專利名稱：一種動脈粥樣硬化細(xì)胞模型的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動脈粥樣硬化細(xì)胞模型的建立方法。
背景技術(shù)：
已經(jīng)知道oxLDL中的很多組分對動脈硬化斑的形成和動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展起到至關(guān)重要的作用。研究又發(fā)現(xiàn)P2-GPI的特異性配體，oxLig-l，具有較強(qiáng)的免疫活性，并在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展起到至關(guān)重要的作用(Liuetal.， J Lipid Res 2002， 43:1486-95)。
PCT/JP02/00723公開了利用WSC/DMAP催化劑體系化學(xué)合成oxLig-l方法合成oxLig-l，在進(jìn)行7-酮基膽固醇(7-KC)和壬二酸的脂縮合反應(yīng)合成oxLig-l時，l-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(WSC)和4- 二甲氨基吡啶(DMAP)作為合成反應(yīng)的催化劑。但此方法的缺陷是oxLig-l合成量并不高，反應(yīng)時間較長，需2-3天。
在動脈粥樣硬化的初期，NF-k B活化被認(rèn)為動脈粥樣硬化形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，oxLDL中的很多組分，如13-HPODE(13-hydroperoxyoctadecadienoic acid)，氧磷脂，溶血卵磷脂，氧固醇和羥基壬烯，均激活NF-k B的活化[Winther et al.， Arterioscler ThrombVase Biol 2005， 25 : 904-14]，但oxLig-l對NF- k B的活化作用未見報道。[OO(H] 陳潔等[解剖學(xué)研究，2007，第29巻第03期]報道了建立鼠動脈粥樣硬化模型的建立方法，但是動物模型的建立既費時間又耗經(jīng)費。目前尚未報道有關(guān)利用oxLig-l建立動脈粥樣硬化細(xì)胞模型的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過對oxLig-l的合成方法進(jìn)行改良，提出一種高效快速的動脈粥樣硬化細(xì)胞模型的建立方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是 一種動脈粥樣硬化細(xì)胞模型的建立方法，該方法包括合成oxLig-l改良方法；以oxLig-l為剌激物用于促進(jìn)PKC和NF- k B信號通路的活化；以oxLig-l能誘導(dǎo)單核細(xì)胞(THP-1)分化成巨噬細(xì)胞；oxLig-l作用J774A.1細(xì)胞12小時后，巨噬細(xì)胞內(nèi)脂肪蓄積，形成泡沫細(xì)胞，最后引起細(xì)胞凋亡。步驟如下
—、合成oxLig-l : 以7-ketocholesterol(5-cholesten-3 P -ol-7-one)(7-KC)和壬二酸的脂為原料，以1，3- 二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)和4- 二甲氨基吡啶(DMAP)作為合成反應(yīng)的催化劑，二氯
甲烷作為溶劑，各物質(zhì)摩爾比為壬二酸dcc : dmap : 7-kc = 4 : 1.5 : 1 : 1，縮
合反應(yīng)合成oxLig-l，即7-酮基膽甾醇-9-羧基壬烷，反應(yīng)式如下
Azelaic add 反應(yīng)物在室溫下進(jìn)行，攪拌反應(yīng)12h后回流12h，最后過濾。粗產(chǎn)物經(jīng)飽和NaCl 萃取清洗，收集有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥過夜，隔天蒸干。粗產(chǎn)物隨后經(jīng)硅膠柱層析，
純氯仿、氯仿甲醇=100 : i和氯仿甲醇=75 : i三種極性的洗脫液依次進(jìn)行純化。
DCC吸水后生成不溶于反應(yīng)介質(zhì)的N， N' -二環(huán)己基脲，過濾即可除去，后處理容易。
另外DCC的價格比較便宜，而且收率也很高，有一定的經(jīng)濟(jì)效益。通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)分析合成的oxLig-l與13 2-GPI結(jié)合活性。 二、 oxLig-l促進(jìn)PKC和NF-KB信號通路的活化 (l)oxLig-l誘導(dǎo)的J774A.1細(xì)胞中I k B a的磷酸化和降解 oxLig-l是一種氧化型脂類分子，在多種細(xì)胞類型中如巨噬細(xì)胞等，能激活 NF- k B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本發(fā)明中主要探討oxLig-l活化NF- k B是否受I k B a的磷酸化 所介導(dǎo)。 J774A.1細(xì)胞使用50 y g/mL蛋白酶體抑制劑(ALLN)預(yù)處理30分鐘，隨后用以 不同濃度(O， 5， 10， 20， 50iig/mL)的oxLig-l作用J774A.1細(xì)胞，用Western Blot技術(shù) 檢測I k B a 32位和36位絲氨酸磷酸化的水平。結(jié)果顯示I k B a的磷酸化呈時間和濃度 依賴性顯著升高，其發(fā)生在30分鐘后，并在20 g/mL oxLig-l作用2小時后磷酸化水平 最為顯著。這一結(jié)果證實了 oxLig-l介導(dǎo)的NF- k B的活化受I k B a的磷酸化所介導(dǎo)。
(2)oxLig-l介導(dǎo)了 NF- k B的DNA結(jié)合活性 在NF-KB的活化過程中，其與DNA特異位點的結(jié)合非常關(guān)鍵，這種特異性結(jié) 合能啟動下游一系列細(xì)胞因子的表達(dá)。本發(fā)明采用了電泳遷移率EMSA實驗手段觀察了 這種結(jié)合。 J774A.1細(xì)胞經(jīng)20 y g/mL的oxLig-l作用30和60分鐘，以0.1 %的乙醇作用細(xì)胞 設(shè)為空白對照。核提取物經(jīng)包含生物素標(biāo)記的NF-k B保守序列的寡聚核苷酸探針處理， 隨后進(jìn)行電泳遷移率實驗(EMSA)。結(jié)果顯示，oxLig-l介導(dǎo)的NF- k B的DNA結(jié)合活性 呈時間依賴性，相應(yīng)的空白對照并為觀察的這一特異性結(jié)合。我們同時采用了未標(biāo)記的 突變探針和標(biāo)記的探針競爭性的與核提取物結(jié)合來驗證NF- k B的DNA結(jié)合特異性，結(jié) 果顯示只有標(biāo)記了的探針能特異性的識別NF- k B的DNA結(jié)合活性。證實了 oxLig-l介 導(dǎo)的NF- k B與DNA結(jié)合的特異性。
(3)oxLig-l誘導(dǎo)NF- k B/p65的核轉(zhuǎn)位 激光共聚焦顯微鏡法證實了 oxLig-l誘導(dǎo)NF- k B/p65的核轉(zhuǎn)位。在J774A.1細(xì) 胞中，NF-KB/p65主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，而當(dāng)細(xì)胞受到oxLig-l作用后，NF-k B/p65發(fā) 生了核轉(zhuǎn)位，大量的p65蛋白在細(xì)胞核中表達(dá)。
(4)oxLig-l通過激活PKC通路活化NF- k B : 有報道證實NF- k B的活化經(jīng)由PKC信號通路，本發(fā)明探討了 J774A.1細(xì)胞經(jīng) oxLig-1處理后PKC通路的激活情況。PKC信號通路在oxLig-1作用J774A.1細(xì)胞5min 后活化，而I k B a在oxLig-1作用細(xì)胞后30min發(fā)生降解，說明oxLig-1通過激活PKC 信號通路影響NF- k B的活化。 (5) P 2-GPI抑制oxLig-1介導(dǎo)的I k B a的磷酸化 前期研究報道稱oxLig-1是13 2-GPI的特異性配體，并且oxLig-1/13 2-GPI復(fù)合體 對動脈硬化的發(fā)生具有一定的影響。所以本發(fā)明檢測了 ！^-GPI對oxLig-l介導(dǎo)的NF-KB
的活化是否存在一定的干擾作用。 J774A.1細(xì)胞先用ALLN預(yù)處理lh， 分另U用20 y g/mL的oxLig-1和 oxLig-l(20 ii g/mL)/P 2-GPI(200 y g/mL)復(fù)合物作用J774A.1細(xì)胞，結(jié)果顯示P 2-GPII有效 地抑制lKBa的磷酸化。 (6) P 2-GPI抑制oxLig-1介導(dǎo)的NF- k B/p65的核轉(zhuǎn)位 通過激光共聚焦顯微鏡法我們證實了 13 2-GPI對oxLig-1誘導(dǎo)的NF- k B/p65的轉(zhuǎn) 位有抑制作用。在僅用P 2-GPI作用的J774A.1細(xì)胞中，NF- k B/p65主要定位在細(xì)胞質(zhì) 中。而當(dāng)細(xì)胞受到oxLig-1和13 2-GPI的作用后，NF- k B/p65核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象受到了抑制。
三、oxLig-1介導(dǎo)的人THP-1向巨噬細(xì)胞趨化 動脈硬化的發(fā)展過程中，伴隨著單核細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞層，隨后便進(jìn)入 亞內(nèi)皮空間并分化成巨噬細(xì)胞。進(jìn)而，巨噬細(xì)胞攝取大量的oxLDL形成泡沫化細(xì)胞，最 后在血管內(nèi)皮層堆積。所以，本發(fā)明觀察了oxLig-l是否也具有趨化THP-l細(xì)胞形成巨 噬細(xì)胞的作用。調(diào)節(jié)人THP-1細(xì)胞濃度為2X 105個細(xì)胞/ml，接種于置有蓋玻片的6孔 培養(yǎng)板中，每孔2ml，生長至接近融合，換無血清培養(yǎng)液作用12h，經(jīng)oxLig-l處理后， 常規(guī)H-E染色。光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。結(jié)果顯示oxLig-1確實具有這種特 性，THP-1細(xì)胞受到作用后形成梭形的貼壁細(xì)胞，即巨噬細(xì)胞。
四、oxLig-1介導(dǎo)的人THP-1細(xì)胞的泡沫化 加入不同濃度oxLig-l(O、 5、 10、 20、 40禾P 80 y g/mL)，作用人THP-1細(xì)胞18h 后，經(jīng)油紅O染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚積發(fā)生變化，隨著oxLig-l濃度的增加，人THP-1細(xì) 胞內(nèi)脂質(zhì)含量增加。說明oxLig-l進(jìn)入人THP-1細(xì)胞后在細(xì)胞中聚積。其中，10 g/mL 和20iig/mLoxLig-l作用后細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚積最為明顯，細(xì)胞質(zhì)中有明顯的脂滴。3-(4， 5-二甲基噻唑-2)-2， 5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)結(jié)果顯示，當(dāng)oxLig-1的濃度大于25 y g/ mL時泡沫細(xì)胞引起細(xì)胞凋亡活力呈明顯減弱，并且呈時間和濃度依賴性。
本發(fā)明的有益效果是動脈粥樣硬化細(xì)胞模型的建立可以代替耗費時間的動物 模型，將會對動脈粥樣硬化的機(jī)理研究提供一種有效手段。


圖1為ELISA分析測定oxLig-1與P 2-GPI結(jié)合能力圖。 圖2為oxLig-l誘導(dǎo)的lKBa的磷酸化和I k B a的表達(dá)呈濃度和時間依賴性曲 線圖。 圖3為oxLig-1介導(dǎo)了 NF- k B的DNA結(jié)合活性呈時間依賴性對比圖。
圖4oxLig-l介導(dǎo)的NF- k B/p65的核轉(zhuǎn)位。 圖5oxLig-l對I k B a的表達(dá)和PKC通路的影響。 圖6 P 2-GPI對oxLig-1介導(dǎo)的I k B a的磷酸化的抑制作用。 圖7為oxLig-1介導(dǎo)的人THP-1向巨噬細(xì)胞趨化前后對比圖。 圖8為oxLig-1介導(dǎo)的人THP-1細(xì)胞的泡沫化形成圖。 圖9為oxLig-1對J774A.1細(xì)胞生長的影響示意圖。
具體實施方式

實施例1 —、 oxLig-1的化學(xué)合成及結(jié)構(gòu)分析
1、合成oxLig-1 :
(1)建立反應(yīng) 0.500mmol的壬二酸、0.1875mmol DCC和(U25mmo1催化劑DMAP溶于15mL 二氯甲烷中，由恒壓漏斗逐滴加入同樣溶于二氯甲烷的0.125mmo1 7-KC，各物質(zhì)摩爾比
為壬二酸dcc : dmap : 7-kc = 4 : 1.5 : i : i。 反應(yīng)物在4(TC攪拌反應(yīng)12h后回流12h，其間利用薄層層析隨時檢測反應(yīng)情況。 [OO49] (2)反應(yīng)后處理 將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行減壓過濾，除去不溶的脲；飽和NaCl萃取3次，收集有機(jī)相； 無水Na^04干燥過夜。 (3)拌樣 稱取干燥產(chǎn)物3倍質(zhì)量的拌樣硅膠(100-140目)與產(chǎn)物于少量CH2C12中溶解，
自然晾干。 (4)裝柱 稱取干燥產(chǎn)物50倍質(zhì)量的純化硅膠(200-300目)，連續(xù)倒入柱子中，顛實；加 入拌樣硅膠，最后壓一薄層純化硅膠。
(5)純化 先后用純氯仿、氯仿甲醇=ioo : i和氯仿甲醇=75 : i三種極性的洗脫 液進(jìn)行純化。
(6)純品收集
6
將含純品的洗脫液收集，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到純品oxLig-l。
(7)樣品分析 測定熔點，紅外譜，核磁碳譜、氫譜，質(zhì)譜檢測合成樣品。 整個脂縮合反應(yīng)時間為24小時，最終產(chǎn)物通過硅膠柱層析分離。以這種方式合 成的oxLig-l的產(chǎn)率為80.4% ，證實DCC/DMAP脂縮合合成體系對oxLig-l的合成是可行 的，并且具有相當(dāng)客觀的得率。 2、 ELISA法檢測oxLig-l與P 2-GPI的結(jié)合情況(1)將合成的oxLig-l和心磷脂(CL，陽性對照)溶于無水乙醇中，以50 ii g/mL
濃度，50iiL/孔進(jìn)行包被，電吹風(fēng)吹干。 (2)1 % (W/V)BSA-PBS(150 y 1/孑L )封閉lh。(3)加入含0.3% (W/V)BSA的P 2-GPI(30 y g/mL， 50 y L/孔)，室溫孵育20min。
(4)加入抗P 2-GPI抗體(WB-CAL-1 ; 5.0 ii g/mL， 50 ii L/孔)，室溫孵育lh。
(5)辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠IgG(HRP-labeled anti-mouse IgG)(l : 1000稀
釋)，室溫孵育lh。 (6)o-phenylenediamine(OPD)禾P H202顯色反應(yīng)(2mg OPD， 10mL 0.1M Citrate Buffer pH5.0， 10 ii L H202)。 (7)2N H2SO4(100 ii L/孑L )終止顯色反應(yīng)。
(8)酶標(biāo)儀490nm檢測吸光度值。各步驟之間用0.05% (W/V)Tween 20PBS洗3次。無水乙醇做空白對照。 通過ELISA分析，合成的oxLig-l具有與P 2-GPI結(jié)合活性，見圖1。 二、 oxLig-l促進(jìn)NF-KB信號通路的活化 1、 oxLig-l誘導(dǎo)的J774A.1細(xì)胞中I k B a的磷酸化和降解 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)分析設(shè)置時間梯度和濃度梯度，用oxLig-l作用
J774A.1細(xì)胞。使用Pierce公司的細(xì)胞核和漿蛋白提取試劑盒提取核蛋白和漿蛋白。每
個樣品的蛋白濃度經(jīng)Pierce BCA蛋白定量試劑盒定量，-S(TC保存。 蛋白樣品(20iig/孔)經(jīng)12X的聚丙烯不連續(xù)凝膠分離，80V約兩小時。電泳后 100V轉(zhuǎn)膜約l小時，之后用含5%的牛血清白蛋白封閉液室溫封閉1小時，洗膜后孵育l 比1000稀釋抗I k B a和I k B a磷酸化抗體，4。C過夜，再次洗膜后用辣根過氧物酶標(biāo)記 的羊抗鼠二抗(l : 5000)孵育1小時，最后使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)ECL顯影，所得結(jié) 果使用UVP凝膠成像系統(tǒng)分析。結(jié)果如圖2所示，lKBa的磷酸化呈時間和濃度依賴 性顯著升高，其發(fā)生在30分鐘后，并在20 i！ g/mL oxLig-l作用2小時后磷酸化水平最為 顯著。這一結(jié)果證實了 oxLig-l介導(dǎo)的NF- k B的活化受I k B a的磷酸化所介導(dǎo)。
2、 oxLig-l介導(dǎo)了 NF- k B的DNA結(jié)合活性 為了檢測NF-KB的DNA結(jié)合活性，研究使用了電泳遷移率實驗(EMSA)，并使 用為標(biāo)記的突變探針做為競爭性探針來確定結(jié)合的特異性。NF- k B的DNA結(jié)合活性通 過EMSA試劑盒檢測(Viagene Biotech, Ningbo)，實驗方法如操作說明書所示。試劑盒中 所包含的保守的NF- k B寡聚核苷酸序列為5' -TTG TTA CAA GGG ACT TTC CGC TGG GGA CTT TCC AGG GAG GCG TGG-3'。 結(jié)果如圖3所示，oxLig-l介導(dǎo)的NF-KB的DNA結(jié)合活性呈時間依賴性，相應(yīng)
7的空白對照并為觀察的這一特異性結(jié)合。我們同時采用了未標(biāo)記的突變探針和標(biāo)記的探 針競爭性的與核提取物結(jié)合來驗證NF-KB的DNA結(jié)合特異性，結(jié)果顯示只有標(biāo)記了的 探針能特異性的識別NF- k B的DNA結(jié)合活性。證實了 OxLig-1介導(dǎo)的NF- k B與DNA
結(jié)合的特異性。 3、 oxLig-1誘導(dǎo)NF- k B/p65的核轉(zhuǎn)位 激光共聚焦顯微鏡法證實了 oxLig-1誘導(dǎo)NF- k B/p65的核轉(zhuǎn)位。正常細(xì)胞及經(jīng) 20ug/mL oxLig-1作用12h后的細(xì)胞，用免疫熒光雙染色法檢測NF- k B/p65的表達(dá)情況， 樣品經(jīng)40g/L的多聚甲醛室溫固定lOmin， PBS清洗3次后，使用lmL/L Triton X-100處 理10min破膜。山羊血清工作液封閉lh， 1 : 50稀釋兔抗NF-KB/p65抗體，4"孵育過 夜。次日，PBS清洗后，使用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的山羊抗兔IgG避光孵育2h，最后用 10mg/L碘化吡啶對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，封片后，激光共聚焦顯微鏡觀察實驗結(jié)果并照相。 細(xì)胞受到oxLig-l作用后，NF-KB/p65發(fā)生了核轉(zhuǎn)位，大量的p65蛋白在細(xì)胞核中表達(dá)， 如圖4所示。 4、 oxLig-l通過激活PKC通路活化NF- k B : 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)分析設(shè)置時間梯度(O， 5， 15， 30， 60， 120h)，用 oxLig-1作用J774A.1細(xì)胞。使用Pierce公司的細(xì)胞核和漿蛋白提取試劑盒提取核蛋白和 漿蛋白。每個樣品的蛋白濃度經(jīng)Pierce BCA蛋白定量試劑盒定量，-S(TC保存。
蛋白樣品(20iig/孔)經(jīng)12X的聚丙烯不連續(xù)凝膠分離，80V約兩小時。電泳后 100V轉(zhuǎn)膜約l小時，之后用含5%的牛血清白蛋白封閉液室溫封閉1小時，洗膜后孵育l 比IOOO稀釋抗PKC磷酸化抗體，fC過夜，再次洗膜后用辣根過氧物酶標(biāo)記的羊抗鼠二 抗(l : 5000)孵育1小時，最后使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)ECL顯影，所得結(jié)果使用UVP 凝膠成像系統(tǒng)分析。結(jié)果如圖5所示，PKC的磷酸化發(fā)生在5分鐘，而I k B a在30分 鐘時降解，證實了 oxLig-l介導(dǎo)的NF- k B的活化受PKC磷酸化所介導(dǎo)。
5、 P 2-GPI抑制oxLig-1介導(dǎo)的I k B a的磷酸化 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)分析J774A.1細(xì)胞先用ALLN預(yù)處理lh，分別用 20 ii g/mL的oxLig-1和oxLig-l(20 y g/mL)/ P 2-GPI(200 y g/mL)復(fù)合物作用J774A.1細(xì)胞。 使用Pierce公司的細(xì)胞核和漿蛋白提取試劑盒提取核蛋白和漿蛋白。每個樣品的蛋白濃 度經(jīng)Pierce BCA蛋白定量試劑盒定量，-80°〇保存。 蛋白樣品(20 P g/孔)經(jīng)質(zhì)量濃度為12%的聚丙烯不連續(xù)凝膠分離，80V約兩小 時。電泳后IOOV轉(zhuǎn)膜約1小時，之后用含質(zhì)量比為5%的牛血清白蛋白封閉液室溫封閉 l小時，洗膜后孵育l比lOOO稀釋抗lKBa磷酸化抗體，4t:過夜，再次洗膜后用辣根 過氧物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗(l : 5000)孵育1小時，最后使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)ECL 顯影，所得結(jié)果使用UVP凝膠成像系統(tǒng)分析。結(jié)果如圖6所示，^-GPII有效地抑制 IkB a的磷酸化。 6、 P 2-GPI抑制oxLig-l介導(dǎo)的NF- k B/p65的核轉(zhuǎn)位 如圖4所示，通過激光共聚焦顯微鏡法我們證實了 13 2-GPI對oxLig-1誘導(dǎo)的 NF- k B/p65的轉(zhuǎn)位有抑制作用。在僅用P 2-GPI作用的J774A.1細(xì)胞中，NF- k B/p65主 要定位在細(xì)胞質(zhì)中。而當(dāng)細(xì)胞受到oxLig-1和13 2-GPI的作用后，NF- k B/p65核轉(zhuǎn)位現(xiàn) 象受到了抑制。
三、oxLig-l介導(dǎo)的人THP-1向巨噬細(xì)胞趨化 調(diào)節(jié)人THP-1細(xì)胞濃度為2X105個細(xì)胞/ml，接種于置有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板
中，每孔2ml，生長至接近融合，換無血清培養(yǎng)液作用12h，經(jīng)oxLig-l處理后，常規(guī)蘇
木精-伊紅(H-E)染色。光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。結(jié)果如圖7所示，oxLig-l
確實具有這種特性，THP-1細(xì)胞受到作用后形成梭形的貼壁細(xì)胞，即巨噬細(xì)胞。 四、oxLig-l介導(dǎo)的人THP-1細(xì)胞的泡沫化(油紅0染色) (1)將滅菌的蓋玻片放入6孔板中，按照1 X 105/mL接種人THP-1細(xì)胞，37"培
養(yǎng)12h ;(2)分別加入含5iig/mL、 10 ii g/mL、 20iig/mL、 40 ii g/mL和80 ii g/mL oxLig-l
培養(yǎng)基2mL， 37"C培養(yǎng)18h; (3)取出蓋玻片，1XPBS洗3次； (4)4% (V/V)多聚甲醛，4"固定15min后，1XPBS洗3次；
(5)60% (V/V)異丙醇洗片1次； (6)配制油紅0工作液6mL飽和油紅+蒸餾水4mL，混合后靜置10min后過 濾，染色20min;(7)60% (V/V)異丙醇洗去多余染液； WOO] (8)蒸餾水洗，晾干后，中性樹膠封片。 經(jīng)油紅O染色發(fā)現(xiàn)，人THP-1細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚積發(fā)生變化，隨著oxLig-l濃度 的增加，人THP-1細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量增加。說明oxLig-l進(jìn)入人THP-1細(xì)胞后在細(xì)胞中聚 積。其中，10iig/mL和20iig/mLoxLig-l作用后細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚積最為明顯，細(xì)胞質(zhì)中有 明顯的脂滴，如圖8所示。
五、細(xì)胞活力檢測(MTT法) 使用MTT法檢測細(xì)胞的活力。簡而言之，處于指數(shù)生長期的1774久1細(xì)胞接種 于96孔板中，每孔1X104細(xì)胞，并做3次重復(fù)。細(xì)胞經(jīng)12小時無血清培養(yǎng)后，用20yg/ mL的oxLig-l作用6、 12、 24和48小時，同時用不同濃度(O、 5、 25、 50、 75、 100 y g/ ml)的oxLig-l作用J774A.1細(xì)胞24小時，J774A.1細(xì)胞經(jīng)處理后，在每孔中加入20 y L MTT(5mg/mL)， 37。C孵育4小時。反應(yīng)后的產(chǎn)物用二甲基亞砜(DMSO)溶解，在570nm 波長處檢測吸光值。結(jié)果顯示，當(dāng)oxLig-l的濃度大于25 ii g/mL時泡沫細(xì)胞活力呈明顯 減弱，并且呈時間和濃度依賴性，見圖9。
權(quán)利要求
一種動脈粥樣硬化細(xì)胞模型的建立方法，其特征在于，步驟如下一、合成oxLig-1以7-ketocholesterol(5-cholesten-3β-ol-7-one)(7-KC)和壬二酸的脂為原料，以1，3-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)作為合成反應(yīng)的催化劑，二氯甲烷作為溶劑，各物質(zhì)摩爾比為壬二酸∶DCC∶DMAP∶7-KC＝4∶1.5∶1∶1，縮合反應(yīng)合成oxLig-1，即7-酮基膽甾醇-9-羧基壬烷，反應(yīng)式如下反應(yīng)物在室溫下進(jìn)行，攪拌反應(yīng)12h后回流12-24h，最后過濾，粗產(chǎn)物經(jīng)飽和NaCl萃取清洗，收集有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥過夜，隔天蒸干，粗產(chǎn)物隨后經(jīng)硅膠柱層析，純氯仿、氯仿∶甲醇＝100∶1和氯仿∶甲醇＝75∶1三種極性的洗脫液進(jìn)行純化，通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)分析，合成的oxLig-1與β2-GPI結(jié)合活性；二、oxLig-1促進(jìn)PKC和NF-κB信號通路的活化(1)oxLig-1誘導(dǎo)的J774A.1細(xì)胞中IκBα的磷酸化和降解；(2)oxLig-1介導(dǎo)了NF-κB的DNA結(jié)合活性；(3)oxLig-1誘導(dǎo)NF-κB/p65的核轉(zhuǎn)位；(4)oxLig-1通過激活PKC通路活化NF-κB；(5)β2-GPI抑制oxLig-1介導(dǎo)的IκBα的磷酸化；(6)β2-GPI抑制oxLig-1介導(dǎo)的NF-κB/p65的核轉(zhuǎn)位；三、oxLig-1介導(dǎo)的人THP-1向巨噬細(xì)胞趨化oxLig-1確實具有這種特性，THP-1細(xì)胞受到作用后形成梭形的貼壁細(xì)胞，即巨噬細(xì)胞；四、oxLig-1介導(dǎo)的人THP-1細(xì)胞的泡沫化oxLig-1進(jìn)入人THP-1細(xì)胞后在細(xì)胞中聚積，其中，10μg/mL和20μg/mL oxLig-1作用后細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚積最為明顯，細(xì)胞質(zhì)中有明顯的脂滴，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽MTT結(jié)果顯示，當(dāng)oxLig-1的濃度大于25μg/mL時泡沫細(xì)胞引起凋亡，并且呈時間和濃度依賴性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種動脈粥樣硬化細(xì)胞模型的建立方法。該方法包括合成oxLig-1改良方法；以oxLig-1為刺激物用于促進(jìn)PKC和NF-κB信號通路的活化；以oxLig-1能誘導(dǎo)單核細(xì)胞(THP-1)分化成巨噬細(xì)胞；oxLig-1作用J774A.1細(xì)胞12小時后，巨噬細(xì)胞內(nèi)脂肪蓄積，形成泡沫細(xì)胞，最后引起細(xì)胞凋亡。本發(fā)明的有益效果是動脈粥樣硬化細(xì)胞模型的建立可以代替耗費時間的動物模型，將會對動脈粥樣硬化的機(jī)理研究提供一種有效手段。
文檔編號C07J9/00GK101691562SQ200910187818
公開日2010年4月7日 申請日期2009年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日
發(fā)明者劉慶平, 李文哲, 黃振宇 申請人:大連大學(xué)