專利名稱：對(duì)大腸桿菌o95型的o－抗原特異的核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大腸桿菌O95型(Escherichia coli O95)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特別是涉及大腸桿菌O95型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用這些對(duì)O-抗原特異的寡核苷酸快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)人體及環(huán)境中的大腸桿菌O95型并鑒定這些致病菌中的O-抗原。
背景技術(shù)：
O-抗原是革蘭氏陰性細(xì)菌脂多糖中的O特異性多糖成分，它由許多重復(fù)的寡糖單位組成。O-抗原的合成過程研究得較清楚先由糖基轉(zhuǎn)移酶將核苷二磷酸單糖轉(zhuǎn)移到一個(gè)固定在細(xì)胞內(nèi)膜的脂分子上，然后在內(nèi)膜的內(nèi)側(cè)合成寡糖單位，O-抗原的寡糖單位再通過轉(zhuǎn)運(yùn)酶被轉(zhuǎn)移到內(nèi)膜外側(cè)，而后通過聚合酶聚合成多糖，再被連接到一個(gè)糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends inMicrobiology.3178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics oflipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.MicrobiologicalReviews，57(3)655-682]。編碼負(fù)責(zé)O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色體上相鄰排列，形成一個(gè)基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterialpolysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4495-503]。在志賀氏菌、大腸桿菌和沙門氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之間[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigenlociimplication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，116923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coliO111 and Salmonella enterica O35 gene clustersgene clusters encoding the samecolitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.1825256-5261]。O-抗原基因簇含有三類基因糖合成路徑基因，糖基轉(zhuǎn)移酶基因，寡糖單位處理基因，其中糖合成路徑基因編碼的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸單糖；糖基轉(zhuǎn)移酶基因編碼的酶將核苷二磷酸單糖及其它分子轉(zhuǎn)到單糖上從而使單糖聚合成寡糖單位；寡糖單位處理基因包括轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和聚合酶基因，它們將寡糖單位轉(zhuǎn)移到細(xì)菌內(nèi)膜外側(cè)，再聚合成多糖。糖基轉(zhuǎn)移酶基因和寡糖單位處理基因只存在于攜帶這些基因的基因簇里。O-抗原中單糖的不同，單糖間聯(lián)結(jié)鍵的不同和寡糖單位之間聯(lián)結(jié)鍵的不同構(gòu)成了O-抗原的多樣性，而單糖的組成、單糖間的聯(lián)結(jié)鍵及寡糖單位之間的聯(lián)結(jié)鍵是由O-抗原基因簇中的基因控制著，所以O(shè)-抗原基因簇決定了O-抗原的合成，也決定了O-抗原的多樣性。
因?yàn)镺-抗原是極強(qiáng)的抗原，是大腸桿菌重要的致病因素之一，同時(shí)它又具有極強(qiáng)的多樣性，這啟示我們能研究一種快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)大腸桿菌及其O-抗原的特異性好、靈敏度高的方法。以表面多糖為目標(biāo)的血清學(xué)免疫反應(yīng)自上世紀(jì)30年代以來一直被用于對(duì)細(xì)菌的分型和鑒定，是鑒定致病菌的唯一的手段。這種診斷方法需要大量的抗血清，而抗血清一般種類不全，數(shù)量不足，大量的抗血清在制備和儲(chǔ)存中也存在一些困難。另一方面此法耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低、漏檢率高、準(zhǔn)確性差，所以，現(xiàn)在普遍認(rèn)為這種傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)方法將為現(xiàn)代分子生物學(xué)方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙門氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特異核苷酸序列通過PCR方法鑒定了沙門氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose andparatose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification ofS.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.312118-2123]。Luk，et.al的方法是將相應(yīng)于沙門氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原內(nèi)的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到對(duì)不同血清型的沙門氏菌特異的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用對(duì)E.coli O111的O-抗原特異的源于wbdI基因的寡核苷酸鑒定了一株產(chǎn)毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.341622-1627]，但是后來的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鑒定E.coli O111的血清型的方法有假陽性結(jié)果出現(xiàn)。Bastin D.A.and Reeves，P.R.認(rèn)為，這是由于wbdI基因是一個(gè)推測(cè)的糖合成路徑基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster ofEscherichia coli O111.Gene 16417-23]，而在其它細(xì)菌的O-抗原的結(jié)構(gòu)中也可能有這個(gè)糖，所以糖合成路徑基因?qū)τ贠-抗原并不是高度特異的志賀氏菌有46種血清型，但只有33種不同的O-抗原，大腸桿菌有166種不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，niche specificselection and bacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett，100509-516]，二者親緣關(guān)系非常近，并且有12種是大腸桿菌和志賀氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenicrelationships between the enteroinvasive Escherichia coli antigensO28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and and Shigella O antigens”J.clinMicrobiol，17(4)681-684]發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供了一種對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原特異的核苷酸。它是大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基轉(zhuǎn)移酶基因和轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因及聚合酶基因的特異的核苷酸。
本發(fā)明的次一目的是提供了大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇的全長(zhǎng)核苷酸序列。
本發(fā)明的另一目的是提供了構(gòu)成大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇的基因即ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因，包括wzm、wzt基因；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf5基因。
本發(fā)明的又一目的是提供了寡核苷酸，它們分別源于大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇中編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因，包括wzm、wzt基因；它們是上述基因內(nèi)的寡核苷酸，長(zhǎng)度在10-20nt；它們對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原是特異的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它們對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原是高度特異的，而且這些寡核苷酸還可重新組合，組合后的寡核苷酸對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原也是高度特異的。
本發(fā)明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作為引物用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列，從而通過這些方法檢測(cè)和鑒定大腸桿菌O95型的O-抗原及檢測(cè)和鑒定大腸桿菌O95型。
本發(fā)明的還一目的是提供了分離大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以獲得其他細(xì)菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以獲得編碼其他多糖抗原的細(xì)菌的基因簇的全序列。
本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原特異的核苷酸，其是如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長(zhǎng)13932個(gè)堿基；或者具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
前述的對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原特異的核苷酸，其中包括命名為rmlB，rmlA，orf3，orf4，orf5，orf6，orf7，wzm，wzt，orf11，orf12，orf13的13個(gè)基因組成，都位于galF基因和gnd基因之間。
前述的對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原特異的核苷酸，其中所述基因中具有高度特異性的基因是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的wzm基因；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf5基因；其中所述的基因wzm是SEQ ID NO1中的8944至9762堿基的核苷酸；orf5是SEQ ID NO1中的4268至5914堿基的核苷酸。
前述的對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原特異的核苷酸，其中它是源于所述的wzm基因、糖基轉(zhuǎn)移酶基因orf5基因；以及它們的混合或它們的重組。
前述的對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其中源于orf5基因的寡核苷酸對(duì)是SEQ ID NO1中的4350至4365堿基的核苷酸和4888至4903堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5246至5263堿基的核苷酸和5690至5707堿基的核苷酸。源于wzm基因的寡核苷酸對(duì)是SEQ ID NO1中的9347至9364堿基的核苷酸和9743至9758堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的9160至9175堿基的核苷酸和9650至9665堿基的核苷酸。
前述的對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原特異的核苷酸在檢測(cè)表達(dá)O-抗原的細(xì)菌、鑒定細(xì)菌的O-抗原和細(xì)菌的其它多糖抗原中的應(yīng)用。
前述的對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原特異的核苷酸的重組分子，在通過插入表達(dá)而提供表達(dá)大腸桿菌O95型的O-抗原，以及制備細(xì)菌疫苗中的應(yīng)用。
前述的對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原特異的核苷酸的應(yīng)用，其特征在于，它作為引物用于PCR、作為探針用于雜交反應(yīng)與熒光檢測(cè)、或者用于制造基因芯片或微陣列，供檢測(cè)細(xì)菌的應(yīng)用。
前述的對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，其包括下述步驟(1)基因組的提取在培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌O95型，離心收集細(xì)胞；得到的基因組DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(2)通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O95型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O95型的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇，將得到的PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小及其特異性，合并該long PCR產(chǎn)物，并用DNA純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫將Long PCR純化產(chǎn)物應(yīng)用鳥槍法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫；(4)對(duì)文庫中的克隆測(cè)序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的克隆用實(shí)驗(yàn)室常用的DNA自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)克隆中的插入片段進(jìn)行測(cè)序，序列達(dá)到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析應(yīng)用生物信息學(xué)軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇的核苷酸全長(zhǎng)序列；(6)特異基因的篩選針對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇中的wzm、orf5基因設(shè)計(jì)引物；在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，每對(duì)引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，確定wzm、orf5基因?qū)Υ竽c桿菌O95型的O-抗原的高度特異性；(7)引物靈敏度的檢測(cè)培養(yǎng)大腸桿菌O95，細(xì)菌計(jì)數(shù)后分別將5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌加入到一定量的某種待檢測(cè)物中，混入細(xì)菌的待檢測(cè)物作為檢測(cè)用樣品，將樣品加入LB培養(yǎng)基，取一些與樣品混合過的LB培養(yǎng)基過濾，將過濾液進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)好的菌液中取數(shù)毫升處理后作為PCR模板用寡核苷酸進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)其對(duì)大腸桿菌O95的靈敏度。
前述的對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，其包括下述步驟(1)基因組的提取在5mL的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)大腸桿菌O95型，離心收集細(xì)胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細(xì)胞，37℃溫育20分鐘，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時(shí)，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘，加等體積酚抽提混合物，取上清再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提兩次，取上清再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚。上清用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，將DNA重懸于30ul TE中；基因組DNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(2)通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O95型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O95型的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇，首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇啟動(dòng)子區(qū)的galF序列設(shè)計(jì)上游引物(#1523-ATT GTG GCTGCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設(shè)計(jì)下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法擴(kuò)增O-抗原基因簇，PCR反應(yīng)程序如下在94℃預(yù)變性2分鐘；然后94℃變性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分鐘，這樣進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后，在68℃繼續(xù)延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小及其特異性，合并5管long PCR產(chǎn)物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫，反應(yīng)體系是300ng PCR純化產(chǎn)物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應(yīng)在室溫中進(jìn)行，酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應(yīng)。合并4管同樣的反應(yīng)體系，用等體積的酚抽提一次，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等體積的乙醚抽提一次后，用2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中，隨后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃30分鐘，將酶切產(chǎn)物補(bǔ)成平端，75℃終止反應(yīng)后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應(yīng)的緩沖液并將體系擴(kuò)大為80ul，70℃反應(yīng)20分鐘，使DNA的3′端加dA尾。此混合物經(jīng)等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等體積乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接10小時(shí)，總體積為90ul。其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶，最后用1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉淀連接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到連接產(chǎn)物；用Bio-Rad公司的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備方法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞，取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5α混合后，轉(zhuǎn)到Bio-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時(shí)間為5.0毫秒至6.0毫秒，電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇，然后將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃過夜培養(yǎng)，次日得到藍(lán)白菌落，將得到的白色菌落即白色克隆轉(zhuǎn)到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)從每個(gè)克隆中提取質(zhì)粒，并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群構(gòu)成了大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇文庫；(4)對(duì)文庫中的克隆測(cè)序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的96個(gè)克隆用本實(shí)驗(yàn)室ABI3730型DNA自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)克隆中的插入片段進(jìn)行測(cè)序，序列達(dá)到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析用英國(guó)劍橋MRC(Medical Research Council)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇的核苷酸全長(zhǎng)序列；序列的質(zhì)量主要由兩個(gè)方面來保證1)對(duì)大腸桿菌O95型的基因組作5個(gè)Long PCR反應(yīng)，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫，2)對(duì)每個(gè)堿基，保證3個(gè)以上高質(zhì)量的覆蓋率，在得到大腸桿菌O95型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息學(xué)中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到13個(gè)開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國(guó)sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對(duì)，最后得到大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)；(6)特異基因的篩選針對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇中的wzm、orf5基因設(shè)計(jì)引物；在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，每對(duì)引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，除在含大腸桿菌O95的第13組中得到了預(yù)期大小的一條帶外，在其他組中都沒有擴(kuò)增到預(yù)期片段大小的正確產(chǎn)物，所以wzm、orf5基因?qū)Υ竽c桿菌O95型的O-抗原都是高度特異的。
(7)引物靈敏度的檢測(cè)購買市場(chǎng)上的生豬肉餡，攪拌均勻，分成20g一份，存在-40℃冰箱中備用。將10μl大腸桿菌O95的凍存菌液接種到有20ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37℃，200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)12小時(shí)至飽和，取少量培養(yǎng)好的菌液作106和107倍的稀釋，其余的菌液放于4℃的冰箱中備用，取50μl稀釋菌液涂布LB瓊脂平板，37度，培養(yǎng)12h，對(duì)所涂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算原液中活菌濃度。在5份生豬肉餡中分別摻入5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌，攪拌均勻，加入200ml LB培養(yǎng)基，經(jīng)6層紗布過濾，過濾液于37℃，200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)12h。從培養(yǎng)好的菌液中取3ml菌液于6,000g離心5分鐘，去上清，加100μl MQ超純水吹開沉淀并混勻，放入100度沸水中煮15分鐘，裂解液于12,000g離心8分鐘，取1μ上清做為PCR模板。用4對(duì)寡核苷酸對(duì)，SEQ ID NO1中的4350至4365堿基的核苷酸和4888至4903堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5246至5263堿基的核苷酸和5690至5707堿基的核苷酸。SEQ ID NO1中的9347至9364堿基的核苷酸和9743至9758堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的9160至9175堿基的核苷酸和9650至9665堿基的核苷酸，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反應(yīng)條件為95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取10μl反應(yīng)產(chǎn)物電泳，若有與預(yù)期大小相符的擴(kuò)增帶，則結(jié)果為陽性，若沒有，則結(jié)果為陰性。參入了5×103，5×102，5×101，和5個(gè)活菌的每份豬肉餡均在4對(duì)引物的PCR反應(yīng)中得到陽性結(jié)果。參入0個(gè)活菌的豬肉餡在4對(duì)引物的PCR反應(yīng)中得到陰性結(jié)果。說明使用上述方法時(shí)，這4對(duì)引物對(duì)豬肉餡中的大腸桿菌O95的檢測(cè)靈敏度均為0.25個(gè)菌/g。
也就是，本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇的全長(zhǎng)核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO1所示，全長(zhǎng)13932個(gè)堿基；或者具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。通過本發(fā)明的方法得到了大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)，如表3所示，它包括命名為rmlB，rmlA，orf3，orf4，orf5，orf6，orf7，wzm，wzt，orf11，orf12，orf13的13個(gè)基因組成，都位于galF基因和gnd基因之間。
本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇中的基因，即ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因(包括wzm、wzt基因)。它們?cè)贠-抗原基因簇中的起始位置和終止位置及核苷酸序列都列在表4中；本發(fā)明尤其涉及到糖基轉(zhuǎn)移酶基因、轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和聚合酶基因，因?yàn)樘呛铣陕窂交蚣春铣珊塑斩姿釂翁堑幕颥F(xiàn)在被預(yù)示對(duì)較多胞外多糖是常見的、共同的，對(duì)細(xì)菌的O-抗原并不是很特異的，而本發(fā)明涉及到的轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和聚合酶基因?qū)Υ竽c桿菌O95型的O-抗原是高度特異的。
本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了源于大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇中的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因，包括wzm、wzt基因；它們是這些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，優(yōu)先被用的是列于表1中的寡核苷酸對(duì)，在表1中也列出了這些寡核苷酸對(duì)在O-抗原基因簇中的位置及以這些寡核苷酸對(duì)為引物所做的PCR反應(yīng)的產(chǎn)物的大小，這些PCR反應(yīng)可用表中的退火溫度進(jìn)行。這些引物除在第13組中得到了預(yù)期大小的一條帶外，在其他組中都沒有擴(kuò)增到任何產(chǎn)物，所以wzm、orf5基因?qū)Υ竽c桿菌O95型的O-抗原都是高度特異的。
所述的對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法包括下述步驟1)基因組的提??；2)PCR擴(kuò)增大腸桿菌O95型中的O-抗原基因簇；3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫；4)對(duì)文庫中的克隆測(cè)序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特異基因的篩選；7)引物靈敏度的檢測(cè)。
本發(fā)明的其他方面由于本文的技術(shù)的公開，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
如本發(fā)明所用，“寡核苷酸”主要指來源于O-抗原基因簇中的編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因、編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因和編碼聚合酶的基因內(nèi)的一段核苷酸分子，它們?cè)陂L(zhǎng)度上可改變，一般在10到20個(gè)核苷酸范圍內(nèi)改變；更確切說這些寡核苷酸是源于wzm基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1中的8944至9762堿基的核苷酸)；orf5基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1中的4268至5914堿基的核苷酸)。源于以上基因內(nèi)的寡核苷酸對(duì)大腸桿菌O95型是高度特異的。
此外，有時(shí)兩個(gè)遺傳相似的編碼不同O-抗原的基因簇通過基因重組或突變產(chǎn)生新的O-抗原，從而產(chǎn)生新的細(xì)菌類型，新的突變株。在這種環(huán)境中，需要篩選出多對(duì)寡核苷酸同重組基因雜交以提高檢測(cè)的特異性。因此，本發(fā)明提供了一整套多對(duì)寡核苷酸的混合物，它們?cè)从谔腔D(zhuǎn)移酶基因；源于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因，包括wzm、wzt基因。這些基因的混合物對(duì)一個(gè)特殊的細(xì)菌多糖抗原來說是特異的，從而使這套寡核苷酸對(duì)這個(gè)細(xì)菌的多糖抗原是特異的。更具體地說，這些寡核苷酸的混合物是源于糖基轉(zhuǎn)移酶基因、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因，包括wzm、wzt基因的組合。
在另一方面，本發(fā)明涉及寡核苷酸的鑒定，它們可以用于檢測(cè)表達(dá)O-抗原的細(xì)菌和在診斷中鑒定細(xì)菌的O-抗原。
本發(fā)明涉及到一種檢測(cè)食品中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原的方法，這些抗原可以使樣品能與以下至少一個(gè)基因的寡核苷酸特異性雜交，這些基因是(i)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因(ii)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因，包括wzm、wzt基因。在條件許可的情況下至少一個(gè)寡核苷酸能與至少一個(gè)表達(dá)特殊的O-抗原的細(xì)菌的一個(gè)以上的那樣的基因特異性雜交，這些細(xì)菌是大腸桿菌O95型?？捎肞CR方法檢測(cè)，更可以將本發(fā)明方法中的核苷酸標(biāo)記后作為探針通過雜交反應(yīng)如southern-blot或熒光檢測(cè)，或者通過基因芯片或微陣列檢測(cè)樣品中的抗原及細(xì)菌。
本發(fā)明設(shè)計(jì)者考慮到以下情況當(dāng)單個(gè)的特異的寡核苷酸檢測(cè)無效時(shí)，寡核苷酸的混合物能與靶區(qū)域特異性雜交以檢測(cè)樣品。因此本發(fā)明提供了一套寡核苷酸用于本發(fā)明所述的檢測(cè)方法。這里所說的寡核苷酸是指源于編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因，包括wzm、wzt基因。這套寡核苷酸對(duì)一個(gè)特殊的細(xì)菌的O-抗原來說是特異的，這一特殊的細(xì)菌O-抗原是由大腸桿菌O95型表達(dá)的。
另一方面，本發(fā)明涉及到一種檢測(cè)排泄物中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原的方法，這些抗原可以使樣品能與以下至少一個(gè)基因的寡核苷酸特異性雜交，這些基因是(i)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因(ii)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因。在條件許可的情況下至少一個(gè)寡核苷酸能與至少一個(gè)表達(dá)特殊的O-抗原的細(xì)菌的一個(gè)以上的那樣的基因特異性雜交。這些細(xì)菌是大腸桿菌O95型?？捎帽景l(fā)明中的寡核苷酸作引物通過PCR的方法檢測(cè)樣品，也可將本發(fā)明中的寡核苷酸分子標(biāo)記后作為探針通過雜交反應(yīng)如southern-blot或熒光檢測(cè)，或者通過基因芯片或微陣列檢測(cè)樣品中的抗原及細(xì)菌。
一般一對(duì)寡核苷酸可能與同樣的基因雜交也可與不同的基因雜交，但它們中必須有一個(gè)寡核苷酸能特異性雜交到特殊抗原型的特異序列上，另一個(gè)寡核苷酸可雜交于非特異性區(qū)域。因此，當(dāng)特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新組合時(shí)，至少能選出一對(duì)寡核苷酸與多糖抗原基因簇中特異基因混合物雜交，或者選出多對(duì)寡核苷酸與特異基因的混合物雜交。甚至即使當(dāng)一個(gè)特殊的基因簇中所有基因都獨(dú)一無二時(shí)，此方法也能應(yīng)用于識(shí)別此基因簇內(nèi)的基因混合物的核苷酸分子。因此本發(fā)明提供了一整套用于檢測(cè)本發(fā)明方法的多對(duì)寡核苷酸，在這里多對(duì)寡核苷酸是源于編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因、編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因，包括wzm、wzt基因，這套寡核苷酸對(duì)一個(gè)特殊的細(xì)菌多糖來說是特異的，這套寡核苷酸可能是糖合成中必須基因的核苷酸。
另一方面，本發(fā)明也涉及到一種檢測(cè)源于病人的樣品中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原的方法。樣品中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原可以使樣品能與以下至少一個(gè)基因中的一對(duì)寡核苷酸中的一個(gè)特異性雜交，這些基因是(i)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因(ii)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因，包括wzm、wzt基因。在條件許可的情況下至少一個(gè)寡核苷酸能與樣品中的至少一個(gè)表達(dá)特殊的O-抗原的細(xì)菌的一個(gè)以上的那樣的基因特異性雜交，這些細(xì)菌是大腸桿菌O95型?？捎帽景l(fā)明中的寡核苷酸作引物通過PCR的方法檢測(cè)樣品，也可將本發(fā)明中的寡核苷酸標(biāo)記后作為探針通過雜交反應(yīng)，或者通過基因芯片或微陣列檢測(cè)樣品中的抗原及細(xì)菌。
更詳細(xì)地說，以上描述的方法可以理解為當(dāng)寡核苷酸對(duì)被使用時(shí)，其中的一個(gè)寡核苷酸分子能雜交到一個(gè)并不是來源于糖基轉(zhuǎn)移酶基因、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因，包括wzm、wzt基因的序列上。此外，當(dāng)兩個(gè)寡核苷酸都能雜交上時(shí)，它們可能雜交于同一基因也可能雜交到不同基因上。也即，當(dāng)交叉反應(yīng)出現(xiàn)問題時(shí)，可選擇寡核苷酸的混合物來檢測(cè)混合的基因以提供檢測(cè)的特異性。
本發(fā)明者相信本發(fā)明不必限于以上所提的核苷酸序列編碼的特定的O-抗原，而且廣泛應(yīng)用于檢測(cè)所有表達(dá)O-抗原和鑒定O-抗原的細(xì)菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如細(xì)菌胞外抗原)合成之間的相似性，本發(fā)明的方法和分子也應(yīng)用于這些其他的多糖抗原。
本發(fā)明首次公開了大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇的全長(zhǎng)序列，而且可從這個(gè)未被克隆的全長(zhǎng)基因簇的序列中產(chǎn)生重組分子，通過插入表達(dá)可產(chǎn)生表達(dá)大腸桿菌O95型的O-抗原，并成為有用的疫苗。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件。
實(shí)施例1基因組的提取在5mL的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)大腸桿菌O95型，離心收集細(xì)胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細(xì)胞，37℃溫育20分鐘，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時(shí)，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提兩次，取上清再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚，上清用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ul TE中?；蚪MDNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
實(shí)施例2通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O95型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O95型的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇。首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇啟動(dòng)子區(qū)的galF序列設(shè)計(jì)上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設(shè)計(jì)下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGTTCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法擴(kuò)增O-抗原基因簇，PCR反應(yīng)程序如下在94℃預(yù)變性2分鐘；然后94℃變性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分鐘，這樣進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。最后，在68℃繼續(xù)延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小及其特異性。合并5管long PCR產(chǎn)物，并用Promega公司的Wizard PCRPreps純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。
實(shí)施例3構(gòu)建O-抗原基因簇文庫首先是連接產(chǎn)物的獲得用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫。反應(yīng)體系是300ng PCR純化產(chǎn)物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應(yīng)在室溫中進(jìn)行。酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應(yīng)。合并4管同樣的反應(yīng)體系，用等體積的酚抽提一次，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等體積的乙醚抽提一次后，用2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中。隨后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mMDTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃30分鐘，將酶切產(chǎn)物補(bǔ)成平端，75℃終止反應(yīng)后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應(yīng)的緩沖液并將體系擴(kuò)大為80ul，70℃反應(yīng)20分鐘，使DNA的3′端加dA尾。此混合物經(jīng)等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等體積乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接10小時(shí)，總體積為90ul。其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶。最后用1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉淀連接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到連接產(chǎn)物。
其次是感受態(tài)細(xì)胞的制備參照Bio-Rad公司提供的方法制備感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α。取一環(huán)大腸桿菌DH5α單菌落于5ml的LB培養(yǎng)基中，180rpm培養(yǎng)10小時(shí)后，取2ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到200ml的LB培養(yǎng)基中，37℃250rpm劇烈振蕩培養(yǎng)到OD600 0.5左右，然后冰浴冷卻20分鐘，于4℃4000rpm離心15分鐘。傾盡上清，用冷的冰預(yù)冷的去離子滅菌水200ml吹散菌體，于4℃4000rpm離心15分鐘。再用冷的冰預(yù)冷的去離子滅菌水100ml吹散菌體，于4℃4000rpm離心15分鐘。用冷的冰預(yù)冷的10％的甘油懸浮細(xì)胞，4℃6000rpm離心10分鐘，棄上清，最后沉淀用1ml冰預(yù)冷的10％的甘油懸浮細(xì)胞，即為感受態(tài)細(xì)胞。將制得的感受態(tài)細(xì)胞分裝為50ul一管，-70℃保存。
最后是電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5α混合后，轉(zhuǎn)到Bio-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時(shí)間為5.0毫秒-6.0毫秒。電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇。然后立即將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37℃倒置過夜培養(yǎng)，次日得到藍(lán)白菌落。將得到的白色菌落即白色克隆轉(zhuǎn)到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)從每個(gè)克隆中提取質(zhì)粒并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群構(gòu)成了大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇文庫。
實(shí)施例4對(duì)文庫中的克隆測(cè)序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的96個(gè)克隆用本實(shí)驗(yàn)室ABI3730型DNA自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)克隆中的插入片段單向進(jìn)行測(cè)序，使序列達(dá)到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列。
實(shí)施例5核苷酸序列的拼接及分析用英國(guó)劍橋MRC(Medical Research Council)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇的核苷酸全長(zhǎng)序列(見序列列表)。序列的質(zhì)量主要由兩個(gè)方面來保證1)對(duì)大腸桿菌O95型的基因組作5個(gè)LongPCR反應(yīng)，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫。2)對(duì)每個(gè)堿基，保證3個(gè)以上高質(zhì)量的覆蓋率。在得到大腸桿菌O95型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息學(xué)中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到13個(gè)開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國(guó)sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用ClustralW軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對(duì)，最后得到大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)，如表3所示。
通過檢索和比較，發(fā)現(xiàn)orf1與Escherichia coli的rmlB基因在297個(gè)氨基酸的序列中有97％的相同性，表明它們之間有高度的同源性。所以可以確定orf1是rmlB基因。orf2與Vibrio cholerae的rmlA基因在289個(gè)氨基酸的序列中有82％的相同性，表明它們之間有高度的同源性。所以，可以確定orf2是rmlA基因。
orf3，orf6，orf8，orf11，orf12和orf13編碼的蛋白通過檢索比較并未發(fā)現(xiàn)其確定的功能，所以我們暫定這幾個(gè)基因?yàn)閛rf3，orf6，orf8，orf11，orf12和orf13。
Orf4編碼的蛋白與Pseudomonas syringae pv.tomato str.DC3000(AE016858)中的NTP轉(zhuǎn)移酶有58％的序列一致性和71％的序列相似性，但其確切功能不清楚，所以我們暫定該基因?yàn)閛rf4。
orf5編碼的蛋白與其他已知的糖基轉(zhuǎn)移酶有25％的序列一致性和43％的序列相似性。通過對(duì)Pfam中糖基轉(zhuǎn)移酶基序數(shù)據(jù)庫的搜索，這個(gè)基因編碼的蛋白與已知的糖基轉(zhuǎn)移酶家族的共有序列的同源性預(yù)期值非常高，但其確切功能不清楚，所以我們暫定該基因?yàn)閛rf5。
orf7編碼的蛋白分別Escherichia coli O52抗原基因簇中Orf3基因編碼的蛋白有31％的序列一致性和45％的序列相似性，但其確切功能不清楚，所以我們暫定該基因?yàn)閛rf7。
Orf9與Legionella pneumophila，(AJ007311)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子的轉(zhuǎn)位酶在283個(gè)氨基酸中有32％的的序列一致性和58％的序列相似性，這個(gè)膜蛋白由wzm基因編碼，所以確定orf9是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子的轉(zhuǎn)位酶基因，命名為wzm。orf10與Legionella pneumophila，(AJ007311)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在474個(gè)氨基酸中有49％的序列一致性和73％的序列相似性，這個(gè)蛋白是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中結(jié)合ATP的亞單位，是轉(zhuǎn)運(yùn)多糖的具有ATP酶活性的蛋白。orf10也與Klebsiellapneumoniae，(L31775)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在246個(gè)氨基酸中有42％的序列一致性和67％的序列相似性，所以確定orf10是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中結(jié)合ATP的具有ATP酶活性的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，命名為wzt。
實(shí)施例6特異基因的篩選針對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇中的wzm、orf5基因設(shè)計(jì)引物，在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，每對(duì)引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，除在含大腸桿菌O95組中得到了預(yù)期大小的一條帶外，在其他組中都沒有擴(kuò)增到預(yù)期片段大小的正確產(chǎn)物，所以wzm、orf5基因?qū)Υ竽c桿菌O95型的O-抗原都是高度特異的；這些基因在核苷酸序列中的位置見表1所示。
實(shí)施例7引物靈敏度的檢測(cè)。
購買市場(chǎng)上的生豬肉餡，攪拌均勻，分成20g一份，存在-40℃冰箱中備用。將10μl大腸桿菌O95的凍存菌液接種到有20ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37℃，200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)12小時(shí)至飽和，取少量培養(yǎng)好的菌液作106和107倍的稀釋，其余的菌液放于4℃的冰箱中備用，取50μl稀釋菌液涂布LB瓊脂平板，37度，培養(yǎng)12h，對(duì)所涂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算原液中活菌濃度。在5份生豬肉餡中分別摻入5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌，攪拌均勻，加入200ml LB培養(yǎng)基，經(jīng)6層紗布過濾，過濾液于37℃，200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)12h。從培養(yǎng)好的菌液中取3ml菌液于6,000g離心5分鐘，去上清，加100μl MQ超純水吹開沉淀并混勻，放入100度沸水中煮15分鐘，裂解液于12,000g離心8分鐘，取1μ上清做為PCR模板。用4對(duì)寡核苷酸對(duì)，SEQ ID NO1中的4350至4365堿基的核苷酸和4888至4903堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5246至5263堿基的核苷酸和5690至5707堿基的核苷酸。SEQ ID NO1中的9347至9364堿基的核苷酸和9743至9758堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的9160至9175堿基的核苷酸和9650至9665堿基的核苷酸，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反應(yīng)條件為95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取10μl反應(yīng)產(chǎn)物電泳，若有與預(yù)期大小相符的擴(kuò)增帶，則結(jié)果為陽性，若沒有，則結(jié)果為陰性。參入了5×103，5×102，5×101，和5個(gè)活菌的每份豬肉餡均在4對(duì)引物的PCR反應(yīng)中得到陽性結(jié)果。參入0個(gè)活菌的豬肉餡在4對(duì)引物的PCR反應(yīng)中得到陰性結(jié)果。說明使用上述方法時(shí)，這4對(duì)引物對(duì)豬肉餡中的大腸桿菌O95的檢測(cè)靈敏度均為0.25個(gè)菌/g。
通過對(duì)O抗原基因簇的克隆和在減毒的疫苗菌株中的表達(dá)，可以組建重組疫苗。O抗原為最主要的革蘭氏陰性菌的表面抗原，可以引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，是制造重組疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret實(shí)驗(yàn)室成功的將志賀氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙門氏菌Tyziai疫苗菌中表達(dá)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明可以引起兔子的免疫反應(yīng)(Molecular Microbiology 1993，7239-252)。中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的小組也在從事與Viret實(shí)驗(yàn)室類似的工作。王磊實(shí)驗(yàn)室在1999年成功的將大腸桿菌O111的O抗原基因簇在沙門氏菌疫苗STM-1中表達(dá)，并證明組建成的菌株可以引起小鼠的血液和體液反應(yīng)(Microbial Pathogenesis 1999，2755-59)。所以本發(fā)明O95的O抗原特異基因序列可以應(yīng)用于組建重組疫苗。
根據(jù)本發(fā)明的對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原特異的核苷酸序列(SEQ IDNO1所示)，構(gòu)造特異核酸探針，將其固定到芯片的載體上制成生物芯片，將要檢測(cè)的樣品適當(dāng)處理后，與生物芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)，然后利用生物芯片信號(hào)分析設(shè)備就可以得到樣品中相應(yīng)的細(xì)菌情況。這種大腸桿菌O抗原鑒定的DNA芯片將可以直接用于臨床和其它檢驗(yàn)場(chǎng)所(如食品加工和生產(chǎn)行業(yè)，畜牧獸醫(yī)行業(yè)海關(guān)檢疫等的微生物檢驗(yàn))。這種芯片只需要擴(kuò)大產(chǎn)量，在完全相同的條件下就可以產(chǎn)業(yè)化。
表1列出了大腸桿菌O95型的O抗原基因簇中糖基轉(zhuǎn)移酶基因和寡糖單位處理基因及基因內(nèi)的引物及PCR數(shù)據(jù)。在表中列出了大腸桿菌O95型的O抗原基因簇的糖基轉(zhuǎn)移酶基因、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因，包括wzm、wzt基因及它們的相應(yīng)的功能和大小。在每個(gè)基因內(nèi)，我們各設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，每對(duì)引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方以確保其特異性。在表中還列出了每個(gè)引物在SEQ ID NO1中的位置和大小。以每對(duì)引物用表中所列的相應(yīng)的退火溫度以表2中的所有菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，得到了相應(yīng)的PCR產(chǎn)物，其大小也列于表中。
表2是用于篩選特異基因的166株大腸桿菌和43株志賀氏菌及它們的來源，為了檢測(cè)的方便，我們將它們每12-19個(gè)菌分為一組，總共12組，它們的來源都列于表中。
在第13組中含有大腸桿菌O95型的基因組DNA作為陽性對(duì)照。以每組菌做模板，用表1中的每對(duì)引物按如下條件做PCR在95℃預(yù)變性5分鐘后，95℃變性30秒，退火時(shí)間是30秒，溫度見表1，72℃延伸2分鐘，這樣進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。最后在72℃繼續(xù)延伸5分鐘，反應(yīng)體系是25ul。模板為1∶20稀釋，取1μl。反應(yīng)完畢后，取10ulPCR產(chǎn)物通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增出的片段。
對(duì)于wzm、orf5基因，每個(gè)基因都有兩對(duì)引物被檢測(cè)，每對(duì)引物除了在第13組中做PCR后得到了預(yù)期大小的正確的一條帶外，在其他組中都沒有擴(kuò)增到任何預(yù)期大小正確的帶，也就是說，在大多數(shù)組中沒有得到任何PCR產(chǎn)物帶，所以wzm、orf5基因?qū)Υ竽c桿菌O95型及其O-抗原是高度特異的。
最后，通過PCR從大腸桿菌O95型中篩選到對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原高度特異的基因wzm、orf5。而這些基因內(nèi)的任何一段10-20nt的寡核苷酸對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原是特異的，尤其是上述每個(gè)基因中的引物即寡核苷酸對(duì)經(jīng)PCR檢測(cè)后證實(shí)對(duì)大腸桿菌O95型是高度特異的。所有的這些寡核苷酸都可用于快速準(zhǔn)確地檢測(cè)人體和環(huán)境中的大腸桿菌O95型，并能鑒定它們的O-抗原。
表3是大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)表，在表中列出了大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)，共由13個(gè)基因組成，每個(gè)基因用方框表示，并在方框內(nèi)寫入基因的名稱，數(shù)字表示的是O-抗原基因簇中的開放閱讀框(orf)的順序。在O-抗原基因簇的兩端是galF基因和gnd基因，它們不屬于O-抗原基因簇，我們只是用它們的一段序列設(shè)計(jì)引物來擴(kuò)增O-抗原基因簇的全長(zhǎng)序列。
表4是大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇中的基因的位置圖，在圖中列出了大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇中的所有開放閱讀框在全序列中的準(zhǔn)確位置，在每個(gè)開放閱讀框的起始密碼子和終止密碼子的下面劃線。在大腸桿菌中開放閱讀框的起始密碼子有兩個(gè)ATG和GTG。
SEQ ID NO1序列(SEQUENCE LISTING)<110>天津生物芯片技術(shù)有限公司<120>對(duì)大腸桿菌O95型的O抗原特異的核苷酸<130>對(duì)大腸桿菌O95型的O抗原特異的核苷酸<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>13932<212>DNA<213>Escherichia coli<400>1attgtggctg cagggatcaa agaaatcgtc ctggttacgc actcgtccaa gaatgcggta 60gaaaaccact tcgacacctc ttacgaactc gaagcgttgc ttgagcagcg cgttaagcgt120cagctgctgg cggaagtgca gtctatttgt ccgccgggcg tcaccatcat gaacgtgcgt180caggcacagc cgctgggtct gggacactct attctttgtg cccgtccggt ggtgggtgat240aacccgttca tcgttgtgct gccggatatc attattgata acgcgtctgc cgatccgctg300cgatacaacc tggcggcaat ggtggcacgt ttcaacgaaa cgggccgtag ccaggtgctg360gcgaagcgca tgaaaggcga tctctccgag tactccgtaa ttcagaccaa agaagcgctg420gaaacggaag ggcaggttag ccgcatcgtt gagttcatcg aaaaaccgga tcagccgcag480acgctggact cggacctgat ggcggttggt cgctatgttc tgaacgccga catctgggcg540gaactggaaa aaaccgagcc aggcgcctgg gatcgtatcc agctcaccga tgcgattgcc600gagctggcga agaagcagtc tgttgacgcg atgctcatga ccggcgagag ctatgactgc660ggtaagaaaa tgggctatat gcaggcgttc gtgaactacg ggctgcgcaa cctgaaggaa720ggggcgaagt tccgtaagag aattgagaaa cttcttacac aataagtcgt taaaccggat780atttcggttg gaacaatatg caggtagctg agggggattc aaagctgttc gcagctttaa840aatcaacctc gctacctttt ttttgtgtta aaaatcagta cctaaagaga acgatgcgcc900gttgtgactc cttattttac ggtgagattt ttccttgttt tcagcgccgt aaaaggggag960aataaccaat tagcattttg tgccaacccc ttctaaaata gctagccaac ttcggtttga 1020gggctaaaaa aactgtcatt gttttcagta tactggtagc tgtagagcca ggggcggtag 1080cgtgttttaa tttctgctaa ctacagtcct ccggctctat gaattaagtt cgaatctaaa 1140cattacgacg caatacggaa tagtcttgtg aaaatacttg tcactggtgg tgcaggtttt 1200attggatctg cagtagttcg ttatattatt aataatactg aagattctgt ggtaaacgta 1260gataagttga cctacgctgg caacctggaa tcgttggcaa aaattgccaa tcatccgcgc 1320tacgcatttg agcgagcaga tatctgtgat gcgagcgttt tggcacgcat tttcgcggaa 1380catcagcccg atgcggtaat gcacctggcg gcagaaagcc atgttgaccg ttctatcacc 1440ggtcccgctg cgtttataga aacgaacatc gttggtacct atgtatcgct ggaagccgcg 1500cgccaatatt ggtctcacct agacgaggcg cgcaaatcgg catttcgttt ccatcatatt 1560tctactgatg aagtctacgg cgatctgccg catccagatg aattgccagc gggaagcacg 1620ctcccactgt tcaccgaaac gacgccttac tctccaagta gtccatattc gtcttctaaa 1680
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aatcaagttt acacttgagc ttactaacga gactgttcat ggcgttgatt tcattgaatg 12780gaatagtgcg ggtaaaatcc ataaactgac tgctttttta aatgattaaa atagttacca 12840gttttggaat gtgaactgtg aacatttatg gatgacttta attgatgaaa aatcgtgtga 12900tttgatatct ttttttttaa ttaatgattt atcgaaattt tttaaaatcg cacaaattca 12960cgctattcgc tgcgaagagc ttgagttaac ataatgttca cttctcccag caggataatg 13020ggcttgctgg taaaccacac tagacaggag tatgtaatgt ctaagcaaca aatcggcgtt 13080gtcggtatgg cagtgatggg ggcgcaacct ggcgctcaac atcgaaagcc gtggttatac 13140cgtctccgtt ttcaaccgct cccgtgataa gaccggagaa gtgattgccg agaacccagg 13200caagaaactg gtccctttct atacggttaa agaattcgtc gaatctctgg aaacccctcg 13260tcgtatcctg ttaatggtga aagcaggtgc aggtaccgat gctgctatcg actccctgaa 13320gccttacctc gaaaaaggcg acatcatcat tgatggcggt aacaccttct tccaggacac 13380cattcgtcgt aatcgtgaac tgtctgctga aggcttcaac ttcattggca ctggtgtttc 13440cggtggtgaa gagggcgctc tgaaaggccc atccatcatg cctgggggcc agaaagaagc 13500atacgaactg gttgcgccta ttctgaccaa aatcgcagct gttgcagaag atggcgagcc 13560gtgtgtgacc tatatcggtc cggacggtgc agggcactat gttaaaatgg tgcacaacgg 13620cattgaatac ggcgatatgc agctgatcgc ggaagcatac tctctcctga aaggcggcct 13680gaatctcacc aatgaagagc tggcggaaac cttcaccgag tggaacaaag gcgagctgaa 13740cagctacctg atcgacatca ccaaagatat cttcacgaag aaagatgaag agggtaaata 13800cctggttgat gtgattctgg atgaagcagc gaacaaaggc accggcaaat ggaccagcca 13860gagttctctg gatctgggcg aaccgctgtc tctgatcacc gaatctgtct tcgcgcgtta 13920catctcttct ct 13932表1 大腸桿菌O95型的O抗原基因簇中的糖基轉(zhuǎn)移酶基因和寡糖單位處理基因及其中的引物及PCR數(shù)據(jù)

*只在大腸桿菌O95型中得到正確的一條帶表2 166株大腸桿菌和43株志賀氏菌及它們的來源組號(hào) 該組中含有的菌株 來源1、野生型大腸桿菌O1，O2，O5，O7，O8，O9，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O18，IMVSaO19ab，O20，O21，O22，O23，O242、野生型大腸桿菌O4，O10，O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O34，O35，IMVSaO36，O37，O38，O40，O41，O42，O433、野生型大腸桿菌O6，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，IMVSaO57，O58，O60，O61，O62，O534、野生型大腸桿菌O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78，IMVSaO79，O80，O81，O82，O83，O685、野生型大腸桿菌O84，O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99，IMVSaO101，O102，O103，O104，O105，O106，O976、野生型大腸桿菌O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113， IMVSa
O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128，O1177、野生型大腸桿菌O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137， IMVSaO138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O1408、野生型大腸桿菌O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158， IMVSaO159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153 b9、野生型大腸桿菌O168，O169，O170，O171，O172，O173， c痢疾志賀氏菌 D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13 d10、鮑氏志賀氏菌 B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15， dB16，B17，B1811、福氏志賀氏菌 F1a，F(xiàn)1b，F(xiàn)2a，F(xiàn)2b，F(xiàn)3，F(xiàn)4a，F(xiàn)4b，F(xiàn)5(v4)，F(xiàn)5(v7)，F(xiàn)6， dDS，DR12、野生型大腸桿菌 O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O100，O114，O151，O155， IMVSaO124，O167，O162，O121，O127，O149，O11913、第12組菌株加上大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株O95 IMVSa為了檢測(cè)的方便，每12-19個(gè)菌分為一組，總共12組，第13組作為陽性對(duì)照a.Institute of Medical and Veterinary Science(IMVS)，Anelaide，Australiab.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmarkc.O172和O173來自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余來自于IMVSd.中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)研究所表3 大腸桿菌O95型O抗原基因結(jié)構(gòu)圖 orfN galF rmlB rmlA orf3 orf4orf5orf6 orf7orf8wzm wzt orf11 orf12 orf13gndG+C％ contert 494142 36 34 32 37 32 3537 333637E.coli O95 O-antigen gene cluster表4大腸桿菌O95型O抗原基因簇基因位置ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCGTC CTGGTTACGC ACTCGTCCAA GAATGCGGTA 60GAAAACCACT TCGACACCTC TTACGAACTC GAAGCGTTGC TTGAGCAGCG CGTTAAGCGT 120CAGCTGCTGG CGGAAGTGCA GTCTATTTGT CCGCCGGGCG TCACCATCAT GAACGTGCGT 180CAGGCACAGC CGCTGGGTCT GGGACACTCT ATTCTTTGTG CCCGTCCGGT GGTGGGTGAT 240AACCCGTTCA TCGTTGTGCT GCCGGATATC ATTATTGATA ACGCGTCTGC CGATCCGCTG 300CGATACAACC TGGCGGCAAT GGTGGCACGT TTCAACGAAA CGGGCCGTAG CCAGGTGCTG 360GCGAAGCGCA TGAAAGGCGA TCTCTCCGAG TACTCCGTAA TTCAGACCAA AGAAGCGCTG 420GAAACGGAAG GGCAGGTTAG CCGCATCGTT GAGTTCATCG AAAAACCGGA TCAGCCGCAG 480ACGCTGGACT CGGACCTGAT GGCGGTTGGT CGCTATGTTC TGAACGCCGA CATCTGGGCG 540GAACTGGAAA AAACCGAGCC AGGCGCCTGG GATCGTATCC AGCTCACCGA TGCGATTGCC 600GAGCTGGCGA AGAAGCAGTC TGTTGACGCG ATGCTCATGA CCGGCGAGAG CTATGACTGC 660GGTAAGAAAA TGGGCTATAT GCAGGCGTTC GTGAACTACG GGCTGCGCAA CCTGAAGGAA 720GGGGCGAAGT TCCGTAAGAG AATTGAGAAA CTTCTTACAC AATAAGTCGT TAAACCGGAT 780ATTTCGGTTG GAACAATATG CAGGTAGCTG AGGGGGATTC AAAGCTGTTC GCAGCTTTAA 840AATCAACCTC GCTACCTTTT TTTTGTGTTA AAAATCAGTA CCTAAAGAGA ACGATGCGCC 900GTTGTGACTC CTTATTTTAC GGTGAGATTT TTCCTTGTTT TCAGCGCCGT AAAAGGGGAG 960AATAACCAAT TAGCATTTTG TGCCAACCCC TTCTAAAATA GCTAGCCAAC TTCGGTTTGA1020GGGCTAAAAA AACTGTCATT GTTTTCAGTA TACTGGTAGC TGTAGAGCCA GGGGCGGTAG1080CGTGTTTTAA TTTCTGCTAA CTACAGTCCT CCGGCTCTAT GAATTAAGTT CGAATCTAAA1140
orf1的起始CATTACGACG CAATACGGAA TAGTCTTGTGAAAATACTTG TCACTGGTGG TGCAGGTTTT 1200ATTGGATCTG CAGTAGTTCG TTATATTATT AATAATACTG AAGATTCTGT GGTAAACGTA1260GATAAGTTGA CCTACGCTGG CAACCTGGAA TCGTTGGCAA AAATTGCCAA TCATCCGCGC1320TACGCATTTG AGCGAGCAGA TATCTGTGAT GCGAGCGTTT TGGCACGCAT TTTCGCGGAA1380CATCAGCCCG ATGCGGTAAT GCACCTGGCG GCAGAAAGCC ATGTTGACCG TTCTATCACC1440GGTCCCGCTG CGTTTATAGA AACGAACATC GTTGGTACCT ATGTATCGCT GGAAGCCGCG1500CGCCAATATT GGTCTCACCT AGACGAGGCG CGCAAATCGG CATTTCGTTT CCATCATATT1560TCTACTGATG AAGTCTACGG CGATCTGCCG CATCCAGATG AATTGCCAGC GGGAAGCACG1620CTCCCACTGT TCACCGAAAC GACGCCTTAC TCTCCAAGTA GTCCATATTC GTCTTCTAAA1680GCATCAAGCG ATCATTTAGT GCGTGCCTGG CGTCGTACCT ATGGTCTTCC GACATTGGTG1740ACAAACTGTT CGAATAACTA CGGTCCTTAT CACTTCCCGG AAAAACTGAT CCCACTCATT1800ATTCTGAACG CCCTCGCAGG CAAACCGCTT CCGGTATACG GTAACGGCGA GCAGATACGA1860GATTGGCTCT TTGTCGAAGA TCATGCGCGC GCGCTATACA AAGTGGTAAC TGAAGGTACT1920GCGGGTGAAA CCTACAATAT CGGTGGCCAC AACGAGCGTA AAAACATCGA GGTTGTGAAG1980ACAATCTGCA CCATTCTGGA CGAAATCATT GCCGATAAGC CCGCAGGCAT TTCTCACTTC2040GCCGAACTGA TTACCTATGT AACCGACCGC CCGGGGCATG ACCTGCGTTA CGCCATTGAT2100GCCAGCAAAA TTAAAAATGA TCTGGGATGG GTACCACAGG AGACGTTTGA GTCCGGTATC2160CGTAAAACGG TTGAGTGGTA TTTAAATAAC GAAAGCTGGT GGAAGCGGGT AATGGATGGC2220Orf1的終止 orf2的起始TCCTATGCGG GCGAACGTCT GGGACTGGCG GAATAAAAAA GGAAAATATGATGAAAGGTA2280TTGTACTTGC TGGTGGTTCC GGAACGCGTC TCTATCCTAT AACTCAGGGT GTATCAAAAC2340AGTTGTTGCC TGTCTATGAT AAACCGATGA TTTATTATCC TATTTCTGTA CTGATGTTGG2400CGGGTATCCG CGATATATTA ATCATTACAA CTCCAGATGA TATCGATGCG TTTAAGCGTT2460TATTAGGCGA TGGCAGTCAA TTTGGCATAA ATCTCAGCTT TGCAGTTCAA CCTTCCCCTG2520ATGGCCTGGC GCAGGCATTC ATCATTGGTG AAGAATTTAT TAATGGCGAA CCATGTGCGC2580TCGTGTTAGG TGATACTGTC TTTTTTGGCC AAAGCTTTAG TAAAAAACTT GAAGCTGCAT2640TCCAACTAAC CTCTGGAGCG ATGGTCTTTG GTTATCAAGT TCAAGATCCT GAACGGTTTG2700GTGTAGTTGA ATTTGATAGT GAATTCAAAG CGTTATCTAT TGAAGAGAAA CCAGCCAAAC2760CTAAATCTAA TTGGGCTGTA ACGGGTCTAT ATTTCTACGA TAAAAATGTT GTCGAAATGG2820CAAAACAGAT TAAACCCTCG GTGCGGGGTG AGCTTGAGAT TACAACATTA AATCAGATGT2880ATCTTGAGCG TGGAGGATTG CAAGTCGAGT TGTTAGGTCG CGGTTTTGCA TGGCTAGATA2940CAGGAACTCA TGACAGTCTG ATAGAAGCAT CTCAATTCAT TCATACAATT GAAAAGCGCC3000AGGGTTTGAA AGTCGCTTGT CTTGAAGAAA TAGCTTTCCG TAAAGGCTGG ATGAATAAAG3060AACAACTATC GGCACAAGCG AAAAAATTCT CAAAAAATGA CTATGGCCGC TACTTACAGA3120orf2的終止TGCTGATTAG TGAGTAATAT TACGATGTGT TCTTTTTTAT TAAAAGCAAT GTGAGGTAAC 3180orf3的起始GTGGAATACT CCAACTTAGA TTCGATGGTA CGAGGCTGGT TTGTCGGTGG CTTTGAGCCA 3240ACCTTATATA AGACTACTGA CGTTGAGGTT GCCGTACAAC ATTTTACTGC CGGAGATCAC3300GAGGCCGCTC ATTGCCATAA AATTGCTACT GAAATAACAG TTATTATTTC GGGTCGAGCC3360AAAATGGCGG GCAGAATTGT TGTAGCAGGT GACATAGTTA AGATTTCGCC AGGGGAATAT3420ACTGATTTTG AAGCTTTAGA AGATACAGTT ACTGCTGTTG TAAAATTGCC TGGCGCTTTA3480orf3的終止orf4的起始AATGATAAAT ATCTCAAAGG AGATGAGTGA TGTTAAATAT TGTTGTTCCA ATGGCTGGTC 3540GCGGAAGTCG TTTTGCCAAA GAAGGTTATG TGGATCCAAA GCCACTGATT AAGTTAAAAG3600
ACAAGCGAAT GATTCAGGTT GTAATCAATA ATTTAACTCC TTCTATTCCT CATCGTTTTA3660TATTTATATG CCAGCGGCAA CATGTTATCG ATTATAGTTT GGACCGGTAT TTAAAAGAGT3720GGGCACCGAA TTCAGAAGTA ATTTGTATTG ATGGAATTAC TGAAGGCGCA GCATGTACCG3780TAATGTGTGC TGAGGAATTA ATCAATAACG ATGAACCTCT TATGATTGCA AACTCGGATC3840AATGGATTGA TATTGATATT AATGATTATC TAAATTACAT GAAGCATGAG GATTTAGACG3900GGCTTATCAT GACAATGAAA GCCGATGACC CTAAATGGTC TTATGCGGAA ATGAATGAAA3960ATAACCATGT TACTCGAGTT GTTGAAAAAG AAGTTGTATC CGATGAAGCG ACTGTAGGGA4020TTTATAATTA TAAAAAAGGC GCTGATTTTT GTAGAAGTGT CAAAAGAATG ATTGCTTTAG4080ATCAACGCTC TAATGGTGAA TTTTATGTTG CACCTGCTTA TACACTCATG TATGAGAATG4140AAGGCGCAAA AATTGGAATT TATAATATTG GGGAAGAAGC AAACGGGATG TATGGTTTGG4200GTATCCCTGC TGATCTTGAA TTGTTCCTTT CCCTTGATGT ATCAAGAAAA GCGTTGGATT4260orf4的終止orf5的起始TCTAATCATGCACGTAGCAA AAAAGATCTG TTTGATTGGG CATGAGTGCG GGTCATATAA4320AGGGCAAGGA GGTATAGCTA CATACATTGA ACTCACCGCG AAAGGATTCG CAAAACTTGG4380TTTAGAAGTT CATGTTATTT ACATCCATGG ATCCGGGGTA GACTGCGATG ATATAAAGTC4440ATGGAAGATA AAAAATGATC CTAGCCTTTA TAAA TATCA CTTGAAGTAG ACAAGGTTTT4500AGAAGAAATA AAACCGGACT TTGTAGAGTG TACAGACTTT ATAGGGATGA TGAGTTATAC4560GCTTTCAAAG CGAGCGATCA GAGGTTTAGA TTATAAATGC ATTTTTATAA CTAATCATCA4620CACGGGGATT AAAGAAGTCT GGGAATGGGG AACACAGCTT AAATTTAATG AGACAGCAAA4680GTCATGGATG AAGTCTTTAT ATATAGCTGA AAGAACACAA TCTCTTTTAT CAGATGCAAA4740CTTCTCGACA TCTAATTTTC TAGCCAGTTA TTTAGATGCA AACCATATTG AATCATATCA4800AGTATCGCCG TCTTATTATG AAATGAATGA TAATTTTGGT GAAACAAATA AAAATCACTA4860TGATTCTAAT TTATTACGTA TCATATCGCT TGGCAGATTC GAGTTAAGAA AAAAACAAGA4920GCTTCTTATT AAAGCTACTT GTGAACTTCT TGATGAAGGC TATGATATTG AAACAACTTT4980GATTGGGAAT AGTGGCGGTG ATTTATATAC GCATCAGGAC TATATGGAAT ATTGCTATAG5040CCTGATTCCC ACAGAGTATA AGCATAAGTT TCATTTTTAT GACTTCATGC CATATAAGTT5100GCTTCAGAAG AAATATACCG AATATGATTT GTTTGTAATC CCATCTCCAT ATGAGAATTT5160TCCAAATACA GCTCTTGAAG CTATCAACTA TGGAGTTACA GTTGTCGGAA GTAAATCCAG5220TGGCGTAGCT GATATGATAG GGGAGGATTT ATCCGATTAC TGCTTCTTGC CTGATTCAGT5280TTCTGATATT AAAAGAGTGA TTTTAAAATA TAACCAGTTA GATGCTGAAG AAAGGGCGAC5340TCTACGTTTG AAACAACGTC TGTCCTTAAA AAATCTTACT TGCTTTGAAA AGAGTATACA5400AGAACGCTTT GAAAAGTATC AAGCTGTAGA TGAGCTACGT AGTGAAAAAA ATATTGATGA5460TAAAGATATA TTGATTGTAT ATCAGGACAA AAATGGGCTC ATCAATAAAG TAGAGTATTG5520CTCAGAAATT TATTACTCCC TTGGGAGCAA ATGGAAAGAC TTTATCAGAG AAATTAAATA5580TATTGTCTTG ACCTCCGAGG AATATCAATT TAACAAGATA GAGAACTACT ATCCGGCACC5640CGGAATCATA TCCTGTTTTT CATCATATGA TCCTTATGGA ACGGTTAGAG AAATACAACA5700GGCTGAAAAA GGATATTCAT CTTTAACATT ATGTGTAGAG ACAATCCCAT ATAATGAAGG5760TGATTCAATA TCTGAATATA TCGCTCAAGT TTTACTTTCA ACAAGCGATG TCATATTCTT5820CATTGATGAA GAAAAGAAAG TAGAACAAGG CATCAGTATC GATATCAAAT ACGCGATTGA5880orf6的起始o(jì)rf5的終止TAAAATTAAG TTTAATTATT CTGGTGAAAAATGAATATAA TAATCCATGG GCCGCTAGAA 5940AAAGATTTCT TATTTAAAAA CTTAAATAAA ATTCGGCACG CTTCAGAAGA CGATCACATA6000ATTATTTCTG TTTATAACGA AGAACTTGAA AAAACAAAGG TTATTATAGA CAGCGTCCCA6060GTCAGAA TA AGGTTACATT AATCGGTTCT GATGATGTTT TTAATCCTGG CTTTTTTAAC6120ATTAACAGAC AAATTAATCT GGTTAGTGCC GCATTAAACG TCATTGAAGA TGAAAGTGAC6180TTTATTCTAA AAGTTCGAAT GGATCAGACT ATTAACTTTC GTTGGGTTAG AAAAGTTGTA6240
ACTGAGAAGC ATGAAGAACT GAAGGATAAA TTGATCACCA CTAACTGCTA TACCAGAAAA6300GATCGTCTTT ATCATCCATC TGATATGTTC CTCGCCGGCA CGAAAAAAAC ACTTCGTGCA6360TATTATCCAG AAGAGTTTTT CCAAGAGACT CACATGGATA ATTTATTGAA AATAAAAGAA6420CTAGTGCTCT CCGGATATAA AGGCGGATAC CATAAATATT GGCCAGAATC ACGACTGTTT6480ATGAATTACT TATCCATATT AGGTGAGGAA TTACAGGATA CAGAGATCTG TAGTCAGTCA6540CAATTGAAAA AGCATGTTTA TATTTTTAAT TCATGGGATA TTGGATTAAA ATGGAAAAAA6600TTCCTTAAAG GCAAAGTTAA CGTTTTACCA TATTTCTTTG TTTTAAGACC TTTCGAAAGA6660GGGCCTCTTG AGAACGCAGA GAATTTTTTA GCAAGTGACT TAACAGGTTA TACAAAAAAG6720CCTTTGAGGG AAATGATATA TAATAGTTTA GCAAAATTAT ATTTTAAATC TGGAGCTTAT6780TTAGCGAACC CAATATTCAT AGATAACAAA TCACTTATAC CAAAATTACT ACGAAAAATG6840TTTGATCATT CATATAAATT CATCCCTCCC ATTTTGCATA ATCTTATGTA TAAAGTCGCA6900orf7的起始 orf6的終止AAGAGAGTTT ATTATGCATT CAAATAAGAT ATATATAATT GGGTGGTCAG GCTTTATTGG6960TCGGCAATAT ATTCATTATC TTGATAAAAC GGGCTTTAAG GGTGAGGTTT TTCTTAACTC7020ACGTGCCGAC GATGAGCAAA AATACACTTC TTCTACAGAT AACATCACAA TAAAATATGT7080TAATTATGAG GAGATGATTA CTGGGCTTAA TTGTTCAAGG TCAACTGTAT TATACCTTGC7140AAATATGTAC TCACCGGGTG AGTCGAATAT TTACCCTTTG AATAGTGTCA AAGAAAACAT7200TATTCCATTT ATCACTTTTT TAGAGGATAT CAAGAATAAT GCAAGCAATA TCAGGTTCAT7260ATTTGCTTCT TCAGGAGGGA CTATATATGG CGATAGTCAA GAAGGGGAAT GTTGCAGCGA7320GAACCACTTA TTAGCTCCGA AAACCATTTA TGCAGCTAAC AAAATAGCGC AAGAGAACTA7380TCTCAACGTT TATCATGTTA ATTATGGTCT TGATTATCGG ATAGCCAGAA TTGCAAACCC7440TTATGGCCCG GGGCAGATAT TGAAAGGTGG TCAAGGATTA ATACCAGCAA TACTTCGTTC7500GTCATTAAAT AATGAAAGCC TTCCTGTGAG TGGTGATGGA AATGGTACAA GAGATTATAT7560ATATATAGAT GATCTTTGTT CACTTTTTTT CAGTCTAAGT AGCTATAGCG GAGCTTGTAG7620AACATTTAAT GCGGGCTCTG GTAAAGAGTA TAGTATAATG GAAATCATAA GTTGCTTTAA7680CGCAGTGCAT GACAGACCAA TAAAATACCA TCATGTTAAA ACCGAATCTT CAGTTGTAAG7740CCGTATTGTC CTTGATATCA GTCGTGCTAA AAATGAGCTG GGATGGAGCC CTAAAACTTC7800orf7的終止CCTATCTGAT GGGATTCGTG CCTTTATCAA CTGGTCGATT CAAGTGATGT AGTTTTCCAT 7860orf8的起始ATTTCAATAA TCTAACCTCA CATGACATAC ACCACTCAAA TCTCGGCTCA AGATGTCTCG 7920ATTGTTATCC AAGGGGCGAT TTTCGATACA AAAAAACAAA AAGTTGATGC TCAATTTATT7980GAATACTTAG AAAAAGTTAT TTCGATATTT ATAGGTTGCG AATTTATTGT TTCGACGTGG8040GAATTTCCTC GCGAAATATA CTTCGGTCTT TGCGAAAAAT ATCCGCAAGT AAATTTTGTT8100CTGAATGCTG ATGTTGGGCC AATAATAAAA ATAGTAGATG ATGTACCGAT TGTCACCAAT8160GTTAATAGGA TGATTTTTTC GACAATAAGT GGACTCAGGG AAGTTAATCG CAAATATGCT8220ATTAAATTGA GAACAGATTC TTTCTTATAC AATGATTCGA TACTCCAATC GCTTTATTAT8280GTTATGAATA AACGCGAATT TTTCGGATTA GACTTGGAAA AGAGAAATGA GCGATATCGG8340ATCTTTGATC ATCATGTAAT TAACTGTAAT CTATTTGCCC GCAATCCGCG CAGTCATTTA8400CCTTTCTTAT ATCATCCTGG TGATATTTTC CTGGCAGGAT TAACTAAAGA TTTAATTAAG8460CTTTTCAATA TACCATTGGC GACGGAAGAC CTAATAAAAA AATGCAATAG TGTGAGAAAT8520ACTTGCTTTA TGAAACTTGT ACCTGAACAA TATATTTGGG TTCAGTGTAT TAAAATGTCA8580AGAAGTACAG ATACGTTCGA TTATTCAAAT TTCACATATG ATGAAAAAGA AATCGAAAAA8640TCAGAGCAGT ATTATTTAAA TAATTTTGTA CCATACACTG CAGAAGAATT GGGTTTTTGT8700TGGCCAAAGC ATCGAGAGGT TTATTTTAAC AAAGGGAGTT CAAGTATTTA TGATCATGAA8760GATTGGCATC ATTTGTATCA TAAATACATT GACGGTTTTG AACAACCTAC AAGTTATGCA8820
CATAAAAAAA GAAGTGTGGT TATATTCTTT ATGAAGATGT ATTTTTTCAT TCGTAGCTCT 8880orf8的終止CTGCTTAAAA TAAAATTCAT TCGCAAATTT GCTTACAAAG TTTTTGTAAA AAGAGGATGA8940orf9的起始CTTATGAAGG GATTTGTTTC AACGCCCTCC AGTACAACGC GCTTTAGTGA AGTTTTTGAA 9000TCACGTAATT TAATTGCAGA ACTTATTCGG CGAGATTTTA ATGTCCGCTA TAAGCAAACA 9060GGGCTTGGAG TATTATGGGC AATAATTAAT CCAGGCGTCA ATATTCTTCT TTATCTCTTT 9120GTATTTGGTT TGTTAGTTAG GTTACCAACC CCAGAATATA ATGCTCCTTA TGCTGCGGTG 9180TTAATCTCAG CGATTTTATT TTGGAATTTA TTTTCTACTA GCATGCTCAC AGCAAGTGAT 9240GCGCTGATTA ATAACATGCA TCTTGTTACT AAAGTTTATT TCCCAAGGTT ATCTTTATGT 9300ATAGCAAGTG TATTTGTTGC ATTGATTGAT TTCTTGATAG CTTTTATCGT GTTTGTCCCG 9360TTAGCATTAT TGTATCATGT GGACATAAGT CTAATTAGAT TGCTTTTATT AATCCCATGT 9420ATAATTATAA CTCTGATGCT TGGATGTGGT TTTGGCTGTG CAATGGCTAT ATTGAAATTG 9480AAGTATAGAG ATATTAGACA TATACTTCCT CTAATAACCC AGGTTATTTT CTTTGCGTCA 9540CCTATTGTAT ATACTCTATC CATTGTTCCA GAACAATATA AAATATTCTA TTCTTTTAAC 9600CCCATCACTG GGATCGTAAT GATGTCTCGC TGGGCTATCT TAGGCGGAGC ACCCATTGAC 9660TTGACAATGC TTACTTATAG CCTAATTAGT GCATTTGTCG TTATGTGTTT AGGTGTCATT 9720orf10的起始o(jì)rf9的終止TATTTTGTTA AAAATGATCG ATCTGTGGCG GATTACGAAT GATTGAGTTT GATTCGGTAA 9780GTAAGCAGTA TGAAATCAAC CATCGACGGG CCAAAAGCTT ACGCGATGTT TTTTCATTTA 9840ACAAAAAGCC AGATGCAAAT GCAGAAATAT TTAAAGCGGT TGATGATGTC AGCTTTAGTA 9900TTGATAGCGG TAAATCAGTA GGTGTCTTGG GACGAAATGG TGCGGGAAAA TCAACGCTTT 9960TAAAATTATT AACGCGTATC ATTTCCCCGA CATCAGGCAA AATAACTGTA GATGGCTCCA10020TTTCTTGTCT GCTGGAAGTT GGCGCTGGTT TTCACCATGA ACTCAGTGGC TACGAAAATA10080TTTTTCTATG TGGCTCAATC TTGGGAATGA GTCGTAAACA AGTCAAATCT AAAATAGAAT10140CTATTATTGA TTTTTCTGAG GTCGAGAAAT TTATTGACGA ACCTGTTAAG TATTATTCAT10200CAGGTATGTA TATGCGCTTA GCTTTTGCGA TAGGTGCTCA TCTTGACTCG GATATTCTAG10260TGATCGACGA AGCTTTGGCT GTTGGTGACT CTCGTTTTCA AAATAAATGT TTAAATAAAA10320TCGACGAGAT TAGAAAAAGT GGAAAGACTA TATTTTTTGT TAGTCATAGC ATTGAACAAG10380TAAAAAAAGT GTGTGATACC AGTATTGTTA TGGATCATGG GAAATTATTG TTCCAGGGCA10440orf10的終止orf11的起始ATACTGATGA AGCTGAAAGA ATTTACAATA GTCTTACTAA TGGTGCGTGAGTATGATCAT10500TATTTCTCAT AGAGGGTATT GGAAGTTGAG CAGTGAAAAA AATACTGCTT TGGCTTTCAA10560ACGCTCATTT TCTTTAGGTT ATGGTACTGA AACAGATATT CGTGACTATA AGGGTAGTTT10620AGTCATCAGT CATGATATAC CAGATGAGAG TTCATTAAGC ATAGACTCTT TTTTTGAAAT10680TTATAATCAA TATGATGTCA AAGGCCCTTT GGCATTAAAC GTAAAATCAG ATGGGCTGCA10740AAAACTAATA AAAGAAAAAT TAAACGAGTA CAAGGTTAGT AATTATTTTT TCTTTGATAT10800GTCTATCCCG GATACTCTTG GGTATTTATC AGAAAAACTA AATACGTTCG TGCGTGTTAG10860TGAATATGAA ACACTAAACG ATCTCTATGA AGATGCTGAT GGTGTTTGGA TTGACGGTTT10920CAAAGAAAAT ATTATAACAG AATCTTTACT CGAAAAAATT ATTTCTGATG GGAAGCGTGC10980TTGTATTGTA TCCGCTGATC TGCATAAAAA CGATCCAGCT ACGCAATGGA AACTTTTAAA11040AAGTTTTAAA ACAAATATTC TTCAGTCGTC AAATATTATT CTTTGTACTG ATTTACCTGA11100orf12的起始 orf11的終止AAAAGCGTCG GAGTTTTTCTATGGATAATA AAATTAAAGC CGTAATCTTC GATATGGACG11160GAGTTCTTAT CGAAGCTAAA GACTGGCATT ACGAAGCTCT AAATCGCGCT TTGGGACTCT11220TCGGTCTGGA GATAACCAAG CATGAACATC TTACAACCTA TGATGGTCTA CCTACTAAAG11280
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以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于其是如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長(zhǎng)13932個(gè)堿基；或者具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
2.按照權(quán)利要求1所述的對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于其是由命名分別為rmlB、rmlA、orf3、orf4、orf5、orf6、orf7、wzm、wzt、orf11、orf12、orf13的13個(gè)基因組成，它們都位于galF基因和gnd基因之間。
3.按照權(quán)利要求2所述的對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，所述基因中具有高度特異性的基因是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的wzm基因；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf5基因；其中所述的基因wzm是SEQ ID NO1中的8944至9762堿基的核苷酸；orf5是SEQ ID NO1中的4268至5914堿基的核苷酸。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于它還包括源于所述的wzm基因、orf5基因；以及它們的混合或它們的重組。
5.按照權(quán)利要求4所述的對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，所述的源于orf5基因的寡核苷酸對(duì)是SEQ ID NO1中的4350至4365堿基的核苷酸和4888至4903堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5246至5263堿基的核苷酸和5690至5707堿基的核苷酸。源于wzm基因的寡核苷酸對(duì)是SEQ ID NO1中的9347至9364堿基的核苷酸和9743至9758堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的9160至9175堿基的核苷酸和9650至9665堿基的核苷酸。
6.權(quán)利要求1所述的對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原特異的核苷酸在檢測(cè)表達(dá)O-抗原的細(xì)菌、鑒定細(xì)菌的O-抗原和細(xì)菌的其它多糖抗原中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原特異的核苷酸的重組分子，在通過插入表達(dá)而提供表達(dá)大腸桿菌O95型的O-抗原，以及制備細(xì)菌疫苗中的應(yīng)用。
8.按照權(quán)利要求1所述的對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原特異的核苷酸的應(yīng)用，其特征在于，它作為引物用于PCR、作為探針用于雜交反應(yīng)與熒光檢測(cè)、或者用于制造基因芯片或微陣列，供檢測(cè)細(xì)菌的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述的對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，其包括下述步驟(1)基因組的提取在培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌O95型，離心收集細(xì)胞；得到的基因組DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(2)通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O95型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O95型的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇，將得到的PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小及其特異性，合并該long PCR產(chǎn)物，并用DNA純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫將Long PCR純化產(chǎn)物應(yīng)用鳥槍法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫；(4)對(duì)文庫中的克隆測(cè)序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的克隆用實(shí)驗(yàn)室常用的DNA自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)克隆中的插入片段進(jìn)行測(cè)序，序列達(dá)到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析應(yīng)用生物信息學(xué)軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇的核苷酸全長(zhǎng)序列；(6)特異基因的篩選針對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇中的wzm、orf5基因設(shè)計(jì)引物；在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，每對(duì)引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，確定wzm、orf5基因?qū)Υ竽c桿菌O95型的O-抗原的高度特異性；(7)引物靈敏度的檢測(cè)培養(yǎng)大腸桿菌O95，細(xì)菌計(jì)數(shù)后分別將5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌加入到一定量的某種待檢測(cè)物中，混入細(xì)菌的待檢測(cè)物作為檢測(cè)用樣品，將樣品加入LB培養(yǎng)基，取一些與樣品混合過的LB培養(yǎng)基過濾，將過濾液進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)好的菌液中取數(shù)毫升處理后作為PCR模板用寡核苷酸進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)其對(duì)大腸桿菌O95的靈敏度。
10.權(quán)利要求1所述的對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原特異的核苷酸的分離和鑒定方法，其特征在于，其包括下述步驟(1)基因組的提取在5mL的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)大腸桿菌O95型，離心收集細(xì)胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細(xì)胞，37℃溫育20分鐘，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘，之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時(shí)，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提兩次，取上清再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚，上清用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，將DNA重懸于30ul TE中；基因組DNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(2)通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O95型中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O95型的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇，首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇啟動(dòng)子區(qū)的galF序列設(shè)計(jì)上游引物(5’-ATT GTG GCT GCAGGG ATC AAA GAA AT-3’)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設(shè)計(jì)下游引物(5’-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C-3’)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法擴(kuò)增O-抗原基因簇，PCR反應(yīng)程序如下在94℃預(yù)變性2分鐘；然后94℃變性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分鐘，這樣進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后，在68℃繼續(xù)延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小及其特異性，合并5管long PCR產(chǎn)物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫，反應(yīng)體系是300ngPCR純化產(chǎn)物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應(yīng)在室溫中進(jìn)行，酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應(yīng)，合并4管同樣的反應(yīng)體系，用等體積的酚抽提一次，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等體積的乙醚抽提一次后，用2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中，隨后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mMDTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃30分鐘，將酶切產(chǎn)物補(bǔ)成平端，75℃終止反應(yīng)后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應(yīng)的緩沖液并將體系擴(kuò)大為80ul，70℃反應(yīng)20分鐘，使DNA的3′端加dA尾，此混合物經(jīng)等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等體積乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接10小時(shí)，總體積為90ul，其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶。最后用1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉淀連接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到連接產(chǎn)物；用Bi0-Rad公司的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備方法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞，取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5α混合后，轉(zhuǎn)到Bi0-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時(shí)間為5.0毫秒至6.0毫秒，電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇，然后將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃過夜培養(yǎng)，次日得到藍(lán)白菌落，將得到的白色菌落即白色克隆轉(zhuǎn)到含有氨卞青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)從每個(gè)克隆中提取質(zhì)粒，并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群構(gòu)成了大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇文庫；(4)對(duì)文庫中的克隆測(cè)序從文庫中挑選插入片段在1kb以上的96個(gè)克隆用本實(shí)驗(yàn)室ABI3730型DNA自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)克隆中的插入片段進(jìn)行測(cè)序，序列達(dá)到100％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析用英國(guó)劍橋MRC(Medical Research Council)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇的核苷酸全長(zhǎng)序列；序列的質(zhì)量主要由兩個(gè)方面來保證1)對(duì)大腸桿菌O95型的基因組作5個(gè)Long PCR反應(yīng)，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫，2)對(duì)每個(gè)堿基，保證3個(gè)以上高質(zhì)量的覆蓋率，在得到大腸桿菌O95型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息學(xué)中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到13個(gè)開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國(guó)sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對(duì)，最后得到大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)；(6)特異基因的篩選針對(duì)大腸桿菌O95型的O-抗原基因簇中的wzm、orf5基因設(shè)計(jì)引物；在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，每對(duì)引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方，以確保其特異性；用這些引物以166株大腸桿菌和43株志賀氏菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，除在含大腸桿菌O95的第13組中得到了預(yù)期大小的一條帶外，在其他組中都沒有擴(kuò)增到預(yù)期片段大小的正確產(chǎn)物，所以wzm、orf5基因?qū)Υ竽c桿菌O95型的O-抗原都是高度特異的。(7)引物靈敏度的檢測(cè)購買市場(chǎng)上的生豬肉餡，攪拌均勻，分成20g一份，存在-40℃冰箱中備用；將10μl大腸桿菌O95的凍存菌液接種到有20ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37℃，200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)12小時(shí)至飽和，取少量培養(yǎng)好的菌液作106和107倍的稀釋，其余的菌液放于4℃的冰箱中備用，取50μl稀釋菌液涂布LB瓊脂平板，37度，培養(yǎng)12h，對(duì)所涂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算原液中活菌濃度。在5份生豬肉餡中分別摻入5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌，攪拌均勻，加入200ml LB培養(yǎng)基，經(jīng)6層紗布過濾，過濾液于37℃，200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)12h。從培養(yǎng)好的菌液中取3ml菌液于6,000g離心5分鐘，去上清，加100μl MQ超純水吹開沉淀并混勻，放入100度沸水中煮15分鐘，裂解液于12,000g離心8分鐘，取1μ上清做為PCR模板；用4對(duì)寡核苷酸對(duì)，SEQ ID NO1中的4350至4365堿基的核苷酸和4888至4903堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5246至5263堿基的核苷酸和5690至5707堿基的核苷酸。SEQ ID NO1中的9347至9364堿基的核苷酸和9743至9758堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的9160至9175堿基的核苷酸和9650至9665堿基的核苷酸，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反應(yīng)條件為95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后，取10μl反應(yīng)產(chǎn)物電泳，若有與預(yù)期大小相符的擴(kuò)增帶，則結(jié)果為陽性，若沒有，則結(jié)果為陰性；參入了5×103，5×102，5×101，和5個(gè)活菌的每份豬肉餡均在4對(duì)引物的PCR反應(yīng)中得到陽性結(jié)果；參入0個(gè)活菌的豬肉餡在4對(duì)引物的PCR反應(yīng)中得到陰性結(jié)果；說明使用上述方法時(shí)，這4對(duì)引物對(duì)豬肉餡中的大腸桿菌O95的檢測(cè)靈敏度均為0.25個(gè)菌/g。
全文摘要
本發(fā)明提供一種對(duì)大腸桿菌O95型(Escherichiacoli O95)的O－抗原特異的核苷酸，它是大腸桿菌型中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長(zhǎng)13932個(gè)堿基；或者具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸；還包括源于大腸桿菌O95型的O－抗原基因簇中的糖基轉(zhuǎn)移酶基因和寡糖單位處理基因的寡核苷酸；本發(fā)明通過PCR證實(shí)寡核苷酸對(duì)大腸桿菌O95型的O－抗原都有高度的特異性；本發(fā)明還公開了用本發(fā)明的寡核苷酸檢測(cè)和鑒定人體及環(huán)境中的大腸桿菌O95型的方法。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1563050SQ20041001903
公開日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月19日
發(fā)明者王磊, 王威, 馮露 申請(qǐng)人:天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司