900gla終止 complementTTTCTTATGG TTTTGTAAAA TCATACTTTA TAGAAATTAC GATACCATTC TACAAAGTTC9960TTTACCCCCT CTTTAACTGA CGTTTCAGGT TTGAATCCTA TTACGTCATA TAGTGCTTTA10020GTATCAGCAC TGGTTTCCAG TACATCACCG GGTTGGAGAG GCATCATATT TTTGTTGGCT10080TCAATACCCA GAGCCTCTTC TAAAGCATTG ATATAGTCCA TCAACTCCAC AGGCGAACTA10140TTACCAATGT TATAAATACG ATATGGTGCT GAACTTGTTG CAGGCGACCC AGTTTCTACA10200GTCCACTGTG GATCTTTTTC TGGAATAACA TCCTGTAACC GAATAATGGC TTCGGCAATA10260TCATCAATAT AGGTAAAGTC ACGCTTCATT TTGCCGAAGT TGTATACATC AATGCTTTTA10320CCTTCCAGCA TAGCTTTAGT GAATTTAAAT AATGCCATAT CCGGACGTCC CCATGGACCA10380TAAACCGTAA AGAAACGCAG CCCTGTGGTC GGTAAGCCAT ACAAATGAGA ATAGGTATGG10440GCCATGAGTT CATTCGCTTT TTTAGTTGCT GCATAAAGCG AAACAGGATG ATCTACAGAG10500TCATCTGTAG AGAAAGGCAT CTTGCGGTTC ATACCATAAA CAGAACTGGA GGAAGCGTAG10560AGTAGATGCT GAACATTATT ATGGCGGCAT CCTTCCAGTA CGTTCAGGAA TCCAATCAGG10620TTTGCATCTG CATATGCATT GGGATTTTCA AGGGAGTAAC GTACACCGGC TTGCGCAGCG10680AGGTTTATTA CGCGATCGAA CCGCTCGTCT GCAAACAGTG TCGCCATTTT CTCACGATCG10740GCCAGGTCAA TTTTATAAAA ACTGAAATTG TCGTGCTTGA GTAAATCAAG TCGTGCTTGT10800TTGAGGTTGA CATCGTAATA ATCATTTAAG TTGTCAATGC CTACAACCTG ATGACCAGCT10860GCAAGAAGCC GTTTACTTAC ATAGAAACCG ATAAAGCCAG CAGCTCCCGT AACCAGAAAT10920gla起始 complementTTCATTTATA ATCCTCGCTC AGGCTAGAAT ATAGCCAATT TTCATCTGGC ATAACTGAAA10980GTTAAATCAT ACCGTTAGAC AAGAAAAAAA GATAATCGGT ATCAGTTCTA AACCTGGCTG11040TTTTTTCTGG TAACGTGCTC ATTTTACAAT CAAAGCTGTT CTAAGCTGAC TATACAAGCC11100GACGTCATTA TTTCCAACCG TATGGCAGAA GAGCTTAAGG ATGTGGCAGA TAAGGTCTAC11160ACCCGCGATC TTTTTGGCAG CGACTAACAT CCTGTTATCA GGGCGATTTT CGCCCTGATT11220CTCTTATGTT CCCTTTGTAG TAATTCATTC TTTTTATCAT TTATCCTATA GCATTCATGA11280wzz起始CGATTATCGC TAAATTATGG CGACTTAAAA TTATTTCGTC CGTTAGGGTA ATGATGAGAG11340TAGAAAATAA TAATGTTTCT GGGCAAAACC ATGACCCGGA ACAGATTGAT TTGATTGATT11400TACTGGTGCA GTTGTGGCGC GGCAAGATGA CAATTATCAT CTCTGTCATT GTCGCTATTG11460
CCCTGGCTAT AGGGTATCTG GCCGTTGCCA AAGAAAAGTG GACTTCCACA GCTATCGTTA 11520CTCAACCTGA TGTGGGGCAA ATCGCTGGTT ATACCAACGC GATGAATGTG ATTTACGGTC 11580CGGCTGTACC GAAAGTCTCC GACATTCAGA CTTCACTTAT CGGACGTTAC AGCACTGCAT 11640TCTCAGCATT AGCGGAAACG TTGGATAATC AGGAAGAACC TGAAAAACTG ACCATTGAGC 11700CTACTGTTAA AAATCAGTCC TTACCTTTAG CGGTGTCTTA TGTTGGTGAA ACAGCTGAAG 11760GTGCGCAGAA ACAGCTGGCG CAATATATCC AGCAAGTTGA CGACCAGGTA AACGAAGAAC 11820TGGAAAAAGA CCTGAAAGAC AACATCGCGC TGCGTATGAA AAACTTGCAG GATTCGCTGA 11880AAACCCAGGA AGTAGTCGCG CAGGAGCAGA AAGATCTGCG TATCCGTCAG ATTCAGGAAG 11940CGTTGCAGTA TGCGAATCAG GCGCAGGTGA CAAAGCCACA GGTTCAGCAG ACTGAAGATG 12000TGACACAAGA TACGTTGTTC CTTTTGGGGA GCGAAGCGCT GGAGTCGATG ATTAAGCATG 12060AGGCGACCCG TCCGTTGGTG TTCTCATCAA ACTACTATCA GACTCGTCAA AACCTGCTGG 12120ATATCGACAA TCTTGACGTT GATAAACTTG ATATTCATGC TTACCGCTAT GTAATGAAAC 12180CGACGTTACC TATTCGTCGC GATAGCCCGA AAAAGGCAAT TACCTTGATT CTGGCGGTGC 12240TGCTGGGCGG CATGGTTGGC GCGGGGATTG TGCTGGGGCG TAACGCTCTG CGTAATTACA 12300wzz終止ACGCGAAGTA ATCTTTTCGG TTTTAAAGAA AAAGGGCAGG GTGGTGACAC CTTGCCCGTT 12360hisI終止 complementTTTTTTGCCG GATGCGACAA CAATATCGCA TCCGCTTACC CCGCAACTCA CTGATGCCGT 12420TTACGCAGGT TCTCAATTAC CGTAGTTAAA TCCAGATCCT GATCTTGCAA CAGCACCAGC 12480AGGTGATACA TCAAATCAGA CGCCTCGTTG GTCAGCTCAA AGCGGTCATG TACAGTCGCG 12540GCCAGTGCGG TTTCCACGCC TTCTTCGCCC ACTTTCTGCG CAATGCGTTT GGTGCCGCTG 12600GCATACAGTT TGGCGGTGTA GGAGGTTTCC GGGTCGGCAG ATTTGCGTTC GGCGAGCAGT 12660TGTTCCAGTT GATACAGGAA CAGCCACTGG TGAGCGGTGT CGCCGAAGCA GCTGCTGGTG 12720CCTTTGTGGC AGGTTGGTCC GATAGGATTC GCCAG 12755以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術方案的范圍內。
權利要求
1.一種對大腸桿菌O155型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于其是如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長12755個堿基；或者具有一個或多個插入、缺失或取代的堿基，同時保持所述分離的核苷酸功能的SEQ IDNO1的核苷酸。
2.按照權利要求1所述的對大腸桿菌O155型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于其是由orf2，wzy，orf4，orf5，wzx，orf8，ugd，gla，wzz9個基因組成，都位于galF基因和hisI基因之間。
3.按照權利要求2所述的對大腸桿菌O155型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，所述基因中具有高度特異性的基因是轉運酶的基因，包括wzx基因；聚合酶基因，包括wzy基因；糖基轉移酶基因，包括orf2、orf4、orf5基因其中所述的基因wzx是SEQ ID NO1中的6827至8113堿基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO1中的2232至3185堿基的核苷酸；orf2是SEQ ID NO1中的1213至2229堿基的核苷酸；orf4是SEQ ID NO1中的3195至4244；基因orf5是SEQ ID NO1中的4358至5173堿基的核苷酸。
4.按照權利要求1或2所述的對大腸桿菌O155型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，它還包括源于所述的wzx基因、wzy基因以及它們的混合或它們的重組。
5.按照權利要求4所述的對大腸桿菌O155型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的7226至7243堿基的核苷酸和8053至8072堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的7131至7148堿基的核苷酸和7862至7881堿基的核苷酸。源于wzy基因的寡核苷酸對是SEQ ID NO1中的2295至2312堿基的核苷酸和2776至2794堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的2234至2251堿基的核苷酸和2864至2881堿基的核苷酸。
6.權利要求1所述的對大腸桿菌O155型的O-抗原特異的核苷酸在檢測表達O-抗原的細菌、鑒定細菌的O-抗原和細菌的其它多糖抗原中的應用。
7.權利要求1所述的對大腸桿菌O155型的O-抗原特異的核苷酸的重組分子，在通過插入表達而提供表達大腸桿菌O155型的O-抗原，以及制備細菌疫苗中的應用。
8.按照權利要求1所述的對大腸桿菌O155型的O-抗原特異的核苷酸的應用，其特征在于，它作為引物用于PCR、作為探針用于雜交反應與熒光檢測、或者用于制造基因芯片或微陣列，供檢測細菌的應用。
9.權利要求1所述的對大腸桿菌O155型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，其包括下述步驟(1)基因組的提取在培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌O155型，離心收集細胞；得到的基因組DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)通過PCR擴增大腸桿菌O155型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O155型的基因組為模板通過Long PCR擴增其O-抗原基因簇，將得到的PCR產物，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及其特異性，合并該long PCR產物，并用DNA純化試劑盒純化PCR產物；(3)構建O-抗原基因簇文庫將Long PCR純化產物應用鳥槍法構建O-抗原基因簇文庫；(4)對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的克隆用實驗室常用的DNA自動測序儀對克隆中的插入片段進行測序，序列達到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析應用生物信息學軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列；(6)特異基因的篩選針對大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因設計引物；在每個基因內各設計了兩對引物，每對引物分布在相應基因內的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進行PCR，確定wzx、wzy基因對大腸桿菌O155型的O-抗原的高度特異性；(7)引物靈敏度的檢測培養(yǎng)大腸桿菌O155，細菌計數(shù)后分別將5×103，5×102，5×101，5個和0個活菌加入到一定量的某種待檢測物中，混入細菌的待檢測物作為檢測用樣品，將樣品加入LB培養(yǎng)基，取一些與樣品混合過的LB培養(yǎng)基過濾，將過濾液進行培養(yǎng)，從培養(yǎng)好的菌液中取數(shù)毫升處理后作為PCR模板用寡核苷酸進行PCR反應，檢測其對大腸桿菌O155的靈敏度。
10.權利要求1所述的對大腸桿菌O155型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，其包括下述步驟(1)基因組的提取在5mL的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)大腸桿菌O155型，離心收集細胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細胞，37℃溫育20分鐘，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘，之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提兩次，取上清再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚，上清用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，將DNA重懸于30ul TE中；基因組DNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)通過PCR擴增大腸桿菌O155型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O155型的基因組為模板通過Long PCR擴增其O-抗原基因簇，首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇啟動子區(qū)的JumpStart序列設計上游引物(5’-ATT GTG GCTGCA GGG ATC AAA GAA AT-3’)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設計下游引物(5’-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C-3’)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法擴增O-抗原基因簇，PCR反應程序如下在94℃預變性2分鐘；然后94℃變性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分鐘，這樣進行30個循環(huán)，最后，在68℃繼續(xù)延伸7分鐘，得到PCR產物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及其特異性，合并5管long PCR產物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產物；(3)構建O-抗原基因簇文庫用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構建O-抗原基因簇文庫，反應體系是300ngPCR純化產物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應在室溫中進行，酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應，合并4管同樣的反應體系，用等體積的酚抽提一次，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等體積的乙醚抽提一次后，用2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中，隨后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃30分鐘，將酶切產物補成平端，75℃終止反應后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應的緩沖液并將體系擴大為80ul，70℃反應20分鐘，使DNA的3′端加dA尾，此混合物經(jīng)等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等體積乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接10小時，總體積為90ul，其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶。最后用1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉淀連接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到連接產物；用Bi0-Rad公司的電轉化感受態(tài)細胞的制備方法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α細胞，取2-3ul連接產物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5α混合后，轉到Bi0-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時間為5.0毫秒至6.0毫秒，電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復蘇，然后將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃過夜培養(yǎng)，次日得到藍白菌落，將得到的白色菌落即白色克隆轉到含有氨卞青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時從每個克隆中提取質粒，并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群構成了大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇文庫；(4)對文庫中的克隆測序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的81個克隆用本實驗室ABI3730型DNA自動測序儀對克隆中的插入片段進行測序，序列達到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析用英國劍橋MRC(Medical Research Council)分子生物學實驗室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇的核苷酸全長序列；序列的質量主要由兩個方面來保證1)對大腸桿菌O155型的基因組作5個Long PCR反應，然后混合這些產物以產生文庫，2)對每個堿基，保證3個以上高質量的覆蓋率，在得到大腸桿菌O155型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國國家生物技術信息學中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到9個開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質序列間的精確比對，最后得到大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇的結構；(6)特異基因的篩選針對大腸桿菌O155型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因設計引物；在每個基因內各設計了兩對引物，每對引物分布在相應基因內的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進行PCR，除在第19組中得到了預期大小的一條帶外，在其他組中都沒有擴增到任何產物，所以wzx、wzy基因對大腸桿菌O155型的O-抗原都是高度特異的。(7)引物靈敏度的檢測購買市場上的生豬肉餡，攪拌均勻，分成20g一份，存在-40℃冰箱中備用；將10μl大腸桿菌O155的凍存菌液接種到有20ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37℃，200轉/分，培養(yǎng)12小時至飽和，取少量培養(yǎng)好的菌液作106和107倍的稀釋，其余的菌液放于4℃的冰箱中備用，取50μl稀釋菌液涂布LB瓊脂平板，37度，培養(yǎng)12h，對所涂平板計數(shù)，計算原液中活菌濃度。在5份生豬肉餡中分別摻入5×103，5×102，5×101，5個和0個活菌，攪拌均勻，加入200ml LB培養(yǎng)基，經(jīng)6層紗布過濾，過濾液于37℃，200轉/分，培養(yǎng)12h。從培養(yǎng)好的菌液中取3ml菌液于6,000g離心5分鐘，去上清，加100μl MQ超純水吹開沉淀并混勻，放入100度沸水中煮15分鐘，裂解液于12,000g離心8分鐘，取1μ上清做為PCR模板；用3對寡核苷酸對，SEQ ID NO1中的7641至7658堿基的核苷酸和8081至8098堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的10451至10468堿基的核苷酸和10736至10753堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的6289至6308堿基的核苷酸和7198至7216堿基的核苷酸，進行PCR反應，PCR反應體系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反應條件為95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30個循環(huán)；反應結束后，取10μl反應產物電泳，若有與預期大小相符的擴增帶，則結果為陽性，若沒有，則結果為陰性；參入了5×103，5×102，5×101，和5個活菌的每份豬肉餡均在3對引物的PCR反應中得到陽性結果；參入0個活菌的豬肉餡在3對引物的PCR反應中得到陰性結果；說明使用上述方法時，這3對引物對豬肉餡中的大腸桿菌O155的檢測靈敏度均為0.25個菌/g。
全文摘要
本發(fā)明提供一種對大腸桿菌O155型(Escherichiacoli O155)的O－抗原特異的核苷酸，它是大腸桿菌O155型中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長12755個堿基；或者具有一個或多個插入、缺失或取代的堿基，同時保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸；還包括源于大腸桿菌O155型的O－抗原基因簇中的糖基轉移酶基因和寡糖單位處理基因的寡核苷酸；本發(fā)明通過PCR證實寡核苷酸對大腸桿菌O155型的O－抗原都有高度的特異性；本發(fā)明還公開了用本發(fā)明的寡核苷酸檢測和鑒定人體及環(huán)境中的大腸桿菌O155型的方法。
文檔編號C07H21/00GK1563057SQ20041001904
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月19日 優(yōu)先權日2004年4月19日
發(fā)明者王磊, 孔慶科, 郭宏杰 申請人:天津生物芯片技術有限責任公司