專利名稱：猴免疫球蛋白序列的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及到猴免疫球蛋白序列。
背景技術(shù)：
猴被用于抗體的評價。例如，較低等的靈長類動物如猴經(jīng)常被用作疾病研究的動物模型。在那些使用猴來研究疾病的例子中，可引入抗體來確定其處理或治療疾病的有效性。在特定例子中，測試的抗體來自其它物種。與其它任何外源抗原一樣，引入的外源抗體會觸發(fā)猴的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對該抗體的反應。例如，接受小鼠抗體的人體會產(chǎn)生針對該小鼠抗體的免疫反應(Exley A.R.et al.，Lancet 3351275-77(1990))。同樣的，在特定例子中猴會對所測試的來自其它物種的抗體產(chǎn)生抗體。猴對外源抗體的免疫反應可能會抑制這些抗體的功能，因此會阻礙對外源抗體的評估。嵌合抗體含有一種以上物種的氨基酸序列，相比那些只含有不同于宿主物種氨基酸序列的抗體，在特定例子中嵌合抗體可能會降低宿主針對其的免疫反應。例如上文所述，人會針對小鼠抗體產(chǎn)生免疫反應。當小鼠抗體的部分序列被人抗體序列取代時，人針對所得嵌合抗體的免疫反應會被降低(LoBuglio A.F.et al.，PNAS-USA 864220-24(1989))。
發(fā)明簡述
在特定實施方案中，提供的分離多肽包含選自SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14或SEQ ID NO20所列出的氨基酸序列并且還包含一個抗體重鏈可變區(qū)。在特定實施方案中，提供的分離多肽包含SEQ ID NO30所示氨基酸序列。在特定實施方案中，提供的分離多核苷酸包含含有選自SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ IDNO14或SEQ ID NO20所示氨基酸序列的多肽的編碼序列，并且還包含編碼含有抗體重鏈可變區(qū)的多肽的序列
在特定實施方案中，提供的分離多核苷酸包含編碼含有SEQ IDNO30所示氨基酸序列的多肽的序列并且還包含編碼含有抗體輕鏈可變區(qū)多肽的序列。在特定實施方案中，提供的分離抗體包含SEQ ID NO6、SEQ IDNO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO20所示的氨基酸序列及包含SEQ ID NO30所示氨基酸序列的多肽。在特定實施方案中，提供了一種制備多肽的方法。在特定實施方案中，提供了一種制備嵌合抗體的方法。在特定實施方案中，提供了一種評價抗體效果的方法，包括a)向食蟹猴(cynomolgus monkey)體內(nèi)導入一個嵌合抗體，它含有抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)以及食蟹猴抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)；及b)評價該嵌合抗體在食蟹猴體內(nèi)的效果。
附圖簡述


圖1顯示了編碼cyno3-16食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)(SEQ ID NO.1)的cDNA核苷酸序列和cyno3-16食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO.2)。圖2顯示了編碼cyno33食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)(SEQ ID NO.3)的基因組DNA核苷酸序列，和cyno33食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO.4)。圖3顯示了編碼cyno2-4食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)(SEQ ID NO.5)的基因組核苷酸序列，和cyno2-4食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO.6)。圖4顯示了編碼cyno2-4cys食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)(SEQ ID NO.7)的基因組核苷酸序列，和cyno2-4cys食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO.8)。圖5顯示了編碼cynods1食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)(SEQ ID NO.9)的基因組核苷酸序列，和cynods1食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO.10)。圖6顯示了編碼cyno439食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)(SEQ ID NO.11)的cDNA核苷酸序列，和cyno439食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO.12)。圖7顯示了編碼cyno686食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)(SEQ ID NO.13)的cDNA核苷酸序列，和cyno686食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO.14)。圖8顯示了編碼cyno35食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)(SEQ ID NO.15)的基因組核苷酸序列，和cyno35食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO.16)。圖9顯示了編碼cyno36食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)(SEQ ID NO.17)的基因組核苷酸序列，和cyno36食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO.18)。圖10顯示了編碼cyno477食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)(SEQ ID NO.19)的cDNA核苷酸序列，和cyno477食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO.20)。圖11顯示了編碼cyno32食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)(SEQ ID NO.21)的基因組核苷酸序列，和cyno32食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO.22)。圖12顯示了編碼cyno3-18食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)(SEQ ID NO.23)的cDNA核苷酸序列，和cyno3-18食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO.24)。圖13顯示了編碼cyno1-3食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)(SEQ ID NO.25)的cDNA核苷酸序列，和cyno1-3食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO.26)。圖14顯示了編碼cyno1-4食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)(SEQ ID NO.27)的cDNA核苷酸序列，和cyno1-4食蟹猴抗體重鏈恒定區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO.28)。圖15顯示了編碼cynoKappa食蟹猴抗體輕鏈恒定區(qū)(SEQ IDNO.29)的cDNA核苷酸序列，和cynoKappa食蟹猴抗體輕鏈恒定區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO.30)。圖16顯示了特定模式食蟹猴免疫球蛋白恒定區(qū)的核酸序列比對。恒定區(qū)可被分為3個序列家族，而鉸鏈編碼區(qū)表現(xiàn)出家族間的最大差異。用粗體突顯的序列是與克隆所用引物對應的內(nèi)源序列。
A.5個具有相似鉸鏈編碼序列的恒定區(qū)。
B.5個具有相似鉸鏈區(qū)的恒定區(qū)。其中兩個恒定區(qū)cyno686和cyno439中發(fā)現(xiàn)有一個21核苷酸的插入序列，而在cyno2-4、cyno2-4cy或cyno2-4ds中不存在。Cyono2-4和cyno2-4cys相同，除了41位核苷酸由G取代C，從而使Cys密碼子取代Ser密碼子。cyno2-4ds1包含cyno33的前288個核苷酸，這288個核苷酸取代了cyno2-4的前288個核苷酸。
C.4個相關(guān)恒定區(qū)。圖17顯示了特定食蟹猴免疫球蛋白恒定區(qū)序列的氨基酸序列對比。斜體部分表示CH1區(qū)域，粗體部分表示鉸鏈區(qū)，正常部分表示CH2區(qū)域，斜體并加粗部分表示CH3區(qū)域。圖18顯示了特定的可用作嵌合抗體輕鏈可變區(qū)的示例性核苷酸序列(A)和氨基酸序列(B)。列出了框架區(qū)(FR)和CDR區(qū)。圖19顯示了特定的可用作嵌合抗體輕鏈可變區(qū)的示例性核苷酸序列(A)和氨基酸序列(B)。列出了框架區(qū)(FR)和CDR區(qū)。
特定的首選實施方案詳述
這里所用的本節(jié)標題僅用來組織文章，而不是用以限制所述主題。本申請以任何目的所引用的所有或部分參考均完整的通過引用結(jié)合到本文。
定義
標準方法可用于重組DNA、寡核苷酸合成、組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(如電穿孔和脂轉(zhuǎn)染法)。酶促反應和純化技術(shù)可根據(jù)制造商說明書進行，使用本領域常規(guī)方法進行或按本文所述方法進行。上述技術(shù)和方案通?？筛鶕?jù)本領域常規(guī)方法和本文引用討論的多種通用或更具體參考所述來進行。例如參見Sambrook et al.Molecular CloningALaboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1989))，特地通過引用被結(jié)合到本文。除了明確限定，本文所述的分析化學、有機合成化學、醫(yī)學和藥學所用的命名和實驗程序和技術(shù)均為本領域熟知和常用的?？捎脴藴始夹g(shù)進行化學合成、化學分析、藥物制備、配伍和給予，以及對病人的治療。以下術(shù)語與本公開所用的一致，除非特別指明，應理解為具以下含義
這里所用的“分離的多核苷酸”指基因組DNA、cDNA或合成起源或是其某些組合的多核苷酸，由于其起源該“分離的多核苷酸”(1)不與“分離的多核苷酸”天然條件下存在于其中的多核苷酸的全部或部分相連，(2)連接到一個天然條件下不與其相連的多核苷酸，(3)不作為更長序列的一部分天然條件下存在于其中。這里所用的“分離的多肽”指由cDNA、重組RNA或合成起源或其一些組合編碼的多肽，它(1)至少不含有一些通常存在在一起的蛋白；(2)基本上不含有同一來源的蛋白，例如來自同一物種的蛋白；(3)被不同物種細胞所表達；或(4)天然條件下不存在。這里所用的術(shù)語“多肽”作為通用術(shù)語是指任何多肽，其含有兩個或多個被肽鍵或修飾肽鍵彼此連接的氨基酸，也就是肽電子等排體?！岸嚯摹奔戎付替?，通常指肽、寡肽或寡聚物，也指長鏈，通常指蛋白。多肽可含有那些與密碼子通常編碼不同的氨基酸。多肽包括被天然方法修飾的氨基酸序列，例如翻譯后修飾，也包括用本領域熟知的化學方法修飾的氨基酸序列。這些修飾在基礎教材中有充分描述，在專著中有更加詳細的描述，在大部分研究文獻中也有描述。修飾可發(fā)生在多肽的任何部位，包括肽骨架、氨基酸側(cè)鏈、氨基或羧基末端。這些修飾在一個給定多肽中可于多個部位以相同或不同程度存在。并且，在特定實施方案中，給定多肽可含有多種形式的修飾，例如天然序列的一個或多個氨基酸的刪除、添加和/或取代。在特定實施方案中，多肽可發(fā)生泛素化作用從而發(fā)生分支，并且在特定實施方案中多肽可為有或無分支的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。環(huán)狀、分支和分支的環(huán)狀多肽可以是翻譯后的自然過程或合成方法導致的結(jié)果。修飾包括但不限于，乙?；Ⅴ；?、ADP-核糖基化、酰胺化、生物素?；?，共價結(jié)合于黃素、共價結(jié)合于亞鐵血紅素、共價結(jié)合于核苷酸或核苷酸衍生物、共價結(jié)合于脂或脂衍生物、共價結(jié)合于磷脂酰肌醇，交聯(lián)、環(huán)化、形成二硫鍵、脫甲基化、形成共價交聯(lián)、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、形成GPI錨、羥基化、碘處理、甲基化、豆蔻?；?、氧化、水解處理、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒?；⒘蛩峄?、tRNA介導的添加氨基酸到蛋白(例如精胺酰化)和泛素化。術(shù)語“多肽”也包含以下物質(zhì)的氨基酸序列的序列cyno3-16、cyno33、cyno2-4、cyno2-4cys、cynods1、cyno439、cyno686、cyno35、cyno36、cyno477、cyno32、cyno3-18、cyno1-3、cyno1-4、cynoKappa、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、L1、L2、L3、L4、L5、L6(如下描述，SEQ ID NOS2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、61-74和81-86)，和這些序列有一個或多個氨基酸被刪除、添加、取代的序列。這里所用的用于對象的術(shù)語“天然存在”是指對象可在自然中找到的事實。例如存在于生物體中(包括病毒)的多肽或多核苷酸，該生物體可從天然來源中分離并且沒有被人類在實驗室中特意修飾，或該生物體就是天然存在的。這里所用的術(shù)語“可操作性連接”(operably linked)是指各部分間的相互關(guān)系使各部分以既定方式發(fā)揮作用。例如以使編碼序列的表達在與控制序列相容的條件下獲得的方式將控制序列“可操作性連接”到編碼序列上。這里所用的術(shù)語“控制序列”指能夠影響其所連接的編碼序列表達和加工的多核苷酸序列。這種控制序列的性質(zhì)依賴宿主種類而不同。依據(jù)特定實施方案，原核生物控制序列可包含啟動子、核糖體結(jié)合部位和轉(zhuǎn)錄終止序列。根據(jù)特定實施方案，真核生物控制序列可包含啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。在特定實施方案中“控制序列”可包含前導序列和/或融合伴侶序列。這里所用的術(shù)語“多核苷酸”是指長度至少為10個堿基的核苷酸聚合物。在特定實施方案中核苷酸至少包括核糖核酸、脫氧核糖核酸和兩者修飾形式中的任一種。該術(shù)語包括單鏈和雙鏈形式的DNA。術(shù)語“多核苷酸”也包括含有SEQ ID NOS1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、47-60和75-80序列的核酸序列。在特定實施方案中多核苷酸的核苷酸序列與圖1-15 18A和19A所示核苷酸序列有約90、或約95、或約96、或約97、或約98、或約99％的一致性。這里所用的術(shù)語“寡核苷酸”包括通過天然存在的寡核苷酸鍵連接到一起的天然存在和/或修飾后的核苷酸，和/或非天然存在的寡核苷酸鍵。寡核苷酸是通常包含長度在200堿基或更低的多核苷酸的子集。在特定實施方案中，寡核苷酸長度為10-60堿基。在特定實施方案中，寡核苷酸長度為12、13、14、15、16、17、18、19或20-40堿基。寡核苷酸可以是單鏈或雙鏈，例如用于構(gòu)建基因突變體的寡核苷酸。本發(fā)明的寡核苷酸可以是有義或反義寡核苷酸。術(shù)語“天然存在核苷酸”包括脫氧核糖核酸和核糖核酸。術(shù)語“經(jīng)修飾的核苷酸”包括帶有修飾或取代的糖基等等的核苷酸。術(shù)語“寡核苷酸鍵”包括如硫代磷酸酯鍵(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯鍵(phosphorodithioate)、硒代磷酸酯鍵(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯鍵(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate、phosphoroamidate等寡核苷酸鍵。參見如LaPlanche等人在Nucl.Acids Res.149081(1986)；Stec等人在J.Am.Chem.Soc.1066077(1984)；Stein等人在Nucl Acids Res.163209(1988)；Zon等人在Anti-Cancer Drug Design 6539(1991)；Zon等人在寡核苷酸及類似物的應用方法(Oligonucleotides and AnaloguesA Practical Approach，pp.87-108(F.Eckstein，Ed.，Oxford UniversityPress，Oxford England(1991)))；Stec等人在美國專利號5,151,510；Uhimann和Peyman在Chemical Reviews 90543(1990)中所公開的，在這里特地通過完整引用結(jié)合到本文。在特定實施方案中寡核苷酸可包含用以檢測的標簽。用已知方法可易于計算出相關(guān)多肽的一致性和相似性。這些方法包括但不限于在Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York(1988)；BiocomputingInformaticsand Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，Part 1，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey(1994)；SequenceAnalysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press(1987)；Sequence Ahalysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M.Stockton Press，New York(1991)；和Carillo et al.，SIAM J.AppliedMath.，481073(1988)中所述的方法。在特定實施方案中多肽的氨基酸序列與圖1-15、18B和19B所示氨基酸序列有約90、或95、或96、或97、或98、或99％的一致性。設計確定一致性的首選方法以得到待測序列間的最大匹配度。確定一致性的方法在公眾可獲得的計算機程序中有描述。確定兩個序列間一致性的首選計算機程序方法包括但不限于GCG程序包，它包含有GAP(Devereux et al.，Nucl.Acid.Res.，12387(1984))，Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI，BLASTP，BLASTN和FASTA(Altschul et al.，J.Mol.Biol.，215403-410(1990))。BLASTX程序來自公眾可得的美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information(NCBI))和其它來源(BLAST Manual，Altschul et al.NCB/NLM/NIH Bethesda，MD20894；Altschul et al.，supra(1990))。熟知的Smith Waterman算法也可用來確定一致性。對兩個氨基酸序列的某些對比方案可能會導致兩個序列間僅有一個短區(qū)域相匹配，并且這個小的比對區(qū)域可能有很高的序列一致性，盡管兩個全長序列間沒有顯著聯(lián)系。相應的，在特定實施方案中選擇的比對方法(GAP程序)產(chǎn)生的序列對比跨越靶多肽至少50個連續(xù)氨基酸。計算機例如使用計算機算法GAP(Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)，兩個待確定序列一致性百分比的多肽會被比對找出各自氨基酸最優(yōu)的匹配(由算法確定的“匹配范圍”)。在特定實施方案中，將空位開放罰分(gap opening penalty)(它作為3X平均對角線而計算；“平均對角線”是所用對比矩陣的平均對角線；“對角線”是由特定對比矩陣分配給每個最佳氨基酸匹配的分值或數(shù)值)，空位拓展罰分(gap extension penalty)(通常是空位開放罰分的1/10)，以及對比矩陣(例如PAM 250或BLOSUM62)和算法聯(lián)合使用。在特定實施方案中，算法也使用標準對比矩陣(PAM 250對比矩陣參見Dayhoff et al.，Atlas of Protein Sequenceand Structure，5(3)(1978)，BLOSUM 62對比矩陣參見Henikoff et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA，8910915-10919(1992))。在特定實施方案中，多肽序列的對比參數(shù)包括以下算法(Needleman et al.，J.Mol.Biol.48443-453(1970))；對比矩陣(BLOSUM 62，Henikoffet al.，supra(1992))；空位罰分(Gap Penalty)12；空位長度罰分(Gap Length Penalty)4；相似性閾值(Threshold of Similarity)0。GAP程序可以有效使用上述參數(shù)。在特定實施方案中上述參數(shù)為用GAP算法進行的多肽對比的默認參數(shù)(連同無末端空位罰分一起(along with no penalty for end gaps))。這里所用的20個常規(guī)氨基酸及其縮寫遵循常規(guī)用法。參見Immunology--A Synthesis(2nd Edition，E.S.Golub and D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，它通過特地引用完整的結(jié)合到本文。20個常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(如D-氨基酸)、非天然氨基酸例如α-、α-雙取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常規(guī)氨基酸也可以是本發(fā)明多肽的合適成分。非常規(guī)氨基酸的實例包括如但不限于，4-羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基賴氨酸、ε-N-乙酰賴氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲?；琢虬彼帷?-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其它相似氨基酸和亞氨基酸(如4-羥脯氨酸)。這里所用的多肽符號中，左手方向為氨基末端方向，右手方向為羧基末端方向，與標準用法和慣例一致。類似的除非特別指出，單鏈多核苷酸序列的左手端是5’末端，雙鏈多核苷酸序列的左手方向指5’方向。5′到3′方向添加初生RNA轉(zhuǎn)錄物指轉(zhuǎn)錄方向；DNA鏈上與RNA有相同序列的序列區(qū)域和從5’到RNA轉(zhuǎn)錄物5’末端的序列區(qū)域為“上游序列”；DNA鏈上與RNA有相同序列的序列區(qū)域和從3’到RNA轉(zhuǎn)錄物3’末端的序列區(qū)域為“下游序列”。保守性氨基酸取代可包括在非天然存在的氨基酸殘基，典型的是通過化學合成肽摻入而不是通過生物系統(tǒng)合成。這些非天然存在氨基酸殘基包括擬肽(peptidomimetics)和其它逆向或反向形式的氨基酸部分。天然存在的殘基可基于共同側(cè)鏈特性分類1)疏水，正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；2)中性親水，Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；3)酸性，Asp、Glu；4)堿性，His、Lys、Arg；5)影響側(cè)鏈方向的殘基，Gly、Pro；6)芳香族，Trp、Tyr、Phe。例如，非保守性取代可包括將這些種類的一個成員替換另一個種類的成員。依據(jù)特定實施方案在進行這種變化時可考慮氨基酸親水指數(shù)。每個氨基酸都根據(jù)其疏水性和電荷特性被指定了一個親水指數(shù)。它們是異亮氨酸(+4.5)、纈氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、蘇氨酸(-0.7)、絲氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、組氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、賴氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。本領域技術(shù)人員了解氨基酸親水指數(shù)在賦予對蛋白的相互生物功能上的重要性。Kyte et al.，J.Mol.Biol.，157105-131(1982)。眾所周知，某些氨基酸取代其它具有與其相似親水指數(shù)或值的氨基酸后蛋白仍保留相似的生物活性。在特定實施方案中根據(jù)親水指數(shù)進行變化時，包括取代親水指數(shù)在±2內(nèi)的氨基酸。在特定實施方案中包括取代掉親水指數(shù)在±1內(nèi)的氨基酸，而在特定實施方案中包括取代親水指數(shù)在±0.5內(nèi)的氨基酸。本領域技術(shù)人員也了解根據(jù)親水性可有效取代相似氨基酸，尤其是借此創(chuàng)造的生物功能性蛋白或肽是用于免疫方案，如本實例。在特定實施方案中，蛋白的最大局部平均親水性由其鄰近氨基酸親水性決定，與蛋白的免疫原性和抗原性相關(guān)，也就是與蛋白的生物學特性相關(guān)。以下為指定的氨基酸殘基親水性值精氨酸(+3.0)、賴氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.01)、谷氨酸(+3.01)、絲氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、蘇氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5 1)、丙氨酸(-0.5)、組氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、纈氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、異亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在特定實施方案中基于相似親水性進行改變時包括取代親水指數(shù)在±2內(nèi)的氨基酸，在特定實施方案中則包括取代親水指數(shù)在±1內(nèi)的氨基酸，而在特定實施方案中包括取代親水指數(shù)在±0.5的氨基酸?？筛鶕?jù)親水性從一級氨基酸序列鑒定表位。這些區(qū)域也稱為“表位核心區(qū)域”。示例性氨基酸取代列于表1。
表1氨基酸取代 技術(shù)人員可使用已知方法來確定這里所列多肽的合適變異體。在特定實施方案中本領域技術(shù)人員通過對確信為非活性重要區(qū)域的定位來鑒別出分子的合適區(qū)域而不破壞分子活性。在特定實施方案中技術(shù)人員可鑒別出分子中的在相似多肽中為保守性的殘基和部分序列。在特定實施方案中甚至可對那些對生物活性和結(jié)構(gòu)重要的區(qū)域進行保守性氨基酸替換而不破壞生物活性，或者不對多肽結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利影響。此外，本領域技術(shù)人員可回顧結(jié)構(gòu)-功能研究，這些研究鑒定了相似多肽中對活性或結(jié)構(gòu)重要的殘基?？紤]到這種比較，技術(shù)人員可根據(jù)對類似蛋白的活性和結(jié)構(gòu)而言很重要的氨基酸殘基從而預測出一個蛋白中與該氨基酸殘基相應的的氨基酸殘基的重要性。本領域技術(shù)人員可選擇用化學上相似的氨基酸取代這種預測為重要的氨基酸殘基。本領域技術(shù)人員也可與相似多肽結(jié)構(gòu)比較來分析三維結(jié)構(gòu)和氨基酸序列?？紤]到這些信息，本領域技術(shù)人員可預測關(guān)于抗體三維結(jié)構(gòu)的抗體氨基酸殘基順序。在特定實施方案中本領域技術(shù)人員可選擇不對預測出現(xiàn)在蛋白表面的殘基進行根本改變，因為這種殘基可能涉及到與其它分子的重要相互作用。而且本領域技術(shù)人員可制備在每個所需氨基酸殘基部位都含有單個氨基酸取代的試驗變異體。隨后使用本領域已知的活性檢測方法來篩選這些變異體。這些變異體可被用來收集關(guān)于合適變異體的信息。例如發(fā)現(xiàn)一個特殊氨基酸殘基的變化會導致失活、非所希望性地降低活性或得到非適合活性，則有這種變化的變異體應加以避免。換句話說，根據(jù)這些例行實驗所收集到的信息，本領域技術(shù)人員可容易的確定哪些氨基酸中單獨或與其它突變組合發(fā)生的進一步替換應加以避免。已經(jīng)有許多致力于預測二級結(jié)構(gòu)的科學出版物。參見Moult J.，Curr.Op.in Biotech.，7(4)422-427(1996)，Chou et al.，Biochemistry，13(2)222-245(1974)；Chou et al.，Biochemistry，113(2)211-222(1974)；Chou et al.，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.，4745-148(1978)；Chou et al.，Ann.Rev.Biochem.，47251-276and Chou et al.，Biophys.J.，26367-384(1979)。另外，當前有計算機程序來輔助預測二級結(jié)構(gòu)。一種預測二級結(jié)構(gòu)的方法的是根據(jù)同源性建模。例如，兩個具有30％以上的序列一致性或者40％以上相似性的多肽或蛋白通常有相似的結(jié)構(gòu)拓撲學。最近發(fā)展的蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(proteinstructural database，PDB)提高了二級結(jié)構(gòu)的可預測性，包括多肽或蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)的可能折疊數(shù)。參見Holm et al.，Nucl.Acid.Res.，27(1)244-247(1999)。有文獻(Brenner et al.，Curr.Op.Struct.Biol.，7(3)369-376(1997))稱給定多肽或蛋白的折疊數(shù)是有限的，一旦關(guān)鍵結(jié)構(gòu)數(shù)被確定，則結(jié)構(gòu)預測的準確性將大大提高。另外的二級結(jié)構(gòu)預測方法包括“聯(lián)系算法”(threading)(Jones，D.，Curr.Opin.Struct.Biol.，7(3)377-87(1997)；Sippl et al.，Structure，4(1)15-19(1996))，“概況分析”(profile analysis)(Bowie et al.，Science，253164-170(1991)；Gribskov et al.，Meth.Enzym.，183146-159(1990)；Gribskov et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.，84(13)4355-4358(1987))和“進化連鎖法”(evolutionary linkage)(Holm，supra(1999)，andBrenner，supra(1997))。在特定實施方案中抗體變異體包括糖基化變異體，其中多肽的糖基化位點的數(shù)目和/或類型相比親代多肽氨基酸序列發(fā)生了改變。在特定實施方案中蛋白變異體相比天然蛋白，其N-連接的糖基化位點數(shù)目增多或減少。一個N-連接的糖基化位點具有Asn-X-Ser或Asn-X-Thr的序列特征，其中指定為X的氨基酸殘基可以是除脯氨酸外的任一氨基酸殘基。產(chǎn)生這個序列的氨基酸殘基的替換，提供了一個添加新N-連接的糖鏈的潛在新位點。另一選擇是，除去這一序列的替換，將除去現(xiàn)有的N-連接的糖鏈。也可對N-連接的糖鏈進行重排，除去一個或多個N-連接的糖基化位點(典型的是天然存在的糖基化位點)或產(chǎn)生更多的新N-連接的糖基化位點。在特定實施方案中抗體變異體包括半胱氨酸變異體。特定實施方案中半胱氨酸變異體相比親代氨基酸序列有一個或多個半胱氨酸殘基被刪除或被其它氨基酸替換(例如絲氨酸)。在特定實施方案中半胱氨酸變異體相比親代氨基酸序列有一個或多個半胱氨酸殘基被添加或被其它氨基酸替換(例如絲氨酸)。在特定實施方案中當抗體要再折疊為生物活性構(gòu)造例如在分離了不可溶的包涵體后，半胱氨酸變異體可能是有用的。在特定實施方案中半胱氨酸變異體的半胱氨酸殘基數(shù)目比天然蛋白少。在特定實施方案中半胱氨酸變異體的半胱氨酸殘基數(shù)目比天然蛋白多。在特定實施方案中半胱氨酸變異體的半胱氨酸殘基數(shù)目為偶數(shù)，使未配對半胱氨酸間的相互作用降到最低。依照特定的實施方案，替換的氨基酸是那些(1)降低對蛋白水解作用的易感性，(2)降低對氧化作用的易感性，(3)改變形成蛋白復合物的結(jié)合親和力，(4)改變親和力，和/或(5)賦予或修飾該多肽的其它物理化學和功能特性。依照特定的實施方案，單個或多個氨基酸替換(在特定實施方案中為保守氨基酸替換)可以發(fā)生在天然存在序列中(特定實施方案中在多肽形成分子間接觸區(qū)域以外的部分)。在特定實施方案中，典型的保守性氨基酸替換可不對親代序列的結(jié)構(gòu)特征產(chǎn)生實質(zhì)改變(例如氨基酸替換不會破壞親代序列中存在的螺旋結(jié)構(gòu)，或破壞親代序列特有的其它二級結(jié)構(gòu)類型)。多肽二級和三級結(jié)構(gòu)經(jīng)典實例的描述參見蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)和分子原理(Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton，Ed.，W.H.Freeman and Company，New York(1984)))；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)導論(Introduction to Protein Structure(C.Branden and J.Tooze，eds.，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991)))；和Thornton等Nature354105(1991)，均通過引用結(jié)合到本文。這里所用的術(shù)語“多肽片段”指刪除了氨基末段和/或羧基末端的多肽。在特定實施方案中，片段長度至少為5-467氨基酸?？梢岳斫獾氖窃谔囟▽嵤┓桨钢衅伍L度至少為5、6、8、10、14、20、50、70、100、150、200、250、300、350、400或450氨基酸。肽類似物通常用于制藥工業(yè)作為具有與模板肽相似特性的非肽藥物。這些種類的非肽化合物被稱為“肽類似物”(peptide mimetics或peptidomimetics)。Fauchere，J.Adv.Drug Res.1529(1986)；Veber和Freidinger TINS p.392(1985)；及Evans等J.Med.Chem.301229(1987)，都特地通過引用結(jié)合到本文。通常在計算機分子建模輔助下開發(fā)這類化合物。與治療有效的肽結(jié)構(gòu)相似的肽類似物可用來產(chǎn)生相似的治療或預防效果?？偟膩碚f，肽類似物與范例多肽(paradigmpolypeptide)例如人抗體(也就是具有生化特性或藥理活性的多肽)的結(jié)構(gòu)相似，但有一個或多個肽鍵任選被選自以下的連接鍵用本領域熟知方法取代-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(順式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-。在特定實施方案中可將共有序列的一個或多個氨基酸用同樣類型的D-氨基酸系統(tǒng)替換(如用D-賴氨酸替換L-賴氨酸)，以產(chǎn)生更加穩(wěn)定的肽。此外，可用本領域所知方法(Rizo and Gierasch Ann.Rev.Biochem.61387(1992)，通過引用結(jié)合到本文)來產(chǎn)生包含一致序列或大體相同的一致序列變體的約束(constrained)肽；例如通過添加一個能夠形成分子內(nèi)二硫鍵的內(nèi)部半胱氨酸殘基來使肽發(fā)生環(huán)化。“抗體”(Antibody)或“抗體肽”(antibody peptide(s))指一個完整抗體或其片段。在特定實施方案中，抗體片段可以是結(jié)合片段，它與完整抗體競爭特異性結(jié)合。在特定實施方案中，用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)結(jié)合片段。在特定實施方案中用酶促或化學切開完整抗體來生產(chǎn)結(jié)合片段。結(jié)合片段包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Facb和單鏈抗體。非抗原結(jié)合片段包括但不限于Fc片段?！扒逗峡贵w”指一種抗體，它含有融合到其它分子的第一物種抗體的可變區(qū)，例如融合到第二物種的抗體恒定區(qū)，如食蟹猴抗體恒定區(qū)。在特定實施方案中，第一物種可以不同于第二物種。在特定實施方案中，第一物種可以與第二物種相同。在特定實施方案中，嵌合抗體是“猴源化(monkeyized antibodies)”抗體，它含有改變后的可變區(qū)(通過突變或CDR移植(CDR grafting))，與猴可變區(qū)已知序列的一部分匹配。典型的CDR移植包括將一個具有所需特異性抗體的CDR移植到一個猴抗體的FRs上，從而用猴序列替換若干或大量非猴序列。因此猴源化抗體與猴抗體更匹配(在氨基酸序列上)。術(shù)語“重鏈”包括含有足夠可變區(qū)序列使得對特定抗原具有特異性的任何多肽。術(shù)語“輕鏈”包括含有足夠可變區(qū)序列使得對特定抗原表位具有特異性的任何多肽。全長的重鏈包含一個可變區(qū)VH和三個恒定區(qū)CH1、CH2及CH3。VH區(qū)位于多肽的氨基末端，CH3區(qū)位于羧基末端。這里所用的術(shù)語“重鏈”(heavy chain)包括全長的重鏈及其片段。全長的輕鏈包含一個可變區(qū)VL和一個恒定區(qū)CL。與重鏈類似，輕鏈的可變區(qū)位于多肽的氨基末端。這里所用的術(shù)語“輕鏈”包括全長的輕鏈及其片段。Fab片段包含一個輕鏈、CH1和一個重鏈的可變區(qū)。Fab分子的重鏈不能與其它重鏈分子形成二硫鍵。Fab′片段含有一個輕鏈和一個含有更多恒定區(qū)的重鏈，其在CH1區(qū)和CH2區(qū)間，以致可在兩個重鏈間形成鏈內(nèi)二硫鍵，從而形成一個F(ab′)2分子。Facb片段與F(ab′)2分子相似，除了它的重鏈恒定區(qū)延伸到CH2區(qū)的末端。Fv區(qū)包含重鏈和輕鏈的可變區(qū)，但是缺少恒定區(qū)。單鏈抗體是Fv分子，其重鏈和輕鏈可變區(qū)間由一個柔韌性連接物所連接，從而形成單個的構(gòu)成一個抗原結(jié)合區(qū)域的多肽鏈。單鏈抗體在如WO 88/01649、美國專利Nos.4,946,778和5,260,203中有詳細描述。Fc片段含有重鏈的CH2和CH3區(qū)及多個恒定區(qū)，其在CH1和CH2之間，以致可在兩個重鏈間形成鏈內(nèi)二硫鍵。在特定實施方案中，雙價抗體(bivalent antibody)不同于“多效抗體”(multispecific)或“多功能抗體”(multifunctional)，一向被理解為每種均具有相同的結(jié)合位點。當過量抗體使與配體結(jié)合的受體數(shù)量減少至少約20％、40％、60％、80％、85％或更多時(體外競爭性結(jié)合檢測所得)，該抗體實質(zhì)上抑制了配體與受體的結(jié)合。術(shù)語“抗原表位”(epitope)包括能特異性的與免疫球蛋白或T細胞受體結(jié)合的任何多肽決定簇(determinant)。在特定實施方案中，表位決定簇包括分子表面的化學活性基團如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷酰基或磺?；⑶以谔囟▽嵤┓桨钢锌删哂刑厥獾娜S結(jié)構(gòu)特征，和/或特殊的電荷特性?？乖砦皇强乖Y(jié)合抗體的區(qū)域。在特定實施方案中，當抗體在復雜的蛋白和/或大分子混合物中優(yōu)先識別出其靶抗原時，它就特異性結(jié)合到抗原上。在特定實施方案中，當解離常數(shù)≤1μM、特定實施方案中當解離常數(shù)≤100nM及特定實施方案中當解離常數(shù)≤10nM時，抗體特異性結(jié)合到抗原上。這里所用的術(shù)語“試劑(agent)”指化合物、化合物的混合物、生物大分子或來自生物材料的提取物。這里所用的術(shù)語“標記”或“標記的”指摻入一個可探測的標記物，例如通過摻入放射性標記的氨基酸或連接上能被標記的抗生物素探測到的生物素部分(如用含有熒光標記或酶促反應活性標記的鏈霉親和素，可通過光學或比色方法檢測到)。在特定實施方案中，標簽或標記物也可以是有治療作用的。標記多肽和糖蛋白的各種方法為本領域熟知并可使用。多肽標記的例子包括但不限于以下放射性同位素或放射性核素(如3H、14C、5N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、熒光標記(如FITC、若丹明、鑭系元素磷光體)、酶標記(如辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酶)、化學發(fā)光標記，生物素?；瘶擞?，二級報告體識別的預定多肽抗原表位(如亮氨酸拉鏈配對序列、二級抗體結(jié)合位點、金屬結(jié)合區(qū)域、表位標簽)。在特定實施方案中，標記物通過不同長度的間隔臂連接在多肽上，以減少潛在的空間阻礙。這里所用的術(shù)語“生物樣品”包括但不限于來自生命體或前生命體的任何數(shù)量的物質(zhì)。這種生命體包括但不限于人、小鼠、猴、大鼠、兔和其它動物。這種物質(zhì)包括但不限于血液、血清、尿液、細胞、器官、組織、骨骼、骨髓、淋巴結(jié)和皮膚。這里所用的術(shù)語“藥劑或藥物”指當向病人適當給藥時能誘導出所需療效的化合物或組合物。這里所用的術(shù)語“調(diào)節(jié)劑”(modulator)是能變化或改變分子活性或功能的化合物。例如，調(diào)節(jié)劑可引起分子的特定活性或功能大小比在無調(diào)節(jié)劑時的所得到的增加或降低。在特定實施方案中，調(diào)節(jié)劑是抑制劑，它降低了分子的至少一種活性或功能大小。特定分子的活性和功能示例包括但不限于，結(jié)合親和力、酶活性和信號轉(zhuǎn)導。特定抑制劑示例包括但不限于，蛋白、肽、抗體、肽抗體(peptibodies)、糖或有機小分子。肽抗體在如WO01/83525中有描述。這里所用的“大體純”意思是目標物表現(xiàn)為優(yōu)勢種類(即摩爾數(shù)比組合物中其它各種類都要高)。在特定實施方案中一種大體純化的部分指在所有存在的大分子物質(zhì)中目標物至少占約50％(摩爾數(shù))的組合物。在特定實施方案中，一種大體純的組合物將包含存在于組合物中所有大分子物質(zhì)的至少約80％、85％、90％、95％或99％。在特定實施方案中，目標物純化至基本同質(zhì)(常規(guī)方法探測不到組合物中的雜質(zhì))，其中組合物基本上由單一大分子物質(zhì)組成。術(shù)語“患者”包括人和受試動物。本申請中除非特別說明則所用的單數(shù)形式也包括相應的復數(shù)形式。本申請中除非特別說明則所用的“或”是指“和/或”。此外，所用的術(shù)語“包括”以及其他形式如“包含”和“內(nèi)含”無限定含義。并且諸如“要素”(element)或“成分”(component)的術(shù)語除非特別說明則既包括含有一個單元的成分也包括含有多個子單元的成分。在特定實施方案中，本申請討論了某些編碼重鏈和輕鏈恒定區(qū)的多核苷酸。在特定實施方案中，本申請討論了某些包含重鏈和輕鏈恒定區(qū)的多肽序列。在特定些實施方案中，這些恒定區(qū)多核苷酸和多肽來源于食蟹猴。在特定實施方案中多核苷酸包含選自SEQ IDNOS1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27和29的核苷酸序列。在特定實施方案中多肽包含選自SEQ ID NOS2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28和30的序列。在特定實施方案中多核苷酸含有氨基酸序列的編碼序列，該氨基酸序列選自SEQ ID NOS2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28和30的序列。在特定實施方案中提供了相應于互補決定區(qū)(CDR′s)，具體說是從CDR1到CDR3的可變區(qū)序列。在特定實施方案中可變區(qū)多核苷酸和多肽來源于人。在特定實施方案中可變區(qū)多核苷酸含有選自SEQ ID NOS47-60和SEQ ID NOS75-80的核苷酸序列。在特定實施方案中多肽含有選自SEQ ID NOS61-74和SEQ ID NOS81-86的序列。在特定實施方案中可變區(qū)多核苷酸和多肽來源于食蟹猴。依據(jù)特定實施方案，也提供了表達包含來源于食蟹猴恒定區(qū)的免疫球蛋白分子的細胞系。在特定實施方案中提供了包含至少部分猴序列和其它種序列的嵌合抗體。在特定實施方案中這種嵌合抗體比其它無猴序列的抗體可使猴體內(nèi)免疫反應降低。例如在特定情況下將含有目的抗原表位的抗原導入到動物宿主(如小鼠)體內(nèi)，如此產(chǎn)生了針對該抗原表位的特異性抗體。在特定情況下可從自然暴露于該抗原表位的宿主獲得生物樣品再得到針對該抗原表位的特異性抗體。在特定情況下將人免疫球蛋白(Ig)座導入到內(nèi)源性Ig基因失活的小鼠體內(nèi)，從而提供了得到完全人單克隆抗體(Mabs)的可能性。在特定情況下這種來自其它物種的抗體可引起猴體內(nèi)對抗體本身的免疫反應，因此阻礙了對這些抗體的評估。在特定實施方案中將抗體部分氨基酸替換為猴序列可降低猴的抗抗體反應規(guī)模。在特定實施方案中嵌合抗體包含第一物種的可變區(qū)和第二物種的恒定區(qū)。在特定實施方案中，恒定區(qū)是食蟹猴恒定區(qū)?？勺儏^(qū)的示例包括但不限于人、小鼠、豬、豚鼠、食蟹猴和兔可變區(qū)。在特定實施方案中可將重鏈和輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)替換為來源于食蟹猴的框架區(qū)序列。可用本領域普通技術(shù)人員熟知的方法來制備嵌合抗體。在特定實施方案中可將編碼重鏈可變區(qū)的第一物種多核苷酸與編碼重鏈恒定區(qū)的第二物種多核苷酸融合。在特定實施方案中可將編碼輕鏈可變區(qū)的第一物種多核苷酸與編碼輕鏈恒定區(qū)的第二物種多核苷酸融合。在特定實施方案中可將這些融合的核苷酸序列或通過單個的表達載體(如質(zhì)粒)導入到細胞中。在特定實施方案中可用含有至少一種表達載體的細胞來生成多肽。在特定實施方案中可將這些融合的核苷酸序列或通過分離的表達載體導入到細胞中。在特定實施方案中宿主細胞既表達嵌合重鏈也表達嵌合輕鏈，二者結(jié)合產(chǎn)生嵌合抗體。在特定實施方案中可用含有至少一個表達載體的細胞來制備嵌合抗體。產(chǎn)生和表達嵌合抗體的示例方法討論如下。在特定實施方案中可將功能性區(qū)域CH1、CH2、CH3和插入序列進行重組以建立一個不同的抗體恒定區(qū)。例如在特定實施方案中可以在血清半衰期、抗體四聚體的裝配和折疊及改進的效應子功能方面對這種雜合恒定區(qū)實施最優(yōu)化處理。在特定實施方案中可通過在恒定區(qū)氨基酸序列中引入單點突變并對所得抗體進行如上文列舉的改進性質(zhì)試驗，來產(chǎn)生修飾的抗體恒定區(qū)。在特定實施方案中含有猴氨基酸序列的嵌合抗體可被用來開展對人和動物疾病的治療。示例的治療包括但不限于HIV、癌癥和炎癥的治療。例如在特定實施方案中可發(fā)展結(jié)合到人病原體如病毒的小鼠抗體，用在有猴動物模型的人類疾病研究中。在特定實施方案中為了確定結(jié)合到特定抗原表位的抗體是否有利于治療人，可在對人體嘗試治療以前，評估包含小鼠抗體可變區(qū)和猴抗體恒定區(qū)的嵌合抗體在猴身上治療該疾病的有效性。因此在特定實施方案中提供了評估抗體效果的方法，包括a)將含有來自一個抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)及來源于食蟹猴抗體的重鏈和輕鏈恒定區(qū)的嵌合抗體導入到食蟹猴體內(nèi)；及b)評估該嵌合抗體在食蟹猴體內(nèi)的效果。在特定實施方案中可通過測量猴體內(nèi)病原體數(shù)量的減少和該疾病癥狀的減輕來評估抗體效果。當然治療并不限于針對病原體引起的疾病。在特定實施方案中可由其它方法在猴體內(nèi)引起疾病，包括導入外源物(例如致癌物)和基因操作。在特定實施方案中可通過檢測猴體內(nèi)的一種過多種不良事件來評估抗體效果。術(shù)語“不良事件”(adverseevent)包括但不限于在接受了沒有接受該抗體的猴體內(nèi)不出現(xiàn)的抗體的猴的不良反應(adverse reaction)。在特定實施方案中不良事件包括但不限于發(fā)熱、對抗體的免疫反應、炎癥或猴死亡。
天然存在的抗體結(jié)構(gòu)
天然存在的抗體結(jié)構(gòu)單元代表性的包含一個四聚體。典型的這種四聚體每個由相同兩對多肽鏈組成，每對含有一個全長“輕鏈”(在特定實施方案中約25kDa)和一個全長“重鏈”(在特定實施方案中約50-70kDa)。每條鏈的氨基末端部分典型的包含一個長約100-110氨基酸或更長可變區(qū)序列，該序列通常負責抗原識別。每條鏈的典型羧基末端定義為恒定區(qū)，可負責效應子功能?？贵w效應子功能包括激活補體和刺激調(diào)理吞噬作用。典型的人輕鏈分為λ和κ輕鏈。典型的人重鏈分為μ、δ、γ、α或ε鏈，相應抗體亞型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG有幾個亞類，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM的亞類包括但不限于IgM1和IgM2。IgA也被類似的細分為亞類，包括但不限于IgA1和IgA2。在全長輕和重鏈區(qū)內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)典型的由約12個氨基酸或更長的“J”區(qū)域連接；重鏈區(qū)還包括約10個氨基酸或更長的“D”區(qū)域。參見基本免疫學第七章(Fundamental Immunology Ch.7)(Paul，W.，ed.，2nd ed.Raven Press，N.Y.(1989)，通過引用完整結(jié)合到本文)。每條輕/重鏈的可變區(qū)配對形成典型的抗原結(jié)合位點。典型的可變區(qū)表現(xiàn)出相同的相對保守框架區(qū)(FR)結(jié)構(gòu)，由三個也稱為互補決定區(qū)或CDR的超可變區(qū)連接。每對兩條鏈上的CDR典型通過框架區(qū)排列，使得能夠與特異的抗原表位結(jié)合。不論是輕鏈還是重鏈可變區(qū)從N-末端到C-某端通常都包含F(xiàn)R1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4區(qū)域。每個區(qū)域的氨基酸排布通常與下文的定義一致免疫學上重要的蛋白Kabat序列(Kabat Sequences ofProteins of Immunological Interest)(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987 and 1991))，或Chothia & Lesk，J.Mol.Biol 196901-917(1987)；Chothia et al.，Nature 342878-883(1989)。
雙特異性或雙功能性抗體
一個典型的雙特異性或雙功能性抗體是人工雜種抗體，含有兩個不同的重/輕鏈對和兩個不同的結(jié)合位點。雙特異性抗體可通過不同方法來生產(chǎn)，包括但不限于雜交瘤的融合或Fab′片段的連接。參見Songsivilai & Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79315-321(1990)，Kostelny et al.J.Immunol.1481547-1553(1992)。在特定實施方案中，本發(fā)明提供了包含所有食蟹猴抗體重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)或其功能性部分的融合蛋白。該融合蛋白可包含任何所需的附加多肽序列，任選包含一個或多個接頭序列。附加的多肽序列可包含如，全部或部分天然存在的多肽序列。可使用任何天然存在多肽序列或其部分序列，例如來自一個能與其它分子如其他蛋白結(jié)合的蛋白的多肽序列。與其它蛋白結(jié)合的天然存在多肽序列的例子包括從受體蛋白、配體蛋白、多亞基蛋白、轉(zhuǎn)錄因子蛋白、核糖體蛋白和細胞骨架蛋白得來的序列。其它適用于這種融合蛋白的天然存在多肽序列的例子包括具有酶活性的多肽序列，例如具有蛋白修飾酶活性，如激酶活性、磷酸酶或蛋白酶活性。其它實施方案中，添加的多肽序列不是天然存在的。例如，可以是天然存在蛋白的修飾、突變或其它衍生物。另一選擇是，它可以是人工序列。這種實施方案中非天然存在多肽序列賦予融合蛋白所需的特性，如穩(wěn)定性、溶解性、可探測性等。在一個實施方案中，非天然存在的多肽序列使融合蛋白與所需靶分子例如其它蛋白結(jié)合。靶蛋白的例子包括受體蛋白和配體。融合蛋白可能，比如對靶分子的功能性無影響，或者可以影響靶分子的功能，例如可以提高或降低靶分子的功能水平。這種融合蛋白可通過任何機制對靶蛋白發(fā)揮作用，例如通過空間上阻礙靶分子與其效應物和/或底物分子間的相互作用，或者通過變構(gòu)改變靶分子對其效應物和/或底物分子的親和力?？墒褂帽绢I域所知的任何技術(shù)來設計或選擇適用于本發(fā)明融合蛋白實施方案的多肽序列。一個實施方案中制得了一個融合蛋白文庫，并根據(jù)單個融合蛋白結(jié)合到所需靶分子的能力來從文庫中選出一個或多個融合蛋白。涉及到本發(fā)明融合蛋白的方法和組合物的其它實例可參考美國專利No.6,660,843(通過引用完整的結(jié)合到本文)。在特定實施方案中本發(fā)明的融合蛋白是作為適用于受試者的藥用組合物的一部分來提供的，受試者例如靈長類如食蟹猴或人類。其它實施方案中本發(fā)明提供了使用融合蛋白處理受試者例如靈長類如食蟹猴或人類的方法。
抗體的制備
在特定實施方案中對食蟹猴嵌合抗體重鏈和輕鏈的保守性修飾(并相應修飾編碼多核苷酸)會產(chǎn)生功能和化學性質(zhì)與原有嵌合抗體相似的抗體。相反，可通過選擇顯著改變以下三方面作用的重鏈和輕鏈的氨基酸序列中的替換來對食蟹猴嵌合抗體的功能和/或化學性質(zhì)進行實質(zhì)上的修飾，這三方面為a)維持替換所在區(qū)域的分子骨架結(jié)構(gòu)方面，如片層和螺旋的形成，b)維持分子在靶位點的電荷或疏水性方面，c)維持側(cè)鏈大小方面，。例如“保守性氨基酸替換”可包括將天然氨基酸殘基替換為非天然氨基酸殘基，使該位置氨基酸殘基的極性或電荷受很少的影響或者沒有影響。另外，多肽中的任何天然殘基均可用丙氨酸替換，如前述的“丙氨酸掃描誘變”(alanine scanning mutagenesis)。本領域技術(shù)人員可在需要替換時確定所需的氨基酸替換(無論是保守性或非保守性)。在特定實施方案中可用氨基酸替換來鑒定嵌合食蟹猴抗體的重要殘基，例如那些可能提高或降低嵌合抗體對給定抗原親和力或嵌合抗體的效應子功能的殘基。在特定實施方案中可在除了雜交瘤細胞系外的細胞系中表達抗體。在特定實施方案中編碼特定抗體包括嵌合抗體的序列可用來轉(zhuǎn)化合適的哺乳動物宿主細胞。依據(jù)特定的實施方案，可用任何已知方法將多核苷酸導入宿主細胞來轉(zhuǎn)化，包括如將多核苷酸包裝到病毒(或病毒載體)中并用該病毒(或載體)轉(zhuǎn)化宿主細胞，或用本領域已知方法轉(zhuǎn)染細胞，如美國專利Nos.4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455例證(這些專利據(jù)此通過引用結(jié)合到本文)。在特定實施方案中所用的轉(zhuǎn)化方法可依賴于待轉(zhuǎn)化的宿主。將異源多核苷酸導入哺乳動物細胞的方法為本領域所熟知，包括但不限于葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、聚溴化季銨(polybrene)介導的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、多核苷酸的脂質(zhì)體包囊和直接將DNA顯微注射入胞核?？捎米鞅磉_宿主的哺乳動物細胞系為本領域所熟知，包括但不限于許多來自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)的無限增殖細胞系，這其中包括但不限于中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary，CHO)、E5細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞(baby hamster kidney，BHK)細胞、猴腎臟細胞(COS)、人肝癌細胞(human hepatocellular carcinom，如Hep G2)及許多其他細胞系。在特定實施方案中可通過確定哪種細胞系具有高水平表達抗體能力并且產(chǎn)生的抗體具有組成型抗原結(jié)合特性來選擇細胞系。依據(jù)特定實施方案，抗體可用于檢測生物樣品中的特定抗原。在特定實施方案中，使得可鑒定出產(chǎn)生該蛋白的細胞或組織。在特定實施方案中可結(jié)合到特定蛋白的抗體并封閉與其它結(jié)合化合物的相互作用的抗體，可能有治療用途。在特定實施方案中提供了對病人的治療方法，包括給予治療上有效量的抗體。在這種特定實施方案中，附加的治療劑按治療上有效量給予。在特定實施方案中，將抗體與治療上有效量的附加治療劑聯(lián)合使用。示例性治療劑包括但不限于稱為BMP-1到BMP-12的骨骼形態(tài)發(fā)生因子(bone morphogenic factors)；β-轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)和TGF-β家族成員；白細胞介素-1(IL-1)抑制劑，包括但不限于IL-1ra及其衍生物和KinereTM；TNFα抑制劑，包括但不限于可溶性TNFα受體，依坦西普(EnbrelTM)，抗TNFα抗體，RemicadeTM和D2E7抗體；甲狀旁腺素及其類似物；甲狀旁腺相關(guān)蛋白及其類似物；E系列前列腺素；二磷酸鹽(例如阿侖膦酸鈉(alendronate)等)；骨增強礦物質(zhì)，例如氟化物和鈣；非類固醇類抗炎藥(NSAIDs)，包括但不限于COX-2抑制劑，例如西樂葆(CelebrexTM)和萬絡(VioxxTM)；免疫抑制劑，例如甲氨蝶呤或來氟米特(leflunomide)；絲氨酸蛋白酶抑制劑，包括但不限于分泌型白細胞蛋白酶抑制劑(SLPI)；IL-6抑制劑，包括(但不限于IL-6抗體)；IL-8抑制劑，包括(但不限于IL-8抗體)；IL-18抑制劑，包括(但不限于IL-18結(jié)合蛋白和IL-18抗體)；白細胞介素-1轉(zhuǎn)化酶(ICE)調(diào)節(jié)劑；纖維母細胞生長因子FGF-1到FGF-10和FGF調(diào)節(jié)劑；PAF拮抗劑；角化細胞生長因子(KGF)、KGF相關(guān)分子和KGF調(diào)節(jié)劑；基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase(MMP))調(diào)節(jié)劑；氮氧化物合酶(NOS)調(diào)節(jié)劑，包括但不限于可誘導NOS的調(diào)節(jié)劑；腎上腺皮質(zhì)激素受體調(diào)節(jié)劑；谷氨酸受體調(diào)節(jié)劑；脂多糖(LPS)水平調(diào)節(jié)劑；和去甲腎上腺素和調(diào)節(jié)劑以及其模仿物。示例的附加治療劑細節(jié)實例參見如PCT公布說明書No.WO03/0002713。在特定實施方案中，考慮到條件和所需治療水平，可以給予兩種、三種或更多種藥物。在特定實施方案中，這些藥物可通過包含于同一制劑中一起提供。在特定實施方案中這些藥物和抗體可通過包含在同一制劑中一起提供。在特定實施方案中這些藥物可通過包含在治療藥盒中一起提供。在特定實施方案中這些試劑可分開提供。在特定實施方案中當使用基因治療形式給藥時，編碼蛋白試劑和/或抗體的基因可插入到同一載體中。在特定實施方案中編碼蛋白試劑和/或抗體的基因可處于同一個啟動子區(qū)域的控制下。在特定實施方案中編碼蛋白試劑和/或抗體的基因可在獨立的載體中。在特定實施方案中本發(fā)明提供了藥用組合物，該組合物含有治療上有效量的抗體和藥學上可接受的稀釋劑、載體、增溶劑、乳化劑、防腐劑和/或輔助劑。在特定實施方案中本發(fā)明提供了藥用組合物，其含有治療上有效量的抗體和至少一種治療上有效量的附加治療劑，以及藥學上可接受的稀釋劑、載體、增溶劑、乳化劑、防腐劑和/或輔助劑。在特定實施方案中至少一種附加的治療劑選自骨骼形態(tài)發(fā)生因子BMP-1到BMP-12；β-轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)和TGF-β家族成員；白細胞介素-1(IL-1)抑制劑，包括(但不限于)IL-1ra及其衍生物和KinereTM；TNFα抑制劑，包括(但不限于)可溶性TNFα受體，依坦西普，抗TNFα抗體，RemicadeTM和D2E7抗體；甲狀旁腺素及其類似物；甲狀旁腺相關(guān)蛋白及其類似物；E系列前列腺素；二磷酸鹽(例如阿侖膦酸鈉等)；氟化物和鈣；非類固醇類抗炎藥(NSAIDs)，包括但不限于COX-2抑制劑，例如CelebrexTM和VioxxTM；免疫抑制劑，例如甲氨蝶呤或來氟米特；絲氨酸蛋白酶抑制劑(SLPI)例如分泌白細胞蛋白酶抑制劑(SLPI)；IL-6抑制劑，包括但不限于IL-6抗體；IL-8抑制劑，包括但不限于IL-8抗體；IL-18抑制劑，包括但不限于IL-18結(jié)合蛋白和IL-18抗體；白細胞介素-1轉(zhuǎn)化酶(ICE)調(diào)節(jié)劑；纖維原細胞生長因子FGF-1到FGF-10和FGF調(diào)節(jié)劑；PAF拮抗劑；角化細胞生長因子(KGF)，KGF相關(guān)分子和KGF調(diào)節(jié)劑；基質(zhì)金屬蛋白酶調(diào)節(jié)劑；氮氧化物合酶(NOS)調(diào)節(jié)劑，包括但不限于可誘導NOS的調(diào)節(jié)劑；腎上腺皮質(zhì)激素受體調(diào)節(jié)劑；谷氨酸受體調(diào)節(jié)劑；脂多糖(LPS)水平調(diào)節(jié)劑；和去甲腎上腺素和調(diào)節(jié)劑以及它們的類似物。示例的附加治療劑內(nèi)容參見PCT公布說明書No.WO03/0002713。在特定實施方案中可取的制劑原料優(yōu)選在所用劑量和濃度下對受體無毒的原料。在特定實施方案中藥用組合物可含有以修飾、維持或保持如下性能，pH、滲透性、粘性、透明度、顏色、等滲性、氣味、無菌度、穩(wěn)定性、溶出或釋放速率、組合物的吸附或滲透能力的制劑原料。在特定實施方案中合適的制劑原料包括但不限于氨基酸，(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸)；抗微生物劑；抗氧化劑(例如抗壞血酸、亞硫酸鈉、或亞硫酸氫鈉)；緩沖劑(例如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其它有機酸)；濕脹劑(bulking agents)(例如甘露醇和甘氨酸)；螯合劑(cheatingagents)(例如乙二胺四乙酸、EDTA)；復合劑(complexing agents)(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-環(huán)糊精或羥丙基-β-環(huán)糊精)；填充劑(fillers)；單糖；二糖；其它糖類(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白(例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑、調(diào)味劑和稀釋劑；乳化劑；親水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；小分子多肽；成鹽平衡離子(例如鈉離子)；防腐劑(例如苯扎氯銨、安息香酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯對羥基苯甲酸丙酯，洗必太、山梨酸和過氧化氫)；溶劑(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露醇和山梨醇)；懸浮劑；表面活性劑或濕潤劑(例如帕洛沙姆、PEG、脫水山梨醇酯、聚山梨酸酯如聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80、曲拉通(triton)、氨基丁三醇(tromethamine)、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙泊(tyloxapal)；穩(wěn)定性提高試劑(例如蔗糖和山梨醇)；張力增強試劑(例如堿金屬鹵化物，優(yōu)選氯化鈉或氯化鉀、甘露醇、山梨醇)；給藥載體；稀釋劑；賦形劑和/或藥物輔助劑。(Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Edition，A.R.Gennaro，ed.，Mack Publishing Company(1990).在特定實施方案中用本領域所知的半衰期延長載體將抗體和/或添加的治療分子連接起來。這種載體包括但不限于Fc區(qū)域、聚乙二醇和葡聚糖。這種載體在如美國專利申請系列No.09/428,082和公開的PCT申請說明書No.WO 99/25044中有描述，并據(jù)此通過引用結(jié)合到本文。在特定實施方案中，本領域技術(shù)人員可根據(jù)如預期給藥途徑、遞藥形式和所需劑量來確定最佳藥用組合物。參見如Remington的藥物科學(Remington′s Pharmaceutical Sciences，supra)。在特定實施方案中這些組合物可影響本發(fā)明抗體的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率和體內(nèi)清除速率。在特定實施方案中，藥用組合物中的主要媒介或載體性質(zhì)可以是水性或非水性。例如，在特定實施方案中合適的媒介或載體可以是注射用水、生理鹽水溶液或人工腦脊液，也可在組合物中補充其它常用物質(zhì)用以腸胃外投藥。在特定實施方案中，中性緩沖鹽水或鹽水與血清白蛋白的混合液是另外的示例性載體。在特定實施方案中藥用組合物含有pH值約7.0-8.5的Tris緩沖液或pH值約4.0-5.5醋酸鹽緩沖液，還可進一步包含山梨醇或合適的替代物。添加的藥用載體包括但不限于油，包括石油、動物油、植物油、花生油、豆油、礦物油、芝麻油等。葡萄糖和甘油水溶液也可被用作液體載體，尤其是用作注射液。在特定實施方案中，含有抗體的組合物有或沒有至少一種附加的治療劑，其制備可通過將選出的具有所需純度的組合物與任選配方劑(Remington′s Pharmaceutical Sciences，supra)混合，并制成凍干塊或水溶液來儲存。此外在特定實施方案中可使用合適的輔料例如蔗糖將含有抗體(有或沒有至少一種附加的治療劑)的混合物用凍干法按配方制造。在特定實施方案中可選出用以胃腸外給藥的藥用組合物。在特定實施方案中可選出用以吸入或通過消化道例如口腔遞藥的藥用組合物。這種藥學上可接受的組合物的制備在本領域技術(shù)范圍內(nèi)。在特定實施方案中制劑成分在給藥部位以可接受的濃度存在。在特定實施方案中使用緩沖液來維持組合物在生理pH或稍低的pH，典型的保持在約pH5-8之間。在特定實施方案中當打算胃腸外給藥時，治療組合物的形式可以是在藥學可行的載體中無熱原且含有所需抗體，有或無附加治療劑的注射用水溶液。在特定實施方案中用以注射的載體是無菌蒸餾水，無或有至少一種附加的治療劑的抗體按配方制備成適于保藏的無菌等滲溶液。在特定實施方案中制備可包括所需分子和介質(zhì)的配制，這種介質(zhì)例如注射用的微球體、可生物蝕解顆粒、聚合化合物(例如聚乳酸和聚乙醇酸)、珠子或脂質(zhì)體，提供產(chǎn)物的控釋或緩釋，然后可通過長效注射來給藥。在特定實施方案中也可使用透明質(zhì)酸，它可產(chǎn)生增加循環(huán)中持續(xù)時間的作用。在特定實施方案中可使用可移植的給藥設備來導入所需分子。在特定實施方案中藥用組合物可制成吸入劑。在特定實施方案中可將抗體(有或沒有至少一種附加的治療劑)制成干粉形式用以吸入。在特定實施方案中可將含有抗體(有或沒有至少一種附加的治療劑)的吸入溶液與一種噴射劑一起配成氣霧劑來給藥。在特定實施方案中溶液可制成噴霧。此外PCT公布說明書No.PCT/US94/001875描述了化學修飾蛋白的肺部給藥。在特定實施方案中可以考慮口服給予制劑。在特定實施方案中通過這種方式給藥的抗體(無或有至少一種附加的治療劑)可以與或不與那些通常用在配制固體劑型中的載體(例如藥片或膠囊)一起配制。在特定實施方案中，可對膠囊加以涉及以使制劑的活性部分在胃腸道中某一點釋放時使生物利用度最大化而體循環(huán)前的降解最小化。在特定實施方案中可包含至少一種附加治療劑以促進抗體和/或任何附加治療劑的吸收。在特定實施方案中也可使用稀釋劑、調(diào)味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、藥片崩解劑和粘合劑。在特定實施方案中藥用組合物可含有治療上有效量的抗體(有或沒有至少一種附加的治療劑)，處于適合制成藥片的無毒輔料混合物中。在特定實施方案中通過將藥片溶解在無菌水或另一合適載體中，可制成單位劑量形式的溶液。在特定實施方案中合適的賦形劑包括但不限于惰性稀釋劑，例如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳酸、磷酸鈣；粘合劑，例如淀粉、明膠、阿拉伯膠；潤滑劑例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。另外的藥用組合物包括制劑對本領域技術(shù)人員而言是顯而易見的，該制劑含有抗體及無或有至少一種附加的治療劑，制成緩釋或控釋給藥制劑。在特定實施方案中本領域技術(shù)人員也了解制成多種其它可緩釋或控釋給藥方法的技術(shù)，例如脂質(zhì)體載體、可生物蝕解微粒或多孔珠和長效注射劑。例如參見PCT公布說明書No.PCT/US93/00829，對多孔多聚微粒聚合物藥用組合物的控釋給藥進行了描述。在特定實施方案中持續(xù)釋放的制劑可包括成形制品如膜或微膠囊形式的半透性聚合物基質(zhì)。緩釋基質(zhì)可包括聚酯、水凝膠、聚交酯(U.S.3,773,919和EP 058,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸共聚物(Sidman et al.，Biopolymers，22547-556(1983))、聚(2-羥乙基-異丁烯酸酯)(Langer et al.，J.Biomed.Mater.Res.，15167-277(1981)and Langer，Chem.Tech.，1298-105(1982))、乙烯醋酸乙烯酯(Langeret al.，supra)或聚(D(-)-3-羥基丁酸)(EP 133,988)。在特定實施方案中緩釋組合物也可包括脂質(zhì)體，可用本領域所知幾種方法的任意一種來制備。如參見Eppstein等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，823688-3692(1985)；EP 036,676；EP 088,046和EP 143,949。在特定實施方案中用以體內(nèi)給藥的藥用組合物是無菌的。在特定實施方案中這可通過用無菌濾膜過濾來實現(xiàn)。在特定實施方案中當組合物為凍干形式時，使用這種方法的滅菌操作可在凍干和解凍操作之前或之后進行。在特定實施方案中用來胃腸外給藥的組合物可以凍干形式或溶液形式保存。在特定實施方案中胃腸外組合物通常置于一個有無菌入口的容器中，例如靜脈內(nèi)溶液袋和玻璃瓶，瓶子具有皮下注射針頭可穿透的塞子。在特定實施方案中當藥用組合物制備完成后，它可以溶液、混懸液、凝膠、乳劑、固體、脫水或凍干粉形式保存于無菌瓶中。在特定實施方案中這種制劑可以即用形式保存，或以給藥前充配的形式(如凍干)保存。在特定實施方案中本發(fā)明所指的藥劑盒用來產(chǎn)生單劑量給藥單元。在特定實施方案中每個藥劑盒可同時裝有第一種存有干蛋白的容器和第二種存有水性制劑的容器。在本發(fā)明的特定實施方案中，藥劑盒裝有預先充填的單和多室注射器(如液體注射器和裝有凍干粉和稀釋劑的二室注射器(lyosyringes))。在特定實施方案中在治療中使用含有抗體(無或有至少一種附加的治療劑)的藥用組合物有效劑量，可通過如治療環(huán)境和治療目的來確定。因此本領域技術(shù)人員將認識到，依據(jù)特定的實施方案合適的治療劑量水平是變化的，部分依賴于所傳遞的分子、所用抗體(有或沒有至少一種附加的治療劑)的適應癥、給藥途徑和病人尺寸(體重、身體表面積或器官大小)和/或病人狀況(年齡和總體健康)。在特定實施方案中臨床醫(yī)生可測定劑量并修改給藥途徑以得到最佳治療效果。在特定實施方案中典型劑量范圍依賴于上述因素可從0.1μg/kg至約100mg/kg或更高。在特定實施方案中劑量范圍可從0.1μg/kg到約100mg/kg；或1μg/kg到約100mg/kg；或5μg/kg到約100mg/kg。在特定實施方案中根據(jù)配方中所用抗體和/或任何附加的治療劑的藥物動力學參數(shù)來確定給藥頻率。在特定實施方案中臨床醫(yī)生開出組合物處方直至得到所需效果。因此在特定實施方案中組合物可單劑量給藥，或隨著時間進行雙劑量或更多次劑量給藥(可含有相同量或不同量所需分子)，或者通過植入裝置或?qū)Ч苓M行連續(xù)輸注。適當劑量的進一步精確化由本領域技術(shù)人員按常規(guī)進行，并且這也在他們例行任務的范圍內(nèi)。在特定實施方案中可通過使用合適的劑量-反應數(shù)據(jù)來確定合適的劑量。在特定實施方案中藥用組合物的給藥途徑與已知方法一致，例如口服，通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、大腦內(nèi)(腦實質(zhì)內(nèi)，intra-parenchymal)、腦室內(nèi)(intracerebroventricular)、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、脈管內(nèi)、門脈內(nèi)(intraportal)或病灶內(nèi)(intralesional)注射途徑；通過緩釋系統(tǒng)或植入裝置給藥。在特定實施方案中組合物的給藥可通過單次快速靜脈注射或持續(xù)輸注給藥，或通過植入裝置給藥。在特定實施方案中可通過植入吸收或包裹了所需分子的膜、紗布或其他合適材料來進行局部給藥。在特定實施方案中當使用植入裝置時，該裝置可被移植到任何合適的組織或器官中，可以擴散、時控釋放丸劑或連續(xù)給藥方式來傳遞所需分子。在特定實施方案中可能需要以先體外后體內(nèi)方式使用含有抗體(有或沒有至少一種附加的治療劑)的藥用組合物。在這種情況下，從病人體內(nèi)取出的細胞、組織和/或器官暴露于含有抗體(有或沒有至少一種附加的治療劑)的藥用組合物，然后將該細胞、組織和/或器官重移植回病人體內(nèi)。在特定實施方案中可使用如本文所述的方法來對某種細胞進行遺傳設計，使其表達并分泌多肽，然后通過植入該細胞來傳遞抗體和/或任何附加的治療劑。在特定實施方案中這種細胞可以是動物細胞或人細胞，同時可以是自身細胞、異源或異種細胞。在特定實施方案中這種細胞可以是無限增殖的。在特定實施方案中為了降低發(fā)生免疫反應的幾率，可將這種細胞進行包囊以避免周圍組織的滲透。在特定實施方案中這種包囊材料是典型的生物相容半透性聚合物外殼(enclosures)或膜，使蛋白產(chǎn)物得以釋放又阻止了病人免疫系統(tǒng)或周圍組織的其它有害因子對細胞的損傷。
實施例實施例1從食蟹猴序列中克隆重鏈恒定區(qū)如下文所述克隆食蟹猴天然抗體重鏈恒定區(qū)的多核苷酸。A.為得到cyno3-16恒定區(qū)，從食蟹猴全血中純化的食蟹猴B細胞中分離RNA。從該RNA合成cDNA，將此cDNA作為模板，用以下引物5-′GCCTCCACCAAGGGCCCTCG-3′(SEQ ID NO31)和5′-TTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3′(SEQ ID NO32)進行PCR。使用Expand High Fidelity PCR System(Roche)并添加5％DMSO進行PCR。樣品先在94℃溫育2min；然后是40個循環(huán)，每個循環(huán)在以下條件進行94℃30s，45℃或50℃30s，72℃1min或1.5min。樣品在最后一個PCR循環(huán)后再于72℃溫育7min。所用PCR引物濃度為30pmol，所用模板cDNA為2μl。B.為得到cyno2-4和cyno33恒定區(qū)，從食蟹猴B細胞的細胞系分離的基因組DNA作為PCR模板。使用兩套不同引物來擴增這些cyno IgG恒定區(qū)。5′-GCCTCCACCAAGGGCCCTCG-3′(SEQ IDNO33)和5′-TTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3′(SEQ ID NO34)用來擴增cyno2-4，5′-GTCACATGGCACCACCTCTCT-3′(SEQ IDNO35)和5′-GGTACGTGCCAAGCATCCTCG-3′(SEQ ID NO36)用來擴增cyno33。如實施例1A所述進行PCR反應，只不過使用1μl基因組DNA作為模板。在初始克隆之后，通過在合適的PCR引物中引入一個Nhe I或Not I限制性酶切位點，將每個編碼食蟹猴恒定區(qū)的多核苷酸構(gòu)建成一個Nhe I-Not I盒。具體說，在每個恒定區(qū)的5’端導入一個Nhe I位點，來進行核苷酸修飾。這沒有改變氨基酸序列。在終止密碼子3’端直接導入一個Not I位點。C.通過在編碼cyno2-4序列的多核苷酸上進行定點突變PCR來構(gòu)建cyno2-4cys恒定區(qū)。使用QuikChange Site-Directed MutagenesisKit(Stratagene)進行定點突變。通過引入一個單點突變將CH1區(qū)的第三個絲氨酸變成半胱氨酸。所用引物為，5′-CTGGCGTCCTGCTCCAGGAGC-3′(SEQ ID NO37)和5′-GCTCCTGGAGCAGGACGCCAG-3′(SEQ ID NO38)。D.cynods1恒定區(qū)包含cyno33和cyno2-4恒定區(qū)序列。如上實施例1A所述進行PCR擴增得到編碼cyno33 CH1區(qū)1到94位氨基酸的多核苷酸，通過使用本領域已知方法在引物中引入Nhe I和SalI位點來產(chǎn)生Nhe I-Sal I盒。所用引物為5′-GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTT-3′(SEQ ID NO39)和5′-AACTGTCTTGTCGACCTTGGTGTTG-3′(SEQ ID NO40)。通過如上實施例1A所述進行PCR來擴增編碼cyno2-4 CH1區(qū)、鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的多核苷酸3’末端，以產(chǎn)生一個Sal I-Not I盒，所用引物為5’-CAACACCAAGGTCGACAAGAGAGTT-3’(SEQ ID NO41)和5’-GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACACGGAG-3’(SEQ ID NO42)。Sal I位點的導入不改變多肽序列。將Nhe I-Sal I盒和Sal I-Not I盒連接在一起，得到編碼cynods1恒定區(qū)的多核苷酸序列。所得構(gòu)建體含有cyno33的CH1區(qū)域，只不過CH1區(qū)倒數(shù)第二個氨基酸發(fā)生了T到R轉(zhuǎn)換。鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)由cyno2-4多核苷酸序列編碼。E.為得到cyno686和cyno439恒定區(qū)，從食蟹猴混合淋巴組織中分離RNA，并藉此制備一個cDNA文庫。以該cDNA為模板，用引物5′-CGTCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATC-3′(SEQ IDNO43)和5′-GCATGTCGACTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3′(SEQ ID NO44)進行PCR。PCR反應混合物包括濃度為5pmol/μl的兩種引物各2μl；5μl Stratagene 10×Pfu緩沖液；10nmoldNTPs(A，C，G，T)混合液0.5μl；2.5U/μl Stratagene Pfupolymerase 0.5μl；1μl cDNA模板；和39μl無菌水。反應液終體積為50μl。用以下參數(shù)進行28個PCR循環(huán)，每個循環(huán)為94℃20s，60℃30s，74℃150s。使用Invitrogen PCRII TOPO-TA克隆系統(tǒng)(K4600-01SC)按系統(tǒng)提供的說明書進行PCR產(chǎn)物克隆?？筛鶕?jù)上述通用方法進行附加重鏈恒定區(qū)的分離。按上述方法制備的cyno3-16、cyno2-4、cyno33、cyno2-4cys、cynods克隆和附加克隆可進行核酸序列和氨基酸序列相似性比較。如見圖16和17。
實施例2食蟹猴序列輕鏈恒定區(qū)的克隆從食蟹猴B細胞的細胞系克隆編碼食蟹猴輕鏈κ恒定區(qū)的天然多核苷酸。從該細胞系分離RNA，并由此RNA合成cDNA。cDNA被用作PCR模板，引物為5′-ATCAAACGAGCTGTGGCTGCACCA-3′(SEQ ID NO45)和5′-CAGGTGGGGGCACTTCTCCCT-3′(SEQID NO46)。使用Expand High Fidelity PCR System(Roche)并添加5％DMSO進行PCR。樣品先于94℃溫育2min；然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)在以下條件中進行94℃30s，45℃30s，72℃1min。樣品在最后一個PCR循環(huán)后再于72℃溫育7min。所用PCR引物濃度為30pmol，使用2μl的cDNA制品。初始克隆之后，通過PCR將編碼食蟹猴κ恒定區(qū)的多核苷酸構(gòu)建成一個BssH II-Not I盒。在恒定區(qū)的5’末端引入一個BssH II位點來進行核苷酸修飾。這并不改變氨基酸序列。在終止密碼子3’端引入一個Not I位點。
實施例3嵌合重鏈和輕鏈的裝配及嵌合抗體的生產(chǎn)嵌合重鏈制備的全長重鏈分子包含重鏈可變區(qū)和食蟹猴恒定區(qū)。通過PCR合成編碼可變區(qū)的多核苷酸，以產(chǎn)生一個Sal I-Nhe I盒或一個Sal I-Apa I盒。這兩種盒均包含Kozak序列和可變區(qū)編碼序列5’的前導序列。Sal I-Apa I盒的3’末端包含有編碼食蟹猴恒定區(qū)的前5個氨基酸的核酸。某些示例性嵌合重鏈可用圖18提供的重鏈可變序列制備。為制備cyno3-16重鏈質(zhì)粒，將Sal I-Apa I可變區(qū)盒連接到實施例1A所述的食蟹猴恒定區(qū)盒的Apa I位點，位于自恒定區(qū)起點后的5個氨基酸。所得構(gòu)建體插入到瞬時表達載體pDC414-N的Sal I和Not I位點之間。為制備cyno33重鏈質(zhì)粒，將Sal I-Apa I可變區(qū)盒連接到實施例1B所述的食蟹猴恒定區(qū)盒的Apa I位點，位于自恒定區(qū)起點后的5個氨基酸。所得構(gòu)建體插入到瞬時表達載體pDC414-N的Sal I和Not I位點之間。為制備cyno2-4重鏈質(zhì)粒，將Sal I-Nhe I可變區(qū)盒連接到實施例1B所述的食蟹猴恒定區(qū)盒編碼多核苷酸的Nhe I位點。所得構(gòu)建體插入到pDC414-N的Sal I和Not I位點之間。為制備cynodsl重鏈質(zhì)粒，將Sal I-Nhe I可變區(qū)盒連接到實施例1D所述的食蟹猴恒定區(qū)盒編碼多核苷酸的Nhe I位點。所得構(gòu)建體也插入到pDC414-N的Sal I和Not I位點之間。pDC414-N是修飾過的pDC412(Ettehadieh et al.，Cytotechnology 3811-14(2002))。pDC414-N含有Epstein-Barr復制起點(Shirakata and Hirai，J.Biochem.123175-181(1998))最低限度的120bp序列，取代了pDC412中2.1kb的Epstein-Barr復制起點。pDC414-N載體骨架中也除去了Nhe I位點。為制備cyno2-4cys重鏈質(zhì)粒，將Sal I-Nhe I可變區(qū)盒連接到實施例1C所述的cyno2-4cys恒定區(qū)編碼多核苷酸的Nhe I位點。所得構(gòu)建體插入到pDC409(Giri et al.，EMBO J.132822-2830(1994))的Sal I和Not I位點之間。
嵌合輕鏈制備的全長輕鏈分子含有輕鏈可變區(qū)和食蟹猴恒定區(qū)。通過PCR將可變區(qū)合成為Sal I-BssH II盒。該盒包含Kozak和可變區(qū)5’的前導序列。依據(jù)各種實施方案，可將任何物種的任何輕鏈可變區(qū)與食蟹猴重鏈恒定區(qū)結(jié)合。某些示例性嵌合輕鏈可用圖19提供的輕鏈可變序列制備。為了制備輕鏈質(zhì)粒，將Sal I-BssH II可變區(qū)盒連接到實施例2所述的Not I-BssH II恒定區(qū)盒的BssH II位點。所得Sal I-Not I盒插入到pDC414-N的Sal I和Not I位點之間。依據(jù)本領域所熟知的過程，構(gòu)建這些嵌合重鏈和輕鏈的方法必需酶切、連接和轉(zhuǎn)化到細菌宿主細胞內(nèi)。
嵌合抗體的制備使用Ettehadieh et al.(Cytotechnology 3811-14(2002))所述方法將嵌合食蟹猴重鏈和輕鏈質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到E5細胞內(nèi)，以進行抗體的瞬時表達。通常使用DEAE/葡聚糖處理并隨后用DMSO休克細胞來進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后，這些細胞在含有0.5％胎牛血清的低血清培養(yǎng)基上生長7d。從細胞上清中純化抗體。先用PBS(pH 7.4磷酸鹽緩沖液)平衡4.6×100mm蛋白A樹脂柱(POROS20 A，Perseptive Biosystems)后，上清以10ml/min的流速過柱。收集流出液。用40ml pH 7.4PBS洗滌柱子，并用15ml 0.1MGlycine pH 2.7+0.3M NaCl溶液洗脫蛋白，收集15×1-ml的流分。使用100μl 1.0M pH 8.0的Tris液中和流分。使用蛋白200plus lab chip kit(Agilent)來制備樣品，并按制造廠家的說明運行Agilent 2100生物分析儀和蛋白200檢測儀。對含有cyno3-16、cyno33和cyno2-4的抗體，用3μl PBS和1μl抗體樣品混合。對含有cyno2-4cy和cynods1的抗體，使用4μl抗體樣品。這4μl樣品然后與2μl變性、非還原性溶液混合。該樣品在100℃下加熱3min，然后用84μl蒸餾水稀釋。取這些稀釋樣品6μl用于實驗室芯片，以分析存在的抗體。另一選擇是，可按本領域標準方法在SDS-PAGE凝膠上分析樣品。嵌合輕鏈分子量約為23.3kDa，嵌合重鏈分子量約為49.7kDa。在SDS-PAGE凝膠上，這些嵌合輕鏈分子量約為29kDa，嵌合重鏈分子量約為53kDa。用透析或用過濾單位大于10k的離心超濾器(AmiconCentricon Plus 10k MWCO)(產(chǎn)品號UFC2LGC24)于4℃3000rpm離心，將含有抗體的流分轉(zhuǎn)移到pH 7.2或6.8的PBS中。轉(zhuǎn)移到PBS后，用22μm濾膜對樣品進行無菌過濾。
實施例4測量嵌合抗體對抗原表位的結(jié)合能力為測試某些示例性抗體的活性，對它們進行活性試驗，以期阻斷IL4和IL13對B細胞上CD23的誘導。如參見T.Defrance等(JExp Med 1651459(1987))和J.Punnonen等(Proc.Nat.Acad.Sci.903730-34(1993))，各自描述了IL 4和IL 13對B細胞上CD23的誘導。在活性試驗中，將抗體滴定到含有IL 4的B細胞培養(yǎng)液中。用檢測細胞表面CD23的熒光抗體進行FACS分析，來測量對CD23表達的抑制作用。
實施例5測量嵌合抗體的Fc結(jié)合能力將稀釋兩倍后的濃度為20mg/ml(nM)的嵌合抗體滴加到PBS中稀釋6倍，用過量(1mM)生物素?；目扇躧ulL-4R(用氨基己酰-生物素-N-羥基-琥珀酸酰亞胺酯制得(Zymed cat.no.004302))4℃下預溫育30min。按制造廠家的說明用氨基己酰-生物素-N-羥基-琥珀酸酰亞胺酯制得生物素?；目扇躧ulL-4R(Zymed cat.no.004302)。這個試驗適用于任何嵌合抗體及其識別的抗原。T細胞移除的外周血單核細胞(PBMC)在無血清RPMI中37℃溫育1h，使結(jié)合FcR的嗜細胞IgG脫落。然后滴加復合的抗hulL-4R ab/生物素-hulL-4R使細胞染色。在PBS中洗滌細胞兩次，以150×g轉(zhuǎn)速離心。然后此細胞與鏈霉親和素-藻紅蛋白(Molecular Probes，cat.no.S-866)(在PBS中以1∶150稀釋)在4℃下溫育30min。在PBS中洗滌細胞兩次，以150×g轉(zhuǎn)速離心。然后通過流式細胞分析法對單核細胞大小設置門控從而探測復合體結(jié)合情況。
序列表<110>AMGEN INC.
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Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu115 120 125Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu130 135 140Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln145 150 155 160Phe Asn Trp Tyr Val Asn Gly Ala Glu Val His His Ala Gln Thr Lys165 170 175Pro Arg Glu Thr Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu180 185 190Thr Val Thr His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Thr Cys Lys195 200 205Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Gln Lys Thr Ile Ser Lys210 215 220Asp Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser225 230 235 240Arg Glu Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys245 250 255Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln260 265 270Pro Glu Asn Thr Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly275 280 285Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln290 295 300Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn305 310 315 320His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys325 330<210>27<211>999<212>DNA<213>食蟹猴(Macaca fascicularis)
<400>27gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct cctccaggag cacctccgag 60agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ctgaacccgt gaccgtgtcg120tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca180gggctctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc240tacgtctgca acgtaaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagata300aaaacatgtg gtggtggcag caaacctccc acgtgcccac cgtgcccagc acctgaactc360ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc420cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc aggaagaccc cgaggtccag480ttcaactggt acgtaaacgg cgcggaggtg catcatgccc agacgaagcc acgggagacg540cagtacaaca gcacgtaccg cgtggtcagc gtcctcaccg tcacacacca ggactggctg600aacggcaagg agtacacgtg caaggtctcc aacaaagccc tcccggcccc catccagaaa660accatctcca aagacaaagg gcagccccga gagcctcagg tgtacaccct gcccccgtcc720cgggaggagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc780agcgacatcg tcgtggagtg ggagagcagc gggcagccgg agaacaccta caagaccacc840ccgcccgtgc tggactccga cggctcctac ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag900agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac960cactacaccc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa 999<210>28<211>333<212>PRT<213>食蟹猴(Macaca fascicularis)<400>28Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg1 5 10 15Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr20 25 30Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser35 40 45Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser50 55 60Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr65 70 75 80
Tyr Val Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys85 90 95Arg Val Glu Ile Lys Thr Cys Gly Gly Gly Ser Lys Pro Pro Thr Cys100 105 110Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu115 120 125Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu130 135 140Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln145 150 155 160Phe Asn Trp Tyr Val Asn Gly Ala Glu Val His His Ala Gln Thr Lys165 170 175Pro Arg Glu Thr Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu180 185 190Thr Val Thr His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Thr Cys Lys195 200 205Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Gln Lys Thr Ile Ser Lys210 215 220Asp Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser225 230 235 240Arg Glu Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys245 250 255Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln260 265 270Pro Glu Asn Thr Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly275 280 285Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln290 295 300Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn305 310 315 320
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys325 330<210>29<211>324<212>DNA<213>食蟹猴(Macaca fascicularis)<400>29cgcgctgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgaggatca ggtgaaatct 60ggaactgtct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc cagcgtaaag120tggaaggtgg atggtgtcct caaaacgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac180agcaaggaca acacctacag cctgagcagc accctgacgc tgagcagcac agactaccag240agtcacaatg tctatgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcaccaag300agcttcaaca gaggagagtg ttag 324<210>30<211>107<212>PRT<213>食蟹猴(Macaca fascicularis)<400>30Arg Ala Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Glu Asp1 5 10 15Gln Val Lys Ser Gly Thr Val Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe20 25 30Tyr Pro Arg Glu Ala Ser Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Leu Lys35 40 45Thr Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Asn50 55 60Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Ser Thr Asp Tyr Gln65 70 75 80Ser His Asn Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser85 90 95Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys100 105<210>31
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<223>引物<400>32tttacccgga gacagggaga g 21<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>33gcctccacca agggccctcg20<210>34<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>34tttacccgga gacagggaga g 21<210>35<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>35gtcacatggc accacctctc t 21<210>36
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<223>引物<400>37ctggcgtcct gctccaggag c 21<210>38<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>38gctcctggag caggacgcca g 21<210>39<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>39gctagcacca agggcccatc ggtctt 26<210>40<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>40aactgtcttg tcgaccttgg tgttg 25<210>41
<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>41caacaccaag gtcgacaaga gagtt 25<210>42<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>42gcggccgctc atttacccgg agacacggag 30<210>43<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>43cgtctctagt gcctccacca agggcccatc 30<210>44<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>44gcatgtcgac tcatttaccc ggagacaggg agag34<210>45<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>引物<400>46caggtggggg cacttctccc t 21<210>47<211>345<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>47gaggttcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacatc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag gctctggatt caccttcagt agaaatgcta tgttctgggt tcgccaggct120ccaggaaaag gtctggagtg ggtatcaggt attggtactg gtggtgccac aaactatgca180gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cttgtatctt240caaatgaaca gcctgagagc cgaggacatg gctgtgtatt actgtgcaag agggaggtac300tactttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca345<210>48<211>345<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>48gaggttcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacatc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag gctctggatt caccttcagt agaaatgcta tgttctgggt tcgccaggct120ccaggaaaag gtctggagtg ggtatcaggt attggtactg gtggtgccac aagctatgca180gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cttgtatctt240caaatgaaca gcctgagtgc cgaggacatg gctgtgtatt actgtgcaag agggaggtac300tacttcaccc actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca345<210>49<211>347<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>49gaggttcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacatc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag gctctggatt caccttcagt agaaatgcta tgttctgggt tcgccaggct120ccaggaaaag gtctggagtg ggtatcaggt attggtactg gtggtgccac aagctatgca180gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cttgtatctt240caaatgaaca gcctgagagc cgaggacatg gctgtgtatt actgtgcaag agggaggtac300tggtacaaca actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctcaca 347<210>50<211>345<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>50gaggttcagt tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacatc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag gctctggatt caccttcagt agaaatgcta tgttctgggt tcgccaggct120ccaggaaaag gtctggagtg ggtatcaggt attggtactg gtggtgccac aaactatgca180gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cttgtatctt240caaatgaaca gcctgagagc cgaggacatg gctgtgtatt actgtgcaag agggaggtac300tacttcccgt ggtggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca345<210>51<211>345<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>51gaggttcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacatc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag gctctggatt caccttcagt agaaatgcta tgttctgggt tcgccaggct120ccaggaaaag gtctggagtg ggtatcaggt attggtactg gtggtgccac aaactatgca180gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cttgtatctt240caaatgaaca gcctgagagc cgaggacatg gctgtgtatt actgtgcaag agggaggtac300tacttcacga ggtggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca345
<210>52<211>345<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>52gaggttcagt tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacatc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag gctctggatt caccttcagt agaaatgcta tgttctgggt tcgccaggct120ccaggaaaag gtctggagtg ggtatcaggt attggtactg gtggtgccac aaactatgca180gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cttgtatctt240caaatgaaca gcctgagagc cgaggacatg gctgtgtatt actgtgcaag agggaggtac300tggtacccgt ggtggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca345<210>53<211>345<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>53gaggttcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacatc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag gctctggatt caccttcagt agaaatgcta tgttctgggt tcgccaggct120ccaggaaaag gtctggagtg ggtatcaggt attggtactg gtggtgccac aagctatgca180gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cttgtatctt240caaatgaaca gcctgagagc cgaggacatg gctgtgtatt actgtgcaag agggaggtac300tggtacccgt ggtggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca345<210>54<211>345<212>DNA<213>人工序列；<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>54gaggttcagt tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacatc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag gctctggatt caccttcagt agaaatgcta tgttctgggt tcgccaggct120ccaggaaaag gtctggagtg ggtatcaggt attggtactg gtggtgccac aaactatgca180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cttgtatctt240caaatgaaca gcctgagagc cgaggacatg gctgtgtatt actgtgcaag agggaggtac300tggttcccgt ggtggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca345<210>55<211>345<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>55gaggttcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacatc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag gctctggatt caccttcagt agaaatgcta tgttctgggt tcgccaggct120ccaggaaaag gtctggagtg ggtatcaggt attggtactg gtggtgccac aagctatgca180gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cttgtatctt240caaatgaaca gcctgagagc cgaggacatg gctgtgtatt actgtgcaag agggaggtac300tggttcccgt ggtggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca345<210>56<211>345<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>56gaggttcagt tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacatc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag gctctggatt caccttcagt agaaatgcta tgttctgggt tcgccaggct120ccaggaaaag gtctggagtg ggtatcaggt attggtactg gtggtgccac aaactatgca180gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cttgtatctt240caaatgaaca gcctgagagc cgaggacatg gctgtgtatt actgtgcaag agggaggtac300tggtacccgt ggtggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca345<210>57<211>345<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>57
gaggttcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacatc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag gctctggatt caccttcagt agaaatgcta tgttctgggt tcgccaggct120ccaggaaaag gtctggagtg ggtatcaggt attggtactg gtggtgccac aagctatgca180gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cttgtatctt240caaatgaaca gcctgagagc cgaggacatg gctgtgtatt actgtgcaag agggaggtac300tggtacccgt ggtggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca345<210>58<211>345<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>58gaggttcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacatc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag gctctggatt caccttcagt agaaatgcta tgttctgggt tcgccaggct120ccaggaaaag gtctggagtg ggtatcaggt attggtactg gtggtgccac aagctatgca180gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cttgtatctt240caaatgaaca gcctgagagc cgaggacatg gctgtgtatt actgtgcaag agggaggtac300tacttcccgt ggtggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca345<210>59<211>345<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>59gaggttcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacatc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag gctctggatt caccttcagt agaaatgcta tgttctgggt tcgccaggct120ccaggaaaag gtctggagtg ggtatcaggt attggtactg gtggtgccac aagctatgca180gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cttgtatctt240caaatgaaca gcctgagtgc cgaggacatg gctgtgtatt actgtgcaag agggaggtac300tacttcccgt ggtggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca345<210>60<211>345<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>60gaggttcagt tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agaaatgcta tgttctgggt tcgccaggct120ccaggaaaag gtctggagtg ggtatcaggt attggtactg gtggtgccac aagctatgca180gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cttgtatctt240caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcaag agggaggtac300tacttcccgt ggtggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca345<210>61<211>115<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>61Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn20 25 30Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110Val Ser Ser115
<210>62<211>115<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>62Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn20 25 30Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Ser Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Thr His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110Val Ser Ser115<210>63<211>115<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>63Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn20 25 30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Gly Arg Tyr Trp Tyr Asn Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110Val Ser Ser115<210>64<211>115<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>64Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn20 25 30Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110
Val Ser Ser115<210>65<211>115<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>65Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn20 25 30Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Thr Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110Val Ser Ser115<210>66<211>114<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>66Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn20 25 30Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Gly Arg Tyr Trp Tyr Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110Val Ser<210>67<211>115<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>67Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn20 25 30Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95Arg Gly Arg Tyr Trp Tyr ProTrp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110Val Ser Ser115<210>68<211>115<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>68Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn20 25 30Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Gly Arg Tyr Trp Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110Val Ser Ser115<210>69<211>115<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列
<400>69Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn20 25 30Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Gly Arg Tyr Trp Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110Val Ser Ser115<210>70<211>115<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>70Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn20 25 30Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Gly Arg Tyr Trp Tyr Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110Val Ser Ser115<210>71<211>115<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>71Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn20 25 30Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Gly Arg Tyr Trp Tyr Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110Val Ser Ser115<210>72<211>115<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>72Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn20 25 30Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110Val Ser Ser115<210>73<211>115<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>73Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn20 25 30Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Ser Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110Val Ser Ser115<210>74<211>115<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>74Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn20 25 30Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110Val Ser Ser115
<210>75<211>327<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>75gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa120cctggccagg ctcccaggct cctcatcttt ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca180gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag240cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcc gtggacgttc300ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaa327<210>76<211>327<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>76gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc aacagctact tagcctggta ccagcagaaa120cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggcccc tggcatccca180gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag240cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatgatc actcagcagg gtggacgttc300ggccaaggga ccaaggtgga gatcaaa327<210>77<211>327<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>77gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccggggga aagagccacc 60ctctcctgca gggccagtca gactgttaac agcgactact tagcctggta ccagcagaaa120ccgggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag240cctgaagatt ttgcagtcta ttactgtcag cagtatggta ggtcacctcc gtggacgttc300ggccaaggga ccaaagtgga tatcaaa327<210>78<211>327<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>78gaaattgtga tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcgactact tagcctggta ccagcagaaa120cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcta gcagggcctc tggcatccca180gacaggttca gtggcagtgg gtttgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag240cctgaagatt ttgcaatata ttactgtcag cagtatggta gctcacctcc gtggacgttc300ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaa327<210>79<211>327<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>79gatattgtgc tgacccagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60ctctcctgca gggccagtca gagtgttaac agcaactact tagcctggta ccagcagaaa120cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtacatcct acagggccac tggcatccca180gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcac cagactggag240cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccacc gtggacgttc300ggccaaggga cacgactgga gattaaa327<210>80<211>327<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列
<400>80gatattgtgc tgacgcagac tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60ctctcctgca gggccagtca gagtgttggc agcagctact tagcctggta ccagcagaga120cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatcccg180gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcacgatcag cagactggag240cctgaagatt ttgcagtgta ttattgtcag cagtatggaa gttcacctcc gtggatgttc300ggccaaggga ccaaggtgga gatcaaa327<210>81<211>109<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>81Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser20 25 30Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45Ile Phe Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65 70 75 80Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro85 90 95Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>82<211>109<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列
<400>82Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Ser20 25 30Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65 70 75 80Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp His Ser Ala85 90 95Gly Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>83<211>109<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>83Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Asn Ser Asp20 25 30Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65 70 75 80Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Pro
85 90 95Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105<210>84<211>109<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>84Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asp20 25 30Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65 70 75 80Pro Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro85 90 95Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>85<211>109<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>85Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Ser Asn20 25 30Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45Ile Tyr Gly Thr Ser Tyr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu65 70 75 80Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro85 90 95Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys100 105<210>86<211>109<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>識別抗IL-4R的抗體可變區(qū)序列<400>86Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser20 25 30Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu35 40 45Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu65 70 75 80Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro85 90 95Pro Trp Met Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 10權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO6、SEQ IDNO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14或SEQ ID NO20所示的氨基酸序列，并且還包含抗體重鏈可變區(qū)。
2.權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述抗體重鏈可變區(qū)是食蟹猴抗體重鏈可變區(qū)。
3.權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述抗體重鏈可變區(qū)是非食蟹猴物種的抗體重鏈可變區(qū)。
4.權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述抗體重鏈可變區(qū)是人抗體重鏈可變區(qū)。
5.權(quán)利要求1的分離的多肽，其中所述抗體重鏈可變區(qū)是小鼠抗體重鏈可變區(qū)。
6.一種分離的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO30所示氨基酸序列，并且還包含抗體輕鏈可變區(qū)。
7.權(quán)利要求6的分離的多肽，其中所述抗體輕鏈可變區(qū)是食蟹猴抗體輕鏈可變區(qū)。
8.權(quán)利要求6的分離的多肽，其中所述抗體輕鏈可變區(qū)是非食蟹猴物種的抗體輕鏈可變區(qū)。
9.權(quán)利要求6的分離的多肽，其中所述抗體輕鏈可變區(qū)是人抗體輕鏈可變區(qū)。
10.權(quán)利要求6的分離的多肽，其中所述抗體輕鏈可變區(qū)是小鼠抗體輕鏈可變區(qū)。
11.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含兩種多肽的編碼序列，其中一種多肽包含SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14或SEQ ID NO20所示氨基酸序列，另一種多肽包含抗體重鏈可變區(qū)。
12.權(quán)利要求11的分離的多核苷酸，其中所述編碼包含抗體重鏈可變區(qū)的多肽的序列是食蟹猴重鏈可變區(qū)的編碼序列。
13.權(quán)利要求11的分離的多核苷酸，其中所述編碼包含抗體重鏈可變區(qū)的多肽的序列是非食蟹猴物種的抗體重鏈可變區(qū)的編碼序列。
14.權(quán)利要求11的分離的多核苷酸，其中所述編碼包含抗體重鏈可變區(qū)的多肽的序列是人抗體重鏈可變區(qū)的編碼序列。
15.權(quán)利要求11的分離多核苷酸，其中所述編碼包含抗體重鏈可變區(qū)的多肽的序列是小鼠抗體重鏈可變區(qū)的編碼序列。
16.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含兩種多肽的編碼序列，其中一種多肽包含SEQ ID NO30所示氨基酸序列，另一種多肽包含抗體輕鏈可變區(qū)。
17.權(quán)利要求16的分離的多核苷酸，其中所述編碼包含抗體輕鏈可變區(qū)的多肽的序列是食蟹猴抗體輕鏈可變區(qū)的編碼序列。
18.權(quán)利要求16的分離的多核苷酸，其中所述編碼包含抗體輕鏈可變區(qū)的多肽的序列是非食蟹猴物種的抗體輕鏈可變區(qū)的編碼序列。
19.權(quán)利要求16的分離的多核苷酸，其中所述編碼包含抗體輕鏈可變區(qū)的多肽的序列是人抗體輕鏈可變區(qū)的編碼序列。
20.權(quán)利要求16的分離的多核苷酸，其中所述編碼包含抗體輕鏈可變區(qū)的多肽的序列是小鼠抗體輕鏈可變區(qū)的編碼序列。
21.權(quán)利要求11的分離的多核苷酸，其中所述分離的多核苷酸包含SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13或SEQ ID NO19所示的核苷酸序列。
22.權(quán)利要求16的分離的多核苷酸，其中所述分離的多核苷酸包含SEQ ID NO29所示的核苷酸序列。
23.一種分離的抗體，所述抗體包含的第一多肽包含SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14或SEQ ID NO20所示的氨基酸序列，包含的第二多肽包含SEQ IDNO30所示的氨基酸序列。
24.權(quán)利要求23的分離的抗體，進一步包含食蟹猴重鏈可變區(qū)和食蟹猴輕鏈可變區(qū)。
25.權(quán)利要求23的分離的抗體，進一步包含非食蟹猴物種的重鏈可變區(qū)和非食蟹猴物種的輕鏈可變區(qū)。
26.權(quán)利要求25的分離的抗體，其中所述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)來源于同一物種。
27.權(quán)利要求23的分離的抗體，進一步包含人抗體重鏈可變區(qū)和人抗體輕鏈可變區(qū)。
28.權(quán)利要求23的分離的抗體，進一步包含小鼠抗體重鏈可變區(qū)和小鼠抗體輕鏈可變區(qū)。
29.一種評估抗體效果的方法，包括a)將包含抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)及食蟹猴抗體輕鏈和重鏈恒定區(qū)的嵌合抗體引入到食蟹猴體內(nèi)；和b)評估該嵌合抗體在食蟹猴體內(nèi)的效果。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述評估包括評估該嵌合抗體治療或預防猴疾病的有效性。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述評估包括檢測猴體內(nèi)的不良事件。
32.一種表達載體，所述表達載體包含權(quán)利要求11的分離的多核苷酸。
33.一種表達載體，所述表達載體包含權(quán)利要求16的分離的多核苷酸。
34.一種細胞，所述細胞至少含有權(quán)利要求32或33的表達載體中的一種。
35.一種制備多肽的方法，包括a)在適于表達該多肽的條件下培養(yǎng)含有權(quán)利要求32的表達載體的細胞；和b)分離該多肽。
36.一種制備多肽的方法，包括a)在適于表達該多肽的條件下培養(yǎng)含有權(quán)利要求33的表達載體的細胞；和b)分離該多肽。
37.一種制備嵌合抗體的方法，包括a)在適于表達該嵌合抗體的條件下，培養(yǎng)含有權(quán)利要求32的表達載體并進一步含有權(quán)利要求33的表達載體的細胞；和b)分離該嵌合抗體。
全文摘要
來自食蟹猴重鏈和輕鏈恒定區(qū)的核苷酸編碼序列及氨基酸序列。描述了具有食蟹猴恒定區(qū)的嵌合抗體。
文檔編號C12N15/13GK1902228SQ200480039760
公開日2007年1月24日 申請日期2004年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月7日
發(fā)明者T·阿爾德里奇, 沈文彥, F·W·雅各布森, A·E·莫里斯, M·J·阿倫 申請人:安姆根有限公司