專利名稱：：Taci-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總的來說涉及包含腫瘤壞死因子受體部分和免疫球蛋白部分的改良的融合蛋白質(zhì)。具體地說，本發(fā)明涉及改良TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞因子是介導(dǎo)包括調(diào)節(jié)很多細(xì)胞類型的生長和各種生物效應(yīng)的可溶的小蛋白質(zhì)，(參見例如Arai等人，」廁.齢.S/oc她59:783(1990);Mosmann，Cz/r二3:311(1991);Paul和Seder,76:241(1994))。構(gòu)成細(xì)胞因子組的蛋白質(zhì)包括白細(xì)胞介素、干擾素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子、以及其他調(diào)節(jié)分子。例如人的白細(xì)胞介素-17是刺激白細(xì)胞介素-6、胞內(nèi)粘附分子l、白細(xì)胞介素-8、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的表達(dá)和前列腺素E2表達(dá)的細(xì)胞因子，并且在CD34+造血前體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成嗜中性粒細(xì)胞的優(yōu)先成熟中起作用(Yao等人，/.J邁/zw70人155:5483(1995);Fossiez等人，/.^r;.#etf.183:2593(1996))。結(jié)合細(xì)胞因子的受體一般由一種或多種整合膜蛋白質(zhì)組成，該整合膜蛋白質(zhì)以高親和性與細(xì)胞因子結(jié)合并且將該結(jié)合事件通過特定的受體亞基的胞質(zhì)部分轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞。根據(jù)其細(xì)胞外的配體結(jié)合區(qū)的相似性，細(xì)胞因子的受體被分為若千類。例如根據(jù)其特征性的200個殘基的胞外區(qū)，負(fù)責(zé)結(jié)合和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)千擾素效應(yīng)的受體鏈?zhǔn)莕型細(xì)胞因子受體家族的成員。在免疫應(yīng)答的時候發(fā)生的細(xì)胞相互作用由若千細(xì)胞表面受體家族的成員(包括腫瘤壞死因子受體(FNFR)家族)調(diào)節(jié)。TNFR家族由一些整合膜糖蛋白受體構(gòu)成，在與它們各自配體的連接中，許多受體調(diào)節(jié)不同造血細(xì)胞^瞽系之間的相互作用(參見例如Cosman，We邁Ce/"12:440(1994);Wajant等人，0^oh'/eFa"or脅.10:15(1999);Yeh等人.，Immunol.Rev.169:283(1999);Idriss和Naismith，￥!'crosc.Wes,fec力.50:184(2000))。一種這樣的受體是TACI,跨膜激活劑和CAML-相互作用劑(vonBillow和Bram,to'e"ce228:138(1997);Bram和權(quán)Btilow，美國專利5，969，102(1999))。TACI是一種膜結(jié)合受體，它具有包含二個富含半胱氨酸的假性重復(fù)片斷(cysteine-richpseudo-repeats)的胞外區(qū)、一個跨膜區(qū)和與CAML(鈣調(diào)節(jié)劑和親環(huán)蛋白配體)相互作用的胞質(zhì)區(qū)、CAML是位于胞內(nèi)嚢泡的整合膜蛋白質(zhì)，當(dāng)其在Jurkat細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)時，是一種NF-AT激活的協(xié)同誘導(dǎo)物。TACI與B細(xì)胞和T細(xì)胞的一種亞型相關(guān)。在此提供編碼TACI的核苷酸序列和其相應(yīng)的氨基酸序列，分別為SEQIDNO:1和2。TACI受體與肺瘤壞死因子(TNF)配體家族的兩個成員相結(jié)合。一個配體被不同地稱為ZTNF4、"BAFF"、"neutrokine-a"、"BLyS"、"TALL-1"、以及"THANK"(Yu等人，國際公開文本W(wǎng)098/18921(1998)，Moore等人，Science285:269(1999);Mukhopadhyay等人J.Biol.Chem.274:15978(1999);Schneider等人,189:1747(1999);Shu等人，萬j'o丄65:680(1999))。提供ZTNF4氨基酸序列為SEQIDNO:3'另一個配體被不同地稱為"ZTNF2"、APRIL"和"TNRF死亡配體-1"(Hahne等人，/#eJ.188:1185(1998);Kelly等人，Ca"cerWes.60:1021(2000)).提供ZTNF2的氨基酸序列為SEQIDNO:4'兩個配體都亦與B細(xì)胞成熟受體(BCMA)結(jié)合(Gross等人，Wa^/re404:995(2000)).提供BCMA的核苷酸序列和氨基酸序列分別為SEQIDNO:26和SEQIDNO:27經(jīng)證實(shí)的胂瘤壞死因子受體的體內(nèi)活性表明了該受體的可溶形式的臨床潛力。TACI受體的可溶形式已經(jīng)被以免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的形式被制造出來。最初的版本導(dǎo)致低水平表達(dá)的異質(zhì)蛋白質(zhì)。在TACI氨基末端、在Fc羧基末端以及TACI柄部可觀察到異質(zhì)性。因此對藥用的TACI受體組合物存在著需要。發(fā)明概述本發(fā)明提供了改良的TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)，它適合作為治療用的化合物。附圖簡述圖1顯示了人TACI的氨基酸序列。富含半胱氨酸的假性重復(fù)段的位置用陰影指出，跨膜結(jié)構(gòu)域被框住，同時柄的區(qū)域用虛線指出。圖2是免疫球蛋白的IgGl亞群的示意圖。CL:輕鏈恒定區(qū)；CH1、CH2、CH3:重鏈恒定區(qū)；VL:輕鏈可變區(qū)；VH:重鏈可變區(qū)；CHO:碳水化合物；N:氨基末端；C:羧基末端。圖3A、3B、3C和3D為野生型人y1恒定區(qū)Fc的氨基酸序列與變體Fc-488、Fc4、Fc5、Fc6、Fc7和Fc8的比較。人的y1恒定區(qū)的Cm結(jié)構(gòu)域不是FC的一部分，因此沒有顯示。指出了鉸鏈區(qū)、Ch2和Ch3結(jié)構(gòu)域的位置。指出了一般與輕鏈恒定區(qū)(LC)和重鏈恒定區(qū)(HC)結(jié)合的二硫鍵有關(guān)的Cys殘基。符號"."表示在該位置與野生型相同，而***"表示羧基末端的位置，并且i兌明了Fc6與其它Fc版本相比在羧基末端的差異.用EU索引位置指出氨基酸的位置。圖4顯示^I-ZTNF4與多種TACI-Fc構(gòu)建體的特異性結(jié)合.TACI-Fc融合蛋白質(zhì)具有缺少SEQIDNO:2氨基酸序列的前29個氨基酸殘基的TACI部分。融合蛋白質(zhì)之一具有帶完整柄結(jié)構(gòu)區(qū)的TACI部分，而TACI-Fc融合蛋白質(zhì)之中的三個具有在柄結(jié)構(gòu)區(qū)有多種缺失(TACI(dl-29，dl07-154)-Fc5;TACI(dl-29,dll1-154)-Fc5:TACI(dl-29，d120-154)-Fc5)的TACI部分。實(shí)施例4敘述了實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)情況。發(fā)明詳述1.總述如下所述，本發(fā)明提供了跨膜激活劑、鈣調(diào)節(jié)劑和親環(huán)蛋白配體相互作用劑(TACI)-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)，以及應(yīng)用TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的方法。例如，本發(fā)明提供了抑制腫瘤細(xì)胞增殖的方法，包含給予腫瘤細(xì)胞含有TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的組合物。上迷組合物可以給予體外培養(yǎng)的細(xì)胞。或者，該組合物可以是一種藥物組合物，它包含藥學(xué)可接受的載體和TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)，該藥物組合物可以給予患腫瘤受治療者.受治療者可以是哺乳動物的受治療者。該藥物組合物的施用可以抑制，例如，哺乳動物受治療者的B淋巴細(xì)胞的增殖.本發(fā)明還提供了在哺乳動物中抑制ZTNF4活性的方法，它包含給哺乳動物施用含有TACI-免疫球蛋白的組合物。ZTNF4活性可與多種不同的疾病和病癥相關(guān)聯(lián)。例如，含有TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的藥物組合物可用于治療自身免疫病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力、多發(fā)性硬化、胰島素依賴性糖尿病、克羅恩氏病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多關(guān)節(jié)型(polyarticular-course)青少年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎以及銀屑病性關(guān)節(jié)炎.或者，含有TACI-免疫球蛋白的藥物組合物可用于治療病癥，例如哮喘、支氣管炎、肺氣腫以及終末階段的腎衰。含有TACI-免疫球蛋白的藥物組合物亦可用于治療腎臟疾病，例如腎小球腎炎、脈管炎、腎炎、淀粉樣變以及腎盂腎炎，或者用于病癥，例如肺瘤、慢性白細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、移植后淋巴組織增生病以及輕鏈丙球蛋白病。在某種情況下，ZTNF4活性可以與T細(xì)胞相關(guān)聯(lián)。含有TACI-免疫球蛋白的藥物組合物亦可用于治療與免疫抑制、移植排斥、移植物對抗宿主的疾病以及炎癥相關(guān)的疾病或病癥.例如含有TACI-免疫球蛋白的藥物組合物可用于減輕炎癥和治療病癥，例如關(guān)節(jié)痛、腫脹、貧血及敗血癥性休克。本發(fā)明還提供了在哺乳動物受治療者中降低循環(huán)血液的ZTNF4水平的方法，它包括將含有藥學(xué)可接受的栽體和TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的藥物組合物給予哺乳動物受治療者，其中藥物組合物的給藥降低哺乳動物受治療者循環(huán)血液中ZTNF4的水平。作為說明，與藥物組合物用藥前血液的ZTNF4水平相比，上述藥物組合物的給藥能夠降低循環(huán)血液的ZTNF4水平至少10%、至少20%、至少10到60%、至少20到50%、或至少30到40%.本領(lǐng)域中的技術(shù)人員可以測定循環(huán)中9的ZTNF4水平。在實(shí)施例4和實(shí)施例5中敘述了說明性的方法。如下所述，說明性的TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)包含(a)TACI受體部分，它由具有SEQIDN0:2的氨基酸殘基30到154的氨基酸序列的多肽片段組成，其中TACI受體部分包含至少(i)SEQIDN0:2的氨基酸殘基34到66和(ii)SEQIDN0:2的氨基酸殘基71到104的序列之一，同時其中TACI受體部分至少與ZTNF2或ZTNF4之一結(jié)合，以及(b)包含免疫球蛋白恒定區(qū)的免疫球蛋白部分。適合的TACI受體部分包括含有SEQIDN0:2氨基酸殘基34到66和SEQIDNO:2氨基酸殘基71到104的多肽；含有SEQIDNO:2氨基酸殘基34到104的多肽；含有SEQIDN0:2氨基酸殘基30到110的氨基酸序列的多肽；以及具有由SEQIDNO:2氨基酸殘基30到110組成的氨基酸序列的多肽。TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的免疫球蛋白部分可以包含重鏈恒定區(qū)，如人的重鏈恒定區(qū)。IgGl重鏈恒定區(qū)是適合的重鏈恒定區(qū)的例子之一。說明性的IgGl重鏈恒定區(qū)是含有Ch2和Cm區(qū)的IgGlFc片段。IgGlFc片段可以是野生型IgGlFc片段或經(jīng)突變的IgGlFc片段，例如含有SEQIDN0:33氨基酸序列的Fc片段。一種典型的TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)是具有包含氨基酸序列SEQIDNO:54的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。本文所述的TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)可以是聚合物，如二聚體。本發(fā)明還提供了編碼TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的核酸分子。用SEQIDN0:53提供了說明性的編碼TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的核苷酸序列。本發(fā)明還包括由具有SEQIDN0:2氨基酸殘基30到154的氨基酸序列的多肽片段組成的TACI可溶性受體，其中TACI可溶性受體包含至少(i)SEQIDNO:2氨基酸殘基34到66和(ii)SEQIDN0:2氨基酸殘基71到104的序列之一，同時其中TACI可溶性受體至少與ZTNF2或ZTNF4之一結(jié)合。本文所述的附加TACI可溶受體是對于TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)適合的TACI受體部分。此外，TACI可溶性受體可用于所述的對于TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)方法中。參閱下面的詳細(xì)敘迷和附圖將會對本發(fā)明的這些方面和其它方面了解更清楚。此外還有，下面確定了各種參考資料。2.定義在接著進(jìn)行的敘述中，大量使用了許多術(shù)語。提供下面定義以便于理解本發(fā)明。本文所用的紫酸"或,酸分子"是指多核苷酸，例如脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA))、寡核苷酸、用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)生的片段、以及用任何連接反應(yīng)、剪切反應(yīng)、核酸內(nèi)切酶作用和核酸外切酶作用產(chǎn)生的片段。核酸分子可以由天然存在的核苷酸(如DNA和RNA)、或者天然存在核苷酸的類似物(如天然存在核苷酸的ot-對映體形式)、或者前二者的結(jié)合物的單體組成。修飾的核普酸在糖的部分和/或嘧咬或噤呤堿基部分可以有變更。糖的修飾包括，例如用卣素、烷基、氨基和疊氮基替換一個或更多羥基，或者糖類可作為酸類或酯類被官能化。此外，整個糖的部分可以用立體的和電子的相似結(jié)構(gòu)(如重氮糖和碳環(huán)糖的類似物)替換。在堿基部分中修飾的實(shí)例包括烷基化的噤呤和嘧啶、?；泥堰驶蜞奏?、或者其它熟知的雜環(huán)取代物。核酸的單體可以由磷酸二酯鍵或該鍵的類似鍵連接。磷酸二酯連接的類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸醋、二硒代磷酸酯、磷酸苯胺硫代酯、磷酸苯胺酯、磷酸酰胺酯等等。術(shù)語凝酸分子"亦包括所謂的"肽核酸"，它含有附著在聚酰胺主鏈上的天然存在的或經(jīng)修飾的核酸堿基。核酸可以是單鏈也可以是雙鏈。術(shù)語紫酸分子的互補(bǔ)體"是指與所提到的核苷酸序列相比，有互補(bǔ)的核苷酸序列和相反方向的核酸分子。例如序列5'ATGCACGGG3，(SEQIDN0:57)與5'CCCGTGCAT3，(SEQIDN0:58)是互補(bǔ)的，術(shù)語"重疊群"表示核酸分子具有與另一核酸分子相同的或互補(bǔ)的一段鄰接的序列。鄰接序列被認(rèn)為是核酸分子以其全部或以部分，疊"某給定的核酸分子的某一段。術(shù)語"簡并核苦酸序列"表示與編碼多肽的參照核酸分子相比，包含一個或多個簡并密碼子的核苷酸序列。簡并密碼子含有不同的核普酸三聯(lián)體，但編碼相同的氨基酸殘基(例如GAU和GAC三聯(lián)體各自編碼Asp).術(shù)語勞構(gòu)基因"是指一種核酸分子，它被轉(zhuǎn)錄到信使RNA(mRNA)中，然后mRNA被翻譯為氨基酸的序列，后者是特異的多肽的特征。"分離的核酸分子"是沒有整合到生物的基因組DNA中的核酸分子。例如已經(jīng)從細(xì)胞基因組DNA中分離出的編碼生長因子的DNA分子是分離的DNA分子。分離的核酸分子的另一個例子是不整合到生物基因組中的化學(xué)合成的核酸分子。已經(jīng)從特定物種分離出的核酸分子比該物種染色體的完整DNA分子小。"核酸分子構(gòu)建體"是一種單鏈或者雙鏈的核酸分子，它已經(jīng)通過人的干預(yù)修飾過，它含有以自然界不存在的排列方式結(jié)合和排列的核酸片段。"線狀DNA"表示含有游離的5，和3，端的非環(huán)狀DNA分子。線狀DNA可以用酶切或物理斷裂的方法，從如質(zhì)粒之類的閉環(huán)DNA分子來制備。"互補(bǔ)DNA(cDNA)"是用逆錄酶從mRNA模板產(chǎn)生的單鏈DNA分子。一般，使用與部分mRNA互補(bǔ)的引物以開始逆轉(zhuǎn)錄.本領(lǐng)域技術(shù)人員也使用術(shù)語"cDNA"來指由上述單鏈DNA分子和其互補(bǔ)DNA鏈組成的雙鏈DNA分子。術(shù)語^DNA"也指從RNA模板合成的cDNA分子的克隆。"啟動子"是控制結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。一般，啟動子位于結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的5'非編碼區(qū)。在轉(zhuǎn)錄起動中起作用的啟動子內(nèi)的序列元件經(jīng)常以共有核苷酸序列為特征。這些啟動子元件包括RNA聚合酶結(jié)合部位、TATA序列、CAAT序列、分化特異性元件(DSEs;McGehee等人，ifo丄^d/ocrj'/o丄7:551(1993))、環(huán)狀A(yù)MP效應(yīng)元件(CREs)、血清效應(yīng)元件(SREs;Treisman，5"e辺j'72arsj'/jCa/2cer萬j'o丄1:47(1990))、糖皮質(zhì)激素效應(yīng)元件(GREs)、以及其它轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位，如CRE/ATF(O'Reilly等人，/萬/o丄C力e瓜267:19938(1992))、AP2(Ye等人，/C力e邁.269:25728(1994))、SP1、cAMP效應(yīng)元件結(jié)合蛋白質(zhì)(CREB;Loeken，Ge/e^77".3:253(1993))和八聚體因子(通常參閱Watson等人編著，J/o7ecf/7ar^'o7o^yo盧《力e《e/e,第四版(TheBenjamin/CummingsPublishingCompany,Inc.1987)，和Lemaigre與Rousseau,^j'oc力e瓜/.303:1(1994))。如果啟動子是可誘導(dǎo)的啟動子，那么轉(zhuǎn)錄速率響應(yīng)于誘導(dǎo)劑而提高。如果啟動子是組成型啟動子，用誘導(dǎo)劑不能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄速率.阻抑型啟動子亦被熟知。"核心啟動子"含有啟動子功能的基本核苷酸序列，包括TATA框和轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)。根據(jù)本定義，在沒有可提高活性或賦予組織特異性活性的特異性序列的情況下，核心啟動子可以具有或不具有可檢測出的活性."調(diào)節(jié)元件"是調(diào)節(jié)核心啟動子活性的核苷酸序列。例如調(diào)節(jié)元件可以含有與細(xì)胞因子結(jié)合的核苷酸序列，該細(xì)胞因子使轉(zhuǎn)錄能夠排他或擇優(yōu)地在特殊的細(xì)胞、組織或細(xì)胞器中進(jìn)行.該調(diào)節(jié)元件的類型一般與以"細(xì)胞特異性"、"組織特異性"或"細(xì)胞器特異性"的方式表達(dá)的基因相關(guān)聯(lián)。"增強(qiáng)子"是調(diào)節(jié)元件的一種類型，它可以提高轉(zhuǎn)錄效率，而與增強(qiáng)子相對轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離或方向無關(guān)."異源DNA"是指一種DNA分子或DNA分子的種群，它在給定的宿主細(xì)胞內(nèi)不天然存在。對于特定的宿主細(xì)胞異源的DNA分子，只要是宿主DNA與非宿主DNA(即外源DNA)聯(lián)合，就可以含有由的宿主細(xì)胞物種(即內(nèi)源DNA)衍生的DNA。例如含有編碼多肽的非宿主DNA片段、與包含轉(zhuǎn)錄啟動子的宿主DNA片段可搡作地連接的DNA分子被認(rèn)為是異源DNA分子。相反，異源DNA分子可以包含與外源啟動子可操作連接的內(nèi)源基因。作為另一個實(shí)例，如果將該DNA分子引入到缺少野生型基因的突變細(xì)胞中，包含從野生型細(xì)胞中得到的基因的DNA分子被認(rèn)為是異源DNA。"多肽"是由天然產(chǎn)生或合成的肽鍵連接的氨基酸殘基的聚合物。少于大約IO個氨基酸殘基的多肽通常被稱為"肽"。"蛋白質(zhì)"是包括一個或多個多肽鏈的大分子。蛋白質(zhì)也可以包含非肽的成分，如碳水化合物基團(tuán).可以在生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞中將碳水化合物和其它非肽取代基團(tuán)加入到蛋白質(zhì)中，并且該基團(tuán)將因細(xì)胞的類型不同而不同。本文給蛋白質(zhì)下定義是依據(jù)它們的氨基酸主鏈結(jié)構(gòu)；對象碳水化合物基團(tuán)之類的取代基一般不作規(guī)定，但其仍然可以存在。用非宿主DNA分子編碼的肽或多肽是"異源"肽或多肽。"整合的遺傳因子"是通過人工的操作將該因子引入到細(xì)胞之后已經(jīng)摻入到宿主細(xì)胞的染色體中的DNA片段。在本發(fā)明中，整合遺傳因子通常大多數(shù)是從用電穿孔或其它技術(shù)而引入到細(xì)胞中的線性質(zhì)粒得到的。整合遺傳因子被從原始宿主細(xì)胞傳遞到其后代。"克隆載體"是一種在宿主細(xì)胞中具有自我復(fù)制能力的核酸分子，例如質(zhì)粒、粘粒或噬菌體?？寺≡泽w一般含有一個或少量允許在不喪失載體基本生物功能的情況下可以以特定方式插入核酸分子的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，以及編碼適合供克隆載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞的鑒定和選擇之用的標(biāo)記基因的核苷酸序列。標(biāo)記基因一般包括提供四環(huán)素抗性或氨芐青霉素抗性的基因。"表達(dá)載體"是一種編碼在宿主細(xì)胞中表達(dá)的基因的核酸分子.一般，表達(dá)載體包含轉(zhuǎn)錄啟動子、基因和轉(zhuǎn)錄終止子?；虮磉_(dá)通常在啟動子的控制下發(fā)生，而該基因被稱為"T操作地連接到"啟動子上.相似地，如果調(diào)節(jié)元件調(diào)節(jié)核心啟動子的活性，調(diào)節(jié)元件和核心啟動子是可操作地連接的。1組宿主"是一種含有異源核酸分子，如克隆栽體或表達(dá)載體，的細(xì)胞。在本文中，重組宿主的例子是從表達(dá)載體生產(chǎn)TACI-Fc融合蛋白質(zhì)的細(xì)胞。14"整合的轉(zhuǎn)化體"是重組宿主細(xì)胞，在其中異源DNA被整合進(jìn)入到細(xì)胞的基因組DNA中."融合蛋白質(zhì)"是由包含至少兩個基因的核苦酸序列的核酸分子表達(dá)的雜合蛋白質(zhì)。例如TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)包含TACI受體部分和免疫球蛋白部分。如本文所使用的，"TACI受體部分"是結(jié)合至少ZTNF2或ZTNF4中的一個的TACI受體的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分。短語免疫球蛋白部分"是指包含免疫球蛋白恒定區(qū)的多肽.例如免疾球蛋白部分可以包含重鏈恒定區(qū)。術(shù)語"TACI-Fc"融合蛋白質(zhì)是指免疫球蛋白部分包含重鏈恒定區(qū)CH2和CH3的TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)。術(shù)語"受體"表示一種與被稱為"配體"的生物活性分子結(jié)合的與細(xì)胞相關(guān)的蛋白質(zhì)。這種相互作用介導(dǎo)配體對細(xì)胞的效應(yīng)。在TACI受體結(jié)合的背景下，詞組，爭異性結(jié)合"是指配體與受體竟?fàn)幮越Y(jié)合的能力。例如ZTNF4與TACI受體特異性結(jié)合，這可以通過觀測可檢測的標(biāo)記過的ZTNF4和未標(biāo)記的ZTNF4之間對TACI受體的竟?fàn)巵碜C明。受體可以是膜結(jié)合的、胞質(zhì)的、細(xì)胞核的；單體的(例如甲狀腺素激活的受體、P-腎上腺素受體)或聚合物的(例如PDGF受體、生長激素受體、IL-3受體、GM-CSF受體、G-CSF受體、紅細(xì)胞生成素受體和IL-6受體).膜結(jié)合受體的特征在于它包含胞外的配體結(jié)合域和一般與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的胞內(nèi)效應(yīng)器域的多個結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)。在某些膜結(jié)合受體中，胞外的配體結(jié)合域和胞內(nèi)效應(yīng)器域位于分離的肽鏈上，它們構(gòu)成了具有完整功能的受體.通常，配體與受體結(jié)合導(dǎo)致受體中的構(gòu)象變化，該變化導(dǎo)致細(xì)胞中效應(yīng)器域和其它分子之間的相互作用，它依次地引起細(xì)胞新陳代謝中的變化。與受體-配體相互作用經(jīng)常相關(guān)的代謝事件包括基因轉(zhuǎn)錄、磷酸化作用、去磷酸化作用、環(huán)化AMP產(chǎn)生的增加、細(xì)胞鈣質(zhì)的轉(zhuǎn)移、細(xì)胞膜脂質(zhì)的動員、細(xì)胞祐著、肌醇脂質(zhì)的水解和磷脂的水解。術(shù)語"分泌信號序列"表示編碼在合成較大的多肽的細(xì)胞中作為較大多肽的組分引導(dǎo)該多肽通過其分泌途徑的肽(分泌肽)的DNA序列。在通過分泌途徑轉(zhuǎn)運(yùn)時，較大的多肽通常被切割以除去分泌肽。"分離的多肽"是基本上不含有污染的細(xì)胞組分，如在自然界中與多肽相連的碳水化合物、脂質(zhì)或其它蛋白質(zhì)雜質(zhì)的多肽。一般，分離的多肽制劑含有高純度的多肽，即純度至少約80%、純度至少約90%、純度至少約95%、純度高于95%、或純度高于99%。顯示特定的蛋白質(zhì)制劑含有分離的多肽的一種方法是在蛋白質(zhì)制劑的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳和凝膠的考馬斯亮藍(lán)染色之后顯出單個條帶。但是，術(shù)語"分離的"不排斥相同的多肽以其他的物理形式存在，例如二聚體或者糖基化的或衍生的形式。本文所使用的術(shù)語豫基端"和"羧基端"是用來表示在多肽內(nèi)的位置。在上下文允許的地方，使用這些術(shù)語來提及多肽的特定的序列或一部分以表示其鄰近或相對的位置。例如某一序列在多肽內(nèi)的參照序列的羧基端是指位于參照序列的羧基末端的近端，但是不一定在整個多肽的羧基末端。術(shù)語"表達(dá)"是指基因產(chǎn)物的生物合成。例如，就結(jié)構(gòu)基因而論，表達(dá)包括將結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄到mRNA中和將mRNA翻譯為一個或多個多肽。本文所使用的術(shù)語噼接變體"表示從基因轉(zhuǎn)錄而來的RNA的可變形式。拼接變體通過在轉(zhuǎn)錄的RNA分子內(nèi)，或在比較少見的情況下，在分別轉(zhuǎn)錄的RNA分子之間，使用可變拼接位點(diǎn)而自然產(chǎn)生，并且可以導(dǎo)致從相同基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生若干mRNA的結(jié)果。拼接變體可以編碼具有不同的氨基酸序列的多肽.本文中亦使用術(shù)語拼接變體來表示由從基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的拼接變體編碼的多肽.本文所使用的，術(shù)語免疫調(diào)節(jié)劑"包括細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長因子、淋巴毒素、共刺激分子、造血因子以及這些分子的合成的類似物。術(shù)語3卜體/抗補(bǔ)體對"表示在適當(dāng)?shù)臈l件下形成非共價連接的穩(wěn)定配對的不同部分。例如生物素和抗生物素蛋白(或鏈霉抗生物素蛋白)是補(bǔ)體/抗補(bǔ)體對的典型。其它典型的補(bǔ)體/抗補(bǔ)體對包括受體/配體對、抗體/抗原(或半抗原或表位)對、正義/反義多核苷酸對等等.由于希望補(bǔ)體/抗補(bǔ)體對接著還能解離，補(bǔ)體/抗補(bǔ)體對最好結(jié)合親和力小于109M—、"抗體片段"是抗體的一部分，如F(ab，)2、F(ab)2、Fab，、Fab等等。與結(jié)構(gòu)無關(guān)，抗體片段與被完整抗體識別的相同抗原結(jié)合。術(shù)語^體片段"還包括與特異性抗原結(jié)合的合成或基因工程改造的多肽，例如由輕鏈可變區(qū)組成的多肽、由重鏈和輕鏈可變區(qū)組成的"Fv"片段、其中用肽連接體(》cFv蛋白質(zhì)")連接輕鏈和重鏈可變區(qū)的重組單鏈多肽分子以及由與高變區(qū)極為相似的氨基酸殘基組成的最小識別單位。"嵌合抗體"是含有從嚙齒類動物抗體得到的可變區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)的重組蛋白質(zhì)，而該抗體分子的其他部分是從人的抗體中得到的。"人源化的抗體"是已經(jīng)將單克隆抗體的鼠互補(bǔ)決定區(qū)從鼠免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變區(qū)轉(zhuǎn)移到人的可變區(qū)的重組蛋白質(zhì)。如本文所使用的，^療劑"是一種分子或原子，它與抗體部分綴合以生產(chǎn)可用于治療的綴合物。治療劑的例子包括藥物、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、螯合物(chelators)、硼化合物、光活性劑或染料以及放射性同位素."可檢測標(biāo)記"是一種分子或原子，其與抗體部分綴合以生產(chǎn)可用于診斷的分子，可檢測標(biāo)記的例子包括螯合物、光活性劑、放射性同位素、熒光劑、順磁離子或其它標(biāo)記部分。本文所使用的術(shù)語"親和標(biāo)記物"表示可以附在另一多肽上的多肽片段，用以純化或檢測第二多肽，或者為第二多肽提供底物的附著位點(diǎn)。原則上，任何可以得到其抗體或其他有特異性結(jié)合的試劑的肽或蛋白都可以作為親和標(biāo)記物來^吏用。親和標(biāo)記物包括多組氨酸序列段、蛋白A(Nilsson等人，f鄉(xiāng)0/4:1075(1985);Nilsson等人，^^邁o丄WU(1991))、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Smith和Johnson,toe67:31(1988))、Glu-Glu親和標(biāo)記物(Grusse翻yer等人，尸了oc.y4cad5"cj'.〃M82:7952(1985))、P物質(zhì)、FLAG肽(Hopp等人，"j'"ec力/oA^76:1204(1988))、鏈酶抗生物素蛋白結(jié)合肽、或其它抗原表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域.通常參閱Ford等人，尸rotejfyj^/7res5M'o/za/7d//^ri/7catj'o/2:95(1991)。編碼親和標(biāo)記物的DNA分子可以從商業(yè)供應(yīng)商(例如PharmaciaBiotech、Piscataway，NJ)處獲得。豫抗體"是一種完整的抗體，與抗體片段不同，它不與治療劑綴合。棵抗體包括多克隆和單克隆抗體兩種，以及某些重組抗體，如嵌合和人源化的抗體。如本文所用到的，術(shù)語貨體組分"包括完整的抗體和抗體片段兩種。免疫綴合物"是指抗體組分與治療劑或可檢測標(biāo)記的綴合物。"乾多肽"或"耙肽"是包含至少一個表桂的氨基酸序列，它在乾細(xì)胞，例如肺瘤細(xì)胞或載有傳染性因子的抗原的細(xì)胞上表達(dá)。T細(xì)位，并且一般溶解靶細(xì)胞或在靶細(xì)胞的位置招募其它免疫細(xì)胞，從而殺傷乾細(xì)胞。"抗原肽"是被T細(xì)胞識別的一種肽，它與主要組織相容性復(fù)合分子結(jié)合以形成MHC-肽復(fù)合體，從而，在對T細(xì)胞遞呈時誘導(dǎo)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的應(yīng)答。因此，抗原肽可以與適當(dāng)?shù)闹饕M織相容性復(fù)合分子結(jié)合，并且誘導(dǎo)結(jié)合或表達(dá)該抗原的耙細(xì)胞的毒性T細(xì)胞的應(yīng)答，例如針對靶細(xì)胞的細(xì)胞溶解作用或特異性細(xì)胞因子的釋放?？乖目梢栽谶f呈抗原的細(xì)胞或靶細(xì)胞上，與I類或II類主要組織相容性復(fù)合分子結(jié)合。在真核生物中，RNA聚合酶n催化結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄以生產(chǎn)mRNA。核酸分子可以被設(shè)計成含有RNA聚合酶n的模板，其中RM的轉(zhuǎn)錄物具有與特異mRNA互補(bǔ)的序列。該RNA轉(zhuǎn)錄物被稱為"反義RNA",同時編碼反義RNA的核酸分子被稱為"反義基因"。反義RNA分子可以與mRNA分子結(jié)合，導(dǎo)致mRNA翻譯的抑制.由于標(biāo)準(zhǔn)分析方法的不精確，聚合物的分子量和長度被理解為近似值。以"大約"x或"大概"x來表達(dá)該值時，所述的數(shù)值x應(yīng)被理解為精確到±10%。3.編碼TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)的核酸分子的生產(chǎn)圖1提供了預(yù)測的人的TACI氨基酸序列(vonBiilow和Bram，5""e;7ce278:138(1997))。TACI多肽含有下述預(yù)期元件(a)作為胂瘤壞死因子配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域特征的二個富含半胱氨酸的假重復(fù)結(jié)構(gòu)，(b)存在于配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域之間的62個氨基酸的"柄區(qū)"，(c)20個氨基酸的跨膜結(jié)構(gòu)域，和(d)127個氨基酸的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列不含有預(yù)期的疏水的氨基端信號序列。為了制造用作為天然配體天然受體相互作用的抑制劑的人的TACI可溶形式，產(chǎn)生了TACI胞外結(jié)構(gòu)域-人的免疫球蛋白Fc融合蛋白質(zhì)。可以得到的人的TACI序列被用作設(shè)計融合蛋白質(zhì)分子的起點(diǎn)(vonB坦ow和Bram，5"cie"ce278:138(1997))。該初始構(gòu)建體，設(shè)計為"TACI-Fc4"，包括下面所述的TACI多肽的氨基酸殘基1到154以及修飾過的人的Fc段.當(dāng)不包括任何預(yù)期的跨膜結(jié)構(gòu)域的潛在部分時，為了包括盡可能多的TACI柄區(qū)而選擇殘基154作為融合點(diǎn)。鑒于天然TACI多肽不舍有氨基端信號序列，為了產(chǎn)生TACI-Fc4融合蛋白質(zhì)的分泌形式，將氨基端信號序列加到TACI上。信號序列是來自人的組織纖溶酶原激活蛋白的修飾過的前原(pre-pro)序列.修飾被包括進(jìn)來是為了促進(jìn)信號肽酶的切割和弗林蛋白酶的特異性加工，并且由于這一原因，該序列已經(jīng)被稱為貨化的tPA(otPA)前導(dǎo)序列"。在下文的闡明了otPA序列(SEQIDNO:25);已修飾過的氨基酸殘基被用陰影標(biāo)出。將重組TACI-Fc4融合蛋白質(zhì)的編碼序列插入到表達(dá)載體中，而它被轉(zhuǎn)染到中國倉鼠的卵巢細(xì)胞中。-35-30MetAspAlaMetLysArgGlyLeuCysCysValLeuLeuLeuCys信號肽酶切割位點(diǎn)_20^lr_______GlyAlaValPheValSerSerGinGlu工leHisAla與yi賴弗林蛋白酶切割位點(diǎn)ArgArgjPlie^京Arg轉(zhuǎn)染過的中國倉鼠的卵巢細(xì)胞以大約以0.3pg/細(xì)胞/天的低水平生產(chǎn)TACI-Fc4蛋白質(zhì)。TACI-Fc4蛋白質(zhì)用羊抗人IgGFc抗血清的免疫印記分析顯現(xiàn)出兩個條帶，一個帶比大概48kDa的期望尺寸小.純化蛋白質(zhì)的氨基酸序列分析顯現(xiàn)，較小的帶由在TACI柄區(qū)中多個位點(diǎn)上對TACI融合蛋白質(zhì)的切割造成。參考SEQIDNO:2發(fā)現(xiàn)，雖然，蛋白質(zhì)也在氨基酸110、139和141位置上被切割，但是主要的末端在氨基酸殘基118和123。除了由在柄區(qū)切割引起異源性之外，在氨基和羧基末端也觀察到了異源性。參考SEQIDNO:2,發(fā)現(xiàn)主要的氨基末端在氨基酸殘基1、10和13上。在羧基末端中的差異反映了重組免疫球蛋白和免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的天然異源性，它包括在羧基末端編碼的賴氨酸殘基的不完全去除.其它異源性的來源是在附著于編碼Fc的免疫球蛋白CH2結(jié)構(gòu)域的碳水化合物結(jié)構(gòu)的可變的自然屬性中發(fā)現(xiàn)的.制成了新版本的TACI-Fc以解決所觀察到的異源性。所設(shè)計的構(gòu)建體至少包括在TACI部分中的以下變異之一(1)缺失TACI柄區(qū)的部分，(2)用BCMA柄區(qū)的一部分替換TACI柄區(qū)的一部分，(3)使在位置119的精氨酸殘基突變，以消除潛在的弗林蛋白酶切割位點(diǎn)，(4)使在位置121的精氨酸殘基突變，以消除潛在的弗林蛋白酶切割位點(diǎn)，(5)使在位置122的精氨酸殘基突變，以消除潛在的弗林蛋白酶切割位點(diǎn)，(6)將在位置123和142的氨基酸殘基突變?yōu)樵谑骉ACI的相應(yīng)位置的氨基酸殘基，(7)用人的重鏈可變區(qū)信號序列替換人的otPA信號序列，(8)將在位置29的纈氨酸殘基突變?yōu)榧琢虬彼釟埢?，并且將otPA信號序列連接到該殘基的氨基末端位置，以及(9)將otPA信號序列連接到在位置30的丙氨酸殘基的氨基末端的位置.修飾亦被引入到了免疫球蛋白部分。五類免疫球蛋白，IgG、IgA、IgM、IgD和IgE,已經(jīng)在高等脊推動物中被鑒別出來。IgG、IgD和IgE蛋白質(zhì)的特征是由二疏鍵連接的由兩個相同重鏈和兩個相同輕鏈組成的異型四聚體。一般，IgM是以四聚體的五聚體的形式被發(fā)現(xiàn)的，而IgA是作為四聚體的二聚體出現(xiàn)。IgG構(gòu)成主要類型，它是以血漿中發(fā)現(xiàn)的第二豐富的蛋白質(zhì)的狀態(tài)存在的'在人類中，IgG由被稱為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的四種亞型組成。如圖2所示，每種免疫球蛋白的重鏈都具有由恒定區(qū)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(C吣鉸鏈區(qū)部、Ch2和Ch3)組成的恒定區(qū)，它對于給定的亞型是不變的。IgG類型的重鏈恒定區(qū)用希臘符號Y來標(biāo)記。例如，IgGl亞型免疫球蛋白含有y1重鏈恒定區(qū)。Fc片段，或Fc結(jié)構(gòu)域，由用二硫鍵連接的重鏈鉸鏈區(qū)、Ch2和Ch3結(jié)構(gòu)域組成。在免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)中，IgGl亞型的Fc結(jié)構(gòu)域經(jīng)常被用作免疫球蛋白部分，因?yàn)镮gGl具有任何血清蛋白質(zhì)中最長的血清半衰期。較長的血清半衰期可以成為對于動物研究和潛在的人類治療應(yīng)用的所希望的蛋白質(zhì)特性。此外，IgGl亞型具有最強(qiáng)的實(shí)現(xiàn)抗體介導(dǎo)的效應(yīng)子功能的能力。在免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)中或許最有用的基本的效應(yīng)子的功能是IgGl抗體介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒作用的能力。在另一方面，對于主要作為拮抗物的融合蛋白質(zhì)這可能是不希望的功能。在IgGl亞型中，若干對于抗體恒定區(qū)介導(dǎo)的活性重要的特異性氨基酸殘基已經(jīng)被確定。因此包含或排除這些特異性的氨基酸就允許包含或排除特異性的免疫球蛋白恒定區(qū)介導(dǎo)的活性。由于制造Fc融合蛋白質(zhì)，六個版本的修飾的人的IgGlFc被產(chǎn)生出來。為了便于克隆含有人的YlFc區(qū)的融合蛋白質(zhì)而設(shè)計了Fc-488，并且它是用野生型人的免疫球蛋白Yl恒定區(qū)作為模板來構(gòu)建的?？紤]到由于不成對的半胱氨酸殘基所導(dǎo)致的潛在的有害作用，決定用絲氨酸殘基替換正常情況下用二疏鍵與免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)結(jié)合半胱氨酸(SEQIDN0:6的氨基酸殘基24)。為了將來DNA操作的筒便，額外的變化被引入到編碼EU索引位置218(SEQIDN0:6的氨基酸殘基22)的密碼子中，以引入萬^/n限制酶的識別位點(diǎn)。將這些變化引入到在PCR引物上編碼的PCR產(chǎn)物中。根據(jù)^gin位點(diǎn)的位置和為了使Fc鉸鏈區(qū)完整，將EU索引位置216和217(SEQIDN0:6的氨基酸殘基20和21)的密碼子摻入到融合蛋白質(zhì)的相應(yīng)序列中。Fc4、Fc5和Fc6包含了通過降低FcYRI的結(jié)合和補(bǔ)體Clq的結(jié)合而降低由Fc介導(dǎo)的效應(yīng)子功能的突變。Fc4包含與被引入到Fc-488中的相同氨基酸替代。將額外的氨基酸替代引入，以降低潛在的Fc介導(dǎo)的效應(yīng)子的功能。具體而言，三個氨基酸替代被引入以降低FcyRI結(jié)合。它們是在EU索引位置234、235和237(SEQIDN0:6的氨基酸殘基38、39和41)的替代物。在這些位置的替代已經(jīng)顯示降低對FcyRI的結(jié)合(Duncan等人，^a&re332:563(1988)).這些氨基酸替代也可以降低FcyRIIa的結(jié)合，以及FcyRIII的結(jié)合(Sondermann等人，406:267(2000):Wines等人，164:5313(2000))。若干研究小組已經(jīng)描述了在補(bǔ)體Clq結(jié)合和接著發(fā)生的補(bǔ)體的固定中EU索引位置330和331(SEQIDNO:6的氨基酸殘基134和135)的相關(guān)性(Canfield和Morrison,,加淑.173:1483(1991);Tao等人，/￡印.#ecT.178:661(1993))。將在該位置的氨基酸替代引入到Fc4中以減少補(bǔ)體的固定。除終止密碼子之外，F(xiàn)c4的0結(jié)構(gòu)域和在相應(yīng)的野生型多肽中的完全一樣，將克隆的DNA在大腸桿菌的dam+菌抹中培育時，TGA被變?yōu)門AA以消除潛在的dam甲基化位點(diǎn)。在Fc5中，將在EU索引位置218的精氨酸殘基突變回賴氨酸，因?yàn)楹性撎厥釬c的融合蛋白質(zhì)不使用萬^n克隆方案。Fc5序列的其他部分與上述的Fc4相符。除羧基端賴氨酸密碼子已經(jīng)被除去之外，F(xiàn)c6和Fc5完全一樣。成熟免疫球蛋白的C末端賴氨酸經(jīng)常在從B細(xì)胞分泌之前在翻譯后從成熟免疫球蛋白被除去，或在血清循環(huán)時被除去.因此，C末端的賴氨酸殘基一般在循環(huán)的抗體上不會被找到。如在上面所述的Fc4和Fc5一樣，在Fc6序列中的終止密碼子被改為TM。除位于(^結(jié)構(gòu)域的在EU索引位置297上的氨基酸替代之外，F(xiàn)c7和野生型YlFc完全一樣。EU索引位置Asn-297(SEQIDNO:6的氨基酸殘基101)是N-連接的碳水化合物的附著的位點(diǎn)。由于在碳水化合物結(jié)構(gòu)中潛在的批與批之間的變化，N-連接的碳水化合物在重組表達(dá)的蛋白質(zhì)中引入了潛在的變異性的來源。在消除這種潛在的變異性的努力中，將Asn-297突變?yōu)楣劝滨０窔埢苑乐筃-連接的碳水化合物在該殘基位置上的附著。在殘基297上的碳水化合物也參與Fc與FcyRIII的結(jié)合(Sondermann等人，406:267(2000))。因此，通常碳水化合物的去除會減少重組的含F(xiàn)c7融合蛋白質(zhì)與FcyRs的結(jié)合。如上所述，F(xiàn)c7序列的終止密碼子突變?yōu)門AA。除將在EU索引位置220(SEQIDNO:6的氨基酸殘基24)半胱氨酸殘基用絲氨酸殘基替代之外，F(xiàn)c8和在SEQIDNO:6中所示的野生型免疫球蛋白Yl區(qū)完全一樣。該突變?nèi)コ送ǔＥc免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)以二硫鍵結(jié)合的半胱氨酸殘基。表1敘述了實(shí)例TACI-Fc構(gòu)建體。表1實(shí)例TACI-Fc融合蛋白質(zhì)構(gòu)建體TACI序列3Fc版本TACIbFc4TACIbFc5TACIbFcylTACI(dl07-154)Fc5TACI(R119Q)Fc4TACI(1-104>BCMA(42-54)cFc5TACI(dl43-150)Fc5TACI(R142G，dl43-150)Fc5TACI(R119G，Q121P，R122Q，S123A〉Fc5TACI(R119G，R122Q)Fc5TAd(dl-28,V29M)Fc6TACI(dl-29)Fc6TACI(dl-29)Fc5TACI(dl-29,dl07-154)Fc5TACI(dl-29,d111-154)Fc5TACI(dl-29，dl20-154)Fc5a在括號內(nèi)提供了參考SEQIDN0:2氨基酸序列的、關(guān)于氨基酸序列的位置、突變和缺失信息.23b包括SEQIDNO:2氨基酸殘基1到154。c該構(gòu)建體包括SEQIDNO:2(TACI)氨基酸殘基1到104和SEQIDN0:27(BCMA)氨基酸42到54。用重組的中國倉鼠卵巢細(xì)胞生產(chǎn)TACI-Fc蛋白質(zhì)，采用免疫印記分析和氨基酸序列分析分離并分析。意想不到的是，從N末端缺失前29個氨基酸的TACI多肽導(dǎo)致在中國倉鼠卵巢細(xì)胞的TACI-Fc融合蛋白質(zhì)生產(chǎn)中增長10倍。該缺失也減少了全長柄區(qū)的切割。此外，在TACI柄區(qū)內(nèi)的切割，通過截短柄區(qū)或者通過在另一個氨基酸序列(例如BCMA柄區(qū)的氨基酸序列)內(nèi)替換TACI的柄區(qū)而得到抑制。如實(shí)施例4所述，TACI-Fc構(gòu)建體的功能分析表明，融合蛋白質(zhì)TACI(dl-29)-Fc5、TACI(dl-29、dl07-154)-Fc5、TACI(dl—29、dlll-154)-Fc5和TACI(dl-29、dl20-154)-Fc5對于ZTNF4具有相似結(jié)合親和力。但是，構(gòu)建體TACI(dl-29)-Fc5、TACI(dl-29、dl11-154)-Fc5和TACI(dl-29、dl20-154)-Fc5與構(gòu)建體TACI(dl-29、dl07-154)-Fc5相比，每摩爾TACI-Fc對ZTNF4表現(xiàn)出更高的結(jié)合性。根據(jù)目的應(yīng)用(即治療、診斷或研究)，可以使用高能或者低能的TACI-Fc融合蛋白質(zhì)，此外，高能和低能TACI-Fc融合蛋白質(zhì)的組合使ZTNF2或ZTNF4的滴定成為可能。本發(fā)明預(yù)期包含由SEQIDN0:2的氨基酸殘基30到106、SEQIDN0:2的30到110、SEQIDN0:2的30到119或者SEQIDN0:2的30到154組成的TACI受體部分的TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)。本發(fā)明也包括包含由SEQIDN0:2的氨基酸殘基31到106、SEQIDN0:2的31到110、SEQIDN0:2的31到119或者SEQIDN0:2的31到154組成的TACI受體部分的TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)。更一般地說，本發(fā)明包括TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)，其中TACI受體部分由SEQIDNO:2氨基酸殘基30到154的片段組成，并且其中TACI受體部分至少與ZTNF2或ZTNF4之一結(jié)合。上述片段包含富含半胱氨酸的假性重復(fù)區(qū)，以及任選地至少能夠包括以下之一存在于富含半胱氨酸的假性重復(fù)區(qū)的氨基端的位置上的N末端片段，和存在于富含半胱氨酸的假性重復(fù)區(qū)的羧基端位置上的柄片段。適合的富含半胱氨酸的假性重復(fù)區(qū)包括多肽(a)至少包含SEQIDN0:2氨基酸殘基34到66和SEQIDN0:2氨基酸殘基71到104之一，(b)包含SEQIDN0:2氨基酸殘基34到66和SEQIDN0:2氨基酸殘基71到104二者，或者(c)包含SEQIDN0:2氨基酸殘基34到104。適合的N末端片段包括SEQIDN0:2的下述部分氨基酸殘基33、氨基酸殘基32到33、氨基酸殘基31到33以及氨基酸殘基30到33。適合的柄片段包括SEQIDN0:2氨基酸殘基105到154的一個或多個氨基酸。例如，柄片段可以由SEQIDN0:2的下述部分組成氨基酸殘基105、氨基酸殘基105到106、氨基酸殘基105到107、氨基酸殘基105到108、氨基酸殘基105到109、氨基酸殘基105到110、氨基酸殘基105到111、氨基酸殘基105到112、氨基酸殘基105到113、氨基酸殘基105到114、氨基酸殘基105到115、氨基酸殘基105到116、氨基酸殘基105到117、氨基酸殘基105到118、氨基酸殘基105到119、氨基酸殘基105到120、氨基酸殘基105到121、氨基酸殘基105到122、氨基酸殘基105到123、氨基酸殘基105到124、氨基酸殘基105到125、氨基酸殘基105到126、氨基酸殘基105到127、氨基酸殘基105到128、氨基酸殘基105到129、氨基酸殘基105到130、氨基酸殘基105到131、氨基酸殘基105到132、氨基酸殘基105到133、氨基酸殘基105到134、氨基酸殘基105到135、氨基酸殘基105到136、氨基酸殘基105到137、氨基酸殘基105到138、氨基酸殘基'105到139、氨基酸殘基105到140、氨基酸殘基105到141、氨基酸殘基105到142、氨基酸殘基105到143、氨基酸殘基105到144、氨基酸殘基105到145、氨基酸殘基105到146、氨基酸殘基105到147、氨基酸殘基105到148、氨基酸殘基105到149、氨基酸殘基105到150、氨基酸殘基105到151、氨基酸殘基105到152、氨基酸殘基105到153和氨基酸殘基105到154。額外的適合的柄片段包括BCMA柄區(qū)的一個或多個氨基酸(即SEQIDNO:27的氨基酸殘基42到54)。例如柄片段可以由以SEQIDNO:27的下述部分組成氨基酸殘基42、氨基酸殘基42到43、氨基酸殘基42到44、氨基酸殘基42到45、氨基酸殘基42到46、氨基酸殘基42到47、氨基酸殘基42到48、氨基酸殘基42到49、氨基酸殘基42到50、氨基酸殘基42到51、氨基酸殘基42到52、氨基酸殘基42到53和氨基酸殘基42到54。更一般地說，柄片段可以由二到50個氨基酸殘基組成。本文中所述的融合蛋白質(zhì)的免疫球蛋白部分包含至少一個免疫球蛋白恒定區(qū)。優(yōu)選地是，免疫球蛋白部分代表人免疫球蛋白的片段。人免疫球蛋白序列可以是野生型的氨基酸序列，或者是具有至少上面討論過的氨基酸突變之一的經(jīng)修飾野生型氨基酸序列。人免疫球蛋白氨基酸序列也可以具有一個或多個已知同種異型決定簇的特征性的突變而與野生型不同。表2顯示人的IgGyl恒定區(qū)的同種異型決定簇(Putman,r力e尸hs/za尸ro"i/2s,Ko丄R第49到140頁(AcademicPress,Inc.1987))。EU索引位置214、356、358和431定義了已知的IgGvl同種異型體。位置214在IgGv1恒定區(qū)的Gu結(jié)構(gòu)域中，因此，不存在于Fc序列內(nèi)。SEQIDN0:6的野生型Fc序列包括Glm(l)和Glm(2-)同種異型體。但是，可以將TACI-Fc蛋白質(zhì)的Fc部分修飾以反映這些同種異型體的任何組合。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>本文公開的TACI-Fc蛋白質(zhì)的實(shí)例包含人IgGl恒定區(qū)。但是，適合的免疫球蛋白部分也包括包含至少一個恒定區(qū)的多肽，如來自下述任何免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD、IgE和IgM。較更有利地，與野生型IgGl或野生型IgG3相比，從野生型IgG2或野生型IgG4衍生的免疫球蛋白部分提供降低了的效應(yīng)子功能。如上所述本發(fā)明還預(yù)期包含TACI受體部分以及為白蛋白或-P2巨球蛋白的融合蛋白質(zhì)。另一類與ZTNF2或ZTNF4結(jié)合的受體融合蛋白質(zhì)是BCMA-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)。已經(jīng)用BCMA-Fc4融合蛋白質(zhì)進(jìn)行了研究，其中BCMA部分由SEQIDN0:27的氨基酸殘基1到48組成.意想不到的是，用鼠進(jìn)行的藥物動力學(xué)研究揭示，BCMA-Fc4融合蛋白質(zhì)具有大約101小時的半衰期，然而，TACI-Fc蛋白質(zhì)有25小時的半衰期。因此，BCMA-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的藥物應(yīng)用在一定的臨床背景下可能更優(yōu)選。此外，TACI-免疫球蛋白和BCMA-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的組合對于一定的治療情況可能有利。該組合治療可以通過TACI-免疫球蛋白和BCMA-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的給藥，或通過TACI-免疫球蛋白和BCMA-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的異源二聚體的給藥來實(shí)現(xiàn)。另一類的結(jié)合ZTNF4的受體融合蛋白質(zhì)是包含被稱為"Ztnfrl2"的受體胞外結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)，Ztnfrl2氨基酸和核苷酸序列分別以SEQIDNO:59和SEQIDN0:60被提供。適合的Ztnfrl2受體部分包括包含SEQIDNO:60氨基酸殘基1到69或者SEQIDN0:60氨基酸殘基19到35的多肽。本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)可以有單鏈多肽、二聚體、三聚體、或二聚體或三聚體的復(fù)合物的形式。二聚體可以是同源二聚體或異源二聚體，同時三聚體可以是同源三聚體或異源三聚體。異源二聚體的實(shí)例包括TACI-免疫球蛋白多肽和BCMA-免疫球蛋白多肽、TACI-免疫球蛋白多肽和Ztnfrl2-免疫球蛋白多肽、以及BCMA-免疫球蛋白多肽和Ztnfrl2-免疫球蛋白多肽。異源三聚體的實(shí)例包括TACI-免疫球蛋白多肽和兩個BCMA-免疫球蛋白多肽、TACI-免疫球蛋白多肽和兩個Ztnfrl2-免疫球蛋白多肽、BCMA-免疫球蛋白多肽和兩個Ztnfrl2-免疫球蛋白多肽、兩個TACI-免疫球蛋白多肽和BCMA-免疫球蛋白多肽、兩個TACI-免疫球蛋白多肽和Ztnfrl2-免疫球蛋白多肽、兩個BCMA-免疫球蛋白多肽和Ztnfrl2-免疫球蛋白多肽、以及TACI-免疫if泉蛋白多肽、BCMA-免疫球蛋白多肽和Ztnfr12-免疫球蛋白多肽的三聚體。在上述融合蛋白質(zhì)中，TACI受體部分可以至少包含SEQIDN0:2的下述氨基酸序列之一氨基酸殘基30到154、氨基酸殘基34到66、氨基酸殘基71到104、氨基酸殘基47到62以及氨基酸殘基86到100。BCMA受體部分可以至少包含SEQIDNO:27的下述氨基酸序列之一氨基酸殘基1到48、氨基酸殘基8到41、以及氨基酸殘基21到37。Ztnfr12受體部分可以至少包含SEQIDNO:60的下述氨基酸序列之一氨基酸殘基1到69、以及氨基酸殘基19到35.融合蛋白質(zhì)可以^使用在實(shí)施例中所述的用來構(gòu)建實(shí)例TACI-Fc分子的PCR方法來生產(chǎn)，但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以應(yīng)用其他標(biāo)準(zhǔn)的方法。例如，編碼TACI、BCMA、Ztnfrl2或免疫球蛋白多肽的核酸分子可以通過使用根據(jù)本文中公開的序列而得到的多核苷酸探針篩選人28cDNA或基因組文庫來獲得。這些技術(shù)是標(biāo)準(zhǔn)的和非常完備地建立的(參閱例如，Ausubel等人(eds,)，57ort尸rofocoJsi^cJecwJar^Zo7o^r,#應(yīng)，第4-1到4-6頁(JohnWiley和Sons1995)("Ausubel(1995)");Wu等人，#etAo(/s6e"e5iotec力73o7o^y,第33—41頁(CRCPress,Inc.1997)("Wu(1997)");Ausubel(1995)見第5-1到5-6頁；Wu(1997)見第307-327頁)),另外，用于構(gòu)建免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的分子可以通過用突變引發(fā)的長寡核普酸和本文所述的核普酸序列合成核酸分子來獲得。(參閱例如，Ausubel(1995)見第8-8到8-9頁)。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)的成熟工藝提供了可合成長度至少二千堿基DNA分子的能力(Adang等人，^P2a/^i/oJec,萬io丄21:1131(1993),Bambot等人，PCffifetAoa^朋t/v4pAj.catj'o/is2**266(1993)，Dillon等人，"UseofthePolymeraseChainReactionfortheRapidConstructionofSyntheticGenes,"inifet力oc^#o_/ecw_/arAfoJo^K,Fo丄■PCff尸r"ocoh.'Cwrre/2tjf/et力oofs朋ofi4/p2j'ca"o"&White(ed.)，第263-268頁，(H腿naPress,Inc.1993)，和Holowachuk等人，靡淑Ws粉丄4:299(1995))'本發(fā)明的核酸分子也可以用"基因機(jī)"以i者如亞磷酰胺方法之類的方案合成.如果需要化學(xué)合成雙鏈DNA，例如對于基因或基因片段合成之類的應(yīng)用，那么分別合成各互補(bǔ)鏈。短基因(60到80個堿基對)的生產(chǎn)在技術(shù)上是簡單的，它可以用在合成互補(bǔ)鏈之后對其退火來完成。但是，對于較長的基因(大于300堿基對)的生產(chǎn)，可能需要特殊的策略，因?yàn)?，在化學(xué)DNA合成時每個周期的偶聯(lián)效率很少為100%。為了克服該問題，用長度20到100個核苷酸的單鏈片段以模塊的形式裝配成合成的基因(雙鏈的)。關(guān)于多核苷酸合成的綜述，參閱，例如，Glick和Pasternak,#o/eci/7ajr"j'"ec力/7cl/o^jo戶ri/ci^lesa/7cMp/h.ca"(ms0/"/eco辺6j'/ai7i:Z7V^(ASMPress1994)，Itakura等人，細(xì)u.M.萬ioc力e邁.53:323(1984),和Climie等人，尸潔.淑？/4cad5"cj'.USA87:633(1990)。4.TACI-免疫球蛋白多肽的生產(chǎn)本發(fā)明的多肽可以通過按照傳統(tǒng)的技術(shù)在重組的宿主細(xì)胞中生產(chǎn)。對于表達(dá)編碼TACI-免疫球蛋白的序列，編碼多肽的核酸分子必須與在表達(dá)載體中控制轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)節(jié)序列切實(shí)可操作地連接，之后引入到宿主細(xì)胞中。除轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列(如啟動子和增強(qiáng)子)之外，表達(dá)載體可以包括翻譯調(diào)節(jié)序列和適于篩選帶有表達(dá)載體的細(xì)胞的標(biāo)記基因。適合在真核細(xì)胞中生產(chǎn)外源蛋白的表達(dá)載體一般含有(l)編碼細(xì)菌復(fù)制起始點(diǎn)的和在細(xì)菌宿主中為表達(dá)載體的生長和選擇提供的抗生素抗性標(biāo)記的原核DNA元件；(2)控制轉(zhuǎn)錄起始的真核DNA元件，如啟動子；和(3)控制轉(zhuǎn)錄物加工的DNA元件，如轉(zhuǎn)錄終止/聚腺苷酸化序列。表達(dá)載體也可以包括編碼指導(dǎo)異源多肽進(jìn)入到宿主細(xì)胞的分泌途徑的分泌序列的核香酸序列。例如，表達(dá)載體可以包含編碼TACI免疫球蛋白的核苦酸序列和由從任何分泌型基因中得到的分泌序列。如上面討論的，一種適合的信號序列是tPA信號序列。典型的信號序列由SEQIDN0:25提供。另一個適合的信號序列是鼠26-10V"言號序列。例如Near等人，#o7./咖w/o丄27:901(1990)敘迷了鼠26-10抗體。說明性的鼠26-10VH信號序列的氨基酸和核苷酸序列分別由SEQIDNO:61和SEQIDN0:65提供。SEQIDNO:62公開了包含鼠26-10VH信號序列的TACI-Fc5融合蛋白質(zhì)的氨基酸序列。本發(fā)明的TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)可以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。適合的哺乳動物宿主細(xì)胞的實(shí)施例包括非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero;ATCCCRL1587)、人胚腎細(xì)胞(293-HEK;ATCCCRL1573)、幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK-21,B服-570;ATCCCRL8544，ATCCCRL10314)、犬腎細(xì)胞(MDCK;ATCCCCL34)、中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CH0-K1:ATCCCCL61;C訓(xùn)G44(Chasin等人，5b瓜Ce".Uec.Ge"".12:555，1986))、大鼠垂體細(xì)胞(GH1;ATCCCCL82)、海拉S3細(xì)胞(ATCCCCL2.2)、大鼠肝瘤細(xì)胞(H-4-II-E;ATCCCRL1548)、SV40轉(zhuǎn)化的猴腎細(xì)胞(C0S-1;ATCCCRL1650)和鼠胚胎細(xì)胞(腿-3T3;ATCCCRL1658)。對于哺乳動物宿主，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)信號可以從病毒來源得到，例如腺病毒、牛乳頭瘤病毒、猿猴病毒，等等，其中調(diào)節(jié)信號與高水平表達(dá)的特定基因相關(guān)。適合的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列也可以從哺乳動物的基因獲得，如肌動蛋白、膠原蛋白、肌球蛋白和金屬疏蛋白基因。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列包括一個足夠指導(dǎo)RNA合成啟始的啟動子區(qū)。適合的真核啟動子包括小鼠金屬硫蛋白I基因的啟動子(Hamer等人，ifo/ec,場丄1:273(1982))、皰滲病毒TK啟動子(McKnight,31:355(1982))、SV40早期啟動子(Benoist等人，淑ure290:304(1981))、勞斯(Rous)肉瘤病毒啟動子(Gorman等人，iProc.，_/y4caf/.5"cj'.6K479:6777(1982))、巨細(xì)胞病毒啟動子(Foecking等人，"e/e45:101(1980))、以及小鼠乳癌病毒啟動子(一般參閱Etcheverry,"ExpressionofEngineeredProteinsinMammalianCellCulture,"載于尸rotei"_￡>^!-/26677.7^:尸"72ciWes朋of尸rac"ce,Cleland等人(eds.)，第163-181頁(JohnWiley和Sons,Inc.1996))。一種實(shí)用的啟動子和增強(qiáng)子的組合由骨髓增殖肉瘤病毒啟動子和人巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子提供。另一方面，如果，用真核啟動子調(diào)節(jié)原核啟動子，則原核啟動子，如噬菌體T3RNA聚合酶啟動子，可以用于控制哺乳動物細(xì)胞內(nèi)TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)的生產(chǎn)(Zhou等人，#0丄Cei丄10:4529(1990)，以及Kaufman等人，^"uc丄JciVsWes.19:4485(1991))?？梢杂冒姿徕}轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、微粒介導(dǎo)的傳遞、電穿孔等等在內(nèi)的多種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將表達(dá)載體引入到宿主細(xì)胞內(nèi)，可以將轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞進(jìn)行選擇并且繁殖，以提供含有在宿主細(xì)胞基因組中穩(wěn)定整合的表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞。用于將載體引入到真核細(xì)胞的技術(shù)和采用顯性選擇標(biāo)記以選擇上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的技術(shù)已有敘述，例如，Ausubel(1995)和Murray(ed.)，fe/zeZra/s/er朋dj&rAress!-o/7戶rotoco/s(Hu邁anaPress1991)。31例如，一種適合的選擇標(biāo)記是提供抗生素新霉素抗藥性的基因。這種情況下，在新霉素類藥物，如G-418或其同類存在的情況下進(jìn)行選擇。選擇系統(tǒng)也可以用于提高目的基因的表達(dá)水平，即被稱為"擴(kuò)增"的過程。擴(kuò)增是在低水平的選擇劑存在的情況下以培養(yǎng)轉(zhuǎn)染子(transfectant)來進(jìn)行的，接下來，增加選擇劑的量以選擇高水平生產(chǎn)的所引入的基因的產(chǎn)品的細(xì)胞。適合的可擴(kuò)增可選擇標(biāo)記是提供氨甲蝶呤抗性的二氳葉酸還原酶。也可以使用其他藥物的抗性基因(例如潮霉素抗性、多藥抗性、嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)?；蛘?，將像綠熒光蛋白質(zhì)之類的改變表型的標(biāo)記或者像CD4、CD8、I類MHC、胎盤堿性磷酸酶之類的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，可以通過用例如FACS分類術(shù)或磁性小珠分離技術(shù)之類的方法，從未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中分離轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。TACI-免疫球蛋白多肽也可以用病毒傳遞系統(tǒng)通過培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞來生產(chǎn)。用于此目的的代表性的病毒包括腺病毒、皰滲病毒、痘病毒和腺伴隨病毒(AVVK腺病毒，一種雙鏈DNA病毒，是目前研究最多的用于異源核酸傳遞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體(關(guān)于綜述，參閱Becker等人，淑AA'a/.43:161(1994),以及Douglas和Curiel，5"cj'e"ce必#ec/icjf"e4:44(1997))。腺病毒系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)包括，能夠容納相對較大的DNA的插入、以高滴度生長的能力、轉(zhuǎn)染較大范圍的哺乳動物細(xì)胞類型的能力、以及允許使用大量可以得到的含有不同啟動子的載體的靈活性。通過刪除部分腺病毒基因組，可以接納較大的異源DNA的插入(大于7kb),可以用直接連接反應(yīng)或通過與共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒一起同源重組將該插入物整合到病毒DNA中。一種選擇是從病毒栽體中刪除必須的El基因，這將導(dǎo)致除非由宿主細(xì)胞提供El基因，否則不能復(fù)制。例如，腺病毒載體傳染的人293細(xì)胞(ATCCNos.CRL-1573,45504，45505)可以作為貼壁細(xì)胞或以相對高的細(xì)胞密度在懸浮培養(yǎng)基中生長，以生產(chǎn)顯著量的蛋白質(zhì)(參閱Garnier等人，6>totec//oL15:145(1994))。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以設(shè)計適合的表達(dá)載體來用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)本文所述的融合蛋白質(zhì)。實(shí)施例4敘述了一種表達(dá)載體的特性。作為另一個實(shí)例，表達(dá)載體可以包含雙順反子表達(dá)盒，其包括人巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子的一部分、骨髓增殖肉瘤病毒的啟動子、編碼融合蛋白質(zhì)的核苷酸序列、脊髓灰質(zhì)炎病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、編碼鼠二氫葉酸還原酶的核普酸序列、再加上SV40聚腺苷酸添加序列。SEQIDN0:69的核苷酸序列顯示了一種巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子/骨髓增殖肉瘤病毒LTR啟動子構(gòu)建體，其中巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子從核苷酸1延伸到407。缺少負(fù)控制區(qū)的骨髓增殖肉瘤病毒LTR啟動子從SEQIDN0:69的核普酸408延伸到核苷酸884。沒有負(fù)控制區(qū)的骨髓增殖肉瘤病毒LTR啟動子的核苷酸序列在SEQIDN0:70中提供。實(shí)施例1敘述了一種表達(dá)載體，它包含指導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的巨細(xì)胞病毒啟動子、免疫球蛋白內(nèi)含子和組織纖溶酶原激活蛋白的信號序列.一種合適的免疫球蛋白內(nèi)含子是鼠26-10Vh內(nèi)含子。SEQIDN0:66提供了鼠26-10VH內(nèi)含子的示例核香酸序列.表達(dá)載體也可以包括位于編碼TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)的核苷酸序列上游的5，未翻譯區(qū)(UTR)。適合的5，-UTR可以從鼠26-10Vh基因中得到.SEQIDN0:63公開了有用的天然鼠26-10Vh的5，-UTR核苷酸序列，而SEQIDN0:64顯示鼠26-10VH5，-UTR核普酸序列時，它已經(jīng)在3'末端被得到最優(yōu)化。作為實(shí)例，SEQIDN0:67提供了包括下述元件的核苷酸序列天然鼠26-10VH5，-UTR(核苷酸1到51)、鼠26-10Vh信號序列(核苷酸52到97和182到192)、鼠26-10VH內(nèi)含子(核苷酸98到181)、編碼TACI部分的核苷酸序列(核苷酸193到435)、以及編碼Fc5部分的核苷酸序列(核香酸436到1131)。由于用最優(yōu)化的鼠26-10VH5，-UTR(核苷酸1到51)對天然序列的替換，核苷酸序列SEQIDN0:68與SEQIDNO:67不同。TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)也可以在其它較高等的真核細(xì)胞，例如鳥類的、真菌的、昆蟲、酵母或植物細(xì)胞中表達(dá)。桿狀病毒系統(tǒng)提供了一種向昆蟲細(xì)胞中引入克隆的基因的有效方法。適合的表達(dá)載體以苜33蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)多核型多角體病毒(AcMNPV)為基礎(chǔ)，并且含有熟知的啟動子，例如，果蠅熱休克蛋白(hsp)70啟動子、苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒立即早期基因啟動子(ie-l)和晚早期39K啟動子、桿狀病毒plO啟動子、和果蠅金屬疏蛋白啟動子。制備重組桿狀病毒的第二種方法使用Luckow所述的基于轉(zhuǎn)座子的系統(tǒng)(Luckow等人，/.Kz'ro丄67:4566(1993))。使用轉(zhuǎn)移載體的該系統(tǒng)，以BAC—to-BAC試劑盒(LifeTechnologies,Rockville，MD)銷售。該系統(tǒng)使用一種轉(zhuǎn)移載體PFASTBAC(LifeTechnologies),它含有Tn7轉(zhuǎn)座子，以將編碼TACI-免疫球蛋白多肽的DNA轉(zhuǎn)移到大腸桿菌(E.Coli)中作為被稱為軒粒(bacmid)"的較大質(zhì)粒而維持的桿狀病毒的基因組中。參閱，Hill-Perkins和Possee，/G肌h'ro丄71:971(1990)，Bonning等人，G朋.K/ro丄75:1551(1994),以及Chazenbalk和Rapoport，/Afo丄C力e邁.270:1543(1995)。此外，轉(zhuǎn)移載體可以在表達(dá)的TACI-免疫球蛋白多肽的C-或N-末端包括與編碼表位標(biāo)簽的DNA以符合讀框的方式融合，該表位例如Glu-Glu表位標(biāo)簽(Grussenmeyer等人，.尸roc.'7y4cad.5"cj'.82:7952(1985))。采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，將含有編碼TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)核苷酸序列的轉(zhuǎn)移栽體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，并且篩選含有標(biāo)志重組桿狀病毒的間斷的lacZ基因的桿粒.然后將含有重組桿狀病毒基因組的桿粒DNA用普通技術(shù)分離。實(shí)例PFASTBAC栽體可以在相當(dāng)大的程度上修飾.例如，可以將多角體蛋白啟動子去除，用桿狀病毒的堿性蛋白質(zhì)啟動子(也被稱為Pcor,p6.9或MP啟動子)替換，它在桿狀病毒感染的早期表達(dá)，并且已經(jīng)顯示出比表達(dá)分泌型蛋白質(zhì)有利(參閱，例如，Hill-Perkins和Possee,/Ge/.Kz>oL71:971(1990)，Bonning等人，/tfe".75:1551(1994),以及Chazenbalk和Rapoport,丄,丄C力e瓜270:1543(1995))。在上述轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建體中，可以使用短的或長的堿性蛋白質(zhì)啟動子。此外，轉(zhuǎn)移載體可以用從昆蟲蛋白質(zhì)中得到的分泌信號序列來構(gòu)建。例如，來自蛻皮甾類葡糖基轉(zhuǎn)移酶(EGT)、蜜蜂蜂毒肽(InvitrogenCorporation;Carlsbad,CA)或桿狀病毒gp67(PharMingen:SanDiego，CA)的分泌信號序列可以在上述構(gòu)建體中使用。將重組病毒或桿粒用于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。適合的昆蟲宿主細(xì)胞包括從IPLB-5"/-21得到的細(xì)胞系，草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)蛹卵巢細(xì)胞系，如5"/9(ATCCCRL1711)、5"/21AE和5"/21(InvitrogenCorporation;SanDiego，CA)、以及果錄(Drosophila)施奈德-2(Schneider-2)細(xì)胞、和從粉紋夜蛾(Trichoplusiani)中得到的HIGHFIVEO細(xì)胞系(Invitrogen)(美國專利No.5,300,435)?？梢詫⑹袌錾夏軌虻玫降臒o血清培養(yǎng)基用于細(xì)胞的生長和維持。對于Sf9細(xì)胞，適合的培養(yǎng)基是Sf900IITM(LifeTechnologies)或ESF921(ExpressionSystems);而對于粉紋夜蛾細(xì)胞，是Ex-cel10405(JRHBiosciences,Lenexa,KS)或ExpressFiveO(LifeTechnologies)。在使用重組病毒時，細(xì)胞一般從大概2-5x105細(xì)胞的接種密度生長到1-2x106細(xì)胞的密度，這時，以0.1到10的感染復(fù)數(shù)加入重組病毒的母抹，更一般地，感染復(fù)數(shù)接近3。在桿狀病毒系統(tǒng)中生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的成熟工藝由Bailey等人提供，可參閱Bailey等人,"ManipulationofBaculovirusVectors,"栽于ifet/octeifoJecwJarA.o/ogy,巻7:Ge"e7!ra/7Sjfera/7f/^srpressJ.OT2/!rotoco_Z&Murray(編輯)第147—168頁(TheHumanaPress,Inc.1991),Patel等人，"Thebaculovirusexpressionsystem,"載于67o/7i/7^"2,fjf/re5"5^o/sj^f卿第2版，Glover等人(編輯)，第205-244頁(OxfordUniversityPress1995)，Ausubel(1995)第16-37到16-57頁，Richardson(編輯)，Sacu_/oyj>wsEspressio/2尸rotocois，(TheHumanaPress,Inc.1995)，以及Uicknow，"InsectCellExpressionTechnology,"載于尸2"otej'/7^y^.力eeri"f/^r/zzc/A/es1朋^/戶ra"!'ce,Cleland等人(編輯)，第183—218頁(JohnWiley&Sons,Inc.1996)。真菌細(xì)胞，包括酵母細(xì)胞，也可以用于表達(dá)本文所述的基因。在這方面有特殊意義的酵母種類包括啤酒糖酵母(Saccharo邊ycescerevisiae)、巴斯《^-畢赤氏酵母(/astojrj's乂和邁et/a/oh'ca。對于酵母的表達(dá)適合的啟動子包括從GAL1(半乳糖)、PGK(磷酸甘油酸激酶)、ADH(醇脫氫酶)、A0X1(醇氧化酶)、HIS4(組氨醇脫氫酶)中得到的啟動子。許多酵母克隆載體已經(jīng)被設(shè)計出來并且很容易得到。載體可以被設(shè)計成生成使用在酵母中進(jìn)行同源重組所需要的元件Wj構(gòu)建體(參閱，侈'J如，Raymond等人，萬j'oTec力/H》i/es26:134(1999))。例如，這樣的表達(dá)載體可以包括對于在畔酒糖酵母中進(jìn)行選擇和復(fù)制所需要的URA3和CEN-ARS(自主復(fù)制序列)序列。其它適合的載體包括基于Yip-載體，如YIp5，YRp載體，如YRpl7，YEp載體，如YEpl3以及YCp載體，如YCpl9。用外源DNA轉(zhuǎn)化啤酒糖酵母細(xì)胞和用這些細(xì)胞生產(chǎn)重組多肽的方法已經(jīng)被7>開，例如，Kawasaki，美國專利No.4,599,311;Kawasaki等人，美國專利No.4,931,373;Brake,美國專利No.4，870，008;Welch等人，美國專利No.5，037，743;以及Murray等人，美國專利No.4，845，075。通過由可選擇的標(biāo)記決定的表型、普通的藥物抗性或在缺少特定營養(yǎng)(例如亮氨酸)的情況下生長的能力來篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞.適合在啤酒糖酵母中使用的載體系統(tǒng)是由Kawasaki等人(美國專利No.4，931，373)公開的P0T1載體系統(tǒng)，它允許通過轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠在含葡萄糖的培養(yǎng)基中生長來篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞.其他的適合用于酵母中的啟動子和終止子，包括從糖酵解酶基因(參閱，如Kawasaki,美國專利No.4,599，311:Kingsman等人，美國專利No.4，615,974和Bitter,美國專利No.4，977，092)和醇脫氫酶基因(亦參閱美國專利No.4，990，446、5，063，154、5,139,936和4，661，454)中得到的那些。本領(lǐng)域已知用于其它酵母的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，酵母包括多形漢遜氏酵母("a/se/m7a/0J72z0277力a>>、非洲粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、產(chǎn)乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfragilis)、玉蜀黍黑粉菌(〃s"7ago邁ay^i'sJ、S身遂f^"沃脊#、尸j'c力2'a邁et力a/7o7ica、季也蒙氏畢赤氏酵母(^i^er邁o/7c^'j和麥芽糖假絲酵母(Candidamaltosa)'參閱，例如，Gleeson等人，臉ro/;j.o丄132:3459(1986)和Cregg，美國專利No.4,882,279。根據(jù)McKnight等人在美國專利No.4,935,349所述的方法，可以使用曲霉屬(Aspergillus)細(xì)胞。Sumino等人在美國專利No.5，162,228公開了轉(zhuǎn)化力cre辺0/2j'咖cAzrsc^e/i/邁的方法。Lambowitz在美國專矛JNo.4，486,533公開了轉(zhuǎn)化鏈孢霉屬(Neurospora)的方法'例如，在重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)中作為宿主而使用尸ic力ia邁et力a/2oh'ca已經(jīng)被Raymond公開，對此可參閱美國專利No.5，716，808，Raymond,美國專利No.5，736,383,Raymond等人，7eaW14:11—13(1998)，以及國際專利申請Nos.WO97/17450、W097/17451、W098/02536和W098/02565。轉(zhuǎn)化尸.邊"力朋oh'ca所用的DNA分子通常將以雙鏈、環(huán)狀質(zhì)粒制備，在轉(zhuǎn)化前最好將其線性化。對于用尸.邁etA朋oh'ca生產(chǎn)多肽，質(zhì)粒中的啟動子和終止子可以是尸.邁"力朋o"cs基因的，如戶.邁"力a/oh'ca醇利用基因(AUG1或AUG2)。其它有用的啟動子包括二羥丙酮合酶(DHAS)、甲酸脫氫酶(FMD)和過氧化氫酶(CAT)基因的那些。為方便DNA整合入宿主染色體，最好使質(zhì)粒的整個表達(dá)片段在兩端都被宿主DNA序列所包閨。在尸ic/j-a邁"Aa/2oh.ca中使用的可選擇的適合標(biāo)記是尸.邊et/a"o』j'ca」Z^^基因，它編碼5-氨基咪唑核甘酸羧化酶(AIRC;EC4.1.1.21)，并且允許ade2宿主細(xì)胞在缺少腺嘌呤的情況下生長，對于希望最少量地使用甲醇的大量工業(yè)生產(chǎn)，宿主細(xì)胞可以在缺失兩個甲醇利用基因(AUG1或AUG2)的情況下被應(yīng)用。對于分泌型蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，宿主細(xì)胞可以在液泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)上有缺陷。應(yīng)用電穿孔，以便于將含有編碼目的多肽的DNA的質(zhì)粒引入到尸.邁et力a"oh'ca細(xì)胞?？梢杂弥笖?shù)式衰減的脈沖電場通過電穿孔轉(zhuǎn)化尸.邁et力a/zoj'ca細(xì)胞，其場強(qiáng)為2.5到4.5kV/c邁，優(yōu)選為大約3.75kV/cm，同時時間常數(shù)(t)為l到40毫秒，最優(yōu)選為大約20毫秒，也可以將表達(dá)載體引入到植物原生質(zhì)體、完整的植物組織或分離的植物細(xì)胞中。將表達(dá)載體引入到植物組織中的方法包括直接轉(zhuǎn)染或植物組織與根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)共同培養(yǎng)、微粒介導(dǎo)的傳遞、DNA注射、電穿孔等等。參閱，例如，Horsch等人，Scie"ce227:1229(1985)，Klein等人，萬J'"ec/woJo^y10:268(1992),以及Miki等人，"ProceduresforIntroducingForeignDNAintoPlants"載于i//7a/tUec〃2ar"ioJo^朋c/萬j.otec力73oJ柳Glick等人(編輯)，第67-88頁(CRCPress,1993)。另一方面，TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)可以在原核宿主細(xì)胞中生產(chǎn)?？梢杂糜谠谠怂拗髦猩a(chǎn)TACI-免疫球蛋白多肽的合適的啟動子為本領(lǐng)域中的技術(shù)人員所熟知，包括能夠識別T4、T3、Sp6和T7聚合酶的啟動子、噬菌體A的PK和Pi啟動子、大腸桿菌的tr/,recA熱休克、7ac〃M,tac、7p/-^c6^r、/力o力和7acZ啟動子、枯草芽孢桿菌(及Sf/6。7h)的啟動子、芽孢桿菌CfeCJ'77iA9)噬菌體的啟動子、鏈霉菌屬(stre/^o辺yces)啟動子、噬菌體入的i/2t啟動子、pBR322的Ah啟動子和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的CAT啟動子。對于原生啟動子已有綜述，可參閱Glick，/.Znd^j'cro^o丄1:277(1987)，Watson等人，UectLar萬icJofo/"tAeGe"e,第4版(BenjaminCummins1987)，以及Ausubel等人(1995)'適合的原核宿主包括大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。適合的大腸桿菌菌抹包括BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、DH1、DH41、DH5、DH51、DH5IF，、DH5IMCR、DH10B、DH10B/p3、DH11S、C600、HB101、JM101、JM105、JM109、JM110、K38、RR1、Y1088、Y1089、CSH18、ER1451和ER1647(參閱，例如，Brown(編輯)，扁ecWar^f0J0g7As/7/ajsr(AcademicPress1991))。適合的枯草芽孢桿菌菌抹包括BR151、YB886、MI119、MI120和B17(X參閱，例如，Hardy,"BacillusCloningMethods,"載于C7o"j./7f』尸ra"j'ca2i4涉roac力,Glover(編輯)(IRLPress1985))。在細(xì)菌，如大腸桿菌中表達(dá)TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)時，多肽可38以被保留在胞質(zhì)中，一般作為不可溶的顆粒，或者可以被細(xì)菌分泌序列引導(dǎo)進(jìn)入壁膜間隙。在前一種情況下，細(xì)胞被裂解，并且顆?；厥詹⒂美绠惲驓杷犭一螂遄冃?。然后，變性的多肽可以通過稀釋的變性劑被重新折疊和二聚化，例如用脲溶液和還原的及被氧化的谷胱甘肽組合溶液透析，接著用緩沖的鹽溶液透析.在后一種情況下，通過破裂細(xì)胞(例如超聲處理或滲透震擾)的方法，可以將多肽以溶解的并且具有功能的形式從壁膜間隙回收，以釋放壁膜間隙的內(nèi)容物并回收蛋白質(zhì)，從而排除了變性和重新折疊的必要。用原核宿主表達(dá)蛋白質(zhì)的方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知(參閱，例如，Williams等人,"ExpressionofforeignproteinsinAC(xZj'usingplasmidvectorsandpurificationofspecificpolyclonalantibodies,"載于ZW力C7o"jV^么.^y/ressj.o"5yste軀,#2應(yīng)，Glover等人(編輯)第15頁(OxfordUniversityPress1995)，Ward等人,"GeneticManipulationandExpressionofAntibodies,"載于7(/b720cJo"a7J"力j'Aof/j'es..尸2*j./3ci/Jesa/3</y4/p_/icati077s,第137頁(Wiley-Liss，Inc.1995)以及Georgiou，ExpressionofProteinsinBacteria,"栽于/!rotei/^r7^77eerj'/75v/W"ciA/es朋d戶ra"J'ce,Cleland等人(編輯)，第101頁(JohnWiley&Sons,Inc.1996)).人們已經(jīng)提供了將表達(dá)載體引入到細(xì)菌、酵母、昆蟲和植物細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如，Ausubel(1995)。人們已經(jīng)提供了用哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)生產(chǎn)表達(dá)和回收外源蛋白質(zhì)的一般方法，例如Etcheverry,ExpressionofEngineeredProteinsinMammalianCellCulture,"載于尸rotei/7f/^y/2een77f/!rj7c/pJes尸rac"ce,Cleland等人(編輯),第163頁(Wiley-Liss，Inc.1996).人們已經(jīng)提供了回收用細(xì)菌系統(tǒng)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)工藝，例如Grisshammer等人，"Purificationofover-producedproteinsfromcoh'cells,"載于ZMi467oz7i"/7g么.iExpressj.o"5>5^邁&#2廒，Glover等人(編輯)第59-92頁(OxfordUniversityPress1995)。對于分離從桿狀病毒系統(tǒng)分離重組蛋白質(zhì)的成熟方法的敘述可參閱Richardson(編輯)，"aci/7opa'/YAi;srpjress7.0/7尸rotoco7s(TheHumanaPress,Inc.1995)。或者，本發(fā)明的多肽可以通過下述方法合成，例如完全固相合成、部分固相的方法、片段縮合或傳統(tǒng)溶液合成。這些合成方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知(參閱，例如Merrifield，/.力瓜85:2149(1963)，Stewart等人，"SolidPhaseP印tideSynthesis"(第2版)，(PierceChemicalCo.1984)，Bayer和Rapp，C力e邁.尸抓Z!rot.3:3(1986)，Atherton等人，戶力ase5y/3t/esi"s.'/4Z!racti"ca7/JpproacA(IRLPress1989)，F(xiàn)ields和Colowick，"Solid—PhasePeptideSynthesis,"i^et力ocfeA/7zy邁o/o^KZo7"/z7e289(AcademicPress1997)，以及Lloyd-Williams等人，y4//_roac/stot力eSjwtAesj'sof戶e/t油朋t/尸r"e!./w(CRCPress,Inc.1997))。在全部化學(xué)合成策略中的變異，如"天然化學(xué)連接反應(yīng)"和"表達(dá)蛋白質(zhì)連接反應(yīng)"也是標(biāo)準(zhǔn)的(參閱，例如Dawson等人，5""e"ce266:776(1994)，Hackeng等人，尸roc.淑'HsdSc丄編94:7845(1997)，Dawson,淑力od/"/z，丄287:34(1997)，Muir等人，尸jtoc.艦？5"c丄S95:6705(1998)，以及Severinov和Muir，/.Sj'o丄C力e邁.273:16205(1998)).5.TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的鑒定可以用多種方法評定融合蛋白質(zhì)結(jié)合ZTNF4或ZTNF2的能力，從而檢測TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的功能。作為實(shí)例，實(shí)施例4提供了測定ZTNF4結(jié)合親和力和結(jié)合能力的方法。或者，如Gross等人在國際專利申請No.WO00/40716中所述的，TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)可以用抑制由可溶ZTNF4對人B細(xì)胞的激活的能力而表征。筒單地說，根據(jù)制造商的說明書，使用CD19磁珠和VarioMacs磁性分離系統(tǒng)(MiltenyiBiotecAuburn,CA)，將人B細(xì)胞從外周血單核細(xì)胞中分離。將B細(xì)胞與可溶的ZTNF4(25ng/ml)和重組的人IL-4(10ng/mlPharmingen)混合，將該細(xì)胞以每個孔1x105細(xì)胞數(shù)鋪到圓底96孔板上?？梢詫⒖扇艿腡ACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)從大約5ng/ml稀釋到大約6ng/ml，然后與B細(xì)胞一起孵育五天，在第四天對每孔用1mCi3H-胸苷脈沖過夜。作為對照，在沒有ZTNF4的情況下，也將TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)與B細(xì)胞和IL-4一起終育。用Packard平板收獲器將平板收獲，并用Packard讀數(shù)器計數(shù)。這種通用方法被用于測定三種TACI-Fc融合蛋白質(zhì)。雖然，所有融合蛋白質(zhì)都抑制B細(xì)胞增殖，但是構(gòu)建體TACI(dl-29，dll1-154)-Fc5和TACI(dl-29，dl20-154)-Fc5比TACI(dl-29，dl07-154)-Fc5更有效。已有成熟的動物模型可以用來體內(nèi)測試在一定疾病狀態(tài)下TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)的效率.例如，可以用TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)在一些自身免疫疾病的動物模型中進(jìn)行測試，例如，作為SLE(系統(tǒng)性紅斑狼瘡)的模型的MRL-力r/7pr或NZBxNZWFl鼠同類品系。上述動物模型為本領(lǐng)域已知(參閱，例如，Cohen和Miller(編輯)，yluto!'咖W7e"j.s朋seifof/eJs.'爿(7ujfVe6oo/:(AcademicPress,Inc.1994))。新西蘭黑鼠(NZB)和新西蘭白鼠(NZW)之間雜交的后代發(fā)育成為十分類似人類的SLE的自發(fā)形式的SLE。后代鼠，稱為NZBW,在一個月齡時開始產(chǎn)生針對T細(xì)胞的IgM自身抗體，至五到七個月齡抗DNA自身抗體是占優(yōu)勢的免疫球蛋白。多克隆B細(xì)胞的過度活化導(dǎo)致自身抗體的超量產(chǎn)生。該自身抗體，尤其是那些針對單鏈DNA的抗體的積累，與腎小球腎炎的發(fā)生相關(guān)，它在臨床上的表現(xiàn)為蛋白尿、氮質(zhì)血癥以及因腎衰竭而死亡。腎衰竭是導(dǎo)致受自發(fā)SLE影響的小鼠死亡的最主要原因，在NZBW品系中，該過程是慢性的和消除性的，該病在雌鼠中比在雄鼠中更急且重，平均存活時間與雄鼠的406天相比僅為245天.雖然在7到9個月齡時許多雌鼠將出現(xiàn)癥狀(蛋白尿)，但是一些雌鼠發(fā)生癥狀時可以更年輕或更老。在NZBW鼠中觀察到的致命的免疫性腎炎與在人的SLE中觀察到的腎小球腎炎相類似，使得該自發(fā)型鼠模型對于潛在的SLE治療測試非常具有吸引力(Putterman和Naparstek，MurineModelsofSpontaneousSystemicLupusErythematosus,"載于」wtoJ.鵬weZiseaseifoo^/s..爿GwjVe600A^第217—234頁(AcademicPress,Inc.,1994);Mohan等人，/.154:1470(1995):以及Daikh等人，//邁邁w20丄159:3104(1997))。如Gross等人在國際專利申請No.WO00/40716中所述，當(dāng)NZBW鼠中B細(xì)胞自身抗體的產(chǎn)生被認(rèn)為是平均處于高水平時，可以將TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)向NZBW鼠給藥，以監(jiān)測其在5周時間內(nèi)對B細(xì)胞的抑制效果.簡單地說，可以將100只8周大的雌性(NZBxNZW)R鼠分成六組，每組15只。治療前，一個月一次監(jiān)測鼠的尿蛋白，抽血作全血細(xì)胞計數(shù)和血清庫.血清可以用來對自身抗體的存在進(jìn)行篩查。因?yàn)榈鞍啄蚴悄I小球腎炎的標(biāo)志征象，所以在研究過程中一直以一定的間隔用試紙監(jiān)測尿蛋白水平。在鼠大約為5個月齡時可以開始治療。在5周內(nèi)一周三次，對鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射僅有載體(磷酸緩沖鹽水)或人TACI-免疫球蛋白(對照蛋白質(zhì))或TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)(例如每次給藥20到100Mg測試蛋白質(zhì))。在治療期間采血兩次，并且在治療以后將至少采集兩次。在治療開始后每兩周測定蛋白尿的尿試紙檢測值和體重。在安樂死的時候，采集血、尿的試紙檢測值和體重。將脾和胸腺分割以用于熒光活化的細(xì)胞的分類分析和組織學(xué)研究.也將頜下唾液腺、腸系膜淋巴結(jié)鏈、帶膽嚢的肝葉、盲腸和大腸、胃、小腸、胰腺、右腎、腎上腺、舌與氣管和食管一起、心臟以及肺采集用于組織學(xué)研究.實(shí)驗(yàn)變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎的鼠模型，已經(jīng)用來作為研究免疫介導(dǎo)的疾病的機(jī)理和潛在治療干預(yù)方法二者的工具。該模型類似人的多發(fā)性硬化，并且作為神經(jīng)蛋白，如髓鞘堿性蛋白或蛋白脂質(zhì)蛋白，對T細(xì)胞激活的結(jié)果而產(chǎn)生脫髓鞘作用。用抗原接種誘導(dǎo)CD4+、n型MHC-限制的T細(xì)胞(Thl)。在對于實(shí)驗(yàn)變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎的方案中的改變42可以產(chǎn)生該模型的急性、慢性復(fù)發(fā)性或者被動轉(zhuǎn)移的變體(Weinberg等人，//鵬朋o丄162:1818(1999):Mijaba等人，/咖"/o丄186:94(1999);以及Glabinski，f/^"瓜288:182(1997))。Gross等人在國際專利申請No.W000/40716中敘述了一種方法，用以評價在與實(shí)驗(yàn)變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎相關(guān)的癥狀的改善中TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)的效果。筒單地說，給25只雌性PLxS幾Fl小鼠(12周齡)皮下注射配有完全弗氏佐劑的抗原(髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白，PLP，殘基139-151)125Mg/鼠。將該鼠分為五組，每組五只鼠。在0和2天給與百日咳毒素的腹膜內(nèi)注射。給這些組lx、10x或100x劑量的TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)，一組將僅接受載體，而另一組將不進(jìn)行治療。預(yù)防性治療在0天開始，干預(yù)性治療在7天或臨床征象出現(xiàn)時開始進(jìn)行，在大約10到14天疾病征象，體重下降和麻痹出現(xiàn)，并持續(xù)大約一周。每天通過稱體重和給予與它們癥狀程度相應(yīng)的臨床評分來評價動物。實(shí)驗(yàn)變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎的臨床征象在接種的10到14天內(nèi)出現(xiàn)，并且持續(xù)大約一周.在研究的最后，用過量的氣體對全部動物進(jìn)行安樂死，之后尸檢。采集腦和脊柱用于組織學(xué)研究或冷凍腦和脊柱用于mRNA分析。對體重和臨床評分的數(shù)據(jù)以個體和分組繪出曲線.在膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中，小鼠患有慢性炎癥性關(guān)節(jié)炎，它非常類似人的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。因?yàn)槟z原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎共有相似的免疫學(xué)和病理學(xué)特性，這使得它對于篩選潛在的人抗炎癥化合物是理想的模型。在應(yīng)用膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中的另一個優(yōu)點(diǎn)是，其病理機(jī)理已知。在II型膠原上的T和B細(xì)胞表位已經(jīng)確定，同時，多種與免疫介導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的免疫學(xué)(遲發(fā)型過敏反應(yīng)和抗膠原蛋白抗體)和炎癥(細(xì)胞因子、趨化因子和基質(zhì)降解酶)相關(guān)的參數(shù)巳經(jīng)確定，并且可以應(yīng)用于評定模型中測試化合物的效果(Wooley，C。/j.仏朋e咖.3:407(1999);Williams等人，/咖w/70丄89:9784(1992);Myers等人，h./e5"c六61:1861(1997);以及Wang等人，92:8955(1995))。Gross等人在國際專利申請No.WO00/40716中敘述了一種方法，用以評價在與膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎相關(guān)癥狀的改善中TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)的效果。簡單地說，將8周大雄性DBA/1J鼠(JacksonLabs)分組為5只/組，每隔三周地進(jìn)行兩次50到100pl的lmg/ml的膠原蛋白(小雞或牛來源)皮下注射。一組對照組不進(jìn)行膠原蛋白注射.第一次注射配有完全弗氏佐劑，而第二次注射配有不完全弗氏佐劑。在第二次注射時或在第二次注射之前、或者在動物出現(xiàn)了二或更高的臨床評分并持續(xù)至少24小時之后，將TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)預(yù)防性地給藥。在第二次膠原蛋白注射之后，通常在2到3周內(nèi)，動物開始出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎的癥狀。例如，TACI-Fc、對照蛋白質(zhì)、人IgFc、或磷酸緩沖鹽水(載體)可以在第二次注射前7天(第7天)開始用于預(yù)防性的給藥。蛋白質(zhì)可以100Pg給藥，以200pl—周三次給藥，并且連續(xù)4周。在膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中，用游標(biāo)卡尺對每一個爪測量爪的厚度，并且對每一個爪給予臨床評分，以評價疾病的程度。例如，臨床評分為"0"表示正常鼠，評分為"1"表示1或多個趾有紅腫，評分為"2"表示輕度爪部炎癥，評分為"3"表示中度爪部炎癥，評分為"4"表示嚴(yán)重爪部炎癥.在患病一段的時間后，通常為7天之后，對動物施行安樂死。采集爪，進(jìn)行組織學(xué)研究或mRNA分析。采集血清，進(jìn)行免疫球蛋白和細(xì)胞因子測定。重癥肌無力是另一種自身免疫疾病，其鼠模型也可以得到.重癥肌無力是涉及產(chǎn)生針對煙堿乙酰膽堿受體的自身抗體的神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)疾病失調(diào).該疾病是獲得性的或遺傳性的，有著包括活動后異常乏力和疲勞的臨床特征.重癥肌無力的鼠模型已經(jīng)被建立.(Christadoss等人，"EstablishmentofaMouseModelofMyastheniagravisWhichMimicsHumanMyastheniagravidPathogenesisforImmuneIntervention,"載于/咖u"oZ^.CLZo^yojf尸2^tei/2sa/2^尸e/"VesAtassi和Bixler(編輯)，第195-199頁(1995))。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力是抗體介導(dǎo)的疾病，其特征在于針對乙酰膽堿受體的抗體的存在。該抗體破壞受體導(dǎo)致有缺陷的神經(jīng)肌肉電脈沖，引起肌肉乏力。在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力模型中，用煙堿乙酰膽堿受體免疫鼠。在第二次免疫后數(shù)周重癥肌無力的臨床征象變得明顯。評價實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力有若干方法，包括用放射免疫試驗(yàn)測定乙酰膽堿受體抗體的血清水平(Christadoss和Dauphinee，/J鵬w/70丄136:2437(1986);Lindstrom等人，#et/oo^^>7^"銜丄74:432(1981))、測定肌肉乙酰膽堿受體或肌電描記術(shù)(Coligan等人(編輯)，尸ro&ca7si/z/咖歸*,"丄&第15.8.1頁(JohnWiley&Sons,1997))。TACI-免疫球蛋白在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力方面的效果可以通過對臨床上正在進(jìn)展重癥肌無力期間的B6鼠中應(yīng)用融合蛋白質(zhì)來測定。例如，給100只B6鼠在0天和30天用配以完全弗氏佐劑的乙酰膽堿受體20Pg進(jìn)行免疫。用乙酰膽堿受體強(qiáng)化之后，大約40到60%的小鼠發(fā)生從中度(2級)到重度(3級)臨床重癥肌無力。將患有2級和3級臨床疾病的鼠分為三組(有著相等的乏力級別)，之后稱重(乏力的鼠體重也減輕,因?yàn)樗鼈冊诓墒呈澄锖退畷r有困難)和采血以獲得血清(為得到治療前抗乙酰膽堿受體抗體和同種型水平)。給A組1.P注射磷酸緩沖鹽水，對B組腹膜內(nèi)注射人IgG-Fc作為對照蛋白(100Mg)，給C組用100ngTACI-Fc注射，一周三次持續(xù)四周.對鼠進(jìn)行一周兩次的在臨床肌肉乏力方面的篩選，并且在治療開始后15天和30天稱重并采血以獲得血清，在第15天采集全血，采用標(biāo)記B220和CD5通過熒光活化細(xì)胞分選儀分析以測定T/B細(xì)胞之比.在治療開始后30到45天將存活的鼠殺死，將其尸體冷凍，用于以后的肌肉乙酰膽堿受體提取，以測定肌肉乙酰膽堿受體的損失情況，這是重癥肌無力的基本病理(參閱，例如，Coligan等人。(編輯)，尸rotoco7sj'力/鵬w7^o^r.第15,8.1頁(JohnWiley&Sons,1997)).針對鼠肌肉乙酰膽堿受體的血清抗體可以通過確立的放射免疫試驗(yàn)法測定，同時抗乙酰膽堿受體的抗體同種型(IgM、IgGl、IgG2b和45IgG2c)用ELISA檢測。上述方法是已知的。測定TACI-免疫球蛋白對正在進(jìn)展的臨床重癥肌無力、抗乙酰膽堿受體抗體和同種型水平、以及肌肉乙酰膽堿受體損失方面的效果?？梢詫⒋蠹s100只鼠在0天和30天用配以完全弗氏佐劑的乙酰膽堿受體20pg進(jìn)行免疫。將患有臨床重癥肌無力的鼠分為四組。A組用100pg對照Fc進(jìn)行腹膜內(nèi)注射，B組用20ng對照Fc進(jìn)行注射，C組用IOOygTACI-Fc注射，以及D組用20pgTACI-Fc注射，一周三次持續(xù)四周。在治療開始之前和治療開始之后15天和30天，給鼠稱重和采血以獲得血清.如上面敘述的，測試血清中的抗乙酰膽堿受體抗體和同種型。也可以檢測肌肉乙酰膽堿受體損失。TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的其它適合的測定，可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定。6.TACI-免疫球蛋白綴合物的生產(chǎn)本發(fā)明包括化學(xué)修飾的TACI-免疫球蛋白組合物，其中的TACI-免疫球蛋白多肽與聚合物相連接.一般該聚合物是水溶性的，因此在水性環(huán)境中，如生理環(huán)境中，TACI-免疫球蛋白綴合物不沉淀。適合的聚合物的實(shí)例是已經(jīng)修飾過的具有單個反應(yīng)基團(tuán)的聚合物，例如用于酰化作用的活性酯、或用于烷化的醛。這樣，聚合反應(yīng)的程度可以被控制。活性醛的實(shí)例是聚乙二醇丙醛、或單-(d-d。)烷氧基、或其芳氧基衍生物(參閱，例如，Harris等人，美國專利No.5,252,714).聚合物可以是支鏈或非支鏈.此外，聚合物的混合物可以用于生產(chǎn)TACI-免疫球蛋白的綴合物.用于治療的TACI-免疫球蛋白的綴合物可以含有制藥上可接受的水溶性聚合物部分。適合的水溶性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、單甲氧基-PEG、單-(d-C,。)烷氧基-PEG、芳氧基-PEG、多-(N-乙烯基吡咯烷酮)PEG、tresyl單甲氧基PEG、PEG丙醛、二琥珀酰碳酸酯PEG、丙二醇均聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、右旋糖、纖維素、或其它以碳水化合物為基礎(chǔ)的聚合物.適合的PEG具有的分子量可以從大約600到60，000,包括，例如5,000、12,000、20，000和25，000,TACI-免疫球蛋白的綴合物也可以含有上述水溶性聚合物的混合物。一個TACI-免疫球蛋白的綴合物的實(shí)例含有TACI-免疫球蛋白部分和附在TACI-免疫球蛋白N-末端的聚烷基氧化物部分。PEG是一種適合的聚烷基氧化物。作為實(shí)例，可以用PEG,即被稱為"PEG化(PEGylation)"的過程來修飾TACI-免疫球蛋白。TACI-免疫球蛋白的PEG化可以采用本領(lǐng)域已知的任何一種PEG化反應(yīng)進(jìn)行(參閱，例如，歐洲專利EP0154316，Delgado等人，CritJ'ca7/ew'e『si/7^erapew"c"rugCarri"er5yste邁s9:249(1992)，Duncan和Spreafico,d尸/a，coA"j'72",27:290(1994)，以及Francis等人，/〃柳ato768:1(1998))。例如，PEG化可以用活性聚乙二醇分子通過?；磻?yīng)或烷基化反應(yīng)進(jìn)行。在另一種供選擇的方法中，TACI-免疫球蛋白的綴合物用縮合活性的PEG來形成，其中PEG的末端羥基或氨基基團(tuán)已經(jīng)被活化的連接體所替換(參閱，例如，Karasiewicz等人，美國專利No.5,382,657)。通過?；瘉鞵EG化，一般需要將PEG的活化酯的衍生物與TACI-免疫球蛋白多肽反應(yīng)。一個活化PEG酯的實(shí)例是以N-羥基琥珀酰亞胺酯化的PEG。如本文所使用的，術(shù)語"?；磻?yīng)"包括下列在TACI-免疫球蛋白和水溶性聚合物之間的連接類型酰胺、氨基甲酸酯、聚氨酯等等。通過酰化來制備PEG化的TACI-免疫球蛋白的方法一般包含步驟(a)在一個或多個PEG基團(tuán)附著在TACI-免疫球蛋白上的條件下將TACI-免疫球蛋白多肽與PEG(如PEG醛衍生物的活性酯)反應(yīng)，以及(b)獲得反應(yīng)產(chǎn)物。通常，對于?；磻?yīng)的最佳反應(yīng)條件將根據(jù)已知的參數(shù)和期望的結(jié)果來確定。例如，PEG:TACI-免疫球蛋白的比越大，多PEG化的TACI-免疫球蛋白產(chǎn)物的百分比越大。通過酰化得到的PEG化的產(chǎn)物一般是多PEG化的TACI-免疫球蛋白產(chǎn)物，其中賴氨酸s-氨基基團(tuán)借助于?；B接基團(tuán)被PEG化。連接鍵的實(shí)例是酰氨。一般，所得到的TACI-免疫球蛋白將至少95%被單、二或三PEG化，雖然根據(jù)反應(yīng)條件可以生成具有PEG化程度較高的某些種類。采用標(biāo)準(zhǔn)提純方法，例如透析、超濾、離子交換層析、親和層析等等，可以將PEG化的種類從未綴合的TACI-免疫球蛋白多肽中分離。通過烷基化進(jìn)行PEG化一般包括，在還原劑的存在下，將PEG末端醛衍生物與TACI-免疫球蛋白反應(yīng)。借助于"CH2-NH基團(tuán)，PEG基團(tuán)可以附著在多肽上。借助于還原性烷基化作用來生產(chǎn)單PEG化的產(chǎn)物的衍化可以利用不同類型的伯氨基的不同活性來衍化。一般，在允許利用賴氨酸殘基e-氨基基團(tuán)和蛋白質(zhì)N末端殘基a-氨基基團(tuán)之間pKa差異的pH值下進(jìn)行反應(yīng)。通過上述選擇性的衍化，含有像醛這樣的活性基團(tuán)的水溶性聚合物與蛋白質(zhì)的附著是可控制的。與聚合物的綴合主要發(fā)生在蛋白質(zhì)的N-末端，而沒有對其他活性基團(tuán)如賴氨酸側(cè)鏈氨基基團(tuán)的顯著修飾。本發(fā)明提供了TACI-免疫球蛋白單聚合物綴合物的基本均一的制備物.以還原性烷基化作用生產(chǎn)單聚合物TACI-免疫球蛋白綴合分子的基本均一的集合可以包含步驟(a)在還原性烷基化作用的條件下以選擇性修飾TACI-免疫球蛋白氨基末端的ot-氨基基團(tuán)的適合的pH值，使TACI-免疫球蛋白多肽與活性PEG反應(yīng)，和(b)獲得反應(yīng)產(chǎn)物.用于還原性烷基化作用的還原劑在水溶液中應(yīng)該是穩(wěn)定的，并且具有僅還原在還原性烷基化作用的起始過程中形成的希夫堿的能力。例證的還原劑包括硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、硼烷二甲胺、硼烷三甲胺和硼烷砒咬。對于TACI-免疫球蛋白單聚合物綴合物的基本均一的集合，還原性烷基化反應(yīng)條件是使得水溶性聚合物部分與TACI-免疫球蛋白N-末端選擇性地附著的條件。該反應(yīng)條件通常根據(jù)賴氨酸氨基基團(tuán)和在N-末端的ct-氨基基團(tuán)之間pKa差異而提供。pH值也影響所用得聚合物與蛋白質(zhì)的比。一般說來，如果pH值較低，將希望聚合物對于蛋白質(zhì)是更大量地過量，因?yàn)镹-末端a-基團(tuán)的活性越低，越需要較多的聚合物來實(shí)現(xiàn)最佳條件。如果pH值較高，聚合物TACI-免疫球蛋白比則不需要這么大，因?yàn)橛休^多的活性基團(tuán)可用而。一般，將pH值落在3到9或者3到6之間。另一個要考慮的因素是水溶性聚合物的分子量。通常，聚合物的分子量越高，可以附著在蛋白質(zhì)上的聚合物分子的數(shù)量越少。對于PEG化反應(yīng)，一般的分子量是大約2kDa到大約100kDa、大約5kDa到大約50kDa或者大約12kDa到大約25kDa。通常水溶性聚合物對TACI-免疫球蛋白的摩爾比將在1:1到100:1。一般，水溶性聚合物對TACI-免疫球蛋白的摩爾比，對于多PEG化反應(yīng)在1:1到20:1，而對于單PEG化反應(yīng)則在1:1到5:1'生產(chǎn)包含多肽和水溶性聚合物部分的綴合物的通用方法在本領(lǐng)域是已知的。(可參閱，例如，Karasiewicz等人，美國專利No.5，382,657，Greenwald等人，美國專利No.5,738,846，Nieforth等人，67i/z.f力er.59:636(1996)，Monkarsh等人，^朋丄^foc力e瓜247:434(1997))。本發(fā)明設(shè)想的組合物包含本文所述的肽或多肽。上述組合物可以進(jìn)一步包含載體。該載體可以是傳統(tǒng)的有機(jī)或無機(jī)載體。載體的實(shí)例包括水、緩沖溶液、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、玉米油等等。7.TACI-免疫球蛋白多肽的分離就大分子污染而論，尤其就其它蛋白質(zhì)和核酸以及不含傳染性的和致熱性的物質(zhì)而論，本發(fā)明的多肽可以被提純到至少大約80%純度、至少大約90%純度、至少大約95%純度、或者大于95%純度。本發(fā)明的多肽亦可以被提純到藥品純的狀態(tài)，即純度大于99.9%。在某些制劑中，純化的多肽基本上不含有其它多肽，尤其其它動物來源的多肽。分級法和/或傳統(tǒng)的純化方法可以用于獲得合成的TACI-免疫球蛋白多肽和從重組宿主細(xì)胞純化的重組TACI-免疫球蛋白多肽的制劑。一般說來，疏酸銨沉淀和酸或離液劑提取可以用于樣品的分級.典型的純化步驟可以包括羥磷灰石、大小排阻、FPLC和反相高效液相色譜。適合的層析介質(zhì)包括衍生的右旋糖、瓊脂糖、纖維素、聚丙烯酰胺、專門的珪等等。PEI、DEAE、QAE和Q的衍生物是適合的。典型的層析49介質(zhì)包括用苯基、丁基或辛基基團(tuán)衍生的，如苯基-S印haroseFF(Pharmacia)、Toyopearl丁基650(TosoHaas,Montgomeryville，PA)、辛基-S印harose(Pharmacia)等等；或者聚丙烯酸樹脂，如AmberchromCG71(TosoHaas)等等。適合的固體支持物包括玻璃珠、硅基樹脂、纖維素樹脂、瓊脂糖珠、交聯(lián)的瓊脂糖珠、聚苯乙烯珠、交聯(lián)的聚丙烯酰胺樹脂以及在其使用條件下不溶的類似物。該支持物可以用允許蛋白質(zhì)以氨基基團(tuán)、羧基基團(tuán)、巰基基團(tuán)、羥基基團(tuán)和/或糖類部分附著的活性基團(tuán)修飾。偶聯(lián)化學(xué)的實(shí)例包括溴化氰激活、N-幾基琥珀酰胺激活、環(huán)氧化物激活、巰基激活、酰肼激活、以及對于碳化二亞胺偶聯(lián)化學(xué)的羧基和氨基衍生物。在本領(lǐng)域中，這些及其它固體介質(zhì)是熟知并被廣泛采用的，同時可以從商品供應(yīng)商那里得到。多肽分離和純化的特殊方法的選擇是常規(guī)設(shè)計的問題，并且部分地由所選的支持物的特性來決定?？蓞㈤啠?，i4/!fi/2_z'tyCAro邊ato^rap/y.'尸rj'/ci"/^es<S#et/oofe(PharmaciaLKBBiotechnology1988)，和Doon叫ProteinPurificationProtocols(TheHumanaPress1996)。在TACI-免疫球蛋白的分離和純化中附加的變化可以被本領(lǐng)域的技術(shù)人員設(shè)計出來。例如，抗-TACI或抗-Fc抗體可以通過免疫親和純化用于分離大量的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的多肽也可以通過特殊性質(zhì)的利用來分離.例如，固定化的金屬離子吸附層析可以用于純化富含組氨酸的蛋白質(zhì)，包括那些包含多組氨酸標(biāo)記物的。簡單地說，凝膠首先被用二價金屬離子充滿以形成螯合物(Sulkowski，rre;j(/s5j'oc力e邁.3:1(1985)).富含組氨酸的蛋白質(zhì)，將根據(jù)所用金屬離子以不同親和性，被吸附到該基質(zhì)，之后，用竟?fàn)幮韵疵?、降低pH值、或者強(qiáng)螯合劑的使用，來將其洗脫.其他純化方法包括，通過凝集素親和層析、蛋白質(zhì)A層析、以及離子交換層析進(jìn)行糖基化蛋白質(zhì)的純化(M.Deutscher，(編輯)，iet力.《W加丄182:529(1990))。如上所述，TACI-免疫球蛋白多肽或者其片段也可以通過化學(xué)合成來制備。TACI-免疫球蛋白多肽可以是單體或聚合物；糖基化的或非糖基化的；PEG化的或非PEG化的；并且可以包括或可以不包括起始的甲疏氨酸氨基酸殘基。TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)可以是非糖基化的、糖基化的、或者僅在TACI部分或僅在免疫球蛋白部分糖基化的。免疫球蛋白部分可以從人抗體、嵌合抗體、或人源化的抗體獲得.8.TACI-免疫球蛋白多肽的治療應(yīng)用通過結(jié)合ZTNF4或ZTNF2，TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)可以用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，這樣，阻止這些配體與內(nèi)源TACI或BCMA受體的結(jié)合。因此，本發(fā)明包括，TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)在缺少足夠數(shù)量的TACI或BCMA的受體或產(chǎn)生過量的ZTNF4或ZTNF2的受治療者中的應(yīng)用，這些分子可以對那些需要治療的任何受治療者給藥，并且本發(fā)明設(shè)想了獸醫(yī)的和人的治療應(yīng)用兩個方面。實(shí)例的受治療者包括哺乳動物的受治療者，例如，農(nóng)畜、家畜和人的患者。TACI-免疫球蛋白多肽可以應(yīng)用于治療以下疾病自身免疫疾病、B細(xì)胞癌、免疫調(diào)節(jié)、IBD和任何抗體介導(dǎo)的病狀(例如ITCP、重癥肌無力等等)、腎臟疾病、間接T細(xì)胞免疫應(yīng)答、移植排斥、以及移植物對抗宿主的病。本發(fā)明的多肽可以在免疫應(yīng)答期間以特異性調(diào)節(jié)B細(xì)胞應(yīng)答為目標(biāo)，另外，本發(fā)明的多肽可以用于調(diào)節(jié)B細(xì)胞發(fā)育、其它細(xì)胞的發(fā)育、抗體產(chǎn)生和細(xì)胞因子產(chǎn)生。本發(fā)明的多肽也可以通過中和ZTNF4的增殖效應(yīng)來調(diào)節(jié)T和B細(xì)胞的通訊。本發(fā)明的TACI-免疫球蛋白多肽可以用于中和ZTNF4的效應(yīng)，以治療下述疾病，對于它們ZTNF4多肽增加是相關(guān)聯(lián)的前B細(xì)胞或B細(xì)胞白血病，例如漿細(xì)胞白血病、慢性或急性淋巴細(xì)胞白血??；骨髓瘤，例如多發(fā)性骨髓瘤、漿細(xì)胞骨髓瘤、內(nèi)皮性骨髓瘤和巨細(xì)胞骨髓瘤；以及淋巴瘤，例如非霍奇金淋巴瘤。ZTNF4是在CD8+細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞、活化的單核細(xì)胞中表達(dá)的，其表明，在某種自身免疫疾病中，細(xì)胞毒性T細(xì)胞可以通過ZTNF4的過度產(chǎn)生刺激B細(xì)胞產(chǎn)生。選擇性阻斷B淋巴細(xì)胞活動的免疫抑制蛋白質(zhì)將被用于治療疾病。自身抗體的產(chǎn)生為若干自身免疫疾病所共有，并且促進(jìn)組織破壞和疾病加重。自身抗體也可以導(dǎo)致免疫復(fù)合物沉積并發(fā)癥的發(fā)生，和導(dǎo)致許多系統(tǒng)性紅斑狼疳的癥狀，包括腎衰竭、神經(jīng)痛癥狀和死亡。調(diào)節(jié)不依賴細(xì)胞應(yīng)答的抗體的產(chǎn)生在許多疾病狀態(tài)下也將是有益的。B細(xì)胞也已經(jīng)顯示出，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的關(guān)節(jié)炎性的免疫球蛋白的分泌作用中起作用。因此，抑制ZTNF4抗體的產(chǎn)生，將有益于自身免疫疾病的治療，例如重癥肌無力、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多關(guān)節(jié)型青少年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎。像TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)這樣的選擇性地阻斷或中和B淋巴細(xì)胞的活動的免疫抑制劑治療將應(yīng)用于上述目的本發(fā)明提供用TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)選擇性阻斷或中和與晚期腎病相關(guān)的B淋巴細(xì)胞活動的方法，其中所述腎病可以與或者不與自身免疫疾病相關(guān)。上述方法也將應(yīng)用于治療免疫性腎病。上述方法將應(yīng)用于治療腎小球腎炎，后者與例如膜性腎病、IgA腎病或貝惹病、IgM腎病、古德帕斯徹病、感染后腎小球腎炎、腎小球系增生性疾病，慢性淋巴細(xì)胞白血病、微小病變型腎病綜合癥的疾病相關(guān)。上述方法也用作為治療與例如狼掩、多動脈炎、Henoch-Schonlein病、硬皮病、HIV相關(guān)疾病、淀粉樣變或溶血性尿毒癥的疾病相關(guān)的繼發(fā)性腎小球腎炎或血管炎的治療應(yīng)用。本發(fā)明的方法也用于作為治療與慢性腎盂腎炎、止痛藥濫用、腎鈣質(zhì)沉著相關(guān)的間質(zhì)性腎炎或腎盂腎炎、或由其它因素引起的腎病、腎結(jié)石、或者慢性或急性間質(zhì)性腎炎的治療應(yīng)用的組成部分。本發(fā)明的方法還包括TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)在治療高血壓或大血管病中的應(yīng)用，包括腎動脈狹窄或阻塞和膽固醇栓塞或腎栓塞。本發(fā)明還提供了治療以下疾病的方法，如腎或泌尿系統(tǒng)腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、輕鏈神經(jīng)病或淀粉樣變。本發(fā)明還提供了用TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)阻斷或抑制活化的B細(xì)胞以治療哮喘和慢性呼吸道疾病，如支氣管炎和肺氣腫的方法。本文所述的TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)也可以用于治療斯那格倫綜合癥.還提供了用TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)抑制或中和效應(yīng)子T細(xì)胞應(yīng)答的方法，以用于免疫抑制，尤其是在對于移植物對抗宿主疾病和移植排斥的治療中應(yīng)用.此外，對于象胰島素依賴性糖尿病(IDDM)和克羅恩氏病這樣的自身免疫性疾病的治療，TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)在治療方案中有益。對于治療慢性炎癥疾病，尤其對于減輕關(guān)節(jié)痛、腫脹、貧血和其它相關(guān)癥狀以及治療敗血癥性休克，本發(fā)明的方法將具有額外的治療價值。成熟的動物模型可用于體內(nèi)測試在某種疾病狀態(tài)下，本發(fā)明的TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)的效果。特別是，TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)可以用許多的自身免疫性疾病的動物模型進(jìn)行體內(nèi)測試，例如MRL-7/7r/Z/7r或NZBxNZWFl鼠同類品系，其作為SLE(系統(tǒng)性紅斑狼瘡)的模型。這些動物模型在本領(lǐng)域是已知的。新西蘭黑鼠(NZB)和新西蘭白鼠(NZW)之間雜交的后代發(fā)育為非常類似人類SLE的SLE的自發(fā)形式。后代鼠，稱為NZBW，在一個月齡開始產(chǎn)生針對T細(xì)胞的IgM自身抗體，并且至5到7個月齡時，Ig抗DNA自身抗體是占優(yōu)勢的免疫球蛋白。多克隆的B細(xì)胞過度激活導(dǎo)致自身抗體的過度產(chǎn)生。該自身抗體、尤其針對單鏈DNA的抗體的沉積，與腎小球腎炎的發(fā)展相關(guān)，它臨床上表現(xiàn)為蛋白尿、氮血癥以及因腎衰竭而死亡。腎衰竭是導(dǎo)致受自發(fā)SLE影響的鼠死亡的最主要原因，在NZBW品系中，該過程是慢性的和消除性的。該病在雌鼠中比在雄鼠更急且嚴(yán)重，平均存活時間與雄鼠的406天相比僅為245天。雖然在7到9個月齡時許多雌鼠將出現(xiàn)癥狀(蛋白尿)時，但是一些雌鼠發(fā)生癥狀時可以更年輕或更老。在NZBW鼠中觀察到的致命免疫性腎炎與在人的SLE中觀察到的腎小球腎炎相類似，使得該自發(fā)型鼠模型對于潛在的SLE治療測試有用。實(shí)驗(yàn)變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)的鼠模型，已經(jīng)用來作為研究免疫介導(dǎo)的疾病的機(jī)理和潛在治療干預(yù)方法二者的工具。該模型類似人的多發(fā)性硬化，并且作為神經(jīng)蛋白，如髓鞘堿性蛋白(MBP)或蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP),對T細(xì)胞激活的結(jié)果而產(chǎn)生脫髓鞘作用.用抗原接種導(dǎo)致CD4+、n型MHC-限制的T細(xì)胞(Thl)的誘導(dǎo)。在對于EAE的方案中的改變可以產(chǎn)生該模型的急性、慢性復(fù)發(fā)性或者被動轉(zhuǎn)移的變體。在膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)模型中，鼠患有慢性炎癥性關(guān)節(jié)炎，它非常類似人的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)。因?yàn)镃IA與RA共有相似的免疫學(xué)和病理學(xué)特性，這使得它對于篩選潛在的人抗炎癥化合物是理想的模型。應(yīng)用CIA模型的另一個優(yōu)點(diǎn)是，其病理機(jī)理已知。在II型膠原上的T和B細(xì)胞表位已經(jīng)確定，同時，多種與免疫介導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎相關(guān)的免疫學(xué)(遲發(fā)型過敏反應(yīng)和抗膠原蛋白抗體)和炎癥(細(xì)胞因子、趨化因子和基質(zhì)降解酶)參數(shù)已經(jīng)確定，并且可以應(yīng)用于評定模型中測試化合物的效果。重癥肌無力(MG)是可以得到其鼠模型的另一種自身免疫疾病。MG是涉及產(chǎn)生針對煙堿乙酰膽堿受體(AChR)的自身抗體的神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)疾病。MG是獲得性的或遺傳性的，有著包括活動后異常乏力和疲勞的臨床特征.MG的鼠模型已經(jīng)被確立。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)是抗體介導(dǎo)的疾病，其特征在于針對AChR的抗體的存在。該抗體破壞受體，導(dǎo)致有缺陷的神經(jīng)肌肉電脈沖，引起肌肉乏力。在EAMG模型中，用煙堿乙酰膽堿受體給鼠免疫。在第二次免疫后數(shù)周，MG的臨床征象變得明顯.評價EAMG有若干方法，包括用放射免疫試驗(yàn)測定AChR抗體的血清水平、測定肌肉AChR或肌電描記術(shù)。通常，TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)的給藥劑量將依據(jù)像受治療者的年齡、體重、身高、性別、總體健康條件和既往的醫(yī)療歷史這樣的因素而不同。一般，理想的是提供在大約1pg/kg到10mg/kg(藥量/受治療者體重)范圍內(nèi)的一定劑量的TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)劑量給受治療者，雖然依據(jù)情況也可以以較低或較高的劑量給藥.對受治療者進(jìn)行TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)給藥可以是靜脈內(nèi)的、動脈內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、皮下的、胸膜內(nèi)的、鞘內(nèi)的、通過一個局部導(dǎo)管灌注、或病損內(nèi)部直接注射.在以注射的方式給藥治療性的蛋白質(zhì)時，可以以連續(xù)注入或者以單或多次的劑量給藥。給藥的其他途徑包括口服的、粘膜、肺的和透皮的?？诜o藥適合于聚脂徵球體(microsphere)、玉米醇溶蛋白微球體、類蛋白質(zhì)微54球體、多氰基丙烯酸酯微球體以及基于脂質(zhì)的系統(tǒng)(可參閱，例如，DiBase和Morrel，"OralDeliveryofMicroencapsulatedProteins,"載于尸rotej'/z"eJ!Ver7.'尸力ysj'caJ5yste邁s,Sanders和Hendren(編輯)，第255-288頁(PlenumPress1997))。通過像胰島素給藥的模式，說明了鼻內(nèi)給藥的可行性(可參閱，例如，Hinchcliffe和Illum，」^M"77;《Zeh>.;eF.35:199(1999)),包含TACI-免疫球蛋白的干燥的或液體的顆粒，可以借助于干粉分散劑、液體氣霧發(fā)生器、或噴霧器來制備和吸入.(例如Pettit和Go邁botz，77萬7鮮16:343(1998);Patton等人，脅."ehV.yer.35:235(1999))。該方法由AERX糖尿病管理系統(tǒng)舉例說明，它是一種將氣霧狀胰島素送入肺中的手持電動吸入器。研究表明，借助于低頻超聲波，48,000kDa大的蛋白質(zhì)已經(jīng)被以治療濃度透皮遞送，這證明了透皮給藥的可行性(Mitragotri等人，5""'朋ce269:850(1995))。通過電穿孔的透皮給藥提供了另一種TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)給藥的方法(Potts等人，萬j'"ec力"o丄10:213(1997)).包含TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)的藥物組合物可以根據(jù)已知的制備藥用的組合物的方法來配制，由此，治療用的蛋白質(zhì)與制藥上可接受的載體以混合物的形式來組合。一種組分，如果它的給藥可以被受治療的患者所耐受，即被稱為是"制藥上可接受的載體"。無菌的磷酸緩沖鹽溶液是制藥上可接受的載體的一個實(shí)例.其它適合的載體為本
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中眾所周知?？蓞㈤?，例如，Gennaro(編輯)，/e/ffj'"gtcw3's戶/ar邁acef/"cs25"cie/ce51,第19版(MackPublishingCompany1995),為了治療的目的，將TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)以治療有效量向患者給藥。如果給藥量在生理上有顯著性，則TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)和制藥上可接受的載體被認(rèn)為是以^療有效量"給藥。如果其存在引起了在受治療的患者生理方面可檢測的變化，則該藥物在生理上顯著。例如，如果其存在減輕了炎癥反應(yīng)，則用于治療炎癥的藥物是生理上顯著的。作為另一個實(shí)例，如果該藥劑的給藥引起胂瘤數(shù)量上的減少、減少的轉(zhuǎn)移、實(shí)體瘤尺寸減小、或腫瘤壞死增加，則用于抑制腫瘤細(xì)胞生長的藥物是生理上顯著的。此外，如果該藥物的給藥引起循環(huán)中抗雙鏈DNA抗體的減少、或至少下述癥狀之一的減輕發(fā)熱、關(guān)節(jié)痛、紅斑性皮膚損害、或系統(tǒng)性紅斑狼瘡的其它特征，則用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的藥物是生理上顯著的。將TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)以治療有效量給藥的通常的標(biāo)志的一個實(shí)例是，在給受治療的患者給藥之后，ZTNF4(BLyS)的循環(huán)水平減少。包含TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)的藥物組合物可以以液體形式、氣霧劑或固體形式提供。液體形式是以可注射的溶液和口服懸浮液為實(shí)例的。典型的固體形式包括膠嚢、片劑以及可控制釋放的形式。后一種形式是以徵型滲透泵和植入物為實(shí)例的(Bremer等人，尸/ar邁.萬j'"ec力"o丄10:239(1997);Ranade，"ImplantsinDrugDelivery,"載于"rwg"eiy^r5y"e邁s,Ranade和Hollinger(編輯)，第95-123頁(CRCPress1995);Bremer等人，"ProteinDeliverywithInfusionPumps，"載于尸r"ei/7"eh'Kew尸力y^/caJ5>"棚&Sanders和Hendren(編輯)，第239-254頁(Ple瞧Press1997);Yewey等人，"DeliveryofProteinfromaControlledReleaseInjectableImplant,"載于"eJiyewPAj^caJ加te斷Sanders和Hendren(編輯)，第93-117頁(PlenumPress1997))。脂質(zhì)體提供了一種以靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、或借助于口服給藥、吸入、鼻內(nèi)給藥等方式，向受治療的患者遞送治療用的多肽的方法。脂質(zhì)體是細(xì)微的膜泡，它由一個或多個包圍含水區(qū)室的脂雙層組成(通?？蓞㈤?，Bakker-Woudenberg等人，fur./^j'cro^'o丄//z/ect.Zj's1.72"u/p丄"S61(1993)，Kim，Zr(/gs46:618(1993),以及Ranade，Site-SpecificDrugDeliveryUsingLiposomesasCarriers,"載于"r"g"e_/_z>ezr分5^邁&Ranade和Hollinger(編輯)，第3-24頁(CRCPress1995))'脂質(zhì)體在成分上類似于細(xì)胞膜，因此，脂質(zhì)體可以被安全地給藥，同時是可生物降解的。根據(jù)制備方法，脂質(zhì)體可以是單層或多層的，脂質(zhì)體的直徑尺寸變化可以從0.02nm到大于10nm。多種藥劑可以用脂質(zhì)體封裝疏水藥劑部分用雙分子層，而親水部分在內(nèi)部含水的區(qū)域內(nèi)(可參閱，例如，Machy等人，"pos"o邁es1//萬io/o^y尸力ar邁aco7o^r(JohnLibbey1987)，和0stro等人，///b早尸力ar邁.46:1576(1989))。此外，通過脂質(zhì)體尺寸、分子層數(shù)、脂質(zhì)組分、以及脂質(zhì)體電荷和表面特征的變化，有可能控制封裝的藥物的治療有效性.脂質(zhì)體實(shí)際上可以被任何類型的細(xì)胞吸收，然后緩慢地釋放所封裝的藥物。或者，被吸收的脂質(zhì)體可以被吞噬細(xì)胞胞吞。胞吞繼之以脂質(zhì)體脂質(zhì)的被內(nèi)溶酶體降解和封裝藥劑的釋放(Scherphof等人，"Ky4cai/.5"c丄446:368(1985))。靜脈內(nèi)給藥后，小的脂質(zhì)體(0.l到1.0Mm)—般被主要位于肝和脾的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細(xì)胞吸收，而大于3.0nm的脂質(zhì)體在肺部沉積。這種小的脂質(zhì)體被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)細(xì)胞的優(yōu)先吸收已經(jīng)被用于向巨噬細(xì)胞和肝部腫瘤遞送化療藥劑。網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)可以通過若干方法被避開，包括以大劑量的脂質(zhì)體顆粒使之飽和、或者用藥理學(xué)的方法選擇性失活巨噬細(xì)胞(Claassen等人，歷'oc力i邁.Afo/7/^5".802:428(1984))'另外，將糖脂或聚乙二醇衍生的磷脂加入脂質(zhì)體膜已經(jīng)顯示出導(dǎo)致了顯著地減少的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吸收(Allen等人，萬ioc力i邁.Sio/7力ys.4cta1068:133(1991):Allen等人，5!.oc力i瓜」"a1150:9(1993))。脂質(zhì)體也可以通過改變磷脂組成或者在脂質(zhì)體中插入受體或配體來被制備出來，以靶向特定細(xì)胞或器官。例如用高含量的非離子型表面活性劑制備的脂質(zhì)體已經(jīng)用于把向肝(Hayakawa等人，日本專利04-244，018;Kato等人，5j'o丄尸力ar瓜16:960(1993)),該劑型是通過在甲醇中混合大豆磷脂酰膽堿、a-維生素E和乙氧基化氫化的蓖麻油(HC0-60)，在真空下濃縮混合物，之后用水重組而制備.57二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)與大豆衍生的sterylglucoside混合物(SG)和膽固醇(Ch)的脂質(zhì)體劑型也已經(jīng)表明耙向肝(Shimizu等人，7./%諷超丄20:881(1997))?；蛘撸梢詫⒍喾N靶向配體結(jié)合到脂質(zhì)體表面，例如抗體、抗體片段、碳水化合物、維生素和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)。例如，可以將脂質(zhì)體用分枝型半乳糖脂質(zhì)衍生物來修飾，以靶向脫唾液酸糖蛋白(半乳糖)受體，該受體專門在肝細(xì)胞表面表達(dá)(Kato和Sugiyama，Crit.Wer.7力er."，Car"'er5>".14:287(1997);Murahashi等人，Az.o丄尸力ar瓜^/7丄20:259(1997))。同樣，Wu等人在〃e/7aZ^7o^727:772(1998)上已經(jīng)表明，用脫唾液酸胎球蛋白標(biāo)記的脂質(zhì)體導(dǎo)致縮短了的脂質(zhì)體血漿半衰期和較大地增強(qiáng)了的肝細(xì)胞對脫唾液酸胎球蛋白標(biāo)記的脂質(zhì)體的吸收。另一方面，含分支型半乳糖脂衍生物的脂質(zhì)體的肝部積累可被預(yù)注射的脫唾液酸胎球蛋白抑制(Murahashi等人，Az'o丄尸Aa7m萬u".20:259(1997))。多順烏頭酸化的人血清白蛋白脂質(zhì)體提供了另一種使脂質(zhì)體靶向肝的方法(Ka即s等人，yVW7爿cad5"cj'.94:11681(1997)).此外，Geho等人在美國專利No.4,603,044敘述了定向于肝細(xì)胞的脂質(zhì)體小泡遞送系統(tǒng)，它具有對與肝的特異性代謝細(xì)胞相關(guān)的肝膽受體的特異性.在組織耙向的更普通的方法中，耙細(xì)胞被用對把細(xì)胞表達(dá)的配體特異的生物素化的抗體預(yù)先標(biāo)記(Harasym等人，^G^."z，i/g/e7j'r./e7.32:99(1998))在血漿消除游離抗體后，施用綴合鏈霉抗生素的脂質(zhì)體。在另一種方法中，靶向抗體被直接附著在脂質(zhì)體上(Harasym等人，」Jr.32:99(1998))?？梢圆捎脴?biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)微量封裝技術(shù)，將TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)封裝在脂質(zhì)體內(nèi)(可參閱，例如，Anderson等人，/"/e".i"咖M.31:1099(1981)，Anderson等人，/Pes.50:1853(1990)，和Cohen等人，^z'oc她爿"a1063:95(1991)，Alving等人PreparationandUseofLiposomesinImmunologicalStudies,"載于"/oso邁eT^c力/7oJo^7i第2版，Vol.III，Gregoriadis(編輯)，第317頁(CRCPress1993)，Wassef等人，淑力.^7^r邁o丄149:124(1987))。如上所述，治療用的脂質(zhì)體可以含有多種組分。例如，脂質(zhì)體可以包含聚(乙二醇)的脂質(zhì)衍生物(Allen等人，萬ioc力i瓜5j'印/j^.力cta1150:9(1993))?？山到獾木酆衔镂⑶蝮w已經(jīng)被設(shè)計成可保持治療性蛋白質(zhì)的高的系統(tǒng)水平。微球體用降解的聚合物制備，例如，(丙交酯乙交酯)共聚物(PLG)、聚酐類、聚(原酯)、不可生物降解的乙基乙烯基乙酸酯聚合物，其中蛋白質(zhì)被包在聚合物中(Gombotz和Pettit，萬j.oco/u'柳tec力e邁.6:332(1995):Ranade，"RoleofPolymerinDrugDelivery,"載于Zr^Ze7i'Kery5y5"te邁5",Ranade和Hollinger(編輯)，第51-93頁(CRCPress1995):Roskos和Maskiewicz,"DegradableControlledReleaseSystemsUsefulforProteinDelivery,"載于尸r"e!7z5yste邁s,Sanders和Hendren(編輯)，第45-92頁(PlenumPress1997);Bartus等人，5"c2'e"ces281:1161(1998);Putney和Burke，嫁wre5j-"ec力/7oJ^716:153(1998):Putney,O/rr.2:548(1998))。包有聚乙二醇(PEG)的毫微球體也可以為治療用蛋白質(zhì)靜脈給藥提供載體(可參閱，例如，Gref等人，尸力32mA'otecA/2o2.10:167(1997))。如上面所討論的，本發(fā)明也設(shè)想了化學(xué)修飾的TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)，其中多肽與聚合物連接。其它給藥形式可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員設(shè)計，如，例如，Ansel和Popovich，尸Mr邁acew"csJZos財e,ar邁s朋dZrwg"eh'7ar7加"邁&第5版(Lea&Febiger1990)、Germaro(編輯)，ye邊i7^o"，s尸力ar邁acew"cs75""'e/7ces,第19版(MackPublishingCompany1995)、以及Ranade和Hoi1inger，Zrw《yery5yste邁s(CRCPress1996)所示。作為實(shí)例，藥物組合物可以包括容器的試劑盒來供應(yīng)，該容器包含TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)。治療用多肽可以一次或多次劑量的可注射溶液形式，或者以在注射前重配制的無菌粉末的形式來提供。或者，上述試劑盒可以包括用于將治療性多肽給藥的干粉分散劑、液體氣霧發(fā)生器或噴霧器。上述試劑盒可以進(jìn)一步包含關(guān)于藥物組合物的適應(yīng)證和用法的書面的信息。此外，上述信息可以包括一個聲明，即TACI-免疫球蛋白蛋白質(zhì)組合物在已知對TACI部分或者對免疫球蛋白部分過敏的患者中禁忌。9.TACI免疫球蛋白核香酸序列的治療應(yīng)用本發(fā)明包括編碼TACI免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的核酸分子的應(yīng)用，以給需要上述治療的受治療者提供該融合蛋白質(zhì)。如上面所討論的，為了獸醫(yī)治療應(yīng)用或人的治療應(yīng)用，可以將該核酸分子給有病癥或疾病的受治療者用藥。正如在前面一個實(shí)例所討論的，編碼TACI免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的核酸分子可以應(yīng)用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的長期治療.有許多給受治療者引入TACI免疫球蛋白基因的方法，包括表達(dá)TACI免疫球蛋白的重組宿主細(xì)胞的應(yīng)用、編碼TACI免疫球蛋白的棵核酸的遞送、陽離子脂質(zhì)載體與編碼TACI免疫球蛋白的核酸分子一起的應(yīng)用、以及表達(dá)TACI免疫球蛋白的病毒的應(yīng)用，例如重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、重組腺伴隨病毒、重組腺病毒、重組單純皰療病毒(可參閱，例如，Mulligan,5"c!.e;3ce260:926(1993)，Rosenberg等人，5We"ce242:1575(1988)，LaSalle等人,Scj.e"ce259:988(1993)，Wolff等人，5We"ce247:1465(1990),Breakfield和Del歸，T力e腸3:203(1991))。在離體的方法中，例如，從受治療者分離細(xì)胞，用表達(dá)TACI免疫球蛋白基因的載體轉(zhuǎn)染，之后植入到受者中。為了實(shí)現(xiàn)TACI免疫球蛋白基因的表達(dá)，表達(dá)載體被構(gòu)建出來，其中編碼TACI免疫球蛋白基因的核苷酸序列被與核心啟動子可操作地連接，并且可選擇與調(diào)節(jié)元件連接，以控制基因轉(zhuǎn)錄。以上敘述了表達(dá)載體的一般要求?；蛘?，TACI免疫球蛋白基因可以用重組病毒載體來遞送，包括例如腺病毒栽體(例如，Kass—Eisler等人，尸roc.〃at力cac/.5""'.〃5^90:11498(1993)，Kolls等人，尸roc.iVat，J」cac/.Sc2'.〃&491:215(1994)，Li等人，#"邁.Ge/e7力er.4:403(1993)，Vincent等人，"e"".5:130(1993)，以及Zabner等人，75:207(1993))、腺伴隨病毒載體(Flotte等人，尸roc.7y4cad"W90:10613(1993))、a病毒，如SemlikiForest病毒和Sindbis病泰Hertz和Huang,Fj>.66:857(1992)，Raju和Huang,/Mr.65:2501(1991),以及Xiong等人，5"cj'e/2ce243:1188(1989))、皰疹病毒載體(例如美國專利Nos.4，769，331、4，859，587、5，288，641和5，328，688)、細(xì)小病毒載體(Koering等人，歷加.7yerap.5:457(1994))、痘病毒載體(0zaki等人，Woc力e邁.Tes.6b鵬.193:653(1993)，Panicali和Paoletti，尸roc.淑？細(xì)d/.5"cj'.仍M79:4927(1982))、痘病毒，如金絲雀痘病毒或牛痘病毒(Fisher-Hoch等人，iProc.,75"c丄〃W86:317(1989),和Flexner等人，J/w.A^KJcad569:86(1989))、以及逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如Baba等人，/.^ewrosuz^79:729(1993)，Ram等人，Ca"cerTes.53:83(1993)，Takamiya等人，/7Veurosc丄Aes.33:493(1992)，Vile和Hart，Ca"cer53:962(1993)，Vile和Hart，C朋cer53:3860(1993),以及Anderson等人，美國專利No.5,399,346)。在不同的實(shí)施方案里，含有病毒載體的病毒載體本身，或者病毒顆粒，可以在如下面敘述的方法和組合物中應(yīng)用.作為一個系統(tǒng)的說明，腺病毒，即一種雙鏈DNA病毒，用于異源核酸分子的遞送是被詳細(xì)表征的基因轉(zhuǎn)移載體.(對于綜述可參閱Becker等人，6WJ43:161(1994);Douglas和Curiel，Scj'e"ce在#ec/j'"'72e4:44(1997)).腺病毒系統(tǒng)提供若干優(yōu)點(diǎn)，包括(i)接納相對較大DNA的插入片段的能力，(ii)生長至高滴度的能力，(iii)感染較大范圍的哺乳動物細(xì)胞類型的能力，以及(iv)與許多不同的啟動子一起使用的能力，包括普遍存在的、組織特異性的、和可調(diào)節(jié)的啟動子。另外，可以將腺病毒通過靜脈內(nèi)注射給藥，因?yàn)樵摬《驹谘髦蟹€(wěn)定.使用部分腺病毒基因組已缺失的腺病毒栽體，插入片斷是通過直接連接反應(yīng)或用共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒同源重組的方法被合并到病毒DNA中的。在典型的系統(tǒng)中，必須的El基因被從病毒載體中缺失，并且除非宿主細(xì)胞提供E1基因，否則病毒不能復(fù)制。當(dāng)從靜脈內(nèi)向未治療的動物給藥時，腺病毒主要靶向肝。雖然已缺失E1基因的腺病毒遞送系統(tǒng)在宿主細(xì)胞中不能復(fù)制，但是宿主的組織將表達(dá)和加工被編碼的異源基因。如果相應(yīng)的基因包括分泌信號序列，宿主細(xì)胞也將分泌異源蛋白質(zhì)。分泌的蛋白質(zhì)將從表達(dá)異源基因的組織(例如高度血管化的肝)進(jìn)入循環(huán)。此外，含有各種病毒基因缺失的腺病毒栽體可以用于減少或消除針對載體的免疫應(yīng)答，上述腺病毒的El已缺失，另外，包括E2A或E4的缺失(Lusky等人，/72:2022(1998);Raper等人，M/邁朋Ge/2e7^erapy9:671(1998))。E2b的缺失減少免疫應(yīng)答也已經(jīng)有報道(Amalfitano等人，/.Wro7.72:926(1998)).通過刪除整個腺病毒的基因組，可以接受很大的異源DNA的插入物。全部病毒基因已被缺失的被稱為gutless"腺病毒的后代，對于大的異源DNA插入物的插入尤其有利(對于綜述，可參閱Yeh.和Perricaudet，尸AS"朋11:615(1997))。能夠表達(dá)治療基因的重組病毒的高滴度的母抹可以采用標(biāo)準(zhǔn)方法從受感染哺乳動物細(xì)胞獲得。例如重組單純皰疹病毒可以用Vero細(xì)胞制備，如以下文獻(xiàn)所述Brandt等人，J.Ge".Kz'ro丄72:2043(1991)，Herold等人，/Ge".Wro丄75:1211(1994),Visalli和Brandt,KzW057185:419(1991),Grau等人，J肝e".0/7雄^頂o丄Kz.s.5"cj'.30:2474(1989)，Brandt等人，/..K/ro丄36:209(1992)，以及Brown和MacLean(編輯)，尸rotoco7s(HumanaPress1997)。或者，可以將包含TACI免疫球蛋白基因的表達(dá)載體，用脂質(zhì)體通過體內(nèi)脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法引入到受治療者細(xì)胞中。合成陽離子脂質(zhì)可以應(yīng)用于制備脂質(zhì)體用于在體內(nèi)轉(zhuǎn)染的編碼標(biāo)記的基因(Feigner等人，尸roc.y4cad5"c丄〃a84:7413(1987);Mackey等人，^cad〃5^85:8027(1988))。在體內(nèi)將外源基因引入到特定器官的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法的應(yīng)用具有某些實(shí)用的優(yōu)點(diǎn)。脂質(zhì)體可以用于導(dǎo)向?qū)μ囟?xì)胞類型的轉(zhuǎn)染，它對于有細(xì)胞異質(zhì)性的組織尤其有利，例如胰、肝、腎和腦.脂質(zhì)可以與為了定向目的的其他分子化學(xué)偶聯(lián)。靶肽(例如激素或神經(jīng)遞質(zhì))、蛋白質(zhì)，如抗體，或非肽分子，可以與脂質(zhì)體化學(xué)偶聯(lián)。電穿孔是另一種可選擇的給藥模式.例如Aihara和Miyazaki，#a^rei^"ec力/o7^^16:867(1998),已經(jīng)說明了在體內(nèi)為l吏基因轉(zhuǎn)移到肌肉的電穿孔的應(yīng)用。通常，包含具有TACI免疫球蛋白核苷酸序列(如重組病毒)的治療載體的組合物的劑量，將依據(jù)受治療者的年齡、體重、身高、性別、總體的健康狀況和既往的醫(yī)療歷史這樣的因素而不同。適合的治療載體給藥途徑包括靜脈內(nèi)注射、動脈內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、胂瘤內(nèi)注射以及注射到含腫瘤的腔隙內(nèi)。作為實(shí)例，Horton等人，尸roc.7Va力'7/4c^/.5"c丄^S/496:1553(1999)，說明了在鼠模型中，編碼oc-干擾素的質(zhì)粒DNA的肌肉內(nèi)注射對于原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤產(chǎn)生有效的抗胂瘤效應(yīng)。包含本發(fā)明的病毒栽體、非病毒載體、或者病毒載體和非病毒載體之組合的組合物，可以根據(jù)已知的制備藥用的組合物的方法配制，由此，載體或病毒與制藥上可接受的載體以混合物的形式組合。如上所述，一種組分，如磷酸緩沖鹽水，如果它的給藥可以被受治療的患者所耐受，即被稱為是"制藥上可接受的栽體".其它適合的載體為本
技術(shù)領(lǐng)域：
眾所周知.(可參閱，例如，ie邁i/^to/7，s尸力ar辺acei/tJ'ca75"cj'e/2ces,第19版(MackPublishingCompany1995),和Gj邁朋'sf/e尸Mr鵬ce[/"ca7o/*r/era/7ewtj.cs第7版(MacMillanPublishingCompany1998))。為了治療的目的，將治療用的基因表達(dá)載體或者包含上述載體和制藥上可接受的載體的重組病毒，以治療有效量向患者給藥.如果給藥量在生理上顯著的，則表達(dá)載體(或病毒)和制藥上可接受的載體63的組合物被認(rèn)為是以^療有效量"給藥的。如果它的存在引起了在受治療的患者生理方面可檢測的變化，則藥物在生理上顯著。例如，如果它的存在減輕了炎癥反應(yīng)，則用于治療炎癥的藥劑是生理上顯著。作為另一個實(shí)例，如果該藥劑的給藥引起在腫瘤數(shù)量上減少、減少轉(zhuǎn)移、實(shí)體瘤尺寸減小、或肺瘤壞死增加，則用于抑制腫瘤細(xì)胞生長的藥物在生理上顯著。當(dāng)用治療用的基因表達(dá)栽體或者重組病毒治療的對象是人時，那么，該治療優(yōu)選為體細(xì)胞基因治療。也就是說，用治療性基因表達(dá)載體或者重組病毒治療人時，優(yōu)選不必需將核酸分子引入到可成為人生殖細(xì)胞系的一部分并被傳遞到相繼的世代的細(xì)胞中(例如人生殖細(xì)胞系的基因治療).10.轉(zhuǎn)基因小鼠的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因鼠可以被遺傳改造為在所有組織或者在組織特異的或組織優(yōu)選的調(diào)節(jié)元件控制下過度表達(dá)編碼TACI免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的核酸序列。該TACI免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的過度產(chǎn)生者可以用來表征由過度表達(dá)引起的表型，并且轉(zhuǎn)基因動物可以作為由過量的TACI受體蛋白質(zhì)引起的人類疾病的模型之用。過度表達(dá)TACI免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因鼠也為在大動物的奶或血中生產(chǎn)TACI免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)提供了模型生物反應(yīng)器。生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因鼠的方法對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是眾所周知的(可參閱，例如，Jacob,"ExpressionandKnockoutofInterferonsinTransgenicMice,"載于Jacob(編輯)，第111-124頁(AcademicPress,Ltd.1994)，Monastersky和Robl(編輯)，Strate^z.esrr朋s^e/!'cyl/7J'邁aJ5"c!'e"ce(ASMPress1995)，以及Abbud和Nilson，"RecombinantProteinExpressioninTransgenicMice,"載于Ge/7e^xpressj'o"5y"e邁s..〃5M'/2g#atwre/ort力eArt^xpressio",Fernandez和Hoeffler(編輯)，第367-397頁(AcademicPress,Ltd.1999))。例如，生產(chǎn)表達(dá)編碼TACI免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的核酸序列的轉(zhuǎn)基因鼠的方法，可以從成熟的可育雄鼠(種鼠)(B6C3fl，2到8月齡(TaconicFarms,Ger邁antown，NY))、切除輸精管的雄鼠(不育鼠)(B6D2fl，2到8月(TaconicFarms))、性成熟前的可育雌鼠(供體)(B6C3fl，4到5周(TaconicFarms))和成熟的可育雌鼠(受體)(B6D2fl，2到4月(TaconicFarms))開始。將供體馴化一周，然后注射PregnantMare血清促性腺激素(SigmaChemicalCompany:St.Louis,MO)LP.大約8IU/鼠，46-47小時后，注射人絨毛膜促性腺激素(hCG(Sigma))I.P.8IU/鼠，以引起超量排卵。在激素注射之后讓供體與種鼠交配。排卵通常在hCG注射13小時內(nèi)發(fā)生。交配是通過交配以后的早晨陰道塞的存在來得到確認(rèn)的。受精卵在解剖鏡下被采集。將輸卵管采集起來，并且將卵放置在含有透明質(zhì)酸酶(Sigma)的尿液分析的載玻片中。將卵在透明質(zhì)酸酶中洗滌一次，再在已經(jīng)用5%C02、5%02和90%N2在37X:孵化過的Whitten'sW640培養(yǎng)基中洗滌兩次(詳述見，例如Menino和0，Claray,萬j'o丄#e/2W.77:159(1986)，以及Dienhart和Downs,^y卯te4:129(1996))。之后將卯儲存在37X1/5%002的孵化器中直到顯微注射。將十到二十微克含有編碼TACI免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)序列的質(zhì)粒DNA線性化、凝膠純化、并且在10mMTris-HCl(pH值7.4)、0.25mMEDTA(pH值8.0)中重懸浮，以每微升5到10毫微克的最終濃度進(jìn)行顯微注射.例如，編碼TACI免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的序列可以編碼具有SEQIDNO:2氨基酸殘基1到29和111到154的缺失和Fc免疫球蛋白部分的TACI多肽。將質(zhì)粒DNA顯微注射到裝在一滴用溫的C02平衡的礦物油覆蓋的W640培養(yǎng)基中的收獲的卵中。將DNA吸入到注射針中(從0.75腿ID、1mm0D硼硅酸鹽毛細(xì)玻璃管拉成的)，注射到單個卵中.用注射針將每一個卵穿透，進(jìn)入到一個或兩個單倍體原核中。皮升(picoliter)的DNA被注射到原核中，不與核仁接觸便將注射針抽回。重復(fù)該程序直到全部卵被注射為止。將成功地顯微注射的卵轉(zhuǎn)移到有預(yù)先排氣的W640培養(yǎng)基的器官組織培養(yǎng)盤中，以在37"C/5%C02的孵化器中過夜儲存。第二天，將二細(xì)胞胚胎轉(zhuǎn)移到假妊娠受體中。在與切除輸精管的不能繁殖的鼠交配之后，通過陰道塞的存在對受體進(jìn)行鑒定，將受體麻醉，在背部左側(cè)剃毛，并且被轉(zhuǎn)移到解剖顯徵鏡下.在皮膚上切一個小切口，穿過位于膝和脾中間的以胸廓、鞍部、和后腿為界的腹部區(qū)域中央的肌肉壁。使生殖器官暴露在小手術(shù)單之上.將脂肪墊在手術(shù)單上伸出，并將小型彈簧鑷(Roboz，Rockville)固定于脂肪墊上，懸掛于鼠的背部上，防止器官滑動回去。用含礦物油及隨后的交替的W640和氣泡的細(xì)移液管，將12到17個健康的由前幾天注射得到的二細(xì)胞胚胎轉(zhuǎn)移到受體中。定位腫脹的壺腹，并且在壺腹和嚢之間固定輸卵管，用28g針在接近嚢處在輸卵管上做一個切口，確認(rèn)沒有弄破壺腹或嚢。將移液管轉(zhuǎn)移到輸卵管的切口中，將胚胎吹入，允許第一個氣泡排出移液管。將脂肪墊緩慢推進(jìn)腹膜，并讓生殖器官滑入。用線縫合腹膜壁，并用傷口夾閉合皮膚。讓鼠在37C滑動加熱器上恢復(fù)最少4小時。讓受體成對地返回籠中，并且允許其19-21天的妊娠'生育后，斷奶前產(chǎn)后的19-21天是允許的。區(qū)分剛斷奶小鼠的性別，然后放入分性別的籠中，用清潔剪刀剪去尾部0.5cm活體解剖(用于基因型分析)。用例如QIAGENDNEASY試劑盒按照制造商的說明書，從尾部剪下的小塊來制備基因組DNA。通過PCR分析基因組DNA，該P(yáng)CR是采用為擴(kuò)增編碼TACI免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的核酸序列或擴(kuò)增被引入相同質(zhì)粒的可選擇的標(biāo)記基因而設(shè)計的引物.在確認(rèn)動物是轉(zhuǎn)基因的之后，通過將轉(zhuǎn)基因雌鼠與野生型雄鼠，或者轉(zhuǎn)基因雄鼠與一只或兩只野生型雌鼠放在一起，讓它們與近親繁殖的品系雜交。當(dāng)幼鼠出生并斷奶時，其性別被分開，并且為了基因型分析將其尾部剪去.為了在活的動物中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)的檢查，進(jìn)行了部分肝切除。在緊接著劍突下的上腹部進(jìn)行外科手術(shù)準(zhǔn)備。采用無菌搡作，在胸骨以下做一個1.5到2cm的小切口，使肝的左外葉露出。用4-0絲線，圍繞下部的肝葉打一個結(jié)，將其固定在體腔外.當(dāng)可吸收的Dexon(AmericanCyanamid;Wayne,N.J.)的第二個環(huán)被放在第一個結(jié)的近端時，用無創(chuàng)鉗夾住該結(jié)。從Dexon結(jié)的遠(yuǎn)端切割，大約100mg切除的肝組織被置于無菌培養(yǎng)皿中。將切除的肝的切片轉(zhuǎn)移到14ml聚丙烯圃底試管中并且立即在液氮中冷凍，然后，在干冰上儲存。用縫線和傷口夾將手術(shù)部位閉合，手術(shù)后，將動物籠置于37i:加熱墊上24小時。手術(shù)后每天對動物進(jìn)行檢查，手術(shù)后7到IO天將傷口夾去除。為每只轉(zhuǎn)基因鼠用RNA溶液雜交試驗(yàn)或者聚合酶鏈反應(yīng)檢測TACI免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)mRNA的表達(dá)水平。采用上述的常規(guī)方法，在奶中表達(dá)顯著水平的TACI免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因鼠已被生產(chǎn)出來。在這種獨(dú)特的情況下，編碼TACI免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的序列編碼了帶有SEQIDNO:2氨基酸殘基1到29和111到154缺失和Fc免疫球蛋白部分的TACI多肽.像通常敘述的一樣，通過參考下述以實(shí)施例的方式提供的實(shí)施例將使本發(fā)明更容易被理解，但是這不能作為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例1編碼TACI-Fc蛋白質(zhì)的核酸分子的構(gòu)建如Gross等人，iVa"re404:995(2000)所述的，編碼人的TACI的核酸分子在ZTNF4的受體克隆的表達(dá)時獲得。采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過重疊PDR，產(chǎn)生出包含在TACI-Fc表達(dá)構(gòu)建體中的編碼序列(參閱，例如Horton等人，Ge/2e77:61(1989)).人的TACIcDNA和FccDNA被作為PCR擴(kuò)增的起動模板來使用。PCR引物被設(shè)計出以生產(chǎn)想要的編碼序列的5，和3，端，并且引入限制酶識別位點(diǎn)以便于該編碼序列插入到表達(dá)載體中。將TACI-Fc編碼序列插入到包括鼠功能性的二氫葉酸還原酶基因的表達(dá)載體中。一種表達(dá)載體也包含引導(dǎo)重組蛋白質(zhì)67轉(zhuǎn)基因的表達(dá)的巨細(xì)胞病毒啟動子、免疫球蛋白內(nèi)含子、組織纖溶酶原激活蛋白的信號序列、內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列、用于表面選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的被缺失了的CD8順反子、以及用于在酵母細(xì)胞中生長質(zhì)粒的酵母表達(dá)元件。用于生產(chǎn)TACI-Fc融合蛋白質(zhì)的一種方法是通過用于構(gòu)建TACI-Fc4的方法來說明的。其它的TACI-Fc融合蛋白質(zhì)是通過將編碼TACI-Fc融合蛋白質(zhì)的核苷酸序列插入到哺乳動物表達(dá)載體中，然后將該表達(dá)載體引入到哺乳動物細(xì)胞中來生產(chǎn)。A.IgY1Fc4片段的構(gòu)建為制備TACI-Fc4融合蛋白質(zhì)，將人的IgGl的Fc區(qū)(鉸鏈區(qū)和Ch2和ch3結(jié)構(gòu)域)修飾，以去除Igy1受體(FcyRI)和補(bǔ)體(Clq)結(jié)合功能。人的IgGlFc的該修飾版本被指定為"Fc4".使用寡引物5，ATCAGCGGAATTCAGATCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCAC3，(SEQIDN0:7)和5'GGCAGTCTCTAGATCATTTACCCGGAGACAGGGAG3'(SEQIDN0:8)采用PCR，將Fc區(qū)從人的胎兒肝的文庫(Clontech)中分離。用PCR引起Fc區(qū)內(nèi)的突變，以降低FcyRI的結(jié)合。將FcyRI結(jié)合位點(diǎn)(Leu-Leu-Gly-Gly;SEQIDN0:6的氨基酸殘基38到40，它相當(dāng)于EU索引位置234到237)突變?yōu)锳la-Glu-Gly-Ala，以降低FcyRl的結(jié)合(參閱，例如Duncan等人，332:563(1988);Baum等人，^KBO/.13:3992(1994))'寡核普酸引物5，CCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGAGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC3'(SEQIDNO:9)和5'GGATTCTAGATTATTTACCCGGAGACAGGGA3，(SEQIDNO:IO)被應(yīng)用以引起該突變.向50yl的最終體積中加入IgFc模板570ng、10xPfu反應(yīng)緩沖液(Stratagene)5M1、1.25mMdNTPs8jil、蒸餾水31n1、20mM寡核苷酸引物2y1。將相等體積的礦物油加入，將反應(yīng)加熱到94X:持續(xù)1分鐘.將Pfu聚合酶(2.5單位，Stratagene)加入繼而進(jìn)行25個循環(huán)的在94C持續(xù)30秒鐘，55X:持續(xù)30秒鐘，72X:持續(xù)l分鐘，接著在72"C延伸反應(yīng)7分鐘。用電泳將反應(yīng)產(chǎn)物分離，將與預(yù)測尺寸相對應(yīng)的大約676個堿基對的條帶檢出。從凝膠上將該條帶切斷，并且使用QIAGENQIAquickTMGelExtraction試劑盒(Qiagen)根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行回收。PCR也被用于引起Ala到Ser(SEQIDN0:6的氨基酸殘基134，它相當(dāng)于EU索引位置330)和Pro到Ser(SEQIDN0:6的氨基酸殘基135,它相當(dāng)于EU索引位置331)的突變，以降低補(bǔ)體Clq的結(jié)合或補(bǔ)體的固定(Duncan和Winter,Watwre332:788(1988))。作為模板使用FcvRI結(jié)合位點(diǎn)突變的IgFc序列進(jìn)行兩次第一輪的反應(yīng)。向50y1的最終體積中加入FcyRI結(jié)合位點(diǎn)突變的IgFc模板1p1、10xPfu反應(yīng)緩沖液(Stratagene)5m1、1.25mMdNTPs8nl、蒸餾水31m1、2p1的20mM5，GGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCGAGCCCAGATCTTCAGACAAAACTCAC3，(SEQIDNO:11)，即在SEQIDNO:5的核普酸36開始的5，引物、以及2m1的20mM5，TGGGAGGGCTTTGTTGGA3，(SEQIDNO:12),即在SEQIDNO:5的核普酸405互補(bǔ)體開始的3，引物。第二反應(yīng)含有各2n1的20mM的貯液寡核苷酸引物5，TCCAACAAAGCCCTCCCATCCTCCATCGAGAMACCATCTCC3，(SEQIDNO:13)，即在SEQIDN0:5的核苷酸388開始的5，引物和5，GGATGGATCCATGMGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATG3，(SEQIDNO:14),即3，引物的原料，以引起Ala到Ser的突變，Xbal限制性位點(diǎn)和終止密碼子。將相等體積的礦物油加入，將反應(yīng)加熱到94t:持續(xù)1分鐘.將Pfu聚合SK2.5單位，Stratagene)加入繼而進(jìn)行25個循環(huán)的在94"持續(xù)30秒鐘，55t:持續(xù)30秒鐘，72X:持續(xù)2分鐘，接著在72t;延伸反應(yīng)7分鐘。用電泳將反應(yīng)產(chǎn)物分離，并將分別與預(yù)測尺寸相對應(yīng)的大約370個和大約395個堿基對的條帶檢測出來。從凝膠中將該條帶切出，并且使用QIAGENQIAquickTMGelExtraction試劑盒(Qiagen)根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行提取，為連接上述片段，并且加入5，BamHI限制性位點(diǎn)和來自人免疫球蛋白JBL2，Ct重鏈可變區(qū)的信號序列，進(jìn)行第二輪反應(yīng)，(Cogne等人，/咖wo丄18:1485(1988))。向50nl的最終體積中加入30gl蒸餾水、8yl1.25mMdNTPs、5n110xPfu反應(yīng)緩沖液(Stratagene)以及兩種第一次的兩個PCR反應(yīng)的產(chǎn)物各1u1.將相等體積的礦物油加入，將反應(yīng)加熱到94C持續(xù)1分鐘。將Pfu聚合酶(2.5單位，層聚基因)加入繼而進(jìn)行5個循環(huán)的在94X:持續(xù)30秒鐘，55X:持續(xù)30秒鐘，72X:持續(xù)2分鐘。再次升溫到94X:,并且將各2p1的20mM貯液的寡核苷酸引物5，GGATGGATCCATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATG3'(SEQIDNO:14)，即在SEQIDNO:5的核苷酸1開始的5，引物和5，GGATTCTAGATTATTTACCCGGAGACAGGGA3，(SEQIDNO:10)加入，繼而進(jìn)行25個循環(huán)的在94'C持續(xù)30秒鐘，55TC持續(xù)30秒鐘，72X:持續(xù)2分鐘，最后在72X:延伸反應(yīng)7分鐘。采用凝膠電泳將反應(yīng)部分顯影。將與預(yù)測尺寸相對應(yīng)的789個堿基對的條帶檢測出。B.TACI-Fc4表達(dá)載體的構(gòu)建借助于在酵母中的同源重組，構(gòu)建包含TACI-Fc4融合蛋白質(zhì)編碼區(qū)的表達(dá)質(zhì)粒。采用PCR分離TACI的cDNA片段，它包括SEQIDNO:l從核苷酸14到核苷酸475的多核苷酸序列.在TACI片段的生產(chǎn)中使用的兩種引物是(1)含有5，載體側(cè)翼序列的40堿基對和與TACI片段氨基末端相對應(yīng)的17個堿基對的引物(5，CTCAGCCAGGAAATCCATGCCGAGTTGAGACGCTTCCGTAGMTGAGTGGCCTGGGCCG3';SEQIDNO:15);(2)與側(cè)翼Fc4序列相對應(yīng)的3，端的40個堿基對和與TACI片段羧基末端相對應(yīng)的17個堿基氺5，GCATGTGTGAGTTTTGTCTGAAGATCTGGGCTCCTTCAGCCCCGGGAG3';SEQIDNO:16)。向100"的最終體積中加入TACI模板10ng、10xTaq聚合酶反應(yīng)緩沖物(PerkinEl邁er)10yl、2.5nMdNTPs8m1、蒸餾水78p1、20mM寡核苷酸引物貯液各2Ml和Taq聚合酶(2.5單位，LifeTechnology)。將相等體積的礦物油加入，將反應(yīng)加熱到94C持續(xù)2分鐘，繼而進(jìn)行25個循環(huán)的在941C持續(xù)30秒鐘，65"C持續(xù)30秒鐘，65t:持續(xù)30秒鐘，72t:持續(xù)l分鐘，接著在72"C延伸反應(yīng)5分鐘.用相似的方法將包含cDNA編碼Fc4片段的片段構(gòu)建。在Fc4片段70生產(chǎn)中使用的兩種引物是(上游和下游)，含有5，TACI側(cè)翼序列的40個堿基對和與Fc4片段氨基末端相對應(yīng)的17個堿基對的寡核普酸引物(5，GCACAGAGGCTCAGAAGCAAGTCCAGCTCTCCCGGGGCTGAAGGAGCCCAGATCTTCAGA3，;SEQIDNO:17);和含有與側(cè)翼載體序列相對應(yīng)的3'端的40個堿基對和與Fc4片段羧基末端相對應(yīng)的17個堿基對的寡核苷酸引物(5，GGGGTGGGTACAACCCCAGAGCTGTTTTAATCTAGATTATTTACCCGGAGACAGGG3';SEQIDNO:18)。向100m1的最終體積中如上所述的Fc4模板10ng、10xTaq聚合酶反應(yīng)緩沖液(PerkinElmer)10p1、2.5nMdNTPs8nl、蒸餾水78u1、20mM寡核苷酸貯液各2m1和Taq聚合酶(2.5單位，LifeTechnology).將相等體積的礦物油加入，將反應(yīng)加熱到94X:持續(xù)2分鐘，繼而進(jìn)行25個循環(huán)的在94t:持續(xù)30秒鐘，65"持續(xù)30秒鐘，72X:持續(xù)l分鐘，接著在72C延伸反應(yīng)5分鐘。為了分析，10微升的如上所述的各100nl的PCR反應(yīng)物與lxTBE緩沖液一起在0.8%LMP瓊脂糖凝膠上(SeaplaqueGTG)跑電泳'將剩余的90m1各種PCR反應(yīng)物用添加的1M氯化鈉5nl和無水乙醇沉淀。用Smal切割質(zhì)粒pZMP6，使之在多連接位點(diǎn)直線化。質(zhì)粒pZMP6來自于質(zhì)粒pCZR199(AmericanTypeCultureCollection,Manassas,VA，ATCC#98668)，是哺乳動物表達(dá)載體，它含有具有巨細(xì)胞病毒立即早期啟動子的表達(dá)盒、來自鼠免疫球蛋白重鏈基因座的可變區(qū)的一致(consensus)內(nèi)含子、用于編碼序列插入的多個限制位點(diǎn)、終止密碼子和人的生長激素的終止子。質(zhì)粒還具有大腸桿菌的復(fù)制原點(diǎn)、帶SV40啟動子的哺乳動物可選擇標(biāo)記表達(dá)單位、增強(qiáng)子和復(fù)制的原點(diǎn)、二氫葉酸還原酶基因和SV40終止子。載體pZMP6通過用巨細(xì)胞病毒立即早期啟動子替換金屬硫蛋白啟動子，和在開放的閱讀框架的5，端的Kozac序列，從pCZR199構(gòu)建。將100微升感受態(tài)的酵母細(xì)胞(啤酒糖酵母)與10y1含有大約1pgTACI胞外結(jié)構(gòu)域和Fc4PCR片段、以及100ngS邁al消化過的pZMP6載體混合，然后轉(zhuǎn)移到0.2cm電穿孔杯。在0.75kV(5kV/cm)，~ohms,25nF下給酵母/DNA混合物電脈沖。向每個杯加入600m11.2M山梨糖醇，將酵母以兩個300m1等分試樣在URA-D平板鋪板，之后在30'C溫育。大約48小時后，將來自單個平板的Ura+酵母轉(zhuǎn)化物用1ml水重新懸浮，簡單地離心使酵母細(xì)胞沉淀。用lml溶胞緩沖液(296TritonX-IOO、1%SDS、100mM氯化鈉、lOraMTris、pH值8.0、lmMEDTA)將細(xì)胞沉淀重新懸浮。將500微升溶胞混合物加到含有300p1酸洗過的玻璃珠和200盼氯仿的Eppendorf試管，以l分鐘的時間間隔旋轉(zhuǎn)兩到三次，接著在Eppendorf離心機(jī)中以最大速度旋轉(zhuǎn)5分鐘。將300微升的水相物轉(zhuǎn)移到新的試管，并用600，1乙醇沉淀DNA，接著在4t:離心分離IO分鐘。用100m1水中將DNA沉淀重新懸浮.電感受態(tài)的(electroco即etent)大腸桿菌細(xì)胞(DH10B、GibcoBRL)轉(zhuǎn)化是用0.5到2ml準(zhǔn)備的酵母DNA和40y1DH10B細(xì)胞進(jìn)行的.以2.OkV、25mF和400ohms向細(xì)胞給予電脈沖。電穿孔后，將1mlSOC(2%細(xì)菌用胰蛋白胨(Difco，Detroit,MI)、0.5%酵母提取物(Difco)、10mMNaCl、2.5mMKC1、10mMMgCl2、10mMMgS04、20mM葡萄糖)以250nl等分試樣在四個LBAMP平板(LB培養(yǎng)液(Lennox)、1.8%細(xì)菌用瓊脂(Difco)、100mg/L氨千青霉素)上鋪板。通過限制性酶切消化鑒定包含TACI-Fc4的正確的表達(dá)構(gòu)建體的個體的克隆，以確定插入物的存在，同時證實(shí)多種DNA序列已經(jīng)正確地相互連接。陽性的克隆插入物要經(jīng)過序列分析.采用QiagenMaxi試劑盒(Qiagen)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書將大量的質(zhì)粒DNA分離。C.Fc5、Fc6和Fc7的構(gòu)建在Fc5中，將在EU索引位置218的Arg殘基被變回Lys殘基.野生型人的Igy1在該位置含有賴氨酸。簡單地說，使用寡核苷酸引物5'GAGCCCAAATCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCA3'(SEQ訓(xùn)O:19)和5'TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA3'(SEQIDNO:20)將編碼Fc5的核酸分子生產(chǎn)出來。PCR擴(kuò)增的條件如下所述.向50nl的最終體積中加入Fc4模板236ng、10Pfu反應(yīng)緩沖液(Stratagene)5nl、2.5mMdNTPs4ul、20nm的每種寡核苷酸1y1、Pfu聚合酶(2.5單位，Stratagene)l/il。擴(kuò)增溫度分布由以下組成在94t:持續(xù)2分鐘，5個循環(huán)的在94'C持續(xù)15秒鐘，42C持續(xù)20秒鐘，72t:持續(xù)45秒鐘，20個循環(huán)的在94。C持續(xù)15秒鐘，72X:持續(xù)1分鐘20秒鐘，接著在72X:延伸反應(yīng)7分鐘。用瓊脂糖凝膠電泳將反應(yīng)產(chǎn)物分離，將與預(yù)測尺寸相對應(yīng)的大約718個堿基對的條帶檢出。從凝膠中將該條帶切下，并且使用QIAGENQIAquickGelExtraction試劑盒(Qiagen)根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行回收。除羧基末端的賴氨酸密碼子已經(jīng)被除去之外，F(xiàn)c6與Fc5相同。如在Fc4和Fc5中所述的，F(xiàn)c6序列中的終止密碼子變?yōu)門M。Fc6用寡核普酸引物5，GAGCCCAAATCTTCAGACAAAACTCACACATGCCCA3，(SEQIDNO:19)和5'GGCGCGCCTCTAGATTAACCCGGAGACAGGGAGAGGC3，(SEQIDN0:21)編碼Fc5的模板DNA產(chǎn)生的。除在位于CH2結(jié)構(gòu)域的EU索引位置Asn297的氨基酸取代物之外，F(xiàn)c7與野生型Y1Fc相同。將Asn297突變?yōu)镚in殘基，以防止在該殘基位置的N聯(lián)接的碳水化合物的附著。如上所迷，在Fc7序列中的終止密碼子被變?yōu)門M。Fc7是通過重疊PCR產(chǎn)生，用野生型人IgGv1FccDNA作為模板和寡核苷酸引物5，GAGCCCAAATCTTGCGACAAMCTCACA3，(SEQIDNO:22)和5'GTACGTGCTTTGGTACTGCTCCTCCCGCGGCTT3'(SEQIDNO:23)以產(chǎn)生Fc7的5，半、以及寡核苷酸引物5'CAGTACCAAAGCACGTACCGTGTGGTCA3'(SEQIDNO:24)和5'TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA3'(SEQIDNO:20)以產(chǎn)生Fc7的3，半。將兩種PCR產(chǎn)物組合，并且用寡核苷酸引物5'GAGCCCAAATCTTGCGACAAMCTCACA3'(SEQIDNO:22)和5'TAATTGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGACA3'(SEQIDNO:20)擴(kuò)增。將全部所得PCR產(chǎn)物凝膠純化，克隆，并且用DNA序列分析確認(rèn)。D.氨基端被截短的TACI-Fc融合蛋白質(zhì)的構(gòu)建四種氨基端被截短TACI-Fc的版本被產(chǎn)生出來。四種全都具有與SEQIDNO:2氨基酸殘基30號融合的修飾過的人組織纖溶酶原激活蛋白的信號序列(SEQIDNO:25)。但是，這四種蛋白質(zhì)在Fc5與SEQIDNO:2的TACI氨基酸序列融合的位點(diǎn)上不同。表3列出了四種融合蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。表3TACI融合蛋白質(zhì)■^,-----!......TACI-Fc的名稱'TACI氨基酸殘基TACI(dl-29)~Fc5SEQIDNO:2的30到154TACI(dl-29，dl07-154)-Fc5SEQIDNO:2的30到106TACI(dl-29，dlll-154)-Fc5SEQIDNO:2的30到110TACI(dl-29,dl20-154)-Fc5'SEQIDNO:2的30到119蛋白質(zhì)編碼表達(dá)盒采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過重疊PCR產(chǎn)生(可參閱，例如Horton等人，"e力e77:61(1989))。將編碼TACI的核酸分子和編碼Fc5的核酸分子用作PCR的模板。寡核苷酸引物在表4和表5中被列出。表4用于生產(chǎn)TACI融合蛋白質(zhì)的寡核香酸引物TACI-Fc的名稱''.寡核苷酸名稱i5'TACI3'TACI5'Fc53'Fc5TAC柳-29)-^c5ZC24鄰3ZC24,955ZC24灘ZC24》46TACI(dl-29，dl07-154)-Fc5ZC24鄰3ZC24，951ZC24,949ZC24》46TACI(dl-29，dlll-154卜Fc5ZC24,903ZC28,978ZC28>979ZC24,946TACI(dl-29，dl20-154)-Fc5ZC24卿ZC28，981ZC28,980ZC24,946表5寡核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>第一輪的PCR擴(kuò)增由兩種反應(yīng)來組成得到四種氨基末端被截短的各版本。對于每一個版本，在一種反應(yīng)中用5，和3，TACI寡核普酸，而在另一種反應(yīng)中用5，和3，F(xiàn)c5寡核苷酸，分別進(jìn)行兩種反應(yīng)。第一輪的PCR擴(kuò)增的條件如下所述。向25M1的最終體積中加入DNA模板大約200ng、10xPfu反應(yīng)緩沖液(Stratagene)2.5n1、2.5mMdNTPs2p1、20jiM的5，寡核苷酸和3，寡核芬酸各O.5m1、Pfu聚合酶(2.5單位，Stratagene)0.5p1。擴(kuò)增溫度分布由以下組成在94X:持續(xù)3分鐘，35個循環(huán)的在94X:持續(xù)15秒鐘，50"C持續(xù)15秒鐘，72X:持續(xù)2分鐘，接著在72X:延伸反應(yīng)2分鐘.用瓊脂糖凝膠電泳將反應(yīng)產(chǎn)物分離，將與預(yù)測尺寸相對應(yīng)的條帶從凝膠中切下，并且使用QIAGENQIAquickGelExtraction試劑盒(Qiagen)根據(jù)制造商的說明書進(jìn)4亍回收。第二輪的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或重疊PCR擴(kuò)增反應(yīng)，是采用從第一輪PCR凝膠純化的片段作為模板而進(jìn)行的.第二輪的PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件如下所述。向25Ml的最終體積中加入TACI片段和Fc片段的DNA模板每種大約10ng、10xPfu反應(yīng)緩沖液(Strategene)2.5n1、2.5mMdNTPs2n1、20nMZC24,903(SEQIDNO:40)和ZC24,946(SEQIDN0:20)各0.5m1以及Pfu聚合酶(2.5單位，Stratagene)0.5m1。擴(kuò)增溫度分布由以下組成在94t:持續(xù)l分鐘，35個循環(huán)的在94X:持續(xù)15秒鐘，55C持續(xù)15秒鐘，72X:持續(xù)2分鐘，接著在72C延伸反應(yīng)2分鐘。用瓊脂糖凝膠電泳將反應(yīng)產(chǎn)物分離，將與預(yù)測尺寸相對應(yīng)的條帶從凝膠中切下，并且使用QIAGENQIAquickGelExtraction試劑盒(Qiagen)根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行回收。對于四種版本的氨基末端被截短的TACI-Fc的PCR產(chǎn)物，將每種都分別使用Invitrogen，sZER0BLUNTT0P0PCRCloning試劑盒，按照制造商推薦的方法克隆。表6確定了這些TACI-Fc構(gòu)建體的核苷酸和氨基酸序列。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>在核苷酸序列得到驗(yàn)證后，將包含氨基末端被截短的TACI-Fc融合物的四種版本中的各種的質(zhì)粒用Fsel和Ascl酶切消化，以釋出編碼氨基酸的片段。將FseI-Ascl片段連接到含有CMV啟動子和SV40多A片段的哺乳動物表達(dá)載體中.將表達(dá)栽體引入到如下所述的中國倉鼠卵巢細(xì)胞中。實(shí)施例2用中國倉鼠卵巢細(xì)胞生產(chǎn)TACI-Fc蛋白質(zhì)借助于電轉(zhuǎn)染，將TACI-Fc表達(dá)構(gòu)建體用來轉(zhuǎn)染在無動物蛋白的培養(yǎng)基中生長的適應(yīng)懸浮的中國倉鼠卵巢(CH0)DG44細(xì)胞(Urlaub等人，6b瓜#o7ec.6"e/et12:555(1986))。由于在兩個二氬葉酸還原酶染色體位置的缺失，CHODG44細(xì)胞缺少功能性二氫葉酸還原酶基因。在氨甲蝶呤濃度增加的情況下，細(xì)胞的生長導(dǎo)致表達(dá)構(gòu)建體上二氫葉酸還原酶基因和連接的編碼重組蛋白質(zhì)的基因的擴(kuò)增。將CHODG44細(xì)胞在PFCHO培養(yǎng)基(JRHBiosciences,Lenexa，KS)、4mML-谷氨酰胺(JRHBiosciences)、和lxhypothanxine-胸苷補(bǔ)液(LifeTechnologies)中傳代，然后在37C和5%0)2的條件下將該細(xì)胞在置于旋轉(zhuǎn)式搖動平臺上以120RPM旋轉(zhuǎn)的Corning搖動燒瓶中溫育。將該細(xì)胞用線性化的表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染。為確保無菌，將Eppendorf試管中的質(zhì)粒DNA200mg與剪切的鮭魚精子(salmonsperm)載體DNA(5，—3，Inc.Boulder,CO,10mg/ml)20u1、3MNa0Ac(pH值5.2)22m1、以及100%乙醇(GoldShieldChemicalCo.，Hayward，CA)484pi混合，在冰上進(jìn)行25分鐘的單次乙醇沉淀。溫育后，將試管置于在4X:冷室中的無菌臺(邁icrofuge)中以14，000RPM離心，去上層清液，然后將沉淀用70%乙醇0.5ml洗滌兩次，之后讓其風(fēng)干.當(dāng)通過在25ml錐形離心試管中以900RPM持續(xù)5分鐘離心總共106細(xì)胞(16.5ml)，將DNA沉淀進(jìn)行干燥時，CHODG44細(xì)胞被制備出。將CHODG44細(xì)胞重新懸浮于總量300m1的PFCHO生長培養(yǎng)基中，之后放入帶有0.4cm電極缺口的基因脈沖杯(Gene-PulserCuvette)(Bio-Rad)中。大約干燥50分鐘后，將DNA在500m1PFCHO生長培養(yǎng)基中重新懸浮，加入杯中的細(xì)胞中以使總量不超過800nl，并且讓其置于室溫中持續(xù)5分鐘以減少氣泡形成。將杯置于0.296kV(千伏)和0.950HC(高電容)的BioRadGenePulserII設(shè)備中，并立即電穿孔。在將細(xì)胞放置于在CoStarT-75燒瓶中的總量20ml的PFCHO培養(yǎng)基中之前，將細(xì)胞在室溫溫育5分鐘'將燒瓶置于在37X:和596C02的條件下48小時，然后，在利用錐蟲藍(lán)不相容性通過血細(xì)胞記數(shù)器對細(xì)胞記數(shù)，并放入不含hypothanxine-胸苷補(bǔ)充液而含有200mM氨甲蝶呤(CalBiochem)的PFCH0選擇培養(yǎng)基中。氨甲蝶呤選擇過程的回收時，采用蛋白質(zhì)印跡分析，檢測含有分泌的TACI-Fc蛋白質(zhì)的條件培養(yǎng)基。實(shí)施例3TACI-Fc蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析在某些情況下，TACI-Fc融合蛋白質(zhì)在分析之前被部分純化。將中國倉鼠卵巢細(xì)胞培養(yǎng)的條件培養(yǎng)基通過0.22pm的濾器進(jìn)行無菌過濾，并且將其TACI-Fc蛋白捕獲在蛋白質(zhì)A柱上。結(jié)合蛋白質(zhì)A的物質(zhì)被洗脫，并通過S-200大小排阻柱而進(jìn)行最終的純化。細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和純化的蛋白質(zhì)兩者上均進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，以評定TACI-Fc蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。簡單的說，將蛋白質(zhì)或上層清液的樣品轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，并用綴合過氧化物酶的羊抗鼠IgG2a(BoehringerMannheim),或綴合過氧化物酶的羊抗人IgGFc特異性抗血清(Pierce)檢測TACI-Fc蛋白質(zhì)。氨基末端的氨基酸序列分析在來自PerkinElmerAppliedBiosystemsDivision(FosterCity,CA)的Model476A和494蛋白質(zhì)測序系統(tǒng)上進(jìn)行'數(shù)據(jù)分析用AppliedBiosystemsModel610A蛋白質(zhì)測序的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，2.la版進(jìn)行.所用的絕大多數(shù)的設(shè)備和試劑來自AppliedBiosystems,Inc.實(shí)施例4TACI-Fc蛋白質(zhì)的功能分析采用兩種方法檢測四種TACI-Fc蛋白質(zhì)與ZTNF4的結(jié)合特性。一種方法測定TACI-Fc構(gòu)建體與TACI覆蓋的平板竟?fàn)?25I-標(biāo)記的ZTNF4的能力。在第二種方法中，增加濃度的1251-標(biāo)記的ZTNF4與每種TACI-Fc構(gòu)建體一起被溫育，并測定與沉淀的ZTNF4-TACI-Fc復(fù)合物相關(guān)的放射活性。TACI-Fc融合蛋白質(zhì)具有缺少SEQIDN0:2氨基酸序列的前29個氨基酸殘基的TACI部分。一種融合蛋白質(zhì)具有帶完整柄區(qū)的TACI部分(TACI(dl-29)-Fc5)，而其它三種融合蛋白質(zhì)具有在柄區(qū)有多種缺失的TACI部分(TACI(dl-29，dl07-154)-Fc5;TACI(dl-29,dill—154)—Fc5;TACI(dl—29，d120-154)—Fc5)。A.竟?fàn)幮越Y(jié)合測定根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，用Iodobeads(Pierce)放射碘化ZTNF4。簡單地說，采用用單個Iodobeads,將50^gZTNF4用4mCi的1251硤化。用0.25%的牛血清白蛋白溶液猝滅反應(yīng)，使用PD-10柱(Pierce)通過凝膠過濾去除游離1251。在脫鹽步驟之前和之后用三氯乙酸沉淀檢測1251-ZTNF4制備物的特異性放射活性。將被稱為"TACI-N"的TACI受體的N-末端片段加到96孔平板(0.1Mg/ml，共100m1)，在4t:下溫育過夜.洗滌平板，用Superblock(Pierce)封閉，然后再洗滌。將TACI-Fc構(gòu)建體，以0到11.5ng/ml范圍內(nèi)的不同濃度，與固定濃度的125I-ZTNF4(20ng/ml)混合，然后在用TACI-N覆蓋的平板上在37"C溫育2小時.對照物在溶液中含有TACI-N，或者不含有TACI-Fc。溫育后，洗滌平板并且記數(shù)。每種測試三次進(jìn)行。結(jié)果顯示，TACI-Fc構(gòu)建體在濃度大約100ng/ml或更高的情況下完全抑制1251-ZTNF4的結(jié)合。TACI-Fc蛋白質(zhì)、TACI(dl-29)-Fc5、TACI(dl-29，dlll-154)-Fc5和TACI(dl-29，d120—154)-Fc5與TACI-Fc構(gòu)建體，TACI(dl-29，d107-154)-Fc5相比，是更有效的抑制劑。單獨(dú)的Fc片段不抑制結(jié)合.對三種實(shí)驗(yàn)的每種構(gòu)建體計算IC50值。各種構(gòu)建體的平均值是TACI(dl-29)-Fc5:2.07nM;TACI(dl-29，dl07-154)—Fc5:4.95nM;TACI(dl—29,d111—154)—Fc5:2.31nM;和TACI(dl-29,dl20-154)-Fc5:2.21nM,B.溶液結(jié)合測定以0.05nM濃度，將每種TACI-Fc構(gòu)建體以0.25ml/試管的總體積在室溫下與0.4pM到1.5nM的1251-ZTNF4—起溫育30分鐘。向每個試管加入Pansorbin(Staph)懸浮液，15分鐘后，將樣品離心處理，洗滌兩次，將沉淀記數(shù)。通過將130nM未標(biāo)記的ZTNF4加入1251-ZTNF4/TACI-Fc的混合物中，測定非特異性的結(jié)合。通過從在每種1251-ZTNF4濃度下結(jié)合的總cpm減去在未標(biāo)記ZTNF4存在下結(jié)合的cpm來計算特異性結(jié)合。每種測試重復(fù)三次進(jìn)行'結(jié)合常數(shù)采用GraphPadPrism軟件(Macintoshv.3.0)計算。圖4說明了125I-ZTNF4與多種TACI-Fc構(gòu)建體的特異性結(jié)合。與每種構(gòu)建體的結(jié)合都顯示接近飽和，并且構(gòu)建體TACI(dl-29)-Fc5、TACI(dl-29，dlll-154)-Fc5、TACI(dl-29,d120—154)—Fc5與TACI(dl-29，dl07-154)-Fc5的結(jié)合相比較則更高。將Bmax和Kd值計算出來，其結(jié)果總結(jié)在表7中。表71251-ZTNF4與TACI-Fc構(gòu)建體的結(jié)合TACI-Fc構(gòu)建體Kd(nM)Bmax(nM)TACI(dl-29)-Fc50.1340.023TACI(dl-29，dl07-154)-Fc50.1210.010TACI(dl-29，dl11-154)-Fc50.1150.018TACI(dl-29,dl20-154)-Fc50.0920.021實(shí)施例5循環(huán)ZTNF4的測定采用電化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)，測定有著疾病情況的(例如SLE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)個體相對于正常個體的ZTNF4水平。再用ORIGIN緩沖液(Igen，Gaithersburg,MD)中制備的10ng/ml、1ng/ml、0-1ng/ml、0.01ng/ml和0ng/ml的人的可溶的ZTNF4,繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。將血清樣品在ORIGIN緩沖液中稀釋。將標(biāo)準(zhǔn)和樣品與在ORIGINAssay緩沖液(IGEN)稀釋到1Pg/ml的生物素化的兔抗人ZTNF4-NFBV抗體和用ORIGINAssay緩沖液(IGEN)稀釋到1pg/ml的ruthenylated兔抗人ZTNF4-NFBV多克隆抗體一起，在室溫下溫育2小時。溫育后，將樣品旋動并且將0.4mg/ml鏈酶抗生物素Dynabeads(Dynal，Oslo,挪威)以50m1/管加入到每個標(biāo)準(zhǔn)和樣品中，在室溫下溫育30分鐘。然后將樣品旋動，并且根據(jù)生產(chǎn)商的說明書用OriginAnalyzer(Igen)分析儀分析樣品。Origin實(shí)驗(yàn)是以電化學(xué)發(fā)光為基礎(chǔ)的并且以ECL顯示讀數(shù)。在一項(xiàng)研究中，從兩種都已經(jīng)進(jìn)展為腎小球腎炎和自身免疫疾病晚期的NZBWF1/J和MRL/Mpj-Fas1"小鼠得到的血清樣品中檢測到ZTNF4水平的增加。ORIGINASSAY也被用于檢測相對于正常個體循環(huán)水平的SLE患者血液中的ZTNF4的水平。用ORIGIN緩沖液(Igen)中制備的10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml和0ng/ml的人的可溶的ZTNF4,繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。所有患者樣品以25m1的最終體積重復(fù)三次進(jìn)行。將標(biāo)準(zhǔn)和樣品與用ORIGINAssay緩沖液(IGEN)稀釋到lyg/ml的捕捉抗體、生物素化的兔抗人ZTNF4-NFBV多克隆抗體和用ORIGINAssay緩沖液(IGEN)稀釋到lpg/ml的檢測抗體、ruthenylated兔抗人ZTNF4-NFBV多克隆抗體一起，在室溫下溫育2小時。溫育后，將樣品旋動并且將0.4mg/ml鏈酶抗生物素Dynabeads(Dynal)以50p1/管加入到每個標(biāo)準(zhǔn)和樣品中，在室溫下溫育30分鐘。然后將樣品旋動，并且根據(jù)生產(chǎn)商的說明書用Origin1.5Analyzer(Igen)分析儀分析樣品。該實(shí)驗(yàn)包括28個正常對照樣品和20個來自診斷為SLE的患者的樣品。與正常對照血清供者相比較，從診為SLE的患者的血清中觀察到ZTNF4水平的提高。與任意人群參考血清樣品相比較，ZTNF4水平被計算出在患者或?qū)φ諛悠分衂TNF4水平成倍提高。28個對照樣品的平均值高于人群參考樣品1.36倍，而20個SLE患者的樣品的平均值則是4.92倍。20個SLE患者中的7個具有高于對照樣品的平均值2倍的ZTNF4水平，而僅有一個對照個體高于對照樣品的平均值2倍以上。序列表<110>ZymoGenetics.Inc.<120>TACI-免疫球蛋白融合蛋白<130>01-20PC<150>60/293,343<151>2001-05-24<160>70<170>FastSEQforWindowsVersion3.0<210>1<211>1377<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(14)...(892)<400>1agcatcctgagtaatgagtggcctgggceggageaggcgaggtggcegg49MetSerGlyLeuGlyArgSerArgArgGlyGlyA「g1510agecgtgtggaccaggaggagcgctttccacagggcctgtggacgggg97SerA「gValAspGinGluGluArgPheProGinGlyLeuTrpThrGly152025gtggetatgagatectgccccgaagagcagtactgggatcctctgctg145ValAlaMetArgSerCysProGluGluGinTyrTrpAspProLeuLeu303540ggtacctgcatgtectgcaaaaccatttgcaaccatcagagecagcgc193GlyThrCysMetSerCysLysThrlieQysAsnHisGinSerGinArg45505560acctgtgcagccttcThrQysAlaAlaPhe65tgcaggteaetcagetgccgcaaggagcaaggcCysArgSerLeuSerCysArgLysGluGinGly7075241aagttctatgaccatLysPheTyrAspHis80etcctg卿gactgcateagetgtgcctecateLeuLeuArgAspCyslieSerCysAlaSerlie8590289tgtggacagcaccctQysGlyGinHisPm95aagcaatgtgcatacttctgtgagaacaagetcLysGinCysAlaTyrPheCysGluAsnLysLeu100105337aggageccagtgaacArgSerProValAsn110cttccaccagagetcaggagac的eggagtggaLeuProProGluLeuArgArgGinArgSerG"ly115120385gaagttgaaGluValGlu125aacaatteagacaactegggaaggtaccaaggattggagAsnAsnSerAspAsnSerGlyArgTyrGinGlyLeuGlu130135140433cacagaggcteagaagcaagtccagetetcccggggctgaagctgagtHisArgGlySerGluAlaSerProAlaLeuProGlyLeuLysLeuSer145150155481gcagatcaggtggccctggtctacageacgctggggetctgcctgtgtAlaAspGinValAlaLeuValTyrSerThrLeuGlyLeuCysLeuCys扁165170529gccgtcetctgctgcttcctggtggcggtggcctgcttcetcaagaagAlaValLeuCysCysPheLeuValAlaValAlaCysPheLeuLysLys175180185577aggggggatccctgctectgccagccccgctc3柳ccccgtcaaagtArgGlyAspProCysSerQysGinProArgSerArgProArgGinSer1901%200625ccggccaagtctteccaggatcacgcgatggaagccggcagecctgtgProAlaLysSerSerGinAspHisAlaMetGluAlaGlySerProVal205210215220673ageacateccccgagccagtggagacctgcagettctgcttccctgagSerThrSe「ProGluProValGluThrQysSerPheCysPheProGlu22523023572183tgcagggcgCysArgAlacccPro240acgThrcagGingagGluageSergcaAla245gtcValacgThrcctProgggGly3CCThr250cccg3CProAsp769cccacttgtgetggaaggtgggggtgccacaccaggaccaca.gtcctgProThrQysAlaGl_yArgTrpGlyCysHisThrArgThrThrValLeu255260265817cagccttgcccacacateccagacagtggccttggcattgtgtgtgtgGinProQysProHislieProAspSerGlyLeuGlylieValCysVal270275280865cctgcccaggaggggggcccaggtgcataaatgggggtcagggagggProAlaGinGluGlyGlyProGlyAla2852卯912aa卿卿aggagagatatgg柳gagagaggcagagaaggggagagaggggggcactctgcaataaagtaaacctttggggagagagataggagagagagagac柳gggaaagagacacagagagacagagtcccagtcctcgtgcctcagctgccctggagaggagggacagagg的gagagagagaggcagagasggagagggagatcccagtgcagctgctcacatcctcaaaaaggagagagaagcagaa柳gcagaggggaagagagaggcagagggacagagctgtaggtcgcccccgaga3333333333agagaggtggagagaaacaggagaggcagagaga卿agagagagatagagtcatcacctgcccctcctc33333ggag卿gga972aggagacaga1032gagggaaaga1092gaggcagaga1152gcaggaggtc1212aaccacacgt1272ctggagaata13321377<210>2<211>293<212>PRT<213>人<400>2MetSerGl_yl_euGlyArgSerArgArgGlyGlyArgSerArgValAsp151015GinGluGluArgPheProGinGlyLeuTrpThrGlyValAlaMetArg202530SerCysProGluGluGinTyrTrpAspProLeuLeuGlyThrCysMet354045SerQysLysThrlieQysAsnHisGinSerGinArgThrCysAlaAla505560PheQysArgSerl_euSerCysA「gLysGluGinL_ysPheTyrAsp65707580HisLeuLeuArgAspCyslieSer85ProLysGinCysAlaTyrPheQys100AsnLeuProProGluLeuArgArg115120AsnSerAspAsnSerGlyArgTyr130135GluAlaSerP「oAlaLeuProGly145150AlaLeuValTy「SerThrLeuGly165Q/sPheLeuValAlaValAlaCys180CysSerCysGinProA廠gSerArg195200Se廣GinAspHisAlaMetGluAla210215GluProValGluThrCysSe廣Phe225230ThrGinGluSerAlaValTh「Pro245GlyArgTrpGlyQysHisThrArg260HisliePmAspSerGlyLeuGly275280GlyProGlyAla2卯<210>3<211>285<212>PRT<213>人<400>3MetAspAspSerThrGluArgGlu15LysLysArgGluGluMetLysLeu20ArgLysGluSerProSerValArg3540CysAlaSerlieCysGlyGinHis9095GluAsnLysLeuArgSerProVal105110GinArgSerGlyGluValGluAsn125GinGlyLeuGluHisA「gGlySe廣140匕euLysLeuSerAlaAspGinVa-1155160LeuCysLeuCysAlaValLeuQys170175PheLeuLysUysArgGlyAspPro185190ProArgGinSerProAlal_ys'Ser205GlySerProValSe廣ThrSerPro220QysPheProGluCysArgAlaPro235240GlyThrProAspProThrCysAla250255ThrThrValLeuGinProCysPro265270lieValCysValProAlaGinGlu285GinSerArgl_euThrSerCysLeu1015LysGluCysValSerlieLeuPro2530SerSerLysAspGlyLysLeuLeu45AlaAlaThrLeuLeuLeuAlaLeu5055Se「PheTyrGinValAlaAlaLeu6570AlaGluLeuGinGlyHisHisAla85AlaProLysAlaGlyLeuGluGlu100LysliePheGluProProAlaPro115120SerArgAsnL_ysArgAlaValGin130135AspCysLeuGinLeulieAlaAsp145150GlySerTy「ThrPheValProTrp165AlaLeuGluGluLysGluAsnLys180PhePhelieTyrGlyGinValLeu195200GlyHisLeulieGinArgLysLys210215SerLeuValTh廣LeuPheArgCys225230Pro.AsnAsnSerQysTyrSerAla245AspGluLeuGinLeuAlaliePro260AspGlyAspValThrPhePheGly275280LeuSerQ/sCysLeuThrValVal60GinGlyAspLeuAlaSerLeuArg7580GluLysLeuProAlaGlyAlaGly卯95AlaProAlaValThrAlaGlyLeu105110GlyGluGlyAsnSerSerGinAsn125GlyProGluGluThrValThrGin140SerGluThrProThrlieGinLys55160Leul_euSerPheLysArgGlySer170175lieLeuValLysGluThrGlyTyr185190TyrThrAspLysThrTyrAlaMet205ValHisValPheGlyAspGluLeu220lieGinAsnMetProGluThrLeu235240GlylieAlaLysLeuGluGluGly250255ArgGluAsnAlaGinlieSerLeu265270AlaLeuLysLeuLeu285<210>4<211>250<212>PRT<213>人<400>4MetProA〗aSerSerP「oPheLeuLeuAlaProLysGlyP「oProGly151015AsnMetGlyGlyProValArgGluProAlaLeuSerValAlaLeuTrp202530LeuSerTrpGlyAlaAlaLeuGlyAlaVa]AlaCysAlaMetAlaLeu354045LeuTh廣GinGinThrGluLeuGinSe廣l_euA「gArgGluValSerArg505560LeuGinGlyTh「Gl_yGlyProSerGinAsnGlyGluGlyTyrProTrp65707580GinSerl_euProGluGinSerSe廣AspAlal_euGluAlaTrpGluAsn859095GlyGluArgSerArgLysArgArgAlaValLeuThrGinLysGinLys100105110LysG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uGluGinTyrAsnSerThr190195taccgtgtggtcagegtcetcaccTyrArgValValSerValLeuThr200628gtcctgcaccaggactggctgaatValLeuHisGinAspTrpLeuAsn205210ggcaaggagtacaagtgcaaggtcGlyLysGluTyrLysQysLysVal215220676tecaac3aagccSerAsnL_ysAlaetcccatectecategagaaaaccatetecaaagccLeuProSerSerlieGlul_ysThrlieSerI_ysAla225230235724aaagggcagcccUysGlyGinPro240cgagaaccacaggtgtacaccctgcccccateceggArgGluProGinValTyrThrLeuProProSerA「g245250772gatgagctgaccAspGlul_euThr255aagaaccaggtcagectgacctgcctggtcaaaggcLysAsnGin.ValSe「LeuThrCysLeuValLysGly260265820ttctatcccagegacategccgtggagtgggagageaatgggcagccgPheTyrProSerAsplieAlaValGluTrpGluSe「AsnGlyGinPro270275280868gagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactecgacggctecGluAsnAsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySer2852卯295300916ttcttcetctacageaagetcaccgtggacaagageaggtggcagcagPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSe廠ArgT「pGinGin305310315964gggaacgtcttcteatgctecgtgatgcatgaggetctgcacaaccacGlyAsnValPheSerQysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHis3203253301012tacacgcagaagageetctecctgtctccgggtaaataatctagagTyrThrGinLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys3353401058gcgcgccaatta1070<210>52<211>344<212>PRT<213>人工序列<220><223>nArgArgLeuArgGlyAlaSer100105.110437578586SerAlaGluAla115ProAspGlyAsp120LysAspAlaProGluP廣oLeu125AspLysVallieliel_euSerProGlylieSerAspAlaThrAlaProAla130135140TrpProProProGlyGluAspP「oGlyThrTh「ProProGlyHisSer145150155160ValProValP「oAla165ThrGluLeuGlySerThrGluLeuValThr170175ThrLysThrAlaGly180ProGluGinGin<210>61<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>26-10VH信號序歹U<400>61MetGlyTrpSerTrpliePheLeuPheLeuLeuSerGlyThrAlaGly151015Vall_euSer<210>62<211>332<212>PRT<213>人工序列<220><223>融合蛋白<400>62MetGlyTrpSerTrpliePheLeuPheLeuLeuSerGlyThrAlaGly151015ValLeuSerAlaMetArgSerCysProGluGluGinTyrTrpAspPro202530LeuLeuGlyThrQysMetSerCysLysThrlieCysAsnHisGinSer354045GinArgThrCysAlaA〗aPheCysArgSerLeuSerQysArgLysGlu505560GinGlyLysPhe65Se「lieQysGlyLysLeuArgSer100ProCysProAla115ProProLysPro130Th「CysValVal145AsnTrpTyrValArgGluGluGin180ValLeuHisGin195Se廣AsnLysAla210LysGlyGinPro225AspGluLeuThrPheTyrProSer260GluAsnAsnTyr275PhePheLeuTyr2卯GlyAsnValPhe305TyrThrGinLyslieSerCysAla80PheCysGluAsn95HisThrCysPro110ValPheLeuPhe125ThrProGluValGluValLysPhe160LysThrLysPro175SerValLeuThr190UysQysLysVal205lieSerL_ysAlaProProSerArg240LeuValLysGly255AsnGlyGinPro270SerAspGlySer285ArgTrpGinGinLeuHisAsnHis320TyrAspHisLeuLeuArgAspCys7075GinHisProLysGinQysAlaTyr8590GluProLysSerSerAspLysThr105ProGluAlaGluGlyAlaProSe廣120LysAspThrLeuMetlieSe廣Arg135140ValAspValSermsGluAspPro150155AspGlyValGluValHisAsnAla165170TyrAsnSerThrTyrArgValVal185AspTrpLeuAsnGlyLysGluTyr200l_euProSerSerlieGluLysThr215220ArgGluProGinValTyrThrLeu230235LysAsnGinValSerl_euThrCys245250AsplieAlaValGluTrpGluSer265LysThrThrProProValLeuAsp280SerLysLeuThrValAspLysSer295300SerCysSerValMetHisGluAla310315SerLeuSerLeuSerProGlyLys325330<210>63<211>51<212>,<213>人工序列<220><223>26-10VH5'UTR.<400>63aacatatgtccaatgtcctctccacagacactgaacacactgactccaacg51<210>64<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>修飾的26-10VH5'U丁R.<400>64aacatatgtccaatgtcctctccacagacactgaacacactgactgccacc51<210>65<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223〉26-10VH信號序歹!J<221>CDS<222>(1)...(57)<400>65atgggatggagetggatetttetctttcttteaggaactgcaggt48MetGlyTrpSerTrpliePheLeuPheLeuLeiiSerGlyThrAlaGly151015gtcetctct57ValLeuSer<210>66<211>84<212>隨<213>人工序列<220i><223>26-10VH內(nèi)含子<400>66gtaaggggctccccagttccaaaatctgaagaaaagaaatggcttgggatgtcacagata60tccactctgtctttctcttcac3g84<210>67<211>1135<212>DNA<213>人工序列<220><223>融合蛋白<400>67aacatatgtccaatgtcctctccacagacactgaacacactgactccaacgatgggatgg60agctggatctttctctttcttctgtc卿aactgcaggtaaggggctccccagttccaaa120atctgaagaaaagaaatggcttgggatgtcacagatatccactctgtctttctcttcaca180ggtgtcctctctgctatgagatcctgccccgaagagcagtactgggatcctctgctgggt240acctgcatgtcctgcaaaaccatttgcaaccatcagagccagcgcacctgtgcagccttc300tgc鄉(xiāng)tcactcagctgccgca柳agcaaggcaagttctatgaccatctcctgagggac360tgcatcagctgtgcctccatctgtggacagcaccctaagcaatgtgcatacttctgtgag420aacaagctcaggagcgagcccaaatcttcagacaaaactcacacatgcccaccgtgccca480gcacctgaagccgagggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacacc540ctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagac600cctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaag660ccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcac720caggactggctgaatggcaa'ggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccatcc780tccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacacc840ctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaa900ggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccgg柳acaac960tacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctc1020accgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag1080gctctgcacaaccacta'cacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaataaa1135<210>68<211>1135<212>瞧<213>人工序列<220><223>融合蛋白<400>68aacatatgtccaatgtcctctccac柳cactgaacacactgactgccaccatgggatgg60agctggatctttctctttcttctgtcaggaactgcaggtaaggggctccccagttccaaa120atctgaagaaggtgtcctctacctgcatgttgcaggtcactgcatcagctaacaagctcagcacctgaagctcatgatctcctgaggtcaccgcggg卿caggactggctccatcgagactgcccccatggcttctatctacaagaccaaccgtggacagctctgcacaaagaaatggcctgctatgagcctgcaaaactcagctgccggtgcctccatggagcgagccccgagggggccccggaccccagttcaactgagcagtacaatgaatggcaaaaaccatctccccgggatgaccagcgacatcgcctcccgt柳gc卿tg3CC2!Ct3C3Cttgggatgtcatcctgcccccatttgcaacca鄉(xiāng)agcaactgtggacagcaaatcttcaaccgtcagtctgaggtcacagtacgtggaccagcacgtacggagtacaagca3鄉(xiāng)c333gctgaccaagcgccgtggaggctggactccgcagc柳gggcagaagagcacagatatccgaagagcagtcatcagagccggcaagttctcaccctaagcgacaaaactcttcctcttcctgcgtggtggggcgtggaggcgtgtggtcatgcaaggtctgggcagccccaaccaggtcatgggagagcagacggctcct33cgtcttctctctccctgtactctgtcttactgggatcc3gcgc3cctgatgaccatctaatgtgcataacacatgccctggacgtgagtgcataatgcgcgtcctcaccc3ac333gcgagaaccacagcctgacctgatgggcagcctcttcctctacatgctccgtctccgggtaatctcttcacatctgctgggttgcagccttccctgagggaccttctgtgagaccgtgcccacaaggacacccc3cga3gacca柳caaagcgtcctgcaccctcccatccggtgtacacccctggtcaaaggagaacaaccagcaagctcgatgcatgag3t33a180240300360420■540600660720780細(xì)900960102010801135<210>69<211>884<212>隨<213>人工序列<220><223>CW增強(qiáng)子/MPSVLTR啟動子構(gòu)建物<400>69cgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgccca60ttgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgt120caatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatg180ccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccag240tacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctatt300accatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacgg360ggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttgaatgaaagacccc4203cctgtaggt￡tggcaagctagcttaagtaacgccatttgcaaggcatggaaaaatacat480aactgagaatag柳agttcagatcaaggtc柳aacagagaaacaggagaatatgggcc540aaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccgctcagggccaagaacagttggaaca600ggagaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccgctcagggccaa660gaacagatggtccccagatcggtcccgccctcagcagtttctagagaaccatcagatgtt720tccagggtgcccca柳acctgaaatgaccctgtgccttatttgaactaaccaatcagtt780cgcttctcgcttctgttcgcgcgcttctgctccccgagctcaataaaagagcccacaacc840cctcactcggcgcgccagtcctccgatagactgcgtcgcccggg884<210>70<211>455<212>DNA<213>人工序列<220><223>MPSVLTR不具有負(fù)調(diào)控區(qū)的MPSVLTR啟動子<400>70aatgaaagaccccacctgtaggtttggcaagctagaaggttaggaacagagagacagcag60aatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaa120cagatggtccccagatgcggtcccgccctcagcagtttctagagaaccatcagatgtttc180cagggtgccccaaggacctgaaaatgaccctgtgccttatttgaactaaccaatcagttc240gcttctcgcttctgttcgcgcgcttctgctccccgagctcaataaaagagcccacaaccc300-ctcactcggcgcgccagtcctccgatagactgcgtcgcccgggtacccgtgttctcaata360aaccctcttgcagttgcatccgactcgtggtctcgctgttccttgggagggtctcctctg420agtgattgactacccgtcagcgggggtctttcagt45權(quán)利要求1.跨膜激活劑和鈣調(diào)節(jié)劑和親環(huán)蛋白配體相互作用劑(TACI)-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)在生產(chǎn)用于抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物中的應(yīng)用，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)包括(c)TACI受體部分，它由具有SEQIDNO2的氨基酸殘基30到154的氨基酸序列的多肽片段組成，其中TACI受體部分包含至少(I)SEQIDNO2的氨基酸殘基34到66；和(II)SEQIDNO2的氨基酸殘基71到104的序列之一，并且其中TACI受體部分至少與ZTNF2或ZTNF4之一結(jié)合，和(d)包含免疫球蛋白的恒定區(qū)的免疫球蛋白部分。2.權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其中TACI受體部分包括SEQIDNO:2的氨基酸殘基34到66，和SEQIDN0:2的氨基酸殘基71到104。3.權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其中TACI受體部分包括SEQIDNO:2的氨基酸殘基34到104.4.權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其中TACI受體部分具有SEQIDNO:2的氨基酸殘基30到IIO的氨基酸序列。5.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中免疫球蛋白部分包括重鏈恒定區(qū)。6.權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中免疫球蛋白部分包括人的重鏈恒定區(qū)。7.權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中重鏈恒定區(qū)是IgGl重鏈恒定區(qū)。8.權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中免疫球蛋白部分是包括CH2、和0結(jié)構(gòu)域的IgGlFc片段。9.權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中免疫球蛋白部分是包括SEQIDN0:33氨基酸序列的IgGlFc片段。10.權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)具有包括SEQIDN0:54氨基酸序列的氨基酸序列。11.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)是二聚體。12.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中組合物對體外培養(yǎng)的細(xì)胞給藥。13.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中組合物是包含TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)和制藥上可接受的載體的藥物組合物，并且其中藥物組合物對患有胂瘤的哺乳動物受治療者給藥。14.權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其中藥物組合物的給藥抑制哺乳動物受治療者中B淋巴細(xì)胞的增殖。15.跨膜激活劑和鈣調(diào)節(jié)劑和親環(huán)蛋白配體相互作用劑(TACI)-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)在生產(chǎn)用于在哺乳動物受治療者中抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物中的應(yīng)用，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)具有包括SEQIDN0:54氨基酸序列的氨基酸序列。16權(quán)利要求15所述的應(yīng)用，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)是二聚體。17.—種融合蛋白質(zhì)，包括(a)跨膜激活劑和鈣調(diào)節(jié)劑和親環(huán)蛋白配體相互作用劑(TACI)受體部分，其中TACI受體部分由具有SEQIDNO:2的氨基酸殘基30到154的氨基酸序列的多肽片段組成，其中TACI受體部分包括至少(I)SEQIDNO:2的氨基酸殘基34到66，和(n)SEQIDNO:2的氨基酸殘基71到104的序列之一，并且其中TACI受體部分至少與ZTNF2或ZTNF4中之一結(jié)合，和(b)包括免疫球蛋白恒定區(qū)的免疫球蛋白部分。18.權(quán)利要求17所述的融合蛋白質(zhì)，其中TACI受體部分包括SEQIDN0:2的氨基酸殘基34到66，和SEQIDNO:2的氨基酸殘基71到104。19.權(quán)利要求17所述的融合蛋白質(zhì)，其中TACI受體部分包拾SEQIDN0:2的氨基酸殘基34到104。20.權(quán)利要求17所述的融合蛋白質(zhì)，其中TACI受體部分具有SEQIDNO:2氨基酸殘基30到110的氨基酸序列。21.權(quán)利要求17所迷的融合蛋白質(zhì)，其中免疫球蛋白部分包括重鏈恒定區(qū)。22.權(quán)利要求21所述的融合蛋白質(zhì)，其中免疫球蛋白部分包括人的重鏈恒定區(qū)。23.權(quán)利要求22所述的融合蛋白質(zhì)，其中重鏈恒定區(qū)是IgGl重鏈恒定區(qū)。24權(quán)利要求23所述的融合蛋白質(zhì)，其中免疫球蛋白部分是包括CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的IgGlFc片段。25權(quán)利要求24所述的融合蛋白質(zhì)，其中免疫球蛋白部分是包括SEQIDNO:33氨基酸序列的IgGlFc片段。26權(quán)利要求25所述的融合蛋白質(zhì)，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)具有包括SEQIDN0:54氨基酸序列的氨基酸序列。27權(quán)利要求17所述的融合蛋白質(zhì)，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)是二聚體。28.編碼權(quán)利要求17所述的融合蛋白質(zhì)的核酸分子。29.權(quán)利要求28所述的核酸分子，其中核酸分子具有包括SEQIDNO:53核苷酸序列的核苷酸序列。30.—種藥物組合物，它含有制藥上可接受的栽體和跨膜激活劑和鉤調(diào)節(jié)劑和親環(huán)蛋白配體相互作用劑(TACI)-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)具有包括SEQIDN0:54氨基酸序列的氨基酸序列.31.權(quán)利要求30所述的藥物組合物，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)是二聚體。32.跨膜激活劑和鈣調(diào)節(jié)劑和親環(huán)蛋白配體相互作用劑(TACI)-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)在生產(chǎn)用于在哺乳動物受治療者中降低ZTNF4的循環(huán)血液水平的藥物中的應(yīng)用，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)包括(a)TACI受體部分，它由具有SEQIDNO:2氨基酸殘基的30到154的氨基酸序列的多肽片段組成，其中TACI受體部分包括至少(I)SEQIDN0:2氨基酸殘基34到66,和(II)SEQIDN0:2氨基酸殘基71到104的序列之一，并且其中TACI受體部分與ZTNF4結(jié)合，和(b)包括免疫球蛋白恒定區(qū)的免疫球蛋白部分。33.權(quán)利要求32所述的應(yīng)用，其中TACI受體部分包括SEQIDN0:2氨基酸殘基34到66，和SEQIDNO:2氨基酸殘基71到104。34.權(quán)利要求32所述的應(yīng)用，其中TACI受體部分包括SEQIDN0:2氨基酸殘基34到104。35.權(quán)利要求32所迷的應(yīng)用，其中TACI受體部分具有SEQIDN0:2氨基酸殘基30到110的氨基酸序列。36.權(quán)利要求32所迷的應(yīng)用，其中免疫球蛋白部分包括重鏈恒定區(qū)。37.權(quán)利要求36所述的應(yīng)用，其中免疫球蛋白部分包括人的重鏈恒定區(qū).38.權(quán)利要求37所述的應(yīng)用，其中重鏈恒定區(qū)是IgGl重鏈恒定區(qū)。39.權(quán)利要求38所述的應(yīng)用，其中免疫球蛋白部分是包括CH2、和"結(jié)構(gòu)域的IgGlFc片段.40.權(quán)利要求39所述的應(yīng)用，其中免疫球蛋白部分是包括SEQIDN0:33氨基酸序列的IgGlFc片段，41.權(quán)利要求40所述的應(yīng)用，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)具有包括SEQIDN0:54氨基酸序列的氨基酸序列。42.權(quán)利要求32所述的應(yīng)用，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)是二聚體。43.跨膜激活劑和鈣調(diào)節(jié)劑和親環(huán)蛋白配體相互作用劑(TACI)-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)在生產(chǎn)藥物中的應(yīng)用，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)具有包括SEQIDN0:54氨基酸序列的氨基酸序列。44.權(quán)利要求43所述的應(yīng)用，其中TACI-免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)是二聚體。全文摘要干預(yù)腫瘤壞死因子受體與其配體結(jié)合的分子，例如，可溶性的受體，已經(jīng)被證實(shí)在基礎(chǔ)研究中和作為治療方法均有用。本發(fā)明提供了經(jīng)過改進(jìn)的可溶性的跨膜激活劑和鈣調(diào)節(jié)劑和親環(huán)蛋白配體相互作用劑(TACI)受體。文檔編號C07K16/00GK101628111SQ20091014621公開日2010年1月20日申請日期2002年5月20日優(yōu)先權(quán)日2001年5月24日發(fā)明者J·A·格羅斯,M·W·里克森申請人:津莫吉尼蒂克斯公司