專利名稱：一種對(duì)蝦病毒感染模型的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗病毒研究領(lǐng)域，特別涉及一種對(duì)蝦病毒感染模型的建立方法。
背景技術(shù)：
對(duì)蝦繁殖力強(qiáng)，生長(zhǎng)迅速，肉味鮮美等特點(diǎn)。而凡納濱對(duì)蝦又具有廣泛的適鹽性和抗病カ較強(qiáng)的特點(diǎn)，因而被世界大面積養(yǎng)殖。我國(guó)養(yǎng)殖對(duì)蝦品種中80%以上是凡納濱對(duì)蝦。對(duì)奸白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)以其對(duì)宿主的泛嗜性、高致病性以及高致死率而位居對(duì)蝦病毒之首。感染對(duì)蝦一般在3 IOd內(nèi)死亡率可高達(dá)100%。由于對(duì)奸與其他無(wú)脊椎動(dòng)物ー樣,特異性免疫機(jī)制的缺乏導(dǎo)致其病毒病防治一直以 非特異性預(yù)防為主，缺少特異性的防治方法。因此，WSSV幾乎毎年均給我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失，塘ロ因暴發(fā)白斑癥而導(dǎo)致對(duì)蝦絕收的現(xiàn)象也常有發(fā)生。鑒于我國(guó)凡納濱對(duì)蝦在我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的重要地位，尋求高效、特異的防治WSSV的方法成為確保我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵。RNA干擾(RNAi)技術(shù)是在真核細(xì)胞中由雙鏈RNA (dsRNA)誘導(dǎo)的特異性RNA降解過(guò)程，在細(xì)胞水平和動(dòng)植物體內(nèi)均表現(xiàn)出高效特異的抗病毒能力。近幾年的相關(guān)研究證明，RNAi在水生無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)也能激發(fā)高效的抗病毒效應(yīng)。由于WSSV基因組序列已經(jīng)明確，因此，運(yùn)用RNA干擾技術(shù)抗WSSV、研究抗病毒專用制劑是完全可能的。但是，我們?cè)诩棺祫?dòng)物中的RNA干擾抗病毒研究方法并不適用于對(duì)蝦這樣的水生無(wú)脊椎動(dòng)物。因?yàn)閷?duì)蝦沒(méi)有穩(wěn)定的傳代細(xì)胞系，相關(guān)RNA干擾研究只能直接在對(duì)蝦體內(nèi)水平進(jìn)行；而不同批次的對(duì)蝦由于個(gè)體差異很大，它們對(duì)病毒的易感性必定不同。在這樣的條件下進(jìn)行RNA干擾抗病毒試驗(yàn)勢(shì)必會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性和可信度。因此，建立ー個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的RNA干擾研究體系對(duì)于在對(duì)蝦體內(nèi)水平進(jìn)行RNA干擾研究是必不可少的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種對(duì)蝦病毒感染模型的建立方法，該方法建立的對(duì)蝦病毒感染模型重現(xiàn)性好，RNA干擾研究結(jié)果可信度高。本發(fā)明的一種對(duì)蝦病毒感染模型的建立方法，包括(I)將人工接種WSSV后發(fā)病死亡的凡納濱對(duì)蝦去除附肢、頭胸甲和肝胰腺并稱重，與0. OlM PBS按質(zhì)量體積比I : 10稀釋，玻璃勻漿器勻漿，勻漿液于4°C離心20min，上清液依次用濾紙和0. 45 ii m濾膜過(guò)濾除菌井分裝成病毒保存液，_80°C凍存?zhèn)溆茫?2)體重7 9g、PCR檢測(cè)陰性的健康凡納濱對(duì)蝦在室內(nèi)池塘?xí)吼B(yǎng)I周后，隨機(jī)分組，每組14只，分別暫養(yǎng)于玻纖桶中；每次RNA干擾實(shí)驗(yàn)前將病毒保存液稀釋成10_(n_2)、10_(n_D、10_n、10_(n+1)、10_(n+2)共5個(gè)濃度的感染液，用胰島素注射器分別于凡納濱對(duì)蝦第四腹節(jié)處肌肉注射，每尾50 u L，對(duì)照組同法注射0. OlM PBS ;對(duì)蝦養(yǎng)殖水溫控制在27 28°C，每天換水l/2，24h持續(xù)充氣；每天觀察四次，撿出死亡和瀕死對(duì)蝦，記錄死亡數(shù)，持續(xù)觀察8d ；
(3)根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)時(shí)，病毒感染液濃度為病毒保存液作10_n倍稀釋，既而確定對(duì)蝦的病毒感染量，建立病毒感染模型。所述步驟(2)中n的值為新收集病毒保存液預(yù)感染對(duì)蝦后，7天內(nèi)致90%以上對(duì)蝦死亡的最大稀釋度。所述步驟(2)中每批對(duì)蝦建立模型用病毒均來(lái)自(I)中同批收集井分裝的病毒保存液。所述步驟(2)中的觀察天數(shù)為8天。所述步驟(3)中的判定標(biāo)準(zhǔn)為7d內(nèi)感染對(duì)蝦的累積死亡率大于90%的組的最大病毒保存液的稀釋度作為RNA干擾用病毒感染濃度。有益效果 通過(guò)本發(fā)明的方法建立的對(duì)蝦病毒感染模型重現(xiàn)性好，RNA干擾研究結(jié)果可信度高；操作簡(jiǎn)便，判斷標(biāo)準(zhǔn)明晰，不僅適用于RNA干擾的抗病毒研究，也可用于將來(lái)RNA干擾制劑在水產(chǎn)實(shí)踐中的推廣應(yīng)用。


圖I為凡納濱對(duì)蝦WSSV感染模型的建立；圖中顯示的是凡納濱對(duì)蝦感染不同稀釋度的WSSV保存液后在7天內(nèi)的累積死亡率；圖中E-I到E-5分別代表不同組的WSSV保存液的稀釋度=KT1到10_5 ；圖2是不同shRNA處理組(包括陽(yáng)性和陰性對(duì)照組)凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)WSSV的PCR檢測(cè)結(jié)果；其中，Al和A2為第一次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；A1為各組對(duì)蝦樣品的WSSV平均感染量；A2為同組對(duì)蝦體內(nèi)18S核糖體DNA平均表達(dá)量；B1和B2為第二次重復(fù)實(shí)驗(yàn)(另ー批對(duì)蝦病毒感染模型)的結(jié)果。圖中2 6列分別代表不同的RNA干擾處理組的結(jié)果；1和7分別代表陽(yáng)性和陰性對(duì)照的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。實(shí)施例IWSSV病毒分離和病毒保存液的制備將人工接種WSSV后發(fā)病死亡的凡納濱對(duì)蝦去除附肢、頭胸甲和肝胰腺并稱重，與0.01M PBS (pH 7.4)1 10(g/mL)稀釋，玻璃勻漿器勻漿，勻漿液于4°C 4000rpm離心20min,上清液依次用濾紙和0. 45 ii m濾膜過(guò)濾除菌井分裝成病毒保存液，_80°C凍存?zhèn)溆?。不同濃度WSSV保存液感染凡納濱對(duì)蝦體重7 9g、PCR檢測(cè)陰性的新購(gòu)健康凡納濱對(duì)蝦在室內(nèi)池塘?xí)吼B(yǎng)I周后，隨機(jī)分組，每組14只，分別暫養(yǎng)于90L的白色玻纖桶中。將病毒保存液稀釋成10'10_2、10_3、10_4、10_5共5個(gè)濃度的感染液(通過(guò)新分離病毒保存液預(yù)感染對(duì)蝦后獲知稀釋度范圍)，用胰島素注射器分別于凡納濱對(duì)蝦第四腹節(jié)處肌肉注射，每尾50 y L，對(duì)照組同法注射0. OlMPBS (pH7. 4)。對(duì)蝦養(yǎng)殖水溫控制在27 28 °C，每天換水1/2，24h持續(xù)充氣。每天觀察四次，及時(shí)撿出死亡和瀕死對(duì)蝦，記錄死亡數(shù)，持續(xù)觀察8d。對(duì)蝦累積死亡率觀察法確定該次RNA干擾研究的對(duì)蝦病毒感染量如圖I所示，隨著WSSV感染濃度的降低，凡納濱對(duì)蝦死亡高峰的出現(xiàn)時(shí)間相對(duì)延后，且觀察時(shí)間內(nèi)對(duì)蝦累積死亡數(shù)相對(duì)減少；當(dāng)WSSV保存液的稀釋度在KT1 10_3倍吋，7d內(nèi)對(duì)蝦幾乎全部死亡(大于90%)，而稀釋度為10_4倍時(shí)死亡數(shù)明顯減少(小于90 %)。根據(jù)本發(fā)明的判定標(biāo)準(zhǔn)7d內(nèi)感染對(duì)蝦的累積死亡率大于90%的組的最大病毒保存液稀釋度作為RNA干擾用病毒感染濃度。因此，該批對(duì)蝦進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)時(shí)，適用的病毒感染液濃度為病毒保存液作10_3倍稀釋(n = 3)。由于每只對(duì)蝦的病毒感染體積是固定的(50 u L/只)，因而對(duì)蝦的病毒感染量也隨之確定，病毒感染模型成功建立。利用以上方法建立WSSV感染模型進(jìn)行RNA干擾抗WSSV的研究，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。如圖2所示，兩次實(shí)驗(yàn)(對(duì)應(yīng)圖中A、B)后半定量PCR對(duì)對(duì)蝦體內(nèi)病毒感染量的檢測(cè)結(jié)果基本 一致。而且，實(shí)驗(yàn)還表明，WSSV的感染量結(jié)果與對(duì)蝦死亡率實(shí)驗(yàn)結(jié)果也基本一致。
權(quán)利要求
1.一種對(duì)蝦病毒感染模型的建立方法，包括 (1)將人工接種WSSV后發(fā)病死亡的凡納濱對(duì)蝦去除附肢、頭胸甲和肝胰腺并稱重，與O.OlM PBS按質(zhì)量體積比I : 10稀釋，玻璃勻漿器勻漿，勻漿液于4°C離心20min，上清液依次用濾紙和O. 45 μ m濾膜過(guò)濾除菌井分裝成病毒保存液，-80°C凍存?zhèn)溆茫? (2)體重7 9g、PCR檢測(cè)陰性的健康凡納濱對(duì)蝦在室內(nèi)池塘?xí)吼B(yǎng)I周后，隨機(jī)分組，每組14只，分別暫養(yǎng)于玻纖桶中；每次RNA干擾實(shí)驗(yàn)前將病毒保存液稀釋成loi'ioin、10_n、10_(n+1)、10_(n+2)共5個(gè)濃度的感染液，用胰島素注射器分別于凡納濱對(duì)蝦第四腹節(jié)處肌肉注射，每尾50 μ L，對(duì)照組同法注射O. OlM PBS ;對(duì)蝦養(yǎng)殖水溫控制在27 28°C，每天換水1/2，24h持續(xù)充氣；每天觀察四次，撿出死亡和瀕死對(duì)蝦，記錄死亡數(shù)，持續(xù)觀察8d ； (3)根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)時(shí)，病毒感染液濃度為病毒保存液作10_n倍稀釋，既而確定對(duì)蝦的病毒感染量，建立病毒感染模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種對(duì)蝦病毒感染模型的建立方法，其特征在于所述步驟(2)中η的值為新收集病毒保存液預(yù)感染對(duì)蝦后，7天內(nèi)致90%以上對(duì)蝦死亡的最大稀釋度。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種對(duì)蝦病毒感染模型的建立方法，其特征在于所述步驟(2)中每批對(duì)蝦建立模型用病毒均來(lái)自(I)中同批收集并分裝的病毒保存液。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種對(duì)蝦病毒感染模型的建立方法，其特征在于所述步驟(2)中的觀察天數(shù)為8天。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種對(duì)蝦病毒感染模型的建立方法，其特征在于所述步驟(3)中的判定標(biāo)準(zhǔn)為7d內(nèi)感染對(duì)蝦的累積死亡率大于90%的組的最大病毒保存液的稀釋度作為RNA干擾用病毒感染濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對(duì)蝦病毒感染模型的建立方法，包括(1)WSSV病毒分離和保存液的制備；(2)不同濃度WSSV保存液感染凡納濱對(duì)蝦；(3)對(duì)蝦累積死亡率觀察法確定該次RNA干擾研究的對(duì)蝦病毒感染量。通過(guò)本發(fā)明的方法建立的對(duì)蝦病毒感染模型重現(xiàn)性好，RNA干擾研究結(jié)果可信度高；操作簡(jiǎn)便，判斷標(biāo)準(zhǔn)明晰，不僅適用于RNA干擾的抗病毒研究，也可用于將來(lái)RNA干擾制劑在水產(chǎn)實(shí)踐中的推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01K61/00GK102613112SQ20121006279
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月12日
發(fā)明者萬(wàn)夕和, 周俊芳, 房文紅 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所