一種免疫球蛋白g片段的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種免疫球蛋白G片段的制備方法及應(yīng)用， 特別設(shè)及一種高純度F(油'）2抗體片段的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig)是機(jī)體產(chǎn)生的一種特殊的蛋白質(zhì)，主要存在于 生物體血液和其他體液（包括組織液和外分泌液）中。多數(shù)Ig具有抗體活性，可W特異性 識(shí)別和結(jié)合抗原，并引發(fā)一系列生物學(xué)效應(yīng)。它的理化性狀穩(wěn)定、生物活性明確、與抗原結(jié) 合的特異性強(qiáng)、便于提取或者重組表達(dá)和質(zhì)量控制，并且來源容易。運(yùn)些優(yōu)點(diǎn)使免疫球蛋白 成為解決生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等許多重大問題的重要手段。盡管免疫球蛋白在疾病的診斷和治療 等方面有著明顯的優(yōu)勢(shì)，但是常規(guī)免疫球蛋白應(yīng)用也具有明顯的局限性，主要體現(xiàn)在其抗 原性W及分子結(jié)構(gòu)的大而復(fù)雜性。前者易產(chǎn)生治療中的排異等副作用，后者造成其組織的 穿透力差，特異性低，表達(dá)復(fù)雜且困難。
[0003]免疫球蛋白Fab'或F(ab')2片段，由于去掉了免疫球蛋白恒定區(qū)Fc，不受位于巨 隧細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨細(xì)胞等細(xì)胞上的Fc受體的影響，不易遭到吞隧細(xì) 胞攻擊，減少非特異性免疫反應(yīng)。在使用鼠源性免疫球蛋白W及馬源性免疫球蛋白用于體 內(nèi)治療的時(shí)候，F(xiàn)ab'或F(ab' )2片段免疫原性小，使人抗鼠免疫球蛋白、人抗馬免疫球蛋白 反應(yīng)最小化。F油'或F(油'）2片段分子量小，穿透性強(qiáng)，到達(dá)祀標(biāo)部位迅速且能滲透入組 織深層處，有利于快速結(jié)合至祀抗原，進(jìn)行疾病的診斷和治療?？梢姡贵wFab'或F(ab')2 片段去除Fc后具有上述優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還能保留對(duì)原抗原的結(jié)合能力，藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)得到改 善，更有利于臨床應(yīng)用。
[0004] 目前免疫球蛋白F油'片段常用酶解法制備獲得。CN104498576A公開了一種固 化酶切制備Fab抗體的方法，包括如下步驟：1)固化酶的制備方法：在木瓜蛋白酶溶液中加 入活化的微球，使木瓜蛋白酶與活化偶聯(lián)填料充分偶聯(lián)；2)固化酶酶切：取2H4抗體5mg， 與5ml含100μL固定化木瓜蛋白酶的邸TA-Na2消化緩沖液混合、解育，酶濃度為0. 05mg/ ml;3)酶切后Fab抗體分離純化即得Fab抗體。木瓜蛋白酶是一種半脫氨酸膚鏈內(nèi)切蛋白 酶，被廣泛用于抗體片段Fab'的制備。木瓜蛋白酶主要水解IgG的部位是在較鏈區(qū)的重鏈 鏈間二硫鍵近N端側(cè)，可將Ig裂解為2個(gè)完全相同的F油'段和1個(gè)Fc段。F油'段即抗 原結(jié)合片段，相當(dāng)于抗體分子的兩個(gè)臂，由一條完整的輕鏈和重鏈的VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成。 一個(gè)Fab'片段為單價(jià)，可與抗原結(jié)合但不發(fā)生凝集反應(yīng)或沉淀反應(yīng)。Fc段為可結(jié)晶片段， 相當(dāng)于IgG的C肥和C冊(cè)結(jié)構(gòu)域。Fc無抗原結(jié)合活性，是IgG與效應(yīng)分子或細(xì)胞相互作用 的部位。但是由于木瓜蛋白酶是一種低特異性的蛋白水解酶，因此制備獲得的F油'產(chǎn)物均 一'性不佳。 陽0化]CN1266907A公開了一種單克隆抗體雙段和單段的制備方法，該方法為：粗體抗 體，酶切，二次純化和凍干，制備的F(油)2、F(油）的純度可大于98%。胃蛋白酶是一種天冬 氨酸型的內(nèi)切蛋白酶，被廣泛用于抗體片段F(油'）2的制備。用胃蛋白酶水解IgG可獲得 1個(gè)F(油'）2片段和一些小片段pFc' (Fc/2)。F(油'）2是由2個(gè)F油'及較鏈區(qū)組成，由于IgG分子的兩個(gè)臂仍由二硫鍵連接，因此F(油'）2片段為雙價(jià)，可同時(shí)結(jié)合兩個(gè)抗原表位。 由于F(油'）2片段保留了結(jié)合相應(yīng)抗原的生物學(xué)活性，又避免了Fc段抗原性可能引起的副 作用，因而被廣泛用作生物制品，如白喉抗毒素、破傷風(fēng)抗毒素經(jīng)胃蛋白酶水解后精制提純 的制品，因去掉Fc段而減少超敏反應(yīng)的發(fā)生。胃蛋白酶水解IgG后所產(chǎn)生的pFc'最終被 降解，無生物學(xué)作用。同樣，胃蛋白酶的底物特異性不是很強(qiáng)，即可作用于較鏈區(qū)的重鏈鏈 間二硫鍵近C端側(cè)，也可作用于較鏈區(qū)的重鏈鏈間二硫鍵近N端側(cè)，同時(shí)由于不同IgG亞類 對(duì)胃蛋白酶消化的敏感性不一樣，尤其是IgG最難消化，甚至有抗性，因此F(ab')2得率很 低。工業(yè)生產(chǎn)的時(shí)候需要復(fù)雜的工藝摸索和嚴(yán)格的酶切體系控制才能獲得所需的F(油'）2 片段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種免疫球蛋白G片段的制備方法及應(yīng)用，該方法獲得的 F(油'）2?及F油'片段純度可達(dá)95%W上。
[0007] 為達(dá)到此發(fā)明的目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0008] 第一方面，本發(fā)明提供一種免疫球蛋白G片段的制備方法，包括W下步驟：
[0009] (1)取IdeS蛋白酶與免疫球蛋白G在緩沖液中混合，解育；
[0010] (2)酶切后分離純化得到免疫球蛋白GF(油'）2抗體。
[0011] 第二方面，本發(fā)明提供一種免疫球蛋白G片段的制備方法，包括W下步驟：
[0012] (1)取IdeS蛋白酶與免疫球蛋白G在緩沖液中混合，解育；
[0013](2)酶切后分離純化免疫球蛋白G F(油'）2片段；
[0014] (3)分離純化的免疫球蛋白G F(油'）2片段還原為F油'片段，得到免疫球蛋白G 化b'片段。 陽015] 本發(fā)明中，IdeS作用底物只有IgG類抗體，而且與胃蛋白酶和木瓜蛋白酶不同， IdeS切割位點(diǎn)專一性高，產(chǎn)物均一，酶切IgG后可W獲得完整的F(ab' )2片段，其中，與抗 原結(jié)合的F(ab' )2片段分子量大小約為lOOkDa。
[0016] 優(yōu)選地，步驟（1)所述IdeS蛋白酶的氨基酸序列包含如SEQIDNO. 1所示的片段， 所述片段的序列如下：
[0017]DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNG邸DLLCGA ATAG醒L冊(cè)W抑QN邸QIKRYL邸HP邸QKINFNGEQM抑VKEAIDTKN朋LDSKLFEYF邸KAFP化STKHLGV FPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGS邸PRGGI抑AVFTRGDQS化LTS畑DFKEKNLKEISDLIK邸LTEG KALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNG化KAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQ VLGLFTLSTGQDSWNQTNHHHH皿SSG。
[0018] 本發(fā)明中，所述IdeS蛋白酶可W特異性的酶切免疫球蛋白G，特異性好，酶切后獲 得單一免疫球蛋白GF(ab'）2片段。
[0019] 優(yōu)選地，所述IdeS蛋白酶含有319個(gè)氨基酸。
[0020] 優(yōu)選地，步驟（1)所述的IdeS蛋白酶與免疫球蛋白G的質(zhì)量比為1: (100-1000)， 例如可W是 1 :1〇〇、1 :1〇1、1 :1〇2、1 :105、1 :110、1 :120、1 :150、1 :180、1 :200、1 :230、1 : 250、1 :300、1 :330、1 :380、1 :400、1 :450、1 :500、1 :550、1 :600、1 :650、1 :700、1 :750、1 : 800、1 :850、1 :900、1 :950 或 1 :1000,優(yōu)選為 1 : (200-800)。
[0021] 優(yōu)選地，所述免疫球蛋白G來源于人和/或動(dòng)物體液中提取的IgG抗體和/或通 過基因工程重組方式表達(dá)純化獲得的IgG抗體。
[0022] 優(yōu)選地，所述人或者動(dòng)物血液/體液中提取的IgG抗體為馬抗血清。
[0023] 優(yōu)選地，所述緩沖液為Tris-HCl、生理鹽水、憐酸鹽溶液或醋酸鋼溶液中的任意一 種或至少兩種的組合。
[0024] 優(yōu)選地，步驟（1)所述解育的溫度為30-40。例如可W是30°C、3rC、32°C、33°C、 34°C、35 °C、36 °C、37 °C、38 °C、39°C或 40 °C，優(yōu)選為 35-39 °C，進(jìn)一步優(yōu)選為 37 °C。
[002引 優(yōu)選地，步驟（1)所述解育的時(shí)間為10-30min，例如可W是lOmin、llmin、12min、 13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、 25min、26min、27min、28min、29min或 30min。
[00%] 優(yōu)選地，步驟（2)所述分離純化包括W下步驟：加入0. 5-1. 5%的明抓吸附熱滅活 的Fc片段，經(jīng)過濾、超濾除鹽、濃縮回收后，進(jìn)行離子交換柱層析，調(diào)抑值至7-8,過濾除菌 后獲得高純度免疫球蛋白GF(ab' )2。
[0027] 優(yōu)選地，步驟（3)所述的免疫球蛋白GF(油'）2片段還原為F油'片段包括如下步 驟：獲得高純度的F(油'）2后，在溶液中加入1-lOOmM的乙醇胺和/或半脫胺還原，只打開 較鏈區(qū)二硫鍵，超濾去除還原劑后獲得均一的免疫球蛋白GF油'片段。
[0028] 第Ξ方面，本發(fā)明提供一種組合物，所述組合物包括第一方面所述的制備方法制 備得到的免疫球蛋白GF(ab')2片段。
[0029] 本發(fā)明中，所述組合物不含有血清白蛋白、完整免疫球蛋白G分子及免疫球蛋白G 化片段。
[0030] 優(yōu)選地，所述組合物在制備治療感染性疾病、免疫性疾病和癌癥的藥物制劑和/ 或藥物組合物中的應(yīng)用。
[0031] 優(yōu)選地，所述組合物用于免疫抗血清和/或基因工程重組單克隆和/或多克隆抗 體的制備。
[0032] 第四方面，本發(fā)明提供一種組合物，所述組合物包括第二方面所述的制