專利名稱：：6-雙取代雙環(huán)核酸類似物的制作方法
技術領域：
：8了可用于調(diào)節(jié)基因表達途徑的6-雙取代的或不飽和的BNA和由其制備得到的反義化合物，包括那些依賴于RNA酶H、RNAi和dsRNA酶等作用機制以及基于靶標降解或靶標占用的其它反義機制的6-雙取代的或不飽和的BNA和由其制備得到的反義化合物。本領域的技術人員在獲知本發(fā)明公開內(nèi)容后將能夠在不進行過度實驗的情況下鑒定、制備和利用用于這些用途的反義化合物。發(fā)明簡述本發(fā)明提供了6-雙取代的雙環(huán)核苷、包含這些雙環(huán)核苷的寡聚化合物和所述寡聚化合物的使用方法。在某些實施方案中，所述雙環(huán)核苷使整合了它們的寡聚化合物的性質(zhì)增強。所述變量分別在此更詳細地定義?？梢岳斫獾氖潜景l(fā)明提供的所述雙環(huán)核苷、寡聚體化合物和其使用方法包括本發(fā)明公開的實施方案和所定義的變量的所有組合。在某些實施方案中，提供的雙環(huán)核苷具有通式I:其中B,為雜環(huán)堿基部分；1\和T2中的一個為H或羥基保護基團并且另一個為H、羥基保護基團或活性磷基團；qi和q2各自獨立地為鹵素、C「C^烷基、取代的C「C^烷基、C2_C12烯基、取代的C2_C12烯基、C2_C12炔基、取代的C2_C12炔基、Q-Ck烷氧基、取代的Q-Cu烷氧基、0JpSJpS0JpS0JpNJj2、N3、CN、C(=O)OJpC(=0)NJJ2、C(=O)J"O-C(=0)NJJ2、N(H)C(=NH)NlJ2、N(H)C(=0)NlJ2或N(H)C(=S)NJ丄J2;或qi和q2—起為=C(q3)(q4);q3和q4各自獨立地為H、鹵素、C「C^烷基或取代的C「C12烷基；每個取代的基團各自獨立地被獨立地選自鹵素、C「Ce烷基、C廠Ce烯基、C廠Ce炔基、0衛(wèi)、S衛(wèi)、N衛(wèi)J2、N3、CN、C(=O)OJ"C(=0)NJJ2、C(=O)J"O-C(=0)NJJ2、N(H)C(=0)J2或N(H)C(=S)NJJ2的取代基團單或多取代；并且每個衛(wèi)和J2各自獨立地為H、C「Ce烷基、C廠Ce烯基、C廠Ce炔基、C「Ce氨烷基或保護基團。在某些實施方案中，Ql和q2的至少一個為C「Ce烷基或取代的C「Ce烷基。在某些實施方案中，&和q2各自獨立地為C「Ce烷基或取代的C「Ce烷基。在某些實施方案中，Ql和化各自獨立地為甲基、乙基或丙基。在某些實施方案中，A和化分別為甲基。在某些實施方案中，&和q2的至少一個為取代的Q-Ce烷基。在某些實施方案中，A和q2的至少一個為取代的C「Ce烷基。在某些實施方案中，&和q2的至少一個為取代的C「C6烷基，其中所述取代基團選自0JpSJpNH、N3、CN、C(=0)OA、C(=0)NJ丄J2、C(=0)衛(wèi)或0-C(=0)NJ丄J2，其中每個衛(wèi)和J2各自獨立地為H、CrC6烷基、C2_C6烯基、C2_C6炔基、C「Ce氨烷基或保護基團。在某些實施方案中，&和q2的至少一個為取代的Q-Ce烷基，其中所述取代基團選自0衛(wèi)、NJA或CN，其中衛(wèi)和J2各自獨立地為H、C「Ce烷基或保護基團。在某些實施方案中，qi和q2—起為二C(q3)(q4)。在某些實施方案中，q3和q4分別為H。在某些實施方案中，q3和q4的至少一個為鹵素、CrCe烷基或取代的C「Ce烷基。在某些實施方案中，化和q4的至少一個為甲基。在某些實施方案中，化和&分別為甲基。在某些實施方案中，1\和T2的分別為羥基保護基團。在某些實施方案中，所述羥基保護基團各自獨立地選自乙?；?、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氫吡喃基、1_乙氧基乙基、l-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷乙基、對氯苯基、2，4-二硝基苯基、芐基、苯甲?；?、對苯基苯甲?；?、2，6-二氯節(jié)基、二苯基甲基、對硝基節(jié)基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲硅烷基、三異丙基甲硅烷基、苯甲?；姿狨?、氯乙?；?、三氯乙?；⑷阴；?、新戊?；?、9-芴基甲基碳酸月旨、甲磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧三苯甲基、三甲氧基三苯甲基或取代的9-苯基黃嘌呤-9-基(Pixyl)。在某些實施方案中，1\為乙?；?、苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基以及4，4'-二甲氧三苯甲基。在某些實施方案中，1\為4，4'-二甲氧三苯甲基。在某些實施方案中，T2為活性磷基團。在某些實施方案中，T2為選自二異丙基氰基乙氧基亞磷酰胺和H-磷酸酯的活性磷基團。在某些實施方案中，L為二異丙基氰基乙氧基亞磷酰胺。在某些實施方案中，T2為二異丙基氰基乙氧基亞磷酰胺并且Ql和q2分別為甲基。在某些實施方案中，T2為二異丙基氰基乙氧基亞磷酰胺并且Ql和q2—起為=C(q3)(q4)，q3和q4分別為H。在某些實施方案中，B,為嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取代的嘌呤。在某些實施方案中，Bx為尿嘧啶、5_甲基尿嘧啶、5_丙炔基-尿嘧啶、5_噻唑-尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5_甲基胞嘧啶、5_丙炔基-胞嘧啶、5_噻唑-胞嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤或2，6-二氨基嘌呤。在某些實施方案中，衛(wèi)和J2各自獨立地為H或C「C3烷基。在某些實施方案中，本發(fā)明提供具有通式II的雙環(huán)核苷在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個具有通式III的雙環(huán)核苷的寡聚化合物10T3-O稱III其中，對于所述至少一個具有通式III的雙環(huán)核苷，各自獨立地Bx為雜環(huán)堿基部分；T3和T4各自獨立地為將具有通式III的雙環(huán)核苷連接至所述寡聚化合物的核苷間連接基團，或T3和T4中的一個為將具有通式III的雙環(huán)核苷連接至所述寡聚化合物的核苷間連接基團而T3和T4中的另一個為H、羥基保護基團、連接的偶聯(lián)物基團或5'或3'-末端基團；qi和q2各自獨立地為鹵素、C「C^烷基、取代的C「C^烷基、C2_C12烯基、取代的C2_C12烯基、C2_C12炔基、取代的C2_C12炔基、Q-Ck烷氧基、取代的Q-Cu烷氧基、0JpSJpS0JpS0JpNJj2、N3、CN、C(=O)OJpC(=0)NJJ2、C(=O)J"O-C(=0)NJJ2、N(H)C(=NH)NlJ2、N(H)C(=0)NlJ2或N(H)C(=S)NJ丄J2;或qi和q2一起為=C(q3)(q4);q3和q4各自獨立地為H、鹵素、C「C^烷基或取代的C「(^烷基；取代的基團各自獨立地被獨立地選自鹵素、CrC6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、OJpSJpNJJ2、N3、CN、C(=0)OJ"C(=0)戦、C=O)JpO-C(=0)戦、N(H)C(=0)NJJ2或N(H)C(=S)NJJ2的取代基團單或多取代；并且衛(wèi)和J2各自獨立地為H、CrC6烷基、C2_C6烯基、C2_C6炔基、Q-Ce氨烷基或保護基團。在某些實施方案中，提供包含至少一個具有通式III的雙環(huán)核苷的寡聚化合物，其中&和q2的至少一個為C「Ce烷基或取代的C「Ce烷基。在某些實施方案中，Ql和q2各自獨立地為C「Ce烷基或取代的C「Ce烷基。在某些實施方案中，&和化各自獨立地為甲基、乙基或丙基。在某些實施方案中，每個A和化為甲基。在某些實施方案中，提供包含至少一個具有通式III的雙環(huán)核苷的寡聚化合物，其中至少每個Ql或每個q2為C「Ce烷基。在某些實施方案中，至少每個Ql或每個q2為取代的C「Ce烷基，其中所述取代基團選自0JpSJpNJj2、N3、CN、C(=O)OJpC(=0)NJ丄、C(=0)J!或0-C(=0)NJJ2，其中每個J!和J2各自獨立地為H、CrC6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C「Ce氨烷基或保護基團。在某些實施方案中，至少每個Ql或每個q2為取代的C「Ce烷基，其中所述取代基團選自0衛(wèi)、NJA或CN，其中每個衛(wèi)和J2各自獨立地為H、C「Ce烷基或保護基團。在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個具有通式III的雙環(huán)核苷的寡聚化合物，其中對于每個雙環(huán)核苷，A和q2—起為二C(cg(q》。在某些實施方案中，每個化和每個q4為H。在某些實施方案中，至少每個q3或每個q4為鹵素、Q-C;烷基或取代的Q-C;烷基。在某些實施方案中，至少每個化或每個^為甲基。在某些實施方案中，每個化和每個A為甲基。在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個具有通式III的雙環(huán)核苷并且進一11步包含至少一個3'或5'-末端基團的寡聚化合物。在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個具有通式III的雙環(huán)核苷并且進一步包含連續(xù)序列的連接的核苷的寡聚化合物，其中每個核苷間連接基團分別為磷酸二酯或硫代磷酯。在某些實施方案中，每個核苷間連接基團為硫代磷酯。在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個具有通式IV的雙環(huán)核苷的寡聚化合物在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個下述區(qū)域的寡聚化合物，所述區(qū)域為至少兩個連續(xù)的具有通式III的雙環(huán)核苷。在某些實施方案中，所述至少兩個連續(xù)的具有通式III的雙環(huán)核苷組成的至少一個區(qū)域位于所述寡聚化合物的3'或5'_末端。在某些實施方案中，所述至少兩個連續(xù)的具有通式III的雙環(huán)核苷組成的至少一個區(qū)域位于所述寡聚化合物的3'或5'-末端并且至少一個具有通式III的雙環(huán)核苷位于所述寡聚化合物的3'或5'-末端的另一端。在某些實施方案中，本發(fā)明提供每個具有約6至約14個單體亞單位的內(nèi)部區(qū)域的有間隙寡聚化合物，所述內(nèi)部區(qū)域亞單位分開兩個外部區(qū)域，所述外部區(qū)域分別將獨立地包含具有通式III的1至約5個連續(xù)的雙環(huán)核苷的兩個外部區(qū)域分開。在某些實施方案中，基本上所述內(nèi)部區(qū)域中的每個單體亞單位為P-D-2'-脫氧核糖基核苷。在某些實施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域包含約8至約14個P-D-2'-脫氧核糖基核苷。在某些實施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域包含約10至約14個P-D-2'-脫氧核糖基核苷。在某些實施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域包含約10至約12個P-D-2'-脫氧核糖基核苷。在某些實施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域包含約10至約12個13-D-2'-脫氧核糖基核苷，并且所述外部區(qū)域各自獨立地分別包含2至約3個具有通式III的雙環(huán)核苷。在某些實施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域包含約10至約12個P-D-2'-脫氧核糖基核苷，并且所述外部區(qū)域各自獨立地包含2個具有通式111的雙環(huán)核苷。在某些實施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域包含10個P-D-2'-脫氧核糖基核苷，并且所述外部區(qū)域各自獨立地包含2個具有通式ni的雙環(huán)核苷。在某些實施方案中，所述外部區(qū)域各自獨立地分別包含2至約3個具有通式III的雙環(huán)核苷，并且所述內(nèi)部區(qū)域包含14個P-D-2'-脫氧核糖基核苷。在某些實施方案中，所述外部區(qū)域各自獨立地包含2個具有通式III的雙環(huán)核苷，并且所述內(nèi)部區(qū)域14個13-D-2'-脫氧核糖基核苷。在某些實施方案中，本發(fā)明提供具有約6至約14個單體亞單位的內(nèi)部區(qū)域的有間隙寡聚化合物，所述內(nèi)部區(qū)域分開兩個外部區(qū)域，所述外部區(qū)域獨立地包含1至約5個連續(xù)的具有通式IV的雙環(huán)核苷在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個具有通式III的雙環(huán)核苷的寡聚化合物，其在長度上包含約8至約40個單體亞單位。在某些實施方案中，提供包含至少一個具有通式III的雙環(huán)核苷的寡聚化合物，其在長度上包含約8至約20個單體亞單位。在某些實施方案中，提供包含至少一個具有通式III的雙環(huán)核苷的寡聚化合物，其在長度上包含約10至約16個單體亞單位。在某些實施方案中，提供包含至少一個具有通式III的雙環(huán)核苷的寡聚化合物，其在長度上包含約10至約14個單體亞單位。在某些實施方案中，本發(fā)明提供抑制基因表達的方法，其包括將一種或多種細胞、組織或動物與包含至少一個具有通式III的雙環(huán)核苷的寡聚化合物接觸。在某些實施方案中，本發(fā)明提供包括將細胞與包含至少一個通式III雙環(huán)核苷的寡聚化合物接觸的方法其中，對于所述具有通式III的至少一個雙環(huán)核苷，各自獨立地Bx為雜環(huán)堿基部分；T3和T4各自獨立地為將具有通式III的雙環(huán)核苷連接至所述寡聚化合物的核苷間連接基團，或T3和T4中的一個為將具有通式III的雙環(huán)核苷連接至所述寡聚化合物的核苷間連接基團而T3和T4中的另一個為H、羥基保護基團、連接的偶聯(lián)物基團或5'或3'-末端基團；qi和q2各自獨立地為鹵素、C「C^烷基、取代的C「C^烷基、C2_C12烯基、取代的C2_C12烯基、C2_C12炔基、取代的C2_C12炔基、Q-Ck烷氧基、取代的Q-Cu烷氧基、0JpSJpS0JpS0JpNJj2、N3、CN、C(=O)OJpC(=0)NJJ2、C(=O)J"O-C(=0)NJJ2、N(H)C(=NH)NlJ2、N(H)C(=0)NlJ2或N(H)C(=S)NJ丄J2;或qi和q2—起為=C(q3)(q4);q3和q4各自獨立地為H、鹵素、C「C^烷基或取代的C「C^烷基；取代的基團各自獨立地被獨立地選自鹵素、C「Ce烷基、C廠Ce烯基、C廠Ce炔基、0衛(wèi)、SJ"NJJ2、N3、CN、C(=O)OJ"C(=0)NJJ2、C(=O)J"O-C(=0)NJJ2、N(H)C(=0)NJJ2或N(H)C(=S)NJJ2的取代基團單或多取代；衛(wèi)和J2各自獨立地為H、C「Ce烷基、C廠Ce烯基、C廠Ce炔基、C「Ce氨烷基或保護基團；并且其中所述寡聚化合物包含約8至約40個單體亞單位并且與耙標RNA互補。在某些實施方案中，所述細胞來源于動物。在某些實施方案中，所述細胞來源于人。在某些實施方案中，所述靶標RNA選自mRNA、pre-mRNA和microRNA。在某些實施方案中，所述靶標RNA為mRNA。在某些實施方案中，所述靶標RNA為人mRNA。在某些實施方案中，所述靶標RNA被裂解從而抑制其功能。在某些實施方案中，所述方法進一步包括評估所述寡聚化合物對所述細胞的反義活性。在某些實施方案中，所述評估包括檢測所述靶標RNA的水平。在某些實施方案中，所述評估包括檢測蛋白質(zhì)的水平。在某些實施方案中，所述評估包括一種或多種表型結(jié)果的檢測。在某些實施方案中，本發(fā)明提供具有以下通式的雙環(huán)核苷其中Bx為雜環(huán)堿基部分；1\和T2中的一個為H或羥基保護基團并且L和T2中的另一個為H、羥基保護基團或活性磷基團；qi和q2各自獨立地為鹵素、C「C^烷基、取代的C「C^烷基、C2_C12烯基、取代的C2_C12烯基、C2_C12炔基、取代的C2_C12炔基、Q-Ck烷氧基、取代的Q-Cu烷氧基、0JpSJpS0JpS0JpNJj2、N3、CN、C(=O)OJpC(=0)NJJ2、C(=O)J"O-C(=0)NJJ2、N(H)C(=NH)NlJ2、N(H)C(=0)NlJ2或N(H)C(=S)NJ丄J2;或qi和q2一起為=C(q3)(q4);q3和q4各自獨立地為H、鹵素、C「C^烷基或取代的C「C^烷基；衛(wèi)和J2各自獨立地為H、CrC6烷基、取代的C「Ce烷基、C廠C6烯基、取代的C2_C6烯基、C廠Ce炔基、取代的C2_C6炔基、C「Ce氨烷基、取代的C「C6氨烷基或保護基團海個^和J2各自獨立地為H、C「Ce烷基、取代的CrC6烷基、C廠Ce烯基、取代的C2_C6烯基、C廠Ce炔基、取代的C2_C6炔基、C「Ce氨烷基、取代的C「Ce氨烷基或保護基團；并且其中取代的基團各自獨立地被獨立地選自鹵素、C「Ce烷基、取代的C「Ce烷基、C2_C6烯基、取代的C2-C6烯基、C廠C6炔基、取代的C2-C6炔基、0JpSJpNJj2、N3、CN、C(=0)0JpC(=0)NJJ2、C(=O)J"O-C(=0)NJJ2、N(H)C(=0)NJJ2或N(H)C(=S)NJJ2的取代基團單或多取代；在一個實施方案中，A和q2中的至少一個為C「Ce烷基或取代的C「Ce烷基。在另一個實施方案中，和q2均為C「Ce烷基或取代的C「Ce烷基。另外的實施方案中，qi和q2均為甲基。在另一個實施方案中，A和化中的至少一個為取代的C「Ce烷基。另外的實施方案中，Ql和q2中的至少一個為(CH2)n-N(H)C(=0)(CH丄-NJJ2、(CH2)n_N(H)C(=S)NJJ2、(CH2)n-0-C(=0)NJJ2或(CH2)n-C(=0)NJJ2，其中優(yōu)選的n為1。本發(fā)明還提供對橋的不飽和取代，其中Ql和q2與將其附著至所述橋的6-碳原子的鍵一起為二C(q》(q4)。在一個實施方案中，化和^各自獨立地為！1。在另一個實施方案中，化和q4的至少一個為鹵素、C「Ce烷基或取代的CrC6烷基。在另外的實施方案中，化和q4的至少一個為甲基。在另一個實施方案中，q3和q4均為甲基。在一個實施方案中，1\和T2分別為羥基保護基團，其中優(yōu)選的羥基保護基團包括乙?；⑹宥』?、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氫吡喃基、1_乙氧基乙基、l-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷乙基、對氯苯基、2，4-二硝基苯基、芐基、苯甲?；Ρ交郊柞；?，6-二氯節(jié)基、二苯基甲基、對硝基節(jié)基、三苯甲基(trityl)、4，4'-二甲氧三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲硅烷基、三異丙基甲硅烷基、苯甲?；姿酳旨、氯乙?；⑷纫阴；⑷阴；?、新戊酰基、9_芴基甲基碳酸脂、甲磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、9-苯基黃嘌呤-9-基(Pixyl)以及9-(對甲氧基苯基)黃嘌呤-9-基(M0X)。在一個實施方案中，1\為乙酰基、苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基以及4，4'-二甲氧三苯甲基，其中優(yōu)選的基團為4，4'-二甲氧三苯甲基。在某些實施方案中，1\為4，4'_二甲氧三苯甲基并且T2為二異丙基氰基乙氧基亞磷酰胺。在一個實施方案中，T2為活性磷基團，其中優(yōu)選的活性磷基團包括二異丙基氰基乙氧基亞磷酰胺和H-磷酸酯。在一個實施方案中，Bx為嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取代的嘌呤。在某些實施方案中，Bx為尿嘧啶、5_甲基尿嘧啶、5_甲基胞嘧啶、5_噻唑-尿嘧啶、5_噻唑-胞嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤或2，6-二氨基嘌呤。在一個實施方案中，衛(wèi)和J2各自獨立地為H或C「C3烷基。在一個實施方案中，所述雙環(huán)核苷具有構型<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>本發(fā)明還提供包含至少一個具有通式I的雙環(huán)核苷的寡聚化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>其中Bx為雜環(huán)堿基部分；T3為羥基、保護羥基、連接的偶聯(lián)基團或附著于核苷的核苷間連接基團、核苷酸、寡聚核苷、寡核苷酸、單體亞單位或寡聚化合物；1\為羥基、保護羥基、連接的偶聯(lián)基團或附著于核苷的核苷間連接-基團、核苷酸、寡聚核苷、寡核苷酸、單體亞單位或寡聚化合物；其中T3和T4的至少一個為附著于核苷的核苷間連接基團、核苷酸、寡聚核苷、寡核苷酸、單體亞單位或寡聚化合物；A和q2各自獨立地為鹵素、C「(^烷基、取代的C「(^烷基、c2-c12烯基、取代的c2-c12烯基丄2-(:12炔基、取代的c2-c12炔基、c「c^烷氧基、取代的c「c12烷氧基、0JpSJi、S0Ji、S0Ji、NJj2、N3、CN、C(=O)OJ"C(=0)NJA、C(=O)J"O-C(=0)NJJ2、N(H)C(=NH)NJJ2、N(H)C(=0)NJJ2或N(H)C(=S)NJJ2;或qi和q2—起為=C(q3)(q4);q3和q4各自獨立地為H、鹵素、C「Q烷基或取代的C「C12烷基；每個衛(wèi)和J2各自獨立地為H、C「Ce烷基、取代的CrC6烷基、C2_C6烯基、取代的C2_C6烯基、C2_C6炔基、取代的C2_C6炔基、C「Ce氨烷基、取代的C「Ce氨烷基或保護基團；每個衛(wèi)和J2各自獨立地為H、C「Ce烷基、取代的CrC6烷基、C廠Ce烯基、取代的C2_C6烯基、C廠Ce炔基、取代的C2_C6炔基、C「Ce氨烷基、取代的C「Ce氨烷基或保護基團；并且其中取代的基團各自獨立地被獨立地選自鹵素、C「Ce烷基、取代的C「Ce烷基、C2_C6烯基、取代的C2-C6烯基、C廠C6炔基、取代的C2-C6炔基、0JpSJpNJj2、N3、CN、C(=0)0JpC(=0)NJJ2、C(=O)J"O-C(=0)NJJ2、N(H)C(=0)NJJ2或N(H)C(=S)NJJ2的取代基團單或多取代；在一個實施方案中，A和q2中的至少一個為C「Ce烷基或取代的C「Ce烷基。在一個實施方案中，和q2均為C「Ce烷基或取代的C「Ce烷基。在另外的實施方案中，qi和q2均為甲基。在另一個實施方案中，A和化中的至少一個為取代的CrCe烷基。在另外的實施方案中，q丄和q2中的至少一個為(CH2)n_N(H)C(=0)(CH2)-戦、(CH2)n_N(H)C(=S)NJJ2、(CH2)n-0-C(=0)NJJ2或(CH2)n-C(=0)NJJ2，其中優(yōu)選的n為1。本發(fā)明還提供具有至少一個雙環(huán)核苷的寡聚化合物，該雙環(huán)核苷包含對橋的不飽和取代，其中qi和q2與將其附著至所述橋的6_碳原子的鍵一起為=C(q3)(q4)。在一個實施方案中，化和q4每個分別為H。在另一個實施方案中，化和q4的至少一個為鹵素、C「Ce烷基或取代的C「Ce烷基。在另外的實施方案中，化和A的至少一個為甲基。在另一個實施方案中，化和^均為甲基。在一個實施方案中，T3為H或羥基保護基團。在另一個實施方案中T3為附著于核苷、核苷酸或單體亞單位的核苷間連接基團。另外的實施方案中，T3為附著于寡聚核苷或寡核苷酸的核苷間連接基團。在另一個實施方案中，T3為附著于寡聚化合物的核苷間連接基團。在一個實施方案中，T4為H或羥基保護基團。在另一個實施方案中1\為附著于核苷、核苷酸或單體亞單位的核苷間連接基團。另外的實施方案中，T4為附著于寡聚核苷或寡核苷酸的核苷間連接基團。在另一個實施方案中，L為附著于寡聚化合物的核苷間連接基團。在一個實施方案中，T3和T4中的至少一個包含選自磷酸二酯或硫代磷酯的核苷間連接基團。在一個實施方案中，還提供具有至少一個具有以下構型的雙環(huán)核苷的寡聚化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>在一個實施方案中，提供了具有至少一個通式I雙環(huán)核苷的寡聚化合物，其包含連續(xù)序列的連接的核苷，其中每個核苷間連接基團分別為磷酸二酯或硫代磷酯。在一個實施方案中，寡聚化合物包含由至少兩個連續(xù)的具有通式I的雙環(huán)核苷組成的至少一個區(qū)域。在另一個實施方案中，所述由至少兩個連續(xù)的具有通式I的雙環(huán)核苷的區(qū)域位于所述寡聚化合物的3'或5'-末端。在另外的實施方案中，至少一個由至少兩個連續(xù)的具有通式I的雙環(huán)核苷組成的區(qū)域位于所述寡聚化合物的3'或5'-末端，并且至少一個具有通式I的雙環(huán)核苷位于所述寡聚化合物的3'或5'-末端的另一端。在某些實施方案中，提供有間隙寡聚化合物，其具有位于所述寡聚化合物的3'或5'-末端的由至少兩個連續(xù)的具有通式I的雙環(huán)核苷組成的一個區(qū)域，以及位于所述寡聚化合物的3'或5'-末端另一端的至少一個具有通式I的雙環(huán)核苷。在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含位于5'-末端的一個或兩個具有通式I的雙環(huán)核苷和位于3'-末端的兩個或三個具有通式I的雙環(huán)核苷的有間隙寡聚化合物。在某些實施方案中，提供有間隙寡聚化合物，其包含位于5'-末端的一個或兩個具有通式I的雙環(huán)核苷，位于3'-末端的兩個或三個具有通式I的雙環(huán)核苷，以及約10至約16個P-D-脫氧核糖基核苷的內(nèi)部區(qū)域。在某些實施方案中，所述有間隙寡聚化合物的內(nèi)部區(qū)域包含約10至約14個P-D-脫氧核糖基核苷。在某些實施方案中，提供在長度上包含10至16個核苷和/或經(jīng)修飾的核苷或模擬物的有間隙寡聚化合物。在一個實施方案中，本發(fā)明提供在長度上包含約8至約40個核苷和/或經(jīng)修飾的核苷或模擬物的寡聚化合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供在長度上包含約8至約20個核苷和/或經(jīng)修飾的核苷或模擬物的寡聚化合物。在另外的實施方案中，本發(fā)明提供在長度上包含約10至約16個核苷和/或經(jīng)修飾的核苷或模擬物的寡聚化合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供在長度上包含約10至約14個核苷和/或經(jīng)修飾的核苷或模擬物的寡聚化合物。此外本發(fā)明提供抑制基因表達的方法，包括將一種或多種細胞、組織或動物與本發(fā)明的寡聚化合物接觸。發(fā)明詳述本發(fā)明提供6-雙取代雙環(huán)核苷、從中制備的寡聚化合物和所述寡聚化合物的應用方法。更具體地，每個6-雙取代雙環(huán)核苷包含具有式2'-O-C(q》(q2)-4'或2'_0_C[=(q3)(q4)]_4'之一的核糖部分4'和2'位之間的橋。在某些實施方案中，寡聚化合物和組合物經(jīng)設計與靶標RNA的一部分雜交。在某些實施方案中，寡聚化合物可用于設計適配子，該適配子是能夠在體內(nèi)環(huán)境中結(jié)合異常蛋白的寡聚化合物。6-雙取代的雙環(huán)核苷通常被制備成具有正交保護的活性基團并進一步包含活性磷基團。所述雙環(huán)核苷可作為合成寡聚體的單體亞單位。在某些實施方案中，本發(fā)明提供的所述單體亞單位的一個例證性的例子具有通式其中由虛線框圍繞的基團是可變的。所顯示的雙環(huán)核苷單體一般被稱為二甲氧基三苯甲基亞磷酰胺，或者更正式地采用IUPAC系統(tǒng)命名法命名為(1S，3R，4R，7S)-7-[2-氰基乙氧基(二異丙基氨基)膦?；鵠-l-(4，4'-二甲氧基三苯甲基氧甲基)-3_(尿嘧啶-i-基)-e-甲基_2，5_二氧雜_雙環(huán)[2.2.1]庚烷(當&和q2均為甲基時)。在某些實施方案中，本發(fā)明提供的6-雙取代的雙環(huán)核苷由通式Ia表示Ia其中星號各自獨立地為羥基、保護的羥基、任選連接的偶聯(lián)基團、報道基團、末端基團、活性磷基團、連接一種或多種核苷的核苷間鍵合或者此處討論的或可用于反義技術的其它基團。B,為雜環(huán)堿基部分；qi和q2各自獨立地為鹵素、C「C。烷基、取代的C「C。烷基、C2_C12烯基、取代的c2-c12烯基、c2-c12炔基、取代的c2-c12炔基、Q-Ck烷氧基、取代的Q-Cu烷氧基、0JpSJpS0JpS0JpNJj2、N3、CN、C(=O)OJpC(=0)NJJ2、C(=O)J"O-C(=0)NJJ2、N(H)C(=NH)NlJ2、N(H)C(=0)NlJ2或N(H)C(=S)NJ丄J2;或Ql和q2一起為=C(q3)(q4);q3和q4各自獨立地為H、鹵素、CrC12烷基或取代的CrC12烷基；取代的基團各自獨立地被獨立地選自鹵素、C「Ce烷基、取代的C「Ce烷基、C廠Ce烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基、0Ji、SJpNJj2、N3、CN、C(=O)OJpC(=0)NJJ2、C(=0)Jp0-C(=0)戦、N(H)C(=0)NJJ2或N(H)C(=S)NJJ2的取代基團單或多取代；并且衛(wèi)和J2各自獨立地為H、C「Ce烷基、C廠Ce烯基、C廠Ce炔基、C「Ce氨烷基或保護基團。在某些實施方案中，本發(fā)明提供的6-雙取代的雙環(huán)核苷具有通式Ia并且進一步18具有如通式IIa所示的構型在某些實施方案中，本發(fā)明提供將細胞與至少一種本發(fā)明提供的寡聚化合物接觸的方法，其中所述寡聚化合物與靶標RNA互補。所述細胞可以存在于動物中，優(yōu)選人中。靶標RNA選自將產(chǎn)生一定益處的任何RNA，但優(yōu)選mRNA、pre-mRNA或microRNA。在某些實施方案中，所述靶標RNA由于與所述寡聚化合物相互作用而被裂解，從而抑制其功能。本發(fā)明提供的所述方法的效率可通過各種標準或終點來評估，例如通過檢測所述靶標RNA的水平、檢測所述蛋白質(zhì)的水平、或通過檢測一種或多種表型結(jié)果來評估所述反義活性。本發(fā)明提供的6-雙取代的雙環(huán)核苷可用于在一個或多個位置修飾寡聚化合物。經(jīng)這樣修飾的寡聚化合物可描述為具有特定的基序。所述術語"基序"指寡聚化合物中的核苷模式。所述模式由寡聚化合物內(nèi)具有未修飾的(P-D-核糖核苷和/或P-D-脫氧核糖基核苷)和/或修飾的糖基團的核苷的定位來決定。每個位點的雜環(huán)堿基和核苷間鍵合的類型是可變的，不是決定寡聚化合物基序的因素。一種或多種其他基團的存在(包括但不限于加帽基團和偶聯(lián)基團)也不是決定基序的因素。用本發(fā)明提供的修飾的核苷來制備的某些基序包括但不限于有間隙的基序、半修飾(hemimer)基序、阻斷修飾(blockmer)基序、全修飾基序、定點修飾基序以及交替基序。結(jié)合這些基序，還可采用多種核苷間接頭，包括但不限于單一或聯(lián)合使用磷酸二酯和硫代磷酸酯鍵合。本發(fā)明提供的經(jīng)修飾的核苷的定位和聯(lián)接策略的使用可以容易地被優(yōu)化，以使針對選定靶標的寡聚化合物的活性最大化。教導了代表性基序的制備的代表性美國專利包括但不限于5，013，S30、5，149，797、5，220，007、5，256，775、5，366，878、5，403，711、5，491，133、5，565，350、5，623，065、5，652，355、5，652，356;以及5，700，922，其中的某些與本申請被共同擁有，其全文分別在此作為參考并入本發(fā)明中?；蛟?005年6月2日提交并于2005年12月22日公開為W02005/121371的國際申請PCT/US2005/019219以及于2005年6月2日提交并于2005年12月22日公開為W02005/121372的PCT/US2005/019220中也有公開，其全文分別在此作為參考并入本發(fā)明中。如此處所用的術語"g即mer"或"有間隙的寡聚化合物"指包含由具有3個區(qū)域的連續(xù)核苷序列組成的寡聚化合物，該序列具有內(nèi)部區(qū)域并在5'和3'末端上各有一個外部區(qū)域。內(nèi)部區(qū)域與外部區(qū)域通過具有不同的糖基團而加以區(qū)別。通常用于區(qū)分有間隙的寡聚化合物的各區(qū)域的核苷類型包括P-D-核糖核苷、P-D-2'-脫氧核糖基核苷、2'-經(jīng)修飾的核苷、4'_硫代經(jīng)修飾的核苷、4'-硫代_2'-經(jīng)修飾的核苷和雙環(huán)糖修飾的核苷。有間隙的寡聚化合物的每個區(qū)域基本上是均勻修飾的，例如至少內(nèi)部區(qū)域的糖基團是一樣的，但不同于每個外部區(qū)域。所述內(nèi)部區(qū)域(間隙)通常包含P-D-脫氧核糖基核苷，但也可以是糖修飾的核苷序列。如本發(fā)明提供的優(yōu)選的有間隙寡聚化合物包含由P-D-脫氧核糖基核苷組成的內(nèi)部區(qū)域，每個外部區(qū)域包含具有通式III的雙環(huán)核苷。19<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>在某些實施方案中，有間隙的寡聚化合物的每個區(qū)域基本上為均勻修飾的，例如內(nèi)部區(qū)域的糖基團基本是一樣的，但不同于每個外部區(qū)域。所述內(nèi)部區(qū)域(間隙)通常包含e-D-脫氧核糖基核苷，但也可以是糖修飾的核苷序列。所述內(nèi)部區(qū)域或間隙通常包含e-D-脫氧核糖基核苷，但也可以是糖修飾的核苷序列。在某些實施方案中，有間隙的寡聚化合物包含具有由P-D-脫氧核糖基核苷組成的內(nèi)部區(qū)域，以及包含經(jīng)修飾的核的兩個外部區(qū)域。有間隙寡聚化合物的例子在實施例部分舉例說明。在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含位于5'-末端的一個或兩個具有通式I的雙環(huán)核苷、位于3'-末端的兩個或三個具有通式I的雙環(huán)核苷、以及由約10至約16個核苷組成的內(nèi)部區(qū)域的有間隙寡聚化合物。在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含位于5'-末端的一個具有通式I的雙環(huán)核苷、位于3'-末端的兩個具有通式I的雙環(huán)核苷、以及由約10至約16個核苷組成的內(nèi)部區(qū)域的有間隙寡聚化合物。在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含位于5'-末端的一個具有通式I的雙環(huán)核苷、位于3'-末端的兩個具有通式I的雙環(huán)核苷、以及由約10至約14個核苷組成的內(nèi)部區(qū)域的有間隙寡聚化合物。在某些實施方案中，所述內(nèi)部區(qū)域基本上為連續(xù)的P-D-脫氧核糖基核苷序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供的寡聚化合物進一步包含一種或多種末端基團，其包括但不限于進一步修飾的或未修飾的核苷或連接的偶聯(lián)基團。在某些實施方案中，本發(fā)明提供的有間隙寡聚化合物的長度為約10至約21個核苷。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供的有間隙寡聚化合物的長度為約12至約16個核苷。在某些實施方案中，本發(fā)明提供的有間隙寡聚化合物的長度為約12至約14個核苷。此處所用的術語"取代基"和"取代基團"包括通常加至其它基團或母體化合物以增強所需屬性或產(chǎn)生所需效果的基團。取代基團可以是被保護或未被保護的，并可加至母體化合物的一個或多個可用位點。取代基團還可進一步被其它取代基團所取代并且可以直接或通過連接基團(例如烷基或烴基基團)連接至母體化合物。所述基團包括但不限于鹵素、羥基、烷基、烯基、炔基、?；?-C(0)Rj、羧基(-C(0)0-Rj、脂肪族基團、脂環(huán)族基團、烷氧基、取代的氧基(-0-Rj、芳基、芳烷基、雜環(huán)、雜芳基、雜芳基烷基、氨基(_NRbbR。。)、亞氨基(=NRbb)、酰氨基(-C(0)N-RbbRcc或-N(Rbb)C(0)Raa)、疊氮基(_N3)、硝基(_N02)、氰基(-CN)、脲基(-0C(0)NRbbRcc或-N(Rbb)C(0)0Raa)、脲基(_N(Rbb)C(0)NRbbRcc)、硫脲基(-N(Rbb)C(S)NRbbRcc)、胍基(-N(Rbb)C(=NRbb)NRbbRcc)、脒基(_C(=NRbb)NRbbRcc或_N(Rbb)C(NRbb)Raa)、硫醇(_SRbb)、亞磺酰(-S(0)Rbb)、磺酰(_S(0)2Rbb)、磺胺基(_S(0)2NRbbRcc或-N(Rj-S(O)Ab)以及偶聯(lián)基團。其中R^、Rbb和R。。各自獨立地為H、任選連接的化學官能團或其它取代基團，所述其它取代基團優(yōu)選包括但不限于H、烷基、烯基、炔基、脂肪族、烷氧基、?；⒎蓟?、芳烷基、雜芳基、脂環(huán)族、雜環(huán)和雜芳基烷基。此處描述的化合物內(nèi)選定的取代基團以遞歸度表示。上下文中的"遞歸取代基"指取代基可以引用其本身的另一實例。由于該種取代基的遞歸性，理論上，在任意給定權利要求中可存在大量取代基。醫(yī)藥化學和有機化學領域的普通技術人員可理解所述取代基的總數(shù)受目標化合物的預期屬性的合理限制。所述屬性包括例如但不限于分子量、溶解性或logP等物理屬性，針對目標靶標的活性等應用屬性，以及合成容易度等實施屬性。遞歸取代基為本發(fā)明的一個方面。醫(yī)藥和有機化學領域的普通技術人員可以理解該種取代基的多功能性。根據(jù)在本發(fā)明的權利要求所示的遞歸取代基的程度，可根據(jù)上文所述確定其總數(shù)。此處所用的術語"?；?指從有機酸去除羥基基團形成的并具有通式-C(O)-X的基團，其中X通常為脂肪族、脂環(huán)族或芳香族。例子包括脂肪族羰基、芳香羰基、脂肪磺酰、芳香磺酰、脂肪族亞磺酰、芳香磷酸鹽、脂肪族磷酸鹽等。此處所用的酰基基團任選地包括其它取代基團。術語"脂環(huán)族的"或"脂環(huán)基"指環(huán)狀的環(huán)系統(tǒng)，其中該環(huán)為脂肪族環(huán)。該環(huán)系統(tǒng)可包含一個或多個環(huán)，其中至少一個環(huán)為脂肪族環(huán)。優(yōu)選的脂肪環(huán)包括環(huán)中具有約5至約9個碳原子的環(huán)。此處所用的脂肪環(huán)任選地包括其它取代基團。此處所用的術語"脂肪族"指最多包含二十四個碳原子的直鏈或支鏈烴基，其中任意兩個碳原子之間的飽和度為單、雙或三鍵。脂肪族基團優(yōu)選包含1至約24個碳原子，更通常包含1至約12個碳原子，更優(yōu)選包含1至約6個碳原子。脂肪族基團的直鏈或支鏈可被一個或多個雜原子包括氮、氧、硫和磷等所中斷。所述被雜原子中斷的脂肪族基團包括但不限于聚烷氧基，例如聚亞烷基二醇、聚胺和聚亞胺。此處所用的脂肪族基團任選地包括其它取代基團。此處所用的術語"烷氧基"指在烷基基團和氧原子之間形成的基團，其中該氧原子用于連接該烷氧基基團和母體分子。烷氧基基團的例子包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、新戊氧基、正己氧基等。此處所用的烷氧基團任選地包括其它取代基團。此處所用的術語"烷基"指含有最多二十四個碳原子的飽和直鏈或支鏈烴基。烷基基團的例子包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、異丙基、正己基、辛基、癸基、十二烷基等。烷基基團通常包含1至約24個碳原子，更通常包含1至約12個碳原子(Q-(^烷基)，更優(yōu)選包含1至約6個碳原子。此處所用的術語"低級烷基"包含1至約6個碳原子。此處所用的烷基任選包含一個或多個進一步的取代基團。此處所用的術語"烯基"指含有最多二十四個碳原子并至少具有一個碳-碳雙鍵的直鏈或支鏈烴基。烯基基團的例子包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、1_甲基-2-丁烯-1-基、二烯如1，3-丁二烯等。烯基基團通常包含2至約24個碳原子，更通常包含2至約12個碳原子，更優(yōu)選包含2至約6個碳原子。此處所用的烯基任選地包含一個或多個進一步的取代基團。此處所用的術語"炔基"指含有最多二十四個碳原子并至少具有一個碳-碳三鍵的直鏈或支鏈烴基。炔基基團的例子包括但不限于乙炔基、l-丙炔基、l-丁炔基等。炔基基團通常包含2至約24個碳原子，更通常包含2至約12個碳原子，更優(yōu)選包含2至約6個碳原子。此處所用的炔基任選地包含一個或多個進一步的取代基團。此處所用的術語"氨烷基"指氨基取代的烷基。該術語包括在任何位置具有氨基取代基的Q-C^烷基基團，其中該烷基基團將該氨烷基連接至母體分子。氨烷基基團的烷基和/或氨基部分可以被取代基團進一步取代。此處所用的術語"芳烷基"和"芳基烷基"指在烷基基團和芳基基團之間形成的基團，其中該烷基基團用于連接該芳烷基基團和母體分子。例子包括但不限于芐基、苯乙基等。此處所用的芳烷基基團任選地包括與烷基、芳基或兩者連接以形成基團的取代基團。此處所用的術語"芳基"和"芳香族的"指具有一個或多個芳環(huán)的單或多環(huán)碳環(huán)系統(tǒng)基。芳基基團的實例包括但不限于苯基、萘基、四氫化萘基、茚滿基、茚基等。優(yōu)選的芳基環(huán)系統(tǒng)在一個或多個環(huán)中具有約5至約20個碳原子。此處所用的芳基基團任選地包括其它取代基團。此處所用的術語"鹵素"指選自氟、氯、溴和碘的原子。如此處所用的術語"鹵代烷基"是指具有如上定義的烷基，其中一個或多個氫被鹵素替代。具體包括單鹵代烷基、二鹵代烷基和多鹵代烷基。單鹵代烷基，例如，在該基團內(nèi)可具有一個碘、溴、氯或氟原子。二鹵代烷基和多鹵代烷基可具有兩個或更多個相同的鹵原子或不同的鹵代基團的組合。鹵代烷基的實例包括氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、五氟乙基、七氟丙基、二氟氯甲基、二氯氟甲基、二氟乙基、二氟丙基、二氯乙基和二氯丙基。如此處所用的術語"全鹵烷基"指其中所有氫原子為鹵原子所取代的烷基。"鹵代亞烷基"是指在兩個或更多個位置連接的鹵代烷基。實例包括氟亞甲基(-CFH-)、二氟亞甲基(-CF廠)、氯亞甲基(-CHC1-)等。此處所用的術語"雜芳基"和"雜芳香族的"指包含單或多環(huán)芳香環(huán)、環(huán)狀系統(tǒng)或稠環(huán)系統(tǒng)的基團，其中至少一個環(huán)為芳香族的，并且包含一個或多個雜原子。雜芳基還包括稠環(huán)系統(tǒng)，其中一個或多個稠環(huán)不包含雜原子。雜芳基通常包含一個選自硫、氮或氧的環(huán)原子。雜芳基基團的例子包括但不限于吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、異噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、苯硫基、呋喃基、四氫喹啉基、異四氫喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、喹喔啉基等。雜芳基基團可直接或通過脂肪族基團或雜原子等連接部分連接至母體分子。此處所用的雜芳基基團任選地包括其它取代基。此處所用的術語"雜芳基烷基"指具有如前文所定義的雜芳基基團具有將其連接至母體分子的烷基基團。例子包括但不限于妣啶甲基、嘧啶乙基、萘啶丙基(n即thyridinylpropyl)等。此處所用的雜芳基烷基基團任選地包括雜芳基或烷基部分的一個或兩個上的其它取代基團。此處所用的術語"雜環(huán)基"指包含至少一個雜原子并且是不飽和、部分飽和或完全飽和的單或多環(huán)的環(huán)系統(tǒng)，包括雜芳基基團。雜環(huán)還包括稠環(huán)系統(tǒng)，其中一種或多種稠環(huán)包含至少一個雜原子而其它環(huán)可包含一個或多個雜原子或任選地不包含雜原子。雜環(huán)基團通常包含至少一個選自硫、氮或氧的原子。雜環(huán)基團的例子包括[1，3]二氧戊環(huán)、吡咯烷基、妣唑啉基、妣唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、噁唑烷基、異噁唑烷基、嗎啉基、四氫噻唑基、異四氫噻唑基、喹喔啉基、噠嗪酮基、四氫呋喃基等。此處所用的雜環(huán)基任選地包含其它取代基團。術語"烴基"包括包含C、0、H的基團。包括具有任意飽和度的直鏈、支鏈和環(huán)狀基團。這樣的烴基基團可包括一個或多個選自N、0和S的雜原子并可進一步被一或多個取代基單或多取代。本發(fā)明中采用的術語"單或多環(huán)結(jié)構"包括具有稠和或連接的環(huán)的單或多環(huán)環(huán)系統(tǒng)，并包括單獨選自脂肪族、脂環(huán)族、芳基、雜芳基、芳烷基、芳基烷基、雜環(huán)、雜芳基、雜芳香基、雜芳基烷基的單獨和混合環(huán)系統(tǒng)。所述單或多環(huán)結(jié)構包含均一或變化的飽和度(包括完全飽和、部分包含或完全不飽和)的環(huán)。各個環(huán)可包含選自C、N、0和S的環(huán)原子以形成雜環(huán)以及存在于混合基序中的僅含有C環(huán)原子的環(huán)，所述混合基序例如苯并咪唑，其中一個環(huán)僅具有碳環(huán)原子而稠合的環(huán)具有兩個氮原子。單或多環(huán)結(jié)構可進一步被取代基團取代，例如，具有連接至其中一個環(huán)的兩個=0的鄰苯二甲酰亞胺。在其它方面，單或多環(huán)結(jié)構可直接通過環(huán)原子、通過取代基團或雙功能連接部分連接至母體分子。術語"氧代"指基團(=0)。術語"雙環(huán)核酸"或"BNA"或"雙環(huán)核苷"或"雙環(huán)核苷酸"指這樣的核苷或核苷酸，其中核苷的呋喃糖部分包含連接呋喃糖環(huán)上兩個碳原子的橋基，從而形成雙環(huán)環(huán)狀系統(tǒng)。術語"嵌合的寡聚化合物"或"嵌合的寡核苷酸"指具有至少一個糖、核酸堿基或核苷間鍵合的寡聚化合物或寡核苷酸，其相對于天然存在的連接的核苷為經(jīng)修飾的。其他糖、核酸堿基和核苷間鍵合可以獨立地為修飾的或未修飾的，其中每個核苷和鍵合可以相同或不同。術語"穩(wěn)定的化合物"和"穩(wěn)定的結(jié)構"指具有足夠穩(wěn)固性而可從反應混合物分離至有用的純度，并制成有效的治療劑的化合物。此處僅涉及穩(wěn)定的化合物。連接基團或雙功能連接部分，如本領所知的那些連接基團或雙功能連接部分可與本發(fā)明提供的寡聚化合物一起使用。連接基團可用于將化學官能團、偶聯(lián)基團、報道基團和其它基團連接至母化合物(例如寡聚化合物)的選定位點。一般而言，雙功能連接部分包含具有兩個官能團的烴部分。選擇一個官能團結(jié)合母體分子或目標化合物，選擇另一基團結(jié)合幾乎任意選定的基團，例如化學官能團或偶聯(lián)基團。在一些實施方式中，該接頭包含鏈結(jié)構或重復單元如乙二醇或氨基酸單元的寡聚體。在雙功能連接部分中常用的官能團的例子包括但不限于用于與親核基團反應的親電子試劑以及用于與親電子反應的親核試劑。在一些實施方式中，雙功能連接部分包括氨基、羥基、羧酸、硫醇、不飽和鍵(例如，雙或三鍵)等。雙功能連接部分的部分非限制性例子包括8-氨基-3，6-二氧雜辛酸(AD0)、琥珀酰亞胺4-[N-甲基馬來酸]-l-羧環(huán)己烷(SMCC)、以及6-氨基己酸(AHEX或AHA)。其它的連接基團包括但不限于取代的Q-Q。烷基、取代的或未取代的C2-C1Q烯基、或取代的或未取代的C2-C1Q炔基，其中優(yōu)選取代基團的非限制性列表包括羥基、氨基、烷氧基、羧基、苯甲基、苯基、硝基、硫醇、硫烷氧基、鹵素、烷基、芳基、烯基、以及炔基。在某些實施方案中，寡聚化合物通過一個或多個5'或3'-末端基團的共價附著而修飾。如此處所用的術語"末端基團"指包括本領域技術人員所知的有用基團，其為了不同的目的如能夠追蹤所述寡聚化合物(熒光標記或其他的報道基團)、提高所述寡聚化合物的藥物動力學或藥效(用于增強攝取和遞送的基團)或提高所述寡聚化合物的一種或多種其他的目標性質(zhì)(用于提高核酸酶穩(wěn)定性或結(jié)合親和力的基團)而可位于寡聚化合物的3'和5'-末端的一端或兩端。在某些實施方案中，3'和5'-末端基團包括但不限于，一種或多種經(jīng)修飾的或未經(jīng)修飾的核苷、偶聯(lián)基團、加帽基團、磷酸鹽部分和保護基團。在某些實施方案中，寡聚化合物通過一種或多種偶聯(lián)基團的共價附著而修飾。通常，偶聯(lián)基團修飾所附著的寡聚化合物的一種或多種性質(zhì)，包括但不限于藥效動力學、藥代動力學、結(jié)合、吸收、細胞分布、細胞攝取、儲存和清除。偶聯(lián)基團通常用于化學領域并且直接或通過任選的連接部分或連接基團連接至母體化合物如寡聚化合物。優(yōu)選的偶聯(lián)基團包括但不限于嵌入齊U、報道分子、聚胺、聚酰胺、聚乙烯乙二醇、硫醚、聚醚、膽固醇、硫膽固醇、膽酸部分、葉酸、脂、磷脂、生物素、吩嗪、菲啶、蒽醌、金剛烷、吖啶、熒光素、若丹明、香豆素和染料。此處所用的術語"保護基團"指本領域中已知的在合成過程中保護反應性基團以避免發(fā)生不需要的反應的不穩(wěn)定化學部分，包括但不限于羥基、氨基和硫醇基團。保護基團通常可以選擇性地和/或正交地使用以在其它位點的反應中保護位點，并可隨后去除以留下未保護基團或供進一步反應。本領域已知的保護基團一般地描述于Greene和Wuts，ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis，第三片反，JohnWiley&Sons，NewYork(1999)?；鶊F可作為前體選擇性地結(jié)合至本發(fā)明的寡聚化合物。例如，氨基基團可以作為疊氮基團結(jié)合至本發(fā)明的化合物，該疊氮基團可在合成的目標位點上化學轉(zhuǎn)化為氨基基團。一般來說，基團可被保護或作為對反應惰性的前體存在，該反應修飾母體分子其它部位的反應以在適當?shù)臅r間轉(zhuǎn)化成為其最終基團。其它對代表性保護或前體基團的討論參見Agrawal，等人，Protocolsfor01igo皿cleotideConjugates,Eds，HumanaPress;NewJersey,1994;Vol.26第1-72頁。羥基保護基團的例子包括但不限于乙酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氫吡喃基U-乙氧基乙基、l-(2-氯乙氧基)乙基、對氯苯基、2，4-二硝基苯基、芐基、2，6-二氯節(jié)基、二苯基甲基、對硝基節(jié)基、雙(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、2-三甲基甲硅烷乙基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、三苯甲硅烷基、[(三異丙基甲硅烷基)氧基]甲基(TOM)、苯甲酰甲酸鹽、氯乙?；?、三氯乙?；⑷阴；⑻匚祯；?、苯甲?；Ρ交郊柞；?-芴甲基碳酸鹽、甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、三苯甲基(trityl)、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基(匿T)、三甲氧基三苯甲基、l(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(FPMP)和取代的9-苯基黃嘌呤-9-基(Pixyl)。其中更優(yōu)選的羥基保護基團包括但不限于，苯甲基、2，6-二氯苯甲基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基、苯甲?；?、甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、二甲氧基三苯甲基(DMT)和取代的9-苯基黃嘌呤-9-基(Pixyl)。氨基保護基團的實例包括但不限于氨基甲酸鹽保護基團，例如，2-三甲基硅烷基乙氧基羰基(Teoc)、l-甲基-l-(4-聯(lián)苯基)-乙氧基羰基(Bpoc)、叔丁氧基羰基(B0C)、烯丙氧基羰基(Alloc)、9-荷甲基甲基氧基羰基(Fmoc)、以及苯甲基氧基羰基(Cbz);酰胺保護基團，例如甲?；?、乙酰基、三鹵代乙酰基、苯甲酰基、以及硝基苯基乙?；?；磺酰胺保護基團，例如2-硝基苯磺?；?；以及亞胺和環(huán)狀酰亞胺保護基團，例如苯二甲酰亞胺和二硫琥珀?；?。硫醇保護基團的實例包括但不限于，三苯甲基(trityl)、苯甲基(Bn)等。在某些實施方案中，通過用任選保護的含磷核苷間鍵合來連接核苷以制備低聚化合物。含磷核苷間鍵合(例如磷酸二酯和硫代磷酸酯鍵合)的代表性保護基團包括P-氰乙基、二苯基硅乙基、S-氰丁烯基、氰對二甲苯基(CPX)、N_甲基-N-三氟乙酰乙基(META)、乙酰氧基苯氧基乙基(APE)以及丁烯-4-基基團。例如參見美國專利4，725，677以及Re.34，069(P-氰乙基);Beaucage，S.L.和Iyer，R.P.，Tetrahedron,49No.10，第1925-1963頁(1993);Beaucage，S.L.和Iyer，R.P.，Tetrahedron,49No.46，第10441-10488頁(1993);Beaucage，S.L.和Iyer，R.P.，Tetrahedron,48No.12，第2223-2311頁(1992)。此處所用的術語"正交地保護"指以不同類別的保護基團保護的功能基團，其中各類別的保護基團可以以任意順序并在所有其它類別存在的情況下去除(參見，Barany，G.和Merrifield，R.B.，J.Am.Chem.Soc，1977，99，7363;idem，1980，102，3084)。正交保護已在自動寡核苷酸合成等領域得到廣泛應用。在一種或多種不受去阻斷過程影響的其它保護功能基團的存在下，將功能基團去阻斷。該去阻斷的功能基團以某種形式反應，在某一時點其它的正交保護基團在不同的反應條件組合下被去除。這使得可以采用選擇性化學方法以產(chǎn)生目標化合物或寡聚化合物。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了具有可用于形成核苷間鍵合(包括例如磷酸二酯和硫代磷酸酯核苷間鍵合)的活性磷基團的化合物。所述活性磷基團已為本領域所知并包含處于P111或PV價態(tài)的磷原子，包括但不限于亞磷酰胺、H-磷酸酯、磷酸三酯和含磷手性助劑。優(yōu)選的合成的固相合成采用亞磷酰胺(Pm化學劑)作為反應性亞磷酸。在優(yōu)選的實施方案中，中間體亞磷酸化合物隨后通過已知的方法被氧化至PV狀態(tài)以獲得磷酸二酯或硫代磷酸酯核苷酸間鍵合。其它的活性磷酸酯和亞磷酸披露于TetrahedronR印ortN咖ber309(Beaucage禾口Iyer，Tetrahedron,1992,48,2223-2311)。如此處所用的術語"核苷間鍵合"或"核苷間連接基團"指包括本領域已知的所有方式的核苷間連接基團，其包括但不限于含有核苷間連接基團的磷如磷酸二酯和硫代磷酯、含有核苷間連接基團如乙?；蛠喖谆鶃啺被姆?磷、以及中性非離子的核苷間連接基團如酰胺-3(3'-CH2-C(=0)-N(H)-5')、酰胺-4(3'_CH2_N(H)-C(=0)_5')。可用于本發(fā)明的寡聚化合物的特定例子包括含有修飾的(例如，非天然存在的)核苷間鍵合的寡核苷酸。通過磷原子的存在或缺失可定義核苷間鍵合的兩個主要類別。具有磷原子的修飾的核苷間鍵合包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基磷酸酯(包括3'-亞烴基磷酸酯、5'-亞烴基磷酸酯以及手性磷酸酯)、亞磷酸酯、磷酰胺(包括3'-氨基磷酰胺和氨烷基磷酰胺)、硫羰基磷酰胺、硫羰基烷基磷酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、具有正常3'-5'鍵合的硒代磷酸酯和硼代磷酸酯及其2'-5'連接的類似物、以及具有反轉(zhuǎn)極性的硒代磷酸酯和硼代磷酸酯，其中一種或多種核苷酸間鍵合為3'至3'、5'至5'或2'至2'鍵合。具有反轉(zhuǎn)極性的寡核苷酸可在3'_最末端鍵合處包含單個3'至3'鍵合，即可以是無堿基(核堿基缺失或該位置被羥基取代)的單個反轉(zhuǎn)核苷殘基。包括多種鹽、混合鹽和游離酸的形式。教導上述含磷鍵合的代表性美國專利包括但不限于U.S.:3，687，808、4，469，863、4，476，301、5，023，243、5，177，196、5，188，897、5，264，423、5，276，019、5，278，302、5，286，717、5，321，131、5，399，676、5，405，939、5，453，496、5，455，233、5，466，677、5，476，925、5，519，126、5，536，821、5，541，306、5，550，111、5，563，253、5，571，799、5，587，361、5，194，599、5，565，555、5，527，899、5，721，218、5，672，697以及5，625，050，其中的一些與本申請被共同擁有，其全文分別在此作為參考并入本發(fā)明中。不具有磷原子的修飾的核苷間鍵合包括但不限于由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合構成的核苷間鍵合、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合構成的核苷間鍵合、或者一個或多個短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵合構成的核苷間鍵合。其包括具有硅氧烷主鏈；硫化物、亞砜和砜主鏈；甲縮醛和硫甲縮醛主鏈；亞甲基甲縮醛和硫甲縮醛主鏈；核糖乙酰主鏈；含烯烴主鏈；氨基磺酸鹽主鏈；亞甲基亞胺和亞甲基肼基主鏈；磺酸鹽和磺酰胺主鏈；酰胺主鏈；和其它具有混合的N、0、S和CH2的組成部分的核苷間鍵合。在本發(fā)明的上下文中，術語"寡核苷"指由不帶磷原子的核苷間鍵合連接的核苷序列。教導了上述寡核苷的制備的代表性美國專利包括但不限于U.S.:5，034，506、5，166，315、5，185，444、5，214，134、5，216，141、5，235，033、5，264，562、5，264，564、5，405，938、5，434，257、5，466，677、5，470，967、5，489，677、5，541，307、5，561，225、5，596，086、5，602，240、5，610，289、5，602，240、5，608，046、5，610，289、5，618，704、5，623，070、5，663，312、5，633，360、5，677，437、5，792，608、5，646，269以及5，677，439，其中的一些與本申請被共同擁有，其全文分別在此作為參考并入本發(fā)明中。核苷間連接基團還包括含有或不含有磷原子的中性核苷間連接基團。如此處所用的短語"中性核苷間鍵合"指包括非離子的核苷間鍵合。所述中性核苷間鍵合包括但不限于磷酸三酯、甲基膦酸酯、匪I(3'-CH2-N(CH3)-0-5，)、酰胺-3(3，_CH2_C(=0)-N(H)-5')、酰胺-4(3'-CH2-N(H)-C(=0)_5')、甲縮醛(3'-0-CH2-0_5')和硫代甲縮醛(3'-S-CH2-0-5')。另外的中性核苷間鍵合包括非電離的鍵合，其包括硅氧烷(二烷基硅氧烷)、羧酸酯、羧酰胺、硫化物、磺酸酯和酰胺(參見例如CarbohydrateModificationsinAntisenseResearch;Y.S.Sanghvi禾口P.D.CookEds.ACSSymposiumSeries580;第3和4章，(第40-65頁))。另外的中性核苷間鍵合包括非電離的鍵合，其包括混合的N、0、S和C^組成部分。此處描述的化合物包含一個或多個不對稱中心，并因此形成了對映體、非對映體、以及其它立體異構形式，其從絕對立體化學而言可定義為(R)-或(S)-，a或p，或是(D)-或(L)-(如針對氨基酸和核苷時)。所有這些可能的異構體，以及它們的外消旋形式和光學純的形式均適用于本發(fā)明提供的寡聚化合物。光學異構體可通過上述的步驟由其相應的光學活性前體制備，或通過拆分外消旋混合物進行制備。所述拆分可在拆分劑的存在下，通過色譜或重復結(jié)晶或這些本領域技術人員已知技術的組合進行。有關拆分進一步的細節(jié)可參見Jacques,等人，Enantiomers，Racemates，andResolutions(JohnWiley&Sons，1981)。當此處所述的化合物包含烯烴雙鍵、其它不飽和性、或其它幾何不對稱中心時，除非另行指明，該化合物意在同時包括E和Z幾何異構體或順式(cis-)和反式(trans-)異構體。同樣地，同樣意在包括所有的互變異構形式。此處所示的任意碳-碳雙鍵的構型僅為方便目的被選擇，若非文中指明，并非意在指定特定的構型；因此，此處任意描述為反式的碳_碳雙鍵或碳_雜原子雙鍵可以是順式、反式或任意比例的兩者的混合物。本發(fā)明的上下文中的術語"寡聚化合物"指至少具有一個區(qū)域能與核酸分子雜交的聚合物。術語"寡聚化合物"包括寡核苷酸、寡核苷酸類似物和寡核苷以及核苷酸模擬物和/或包含核酸和非核酸成分的混合聚合物。術語"寡聚化合物"還包括包含連接的單體亞單位的聚合物，其中所述單體亞單位包括核苷、修飾的核苷、核苷類似物、核苷模擬物以及非-核酸組分如偶聯(lián)基團。在某些實施方案中，單體亞單位的混合物(例如但不限于所列的那些)提供下述寡聚化合物，所述寡聚化合物對于如治療和診斷的應用具有增強的性質(zhì)。由于仍然存在堿基和核糖，本發(fā)明提供的雙環(huán)核苷被歸類為修飾的核苷。所述單體亞單26位可通過天然存在的磷酸二酯核苷間鍵合或者通過此處公開的任何多個核苷間鍵合連接，核苷間鍵合例如但不限于硫代磷酯核苷間鍵合或其混合物。通常，寡聚化合物包含連接的單體亞單位的主鏈，其中每個連接的單體亞單位直接或間接附著于雜環(huán)堿基部分。寡聚化合物還可包含不連接至雜環(huán)堿基部分的單體亞單位從而提供非堿基位點。所述連接單體亞單位、糖部分或替代物和雜環(huán)堿基部分的鍵合可被獨立地修飾。所述鍵合_糖單元，其可能包含或不包含雜環(huán)堿基，可以用模擬物例如肽核酸單體代替。在寡聚化合物每個位點進行修飾或取代部分或全部單體的能力可產(chǎn)生大量可能的基序。寡聚化合物通?？沙Ｒ?guī)線性制備，也可被連接或以其它方式制備成環(huán)狀，并且還可包含分支。寡聚化合物可形成雙鏈構建體，例如，雜交形成雙鏈組合物的雙鏈。該雙鏈組合物可被連接或分離并可在末端包含突出(overhangs)。如本領域所知，核苷是堿基-糖組合。核苷的堿基部分通常為雜環(huán)堿基部分。所述雜環(huán)堿基最常見的兩種類別為嘌呤和嘧啶。核苷酸為進一步包含共價連接至核苷糖部分的磷酸基團的核苷。對于包含了呋喃戊糖的核苷，該磷酸基團可被聯(lián)接至糖的2'、3'或5'羥基部分。在形成寡核苷酸時，該磷酸基團共價連接彼此相鄰的核苷以形成線性聚合化合物?？梢赃B接該線性聚合結(jié)構的相應末端以通過雜交或通過形成共價鍵得到環(huán)狀結(jié)構，然而，通常希望開放的線性結(jié)構。在寡核苷酸結(jié)構中，磷酸基團通常形成寡核苷酸的核苷間連接。RNA和DNA的常見核苷間連接為3'至5'磷酸二酯聯(lián)接。如此處所用的，術語"寡核苷酸"指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)的寡聚體或聚合物。該術語包括由天然存在的核苷堿基、糖和共價核苷間連接構成的寡核苷酸。術語"寡核苷酸類似物"指具有一個或多個非天然存在部分的寡核苷酸。該種非天然存在的寡核苷酸由于其具有理想的性質(zhì)而通常比天然存在的形式更理想，例如，細胞攝取提高，對核酸靶標的親和力增強以及在核酸酶存在下的穩(wěn)定性提高。如此處所用的，術語"寡核苷"指由不帶磷原子的核苷間鍵合連接的核苷序列。該種類型的核苷間鍵合包括短鏈烷基、環(huán)烷基、混合雜原子烷基、混合雜原子環(huán)烷基、一或多種短鏈雜原子以及一或多種短鏈雜環(huán)。這些核苷間鍵合包括但不限于硅氧烷、硫化物、亞砜、砜、乙?；?、甲縮醛、硫甲縮醛、亞甲基甲縮醛、硫甲縮醛、烯基、氨基磺酸鹽、亞甲基亞胺基、亞甲基肼基、磺酸鹽、磺酰胺、酰胺和其它具有混合的N、0、S和CH2的組成部分的核苷間鍵合。教導制備上述寡核苷的代表性美國專利包括但不限于U.S.:5，034，506、5，166，315、5，185，444、5，214，134、5，216，141、5，235，033、5，264，562、5，264，564、5，405，938、5，434，257、5，466，677、5，470，967、5，489，677、5，541，307、5，561，225、5，596，086、5，602，240、5，610，289、5，602，240、5，608，046、5，610，289、5，618，704、5，623，070、5，663，312、5，633，360、5，677，437、5，792，608、5，646，269以及5，677，439，其中的一些與本申請被共同擁有，其全文分別在此作為參考并入本發(fā)明中。如此處所用的術語"核苷堿基"或"雜環(huán)堿基部分"意在與"核酸堿基或其模擬物"同義。一般而言，核苷堿基為含有一個或多個能與核酸堿基氫聯(lián)接結(jié)合的單個或多個雜環(huán)部分。如此處所用的術語"未修飾的核苷堿基"或是"天然的核苷堿基"包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。如此處所用的術語"修飾的核苷堿基"包括其它合成的和天然的核苷堿基，例如5-甲基胞嘧啶(516-0、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-cec-ch3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶堿基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-鹵代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代特別是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-去氮鳥嘌呤和7-去氮腺嘌呤、3-去氮鳥嘌呤和3-去氮腺嘌呤、通用堿基、疏水堿基、混雜堿基、大小擴增的堿基以及此處定義的氟化堿基。其它修飾的核苷堿基包括三環(huán)嘧啶如吩噁嗪胞啶(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞啶(1H-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G型夾(G-clamps)例如取代的吩噁嗪胞啶(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][l，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞啶(2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮)、吡啶吲哚胞啶(H-吡啶[3'，2':4，5]吡咯并[2，3-d]嘧啶_2_酮)。修飾的核苷堿基還可包括以其它雜環(huán)取代嘌呤或嘧啶堿基的核苷堿基，例如7-去氮-腺嘌呤、7-去氮鳥苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其它的核苷堿基包括披露于美國專利3，687，808的核苷減基，披露于TheConciseEncyclopediaOfPolymerScienceAndEngineering,第858-859頁，Kroschwitz，J.I.編，JohnWiley&Sons，1990的核苷堿基；披露于Englisch等人，AngewandteChemie，InternationalEdition，1991，30，613的核苷堿基；以及披露于Sanghvi，Y.S.，第15章，AntisenseResearchandApplications,第289-302頁，Crooke，S.T.和Lebleu，B.編，CRCPress,1993的核苷堿基。修飾的核苷堿基包括但不限于，此處定義的通用堿基、疏水堿基、混雜堿基、大小擴增堿基以及氟化堿基。這些核苷堿基中的一些可特別用于提高本發(fā)明的寡聚化合物的結(jié)合親和力。這些核苷堿基包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶以及N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代基已顯示可以提高核酸雙鏈穩(wěn)定性0.6-1.2°C(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.編，AntisenseResearchandApplications，CRCPress,BocaRaton，1993，第276-278頁)并且是目前優(yōu)選的堿基取代基，特別是在與2'-0-甲氧基乙基糖修飾組合時。教導制備某些上述提到的修飾核苷堿基以及其它修飾的核苷堿基的代表性美國專利包括但不限于，上述美國專利3，687，808以及美國專利4，845，205;5，130，302;5，134，066;5，175，273;5，367，066;5，432，272;5，457，187;5，459，255;5，484，908;5，502，177;5，525，711;5，552，540;5，587，469;5，594，121;5，596，091;5，614，617;5，645，985;5，830，653;5，763，588;6，005，096;以及5，681，941，其中某些專利為與本申請共同擁有的專利，各專利全文在此作為參考并入本發(fā)明中；以及美國專利5，750，692，其為與本申請共同擁有的專利，并在此作為參考并入本發(fā)明中。本發(fā)明的寡聚化合物還可包含一種或多種具有修飾糖部分的核苷。呋喃基糖環(huán)可以多種方式修飾，包括以取代基取代(2'、3'、4'或5')，橋連形成BNA以及以S或N(R)等雜原子取代4'-0。教導制備這種修飾糖的的部分代表性美國專利包括但不限于，美國專利4，981，957;5，118，800;5，319，080;5，359，044;5，393，878;5，446，137;5，466，786;5，514，785;5，519，134;5，567，811;5，576，427;5，591，722;5，597，909;5，610，300;5，627，053;5，639，873;5，646，265;5，658，873;5，670，633;5，792，747;5，700，920;6，600，032以及于2005年6月2日提交并于2005年12月22日公開為WO2005/121371的國際申請PCT/US2005/019219，其中一部分為與本申請共同擁有的申請或?qū)＠?，各文獻全文在此作為參考并入本發(fā)明中。優(yōu)選的修飾糖的代表性列表包括但不限于具有2'-F、2，-OCH2或2，-0(CH2)2-OCH3取代基(2'-MOE或僅為MOE)的取代糖；4'-硫代修飾的糖以及雙環(huán)修飾的糖。此處所用的術語"核苷模擬物"意在包括那些用于替換寡聚化合物的一個或多個位點的糖或非聯(lián)接的糖和堿基的結(jié)構，例如，具有嗎啉或雙環(huán)[3.1.0]己基糖模擬物(例如，具有磷酸二酯聯(lián)接的非呋喃糖)的核苷模擬物。術語"糖替代物"與含義更廣的術語"核苷模擬物"重疊，但意指糖單元(僅呋喃糖環(huán))的替換。術語"核苷酸模擬物"意在包括用于替換寡聚化合物的核苷和一個或多個位點鍵合的結(jié)構，例如，肽核酸或嗎啉(被-N(H)-C(=0)-0-或其它非_磷酸二酯鍵合的嗎啉)。在某些實施方案中，本發(fā)明提供的寡聚化合物可在長度上包含約8至約80個的核苷和/或修飾核苷或模擬物。本領域的普通技術人員將可理解本發(fā)明包含8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個或其中任意范圍的核苷和/或修飾核苷或模擬物長度的寡聚化合物。在某些實施方案中，本發(fā)明提供的寡聚化合物為8至40個的核苷和/或修飾核苷或模擬物的長度。本領域普通技術人員將可理解其可具體為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個或其中任意范圍的核苷和/或修飾核苷或模擬物長度的寡聚化合物。在某些實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物為8至20個的核苷和/或修飾核苷或模擬物長度。本領域普通技術人員將可理解其可具體為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個或其中任意范圍的核苷和/或修飾核苷或模擬物長度的寡聚化合物。在某些實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物為IO至16個的核苷和/或修飾核苷或模擬物的長度。本領域普通技術人員將可理解其可具體為10Ul、12、13、14、15或16或其中任意范圍的核苷和/或修飾核苷或模擬物長度的寡聚化合物。在某些實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物為12至16個的核苷和/或修飾核苷或模擬物的長度。本領域普通技術人員將可理解其可具體為12U3、14、15或16或其中任意范圍的核苷和/或修飾核苷或模擬物長度的寡聚化合物。在某些實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物為IO至14個的核苷和/或修飾核苷或模擬物的長度。本領域普通技術人員將可理解其可具體為10、11、12、13或14個或其中任意范圍的核苷和/或修飾核苷或模擬物長度的寡聚化合物。在某些實施方案中，本發(fā)明提供的所述寡聚化合物具有任何長度范圍的連接的單體亞單位。在某些實施方案中，本發(fā)明提供由X-Y連接的單體亞單位組成的寡聚化合物，其中X和Y分別獨立地選自8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、2927、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50;條件是X〈Y。例如，在某些實施方案中，本發(fā)明提供的寡聚化合物包含8-9、8-10、8-ll、8-12、8-13、8--14、8--15、8-16、8--17、8-L8、8--19、8--20、8-21、8--22、8-23、8.-24、8--25、8-26、8--27、8-28、8.-29、8--30、9-10、9--11、9-L2、9.-13、9--14、9-15、9--16、9-17、9-18、9-19、9-20、9--21、9-22、9-23、9--24、9-25、9--26、9-27、9-28、9--29、9-30、10-ll、10-12、10-13、10--14、10--15、10--16、10--17、10-18、10--19、10--20、10_21、10-22、10--23、10-.24、10--25、10--26、10--27、10--28、lO--29、10-30、11--12、11--13、11-14、11-15、11--16、11-17、11-18、11--19、11--20、11--21、ll--22、11-23、11--24、11--25、11-26、11-27、11--28、11--29、11--30、12--13、12--14、12--15、12--16、12-17、12--18、12.-19、12-20、12-21、12--22、12--23、12--24、12--25、12--26、12.-27、12--28、12-29、12--30、13-14、13-15、13-16、13--17、13--18、13--19、13--20、13--21、13-22、13--23、13-24、13--25、13-26、13-27、13-28、13--29、13--30、14--15、14--16、14--17、14--18、14--19、14-20、14--21、14--22、14-23、14-24、14--25、14--26、14--27、14--28、14--29、14--30、15--16、15-17、15--18、15--19、15-20、15-21、15--22、15--23、15--24、15--25、15--26、15--27、15--28、15-29、15--30、16-17、16-18、16-19、16--20、16--21、16--22、16--23、16--24、16--25、16--26、16-27、16--28、16-29、16-30、17-18、17--19、17--20、17--21、17--22、17--23、17.-24、17--25、17-26、17--27、17-28、17-29、17-30、18--19、18--20、18--21、18--22、18--23、18-24、18--25、18-26、18--27、18-28、18-29、18-30、19--20、19-.21、19--22、19--23、19--24、19--25、19--26、19-29、19--28、19--29、19_30、20-21、20--22、20--23、20--24、20--25、20--26、20--27、20--28、20-29、20--30、21--22、21_23、21-24、21--25、21--26、21--27、21--28、21--29、21--30、22--23、22-24、22--25、22.-26、22-27、22-28、22--29、22--30、23--24、23--25、23--26、23-27、23--28、23-29、23--30、24—25、24-26、24-27、24--28、24--29、24--30、25--26、25--27、25-28、25-29、25-30、26-27、26-28、26-29、26-30、27-28、27-29、27-30、28-29、28-30或者29-30個連接的單體亞單位。在某些實施方案中，所述寡聚化合物的長度范圍包括8-16、8-20、8-40、10-12、10-14、10-16、10-18、10-20、10-21、12-14、12-16、12-18、12-20和12-24個連接的單體亞單位。在某些實施方案中，修飾和未修飾的核苷及其模擬物的寡聚可參照文獻描述的針對DNA(ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs,Ed.Agrawal(1993)，HumanaPress)禾口/或RNA(Scaringe，Methods(2001)，23，206-217;Gait等人，ApplicationsofChemicallysynthesizedRNAinRNA:ProteinInteractions，Ed.Smith(1998)，1-36;Gallo等人，Tetrahedron(2001)，57，5707-5713)合成的適當方法來進行。固相合成的其它方法可參見Caruthers的美國專利4，415，732、4，458，066、4，500，707、4，668，777、4，973，679、和5，132，418以及Koster的美國專利4，725，677和Re.34，069。常規(guī)用于基于支持基質(zhì)合成寡聚化合物和相關化合物的的市售設備已由多家供應商出售，包括，例如AppliedBiosystems(FosterCity，CA)。本領域已知的任何其它該類合成方法均可另外或替代性采用。適用的固相技術(包括自動合成技術)的描述可見F.Eckstein(編)，OligonucleotidesandAnalogues,aPracticalApproach,OxfordUniversityPress,NewYork(1991)。隨著對RNAi研究的深入，RNA和相關類似物的合成相對于DNA和相關類似物的合成也逐漸增加。目前在商業(yè)上采用的初級RNA合成策略包括5'-0-匿T-2'-0-叔丁基二甲基硅烷基(TB匿S)、5'-O-DMT-2'-O-[l(2-氟苯基)-4_甲氧基哌啶+基](FPMP)、2'-O-[(三異丙基硅烷基)氧基]甲基(2'-0-CH2-0-Si(iPr)3(TOM)、以及5'-0-硅醚-2'-ACE(5'-O-二(三甲基硅氧基)環(huán)十二烷氧基硅醚(D0D)-2'-0-二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)。目前提供RNA產(chǎn)品的主要的公司包括PierceNucleicAcidTechnologies、DharmaconResearch公司、AmeriBiotechnologies公司禾口IntegratedDNATechnologies公司。PrincetonS印arations公司正在推廣RNA合成活化劑，該活化劑據(jù)宣傳可以特別針對TOM和TBDMS化學法減少偶聯(lián)次數(shù)。用于商業(yè)RNA合成的初級基團為TBDMS=5'-O-DMT—2'_0_叔丁基二甲基硅烷基；T0M=2'-O-[(三異丙基硅烷基)氧基]甲基；DOD/ACE=(5'_0_二(三甲基硅氧基)環(huán)十二烷氧基硅醚_2'-0_二(2_乙酰氧基乙氧基)甲基；FPMP=5'-O-DMT-2'_0_[1(2_氟苯基)_4_甲氧基哌啶_4_基]。在某些實施方案中，前述的RNA合成策略以及上述策略的混合(例如，采用一種策略中的5'_保護基團和另一策略中的2'-O-保護基團)均包括在本發(fā)明可適用的制備寡聚體的方法中。在本發(fā)明的上下文中，"雜交"指寡聚化合物互補鏈的配對。在某些實施方案中，一種配對機制涉及寡聚化合物鏈的互補核苷或核苷酸堿基(核苷堿基)之間的氫鍵結(jié)合，其可以是Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氫鍵結(jié)合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶為通過形成氫鍵進行配對的互補核苷堿基。雜交可在多種條件下進行。如果化合物與目標核酸的結(jié)合干擾該目標核酸的正常功能而導致活性喪失，且具有足夠的互補性程度，從而避免在需要特異性結(jié)合的情況下(即在體內(nèi)測定或治療的生理條件下和在進行體外測定的條件下)該寡聚化合物與非目標核酸序列發(fā)生非特異性結(jié)合，則該寡聚化合物是可特異性地雜交的。此處所用的"互補"指兩個堿基核苷在任意位置下精確配對的能力。例如，如果在寡聚化合物某一位置的核苷堿基能夠與目標核酸(該目標核酸為DNA、RNA或寡核苷酸分子)的某一位置的核苷堿基氫鍵結(jié)合，則該寡核苷酸和目標核酸之間的氫鍵結(jié)合的位置被認為是互補位置。當各分子中的互補位置被可以彼此氫鍵結(jié)合的核苷堿基占據(jù)時，該寡聚化合物和其它DNA、RNA或寡核苷酸分子彼此是互補的。因此，術語"可特異性雜交"和"互補"用于表明足量核苷堿基精確配對或互補的程度足以使寡核苷酸和目標核酸之間形成穩(wěn)定且特異性的結(jié)合。在本領域中可以理解，寡聚化合物的序列不需要與其目標核酸的序列具有100%的互補性以達到可特異性可雜交。此外，寡核苷酸可在一個或多個片段上雜交從而使中間的或鄰近的片段不參與雜交(例如，環(huán)結(jié)構或發(fā)夾結(jié)構)。本發(fā)明提供的寡聚化合物與其耙向的目標核酸序列中的目標區(qū)域具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、或至少約99%的序列互補性。例如，當寡聚化合物20個核苷中有18個與目標區(qū)域互補時，該寡聚化合物應該是可特異性雜交的，且表示具有90%互補性。在該例子中，剩余的非互補核苷堿基可以成簇或散布在互補核苷堿基中，不需要彼此鄰近或與互補核苷堿基鄰近。同樣地，如果長度為18個核苷堿基的寡聚化合物具有4個非互補性核苷堿基，其中所述4個非互補性核苷堿基側(cè)翼連接兩個與目標核酸完全互補的區(qū)域，則該寡聚化合物與目標核酸具有77.8%的總體互補性，并因而包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。寡聚化合物與目標核酸的互補性百分比可通過本領域已知的BLAST程序(基本的局部對比排列搜索工具)和PowerBLAST程序常規(guī)地測定(Altschul等人，J.Mol.Biol.，1990，215，403-410;Zhang和Madden,Ge謹eRes.，1997，7，649-656)。本發(fā)明提供的寡聚化合物還包括但不限于反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、核酶、外源指導序列(EGS)寡核苷酸、選擇性剪切體、引物、探針，以及與目標核酸的至少一個部分雜交的其它寡聚化合物。因此，這些寡聚化合物可以以單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾寡聚化合物的形式引入，并可包含內(nèi)部或末端突起或環(huán)等結(jié)構元件。本發(fā)明的寡聚化合物一旦引入系統(tǒng)后，就可引發(fā)一種或多種酶或結(jié)構蛋白的作用以實現(xiàn)對目標核酸的修飾。所述酶的非限制性例子之一為RNAseH，一種裂解RNA:DNA雙鏈的RNA鏈的細胞核酸內(nèi)切酶。本領域已知"類DNA"單鏈寡聚化合物引發(fā)RNAseH。RNAseH的激活可導致RNA靶標的裂解，從而大大增強寡核苷酸-介導的基因表達抑制的效率。其它的核糖核酸酶(例如屬于RNAseRII和核糖核酸酶L酶家族的核糖核酸酶)也推定具有類似的作用。盡管寡聚化合物的一種形式為單鏈反義寡核苷酸，但已經(jīng)表明在許多物種中引入雙鏈結(jié)構，例如雙鏈RNA(dsRNA)分子可導致基因或其相關基因產(chǎn)物反義_介導功能的強且特異性降低。該現(xiàn)象同時存在于植物和動物，并被認為與病毒防御和轉(zhuǎn)座子沉默具有進化性聯(lián)系。在某些實施方案中，在篩選調(diào)節(jié)選定蛋白表達的其它寡聚化合物中可采用"適當?shù)哪繕似?。"調(diào)節(jié)劑"為降低或提高編碼蛋白的核酸分子的表達，且至少包含一個與適當?shù)哪繕似位パa的8-核苷堿基部分的寡聚化合物。該篩選方法包括如下步驟將編碼蛋白的核酸分子的適當目標片段與一種或多種候選調(diào)節(jié)劑接觸，和選擇一種或多種提高或降低編碼蛋白的核酸分子的表達的候選調(diào)節(jié)劑。一旦顯示候選調(diào)節(jié)劑能夠調(diào)節(jié)(例如，提高或降低)編碼肽的核酸分子的表達，則該調(diào)節(jié)劑就可用于該肽的功能的進一步考察研究，或用作研究、診斷、或治療劑。在某些實施方案中，適當?shù)哪繕似芜€可與其各自的互補性反義寡聚化合物組合形成穩(wěn)定的雙鏈寡核苷酸。本領域已顯示所述雙鏈寡核苷酸部分可調(diào)節(jié)目標表達并通過反義機制調(diào)節(jié)翻譯和RNA加工。此外，該雙鏈部分還可進行化學修飾(Fire等人，Nature,1998，391，806-811;Timmons和Fire，Naturel998，395，854;Timmons等人，Gene，2001，263，103-112;Tabara等人，Science,1998，282，430-431;Montgomery等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，15502-15507;Tuschl等人，GenesDev.，1999，13，3191-3197;Elbashir等人，Nature,2001，411,494-498;Elbashir等人，GenesDev.2001，15，188-200)。例如，已經(jīng)表明所述雙鏈部分可通過雙鏈的反義鏈與靶標進行的經(jīng)典雜交來抑制該靶標，從而引發(fā)耙標的酶降解(Tijsterman等人，Science,2002，295，694-697)。在某些實施方案中，本發(fā)明提供的寡聚化合物還可用于藥物發(fā)現(xiàn)和靶標驗證領域。此處鑒定的寡聚化合物和靶標還可以用于藥物發(fā)現(xiàn)過程中以闡明蛋白與疾病狀態(tài)、表型或癥狀之間存在的關系。這些方法包括檢測或調(diào)節(jié)目標肽，包括將樣本、組織、細胞或生物體與本發(fā)明的寡聚化合物接觸，檢測在處理一定時間后靶標的核酸或蛋白水平和/或相關的表型或化學終點，并任選地將測量值與未處理樣本或以本發(fā)明的其它寡聚化合物處理的樣本進行比較。這些方法還可平行地或與其它實驗組合地進行，以確定靶標驗證過程使用的未知基因的功能，或者確定特定基因產(chǎn)物作為治療或預防特定疾病、癥狀或表型的靶標的效果。如此處所用的術語"劑量"指提供于單次給藥的藥學制劑的指定量。在某些實施方案中，劑量可以以兩個或更多大丸劑、片劑或注射給藥。例如，在某些實施方案中需要皮下給藥，目標劑量需要的體積通過單次注射不容易供給。所述實施方案中，兩次或多次注射可用于實現(xiàn)目標劑量。在某些實施方案中，劑量可以兩次或多次注射施用以將個體注射部位的反應降到最低。在某些實施方案中，本發(fā)明的化學_修飾寡聚化合物對目標RNA比未-修飾的DNA具有更高的親和力。在某些所述實施方案中，更高的親和力隨后提供增強的效力，使得可以施用較低劑量所述化合物，從而降低可能的毒性以及改善治療指數(shù)和降低總治療花費。核苷修飾對RNAi活性的作用參照現(xiàn)有文獻進行了評估(Elbashir等人，Nature(2001)，411,494-498;Nishikura等人，Cell(2001)，107,415-416;以及Bass等人，Cell(2000)，101，235-238)。本發(fā)明提供的寡聚化合物可用于診斷、治療、預防并可作為研究試劑和試劑盒。此外，本領域的普通技術人員通常使用能夠以超強特異性抑制基因表達的反義寡核苷酸來闡明特定基因的功能或區(qū)分生物途徑各種組分的功能。單獨或與其它寡聚化合物或治療劑聯(lián)合使用的本發(fā)明提供的寡聚化合物可用作差異分析和/或組合分析中的工具來闡明細胞和組織內(nèi)表達的基因的一部分或整個互補的表達模式。寡聚化合物也可在有利于基因擴增或檢測的條件下分別被有效地用作引物和探針。這些引物和探針可用于需要特異性檢測編碼蛋白的核酸分子的方法中，并可用于核酸分子擴增以供檢測或在進一步研究中使用。本發(fā)明的反義寡核苷酸，特別是引物和探針與核酸的雜交可通過本領已知的方法進行檢測。該種方法可包括將酶結(jié)合至寡核苷酸，對該寡核苷酸進行放射性標記或任何其它適用的檢測手段。還可制備使用這種檢測手段的試劑盒以檢測樣本中選定的蛋白水平。作為一個非限制性例子，將用一種或多種寡聚化合物處理的細胞或組織中的表達模式與未用寡聚化合物處理的對照細胞或組織進行比較，根據(jù)基因的差異表達水平分析所形成的模式，因為這些模式涉及例如所檢測基因的疾病相關性、信號轉(zhuǎn)導途徑、細胞定位、表達水平、大小、結(jié)構或功能。這些分析可在影響表達模式的其它化合物或寡聚化合物存在或不存在的情況下對剌激的或未剌激的細胞進行。本領域已知的基因表達分析方法的例子包括DNA陣列或微陣列(Brazma和Vilo，F(xiàn)EBSLett.，2000，480，17-24;Celis，等人，F(xiàn)EBSLett.，2000，480，2-16)、SAGE(基因表達系列分析)(Madden,等人，DrugDiscov.Today,2000，5，415-425)、READS(消化的cDNA的限制性酶擴增)(Prashar和Weissman，MethodsEnzymol.，1999，303，258-72)、T0GA(總基因表達分析)(Sutcliffe，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，97，1976-81)、蛋白陣列和蛋白組學(Celis，等人，F(xiàn)EBSLett.，2000，480，2-16;Jungblut，等人，Electrophoresis,1999，20，2100-10)、表達序列標簽(EST)測序(Celis，等人，F(xiàn)EBSLett.，2000，480，2-16;Larsson，等人，J.Biotechnol.，2000,80，143-57)、消減RNA指紋(SuRF)(Fuchs，等人，Anal.Biochem.，2000，286，91-98;Larson，等人，Cytometry,2000，41，203-208)、消減克隆、差異展示(DD)(JurecicandBelmont，Curr.Opin.Microbiol.，2000，3，316-21)、比較基因組雜交(Carulli，等人，J.CellBiochem.S聊l.，1998，31，286-96)、FISH(熒光原位雜交)技術(Goingandgusterson，Eur.J.Cancer,1999，35，1895-904)以及質(zhì)譜方法(To，Comb.Chem.HighThroughputScreen,2000，3，235-41)。雖然已根據(jù)某些實施方式具體地描述了本發(fā)明提供的單體、寡聚體和方法，以下實施例僅用于闡述本發(fā)明，并非意在對其進行限制。實施例1方案l1112a，l幼A)化合物1將氫化鈉(2.39g，59.8mmo1)小心添加至可從市場購得的1，2:5，6_二_0_異亞丙基-a-D-呋喃阿洛糖1(12.0g，46,1)的DMF冷(0°C)溶液(75mL)中。攪拌20分鐘后，向反應中添加溴化萘(11.12g，50.8mmo1)并繼續(xù)攪拌2小時。以水小心淬滅反應并將其倒入Et0Ac，以水、鹽水洗滌有機層，干燥并濃縮。柱層析(Si02，以10X至33X的Et0Ac/己烷洗脫)純化提供白色固體醇化合物2(18.lg，98%)。B)化合物5將化合物2(18g，46mmol)溶解于冰醋酸(150mL)和水(60mL)。在室溫下攪拌反應物16小時，然后將其真空濃縮。然后將殘留物溶解于Et0Ac，以飽和NaHCOy鹽水洗滌有機層，干燥并濃縮得到粗品化合物3，其在不作進一步純化下使用。將高碘酸鈉(48mmol，10g)水溶液(350mL)添加至上面獲得的化合物3的1，4_二惡烷的溶液(140mL)。室溫攪拌90分鐘后，以EtOAc萃取反應物，以水、鹽水進一步洗滌有機層，干燥(Na2S04)并濃縮得到醛化合物4，其可不作進一步純化下使用。將由前面獲得的粗品化合物4溶解于THF:H20(1:1，lOOmL)混合物，并將反應物在冰浴中冷卻。向反應中添加甲醛(25mL，35%w/w)和lNNa0H(100mL)。室溫攪拌16小時后，向反應添加甲醛(5mL)并繼續(xù)攪拌32小時。將反應物濃縮至干燥，在EtOAc和水之間分配殘留物。分層并以另外的INNaOH、水、鹽水洗滌有機相，干燥并濃縮得到白色固體二醇化合物5(12.96g，80%，三步)。C)化合物6將叔丁基二苯基硅烷基氯(0.75mL，2.9mmo1)添加至化合物5(lg，2.8mmo1)和三乙胺(0.45mL，3.2mmo1)的冷(0°C)溶液。室溫攪拌16小時后，將反應物倒入EtOAc，并依次用5%HC1、飽和NaHCOp鹽水洗滌有機相，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以10%至40%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供油狀的醇化合物6(1.02g，61%)(還分離得到0.42g區(qū)域異構硅保護的二醇)。D)化合物7將二甲基亞砜(1.6mL，22.4mmo1)逐滴加入草酰氯(0.98mL，11.2mmo1)的CH2C12冷(_78°C)溶液(70mL)。攪拌30分鐘后，向反應中添加化合物6(4.8g，8.0,1)的CH2C12溶液(20mL)。在-78°C繼續(xù)攪拌45分鐘并向反應中添加三乙胺(4.72mL，33.7mmo1)。在-78t:下將反應物攪拌15分鐘，隨后取走冰浴，并在45分鐘內(nèi)對反應物逐漸加溫。然后將反應物倒入CH^l2，依次以5%HC1水溶液、飽和NaHCOp鹽水洗滌，干燥(Na2S04)并真空濃縮以提供醛化合物7，其可在不作進一步純化下使用。E)核苷8向三苯基溴化磷(3.88g，10.9mmo1)的干THF冷(0°C)攪拌溶液(60mL)逐滴添加nBuLi(2.5M，4.34mL，10.9,1)。攪拌1小時后，將紅色溶液冷卻至_78°C，并逐滴向反應中添加由前面獲得的醛7(8.4mmo1)的干THF溶液(15mL)。將反應物逐漸加熱至室溫，繼續(xù)攪拌16小時。使用飽和NH4C1小心淬滅反應，且反應物在EtOAc和水之間分配。然后以鹽水洗滌有機層，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以10%EtOAc的己烷溶液洗脫)純化提供無色油狀的烯烴化合物8(4.84g，97%來自26)。F)核苷9將氟化四丁基銨(THF中的IM溶液，10.OOrnL，10.0,1)添加至化合物8(4.83g，8.lmmol)的THF溶液(35mL)。室溫攪拌反應物16小時后，真空去除溶劑并將殘留物溶解于Et0Ac。然后以水、鹽水洗滌有機層，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以40%EtOAc的己烷溶液洗脫)純化提供無色油狀的醇化合物9(2.79g，97%)。G)核苷10將氫化鈉(60%w/w存在于礦物油中，0.4g，10mmo1)添加入化合物9(1.44g，4.lmmol)和苯甲基溴(0.71mL，6.0,1)的DMF冷(0°C)溶液(16mL)。在0。C下攪拌1小時后，用水小心淬滅反應并在EtOAc和水之間分配。以鹽水分離并洗滌有機相，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以10至25%EtOAc的己烷溶液洗脫)純化提供無色油狀的烯烴化合物10(1.84g，定量)。H)核苷ll將四氧化鋨(25%0s04的iPrOH溶液，lmL)添加至化合物10(1.80g，4.0,1)和N-甲基嗎啉-N-氧化物(NMO，O.94g，8.Ommol)的95%丙酮/水(25mL)溶液。在室溫下攪拌16小時后，向反應中再度添加0s04溶液(0.5mL)和NMO(O.40g)。攪拌總計48小時后，以EtOAc稀釋反應物并以10%NaHSOy鹽水洗滌，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以40%至50%EtOAc的己烷溶液洗脫)純化提供無色油狀的二醇化合物11(1.68g，87X，約1:1的異構體混合物)。I)核苷12a禾P12b將TBSC1(0.66g，4.4mmo1)添加至化合物11(1.63g，3.4mmo1)的嘧啶冷(0°C)溶液(17mL)。在(TC下攪拌4小時后，以EtOAc稀釋反應物，以水、鹽水洗滌有機層，干燥并濃縮。柱層析(Si02，以10%至20%EtOAc的己烷溶液洗脫)純化提供無色油狀的醇化合物12a和12b(0.90g和1.117g，未指定絕對立體構型)。實施例2方案2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>(a)ET3N3HF、ET3N、THF、84%(b)MsCl、ET3N、DMAP、CH2C12、79%(c)AcOH、Ac20、H2S04、44%(d)尿嘧啶、BSA、TMS0Tf、CH3CN(e)K2C03、Me0H、51X來自154(f)TBAF、THF、80。C、16h(g)BCl3、CH2Cl2(h)TBDPSCl、咪唑、DMF(i)DDQ、CH2C12、H20(j)Et3N3HF、Et3N、THF(k)DMTC1、妣啶(1)(iPR2N)2P0CH2CH2CN、四唑、NMI、DMF?；衔?3向化合物12a(0.95g，1.6mmo1，羥基未指定的絕對構型)和三乙胺(0.56mL，4.Ommol)的THF溶液(16mL)添加三乙胺三氟化氫(1.56mL，9.6mmo1)。在室溫下攪拌16小時后，在真空下蒸發(fā)THF并將殘留物溶于EtOAc中。用飽和的NaHC03溶液、鹽水洗滌有機層，干燥(Na2S04)并且濃縮。柱層析(SiOy用40至50X的己烷EtOAc洗脫)純化提供二醇化合物13(0.65g，84%)?；衔?4向化合物13(0.65g，1.4mmol)、三乙胺(0.57mL，4.lmmol)和二甲基氨基妣啶(49mg，0.4,1)的二氯甲烷溶液(4mL)添加甲磺酰氯化物(0.32mL，4.1,1)。反應逐步加溫至室溫并且攪拌16小時，其后用EtOAc稀釋。用5%HC1、飽和的NaHCOp鹽水按順序洗滌有機層，干燥(Na2S04)并且濃縮。柱層析(SiOy用40%的己烷EtOAc洗脫)純化提供二甲磺酸鹽化合物14(0.68g，79%)?；衔?54將濃硫酸(3滴)加入化合物14(0.68g，1.lmmol)、乙酸(2mL)和醋酸酐(0.4mL)溶液中。室溫攪拌2小時后將反應物在高度真空下濃縮。將殘留物溶解于EtOAc，以飽和NaHC03溶液、鹽水小心洗滌有機層，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以40至50%己烷EtOAc洗脫)純化提供雙醋酸鹽化合物15(0.32g，44%)?；衔?7將O-雙(三甲基甲硅烷)乙酰胺(0.58mL，2.4mmo1)加入化合物15(0.32g，0.5,1)和尿嘧啶(0.llg，O.9,1)的CH3CN(3mL)懸浮液。40。C加熱15分鐘以獲得透明溶液，將三甲硅烷基三氟甲磺酸酯(0.13mL，0.7mmo1)加入所述反應物。回流2小時后，將反應冷卻至室溫并倒入EtOAc。以飽和NaHCOy鹽水洗滌有機層，干燥(Na2S04)并真空濃縮以提供粗制核苷化合物16，其可在不作任何純化下使用。向粗制的核苷化合物16(由前面獲得)的MeOH溶液(5mL)添加K2C03(0.14mg，1.Ommol)。室溫下攪拌16小時后，真空下除去溶劑并將殘留物在EtOAc和鹽水之間分配。收集有機相，干燥(Na2S04)并真空濃縮提供6(未確定絕對構型)。柱層析(SiOy用25%CHC13丙酮洗脫)純化提供核苷化合物17(0.14g，來自4的產(chǎn)率為51%)。化合物18將氟化四丁基銨(1M存在于THF中，O.lOmL，O.lmmol)添加至化合物17的THF溶液(0.05mL)。IO(TC加熱反應16小時提供核苷化合物18。LCMS:保留時間3.81分鐘；M+H計算值499.18，測定值499.0?；衔?4利用BC13二氯甲烷在_78°〇和0。C溫度之間除去化合物18中的苯甲基保護基團以提供化合物19?；衔?9的初級醇作為TBDPS醚被保護以提供化合物20。隨后利用二氯甲烷和水中的DDQ除去3'O-N即保護基團以提供化合物21。除去5'O-TBDPS保護基團提供化合物22。利用匿TC1吡啶保護5'-羥基以提供化合物23，其經(jīng)己醇磷酸化以提供亞磷酰胺化合物24。實施例3方案33M汰p18丙烷化反應(Smith-Sinunons)PWNTsCuC104X-H,烷基或鹵素27w飛o:》TsHN*實施例4方案4MCPBA或DMDOMCPBA\LJ>/12、C4J238<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula>R、&和R2各自獨立地為H、鹵素、烷基、烯基、炔基、取代的烷基、取代的烯基、取代的炔基或保護基團。實施例5方案5催化氮化W、d40R和&各自獨立地為H、鹵素、烷基、烯基、炔基、取代的烷基、取代的烯基、取代的炔基或保護基團。實施例6方案6TBDPSO-TBDPSO、TBDPSO、腦腦、力一"lo、a幽y^!)'lc,上HO'《Nap43yyMapTBDPSOTBDPSOo:■NapTBDPSO0必Nap46TB鵬OTBDPSOTBDPSO.44Map47Naph,49DMTOfc，俞上SO2(VDMTO0、V53A)化合物43將氯化鈰III(2.96g，12.Ommol)的THF懸浮液(50mL)在室溫下攪拌90分鐘。在冰浴中冷卻反應物，歷經(jīng)5分鐘添加甲基溴化鎂(8.6mL的1.4M甲基溴化鎂的THF溶液，N邵旨I.DMTClDMTO:VwBx-R、2-磷酸化Rf^V、、-'oo4212mmol)，繼續(xù)攪拌90分鐘，然后將反應冷卻至_78°C。將化合物78的THF溶液(20mL)加入反應物。繼續(xù)攪拌90分鐘后，以飽和NH4C1溶液淬滅反應并倒入EtOAc。依次以5%HC1水溶液、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機層，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(3102，以20%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供醇化合物43(4.37g)。B)化合物44將二甲基亞砜(1.41mL，19.9,1)逐滴加入草酰氯(0.87mL，10.0,1)的CH2C12冷(-78°C)溶液(70mL)。攪拌30分鐘后，向反應中添加化合物43(4.35g，7.lmmol)的(^2(:12溶液(20mL)。在-78。C繼續(xù)攪拌45分鐘并向反應中添加三乙胺(4.20mL，30.Ommol)。在-78t:下將反應物攪拌15分鐘，隨后取走冰浴，并在45分鐘內(nèi)對反應物逐漸加溫。然后將反應物倒入CH^l2，先后以5%HC1水溶液、飽和NaHCOy鹽水洗滌有機相，干燥(Na2S04)并真空濃縮以提供酮化合物44，其可在不作進一步純化下使用。C)化合物45將氯化鈰III(543mg，2.2mmo1)的THF懸浮液(120mL)在室溫下攪拌90分鐘。在冰浴中冷卻反應物，歷經(jīng)15分鐘添加甲基溴化鎂(3M甲基溴化鎂的14.7mL二乙醚溶液，44mmol)，繼續(xù)攪拌90分鐘，然后將反應冷卻至_78°C。將化合物44(自上)的THF溶液(lOOmL)加入反應物。繼續(xù)攪拌90分鐘后，以飽和NH4Cl溶液淬滅反應并倒入EtOAc。依次以5%HC1水溶液、飽和NaHCOy鹽水洗滌有機層，干燥(Na2S04)并真空濃縮。用EtOAc洗脫和Si02凝膠過濾提供醇化合物45(11.8g)。^NMR和LCMS光譜與結(jié)構一致。D)化合物46化合物45(11.8g，18.8mmo1)溶于吡啶(94mL)禾P亞硫酰氯化物(2.75mL，37.6mmo1)中，隨后6(TC加熱1小時。反應冷卻至室溫并且倒入EtOAc和鹽水。用鹽水洗滌有機層，干燥(Na2S04)并且真空濃縮。用EtOAc洗脫和Si02過濾提供烯烴化合物46(9.8g)。^NMR和LCMS光譜與結(jié)構一致。E)化合物47濃H2S04(2滴)加入化合物46(自上)的冰醋酸(lOOmL)和醋酸酐(9.8mL)溶液中。在室溫下攪拌1小時后反應物倒入EtOAc，并且用水、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機層，干燥(Na2S04)并且真空濃縮提供雙醋酸鹽化合物47(10.38g)，其直接用于下一步驟。^NMR和LCMS光譜與結(jié)構一致。F)化合物48將N，0-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(16.4mL，66.8mmo1)加入到化合物47(10.38g，15.9mmo1)和尿嘧啶(3.6g，31.8mmo1)的CH3CN懸浮液(lOOmL)中。在40。C下加熱15分鐘以獲得澄清溶液，反應冷卻至0t:且向反應物中添加三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(5.8mL，31.8mmo1)。7(TC加熱4小時后，將反應物冷卻至室溫并倒入EtOAc。以飽和NaHCOy鹽水洗滌有機層，干燥(Na2S04)并真空濃縮提供作為單乙酸酯的粗制核苷，其可在不作任何純化下使用。所述粗制核苷單乙酸酯用7NNH3/MeOH(300mL)處理12小時，隨后真空濃縮反應物。Si02凝膠過濾且用5%meOH/EtOAc洗脫提供核苷化合物48(8.46g，80X來自化合物47)。^NMR和LCMS光譜與結(jié)構一致。G)化合物4941化合物48(7.46g，11.3mmo1)用汞(II)乙酸鹽(7.9g，24.8mmo1)的二氯甲烷(125mL)在室溫下處理16小時。此時添加飽和的NaCl(叫)(30mL)攪拌15分鐘。隨后添加另外的飽和NaCl(aq)并且分離有機層，干燥(Na2S04)且真空濃縮提供粗制的氯化汞。生成的泡沫溶于甲苯(125mL)中且用AIBN(100mg)和三丁基錫氫化物(Bu3SnH，7.6mL，28.3mmo1)處理。反應在室溫下進行1小時并且加熱至5(TC，繼續(xù)攪拌1小時。隨后添加四氯化碳(30mL)，攪拌1小時。添加二氯甲烷，并且潷析有機層，用水、鹽水洗滌，干燥(Na2S04)且真空濃縮。柱層析(Si02，以30%EtOAc/己烷至50%Et0Ac/己烷洗脫)純化提供核苷化合物49(5.08g，68X來自化合物48)。力NMR和LCMS光譜與結(jié)構一致。H)化合物50向化合物49(4.7g，7.9,1)的二氯甲烷(50mL)和H20溶液(3mL)添加2，3-二氯-5，6-二氰-1，4-苯醌(DDQ)(2.4g，10.6mmo1)。攪拌16小時后真空濃縮反應物并將殘留物溶解于EtOAc。依次以水、水飽和NaHC03(1:1)、鹽水洗滌有機層，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，利用2X至5X的EtOAc/meOH/CH2Cl2梯度)純化提供白色固體核苷化合物50(4.lg，99%)。丄匪R和LCMS光譜與結(jié)構一致。I)化合物51在聚丙烯管中向化合物50(3.8g，7.27,1)和三乙胺(2.5mL)的THF(20mL)溶液添加三乙胺三氫氟酸鹽(6mL)。室溫攪拌24小時后，真空濃縮反應物并劇烈攪拌添加水(30mL)。通過過濾收集生成的白色固體并且真空干燥提供白色固體核苷化合物51(1.73g，84%)。力NMRCNMR和LCMS光譜與結(jié)構一致。J)化合物52向化合物51(1.62g，5.7mmo1)的嘧啶溶液(30mL)添加二甲氧基三苯甲基氯(2.5g，7.4mmo1)。室溫攪拌4小時后，將反應物倒入EtOAc，以鹽水洗滌有機層，干燥并濃縮。柱層析(Si02，以30X丙酮/二氯甲烷洗脫)純化提供固體核苷化合物52(3.03g，91%)。"HNMR和LCMS光譜與結(jié)構一致。K)化合物53將2-氰乙基四異丙基亞磷二酰胺(1.lmL，3.5mmo1)加入化合物52(1.35g，2.3mmol)、四唑(129mg，1.8mmo1)和N-甲基咪唑(46ii1，0.58mmo1)的DMF溶液(18mL)。室溫攪拌6小時后，將反應物倒入EtOAc，依次以90%鹽水、鹽水洗滌有機層，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以60%的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體亞磷酰胺化合物53(1.6g，94%)。NMR和LCMS光譜與結(jié)構一致。31PNMR(CDC13)S:150.08，149.22。實施例7方案742<formula>formulaseeoriginaldocumentpage43</formula>方案6(a)TESCl、Et3N、DMAP、CH2C12，rt;(b)P0C13、1，2，4_三唑、Et3N、CH3CN，rt;(c)NH3水溶液、1，4-二氧雜環(huán)己烷，rt;(d)Bz20、DMF，rt;(e)Et3N.3HF、Et3N、THF，rt;(f)CNCH2CH20P(N-iPR2)2、四唑、NMI、DMF。A)化合物54將三乙基甲硅烷基氯化物(868iil，5.17mmol)添加至化合物52(1.52g，2.6mmol)和咪唑(0.74g，10.3mmo1)的DMF溶液(25mL)中。室溫攪拌16小時后，將反應物注入EtOAc，以鹽水連續(xù)萃取，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(SiOy用25%至50%EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體核苷化合物54。力NMR和LCMS光譜與結(jié)構一致。B)化合物57將三氯氧磷(1.8mL，19.4,1)添加至1，2，4_三唑(4g，58翻l)冷(0°C)懸浮液(25mL)中。攪拌15分鐘后，向反應中添加三乙胺(13.4mL，97mmol)，繼續(xù)攪拌30分鐘。在(TC下向反應中添加化合物54(1.7g，2.4,1)的CH3CN溶液(20mL)。攪拌10分鐘后，去除冰浴并在室溫下攪拌反應物4小時。真空去除溶劑，在EtOAc和水之間分配殘留物。然后以飽和NaHCOy鹽水洗滌有機層，干燥(Na2S04)并真空濃縮以提供粗產(chǎn)物化合物55，其可在不作任何純化下使用。將氨水(5mL)添加至化合物55(由前面獲得)的二惡烷溶液(20mL)中。在室溫下攪拌16小時，真空濃縮反應物并在高度真空下干燥8小時以提供核苷化合物56，其可在不作任何純化下使用。向化合物56(由前面獲得)的DMF溶液(10mL)添加苯甲酸酐(0.814g，3.6mmo1)。室溫攪拌16小時后，將反應物倒入EtOAc，以飽和NaHCOp鹽水萃取有機層，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si(^，以40^至60^的EtOAc/己烷洗脫)純化提供白色固體的化合物57(1.57g，來自化合物54的產(chǎn)率為81X)。^NMR和LCMS光譜與結(jié)構一致。C)化合物58在聚丙烯管中向化合物57(1.57g，1.95mmo1)和三乙胺(0.7mL)的THF溶液添(8mL)加三乙胺三氫氟酸鹽(1.6mL)。室溫攪拌16小時后，真空濃縮反應物并將殘留物溶解于Et0Ac，依次以水、飽和NaHC03、鹽水洗滌有機層，干燥(Na2S04)并真空濃縮。柱層析(Si02，以含有1%Et3N的10%MeOH/CHCl3洗脫)純化提供白色固體核苷化合物58(1.2g，89%)。^NMR和LCMS光譜與結(jié)構一致。D)化合物59將2-氰乙基四異丙基亞磷二酰胺(0.83mL，2.6mmo1)加入含有化合物58(1.2g，1.7mmol)、四唑(91mg，1.4mmo1)和N-甲基咪唑(34ii1，0.43mmo1)的DMF溶液(9mL)中。室溫攪拌6小時后，將反應物倒入Et0Ac，依次以90%鹽水、鹽水洗滌有機層，干燥(Na2S04)并濃縮。柱層析(Si02，以60%的Et0Ac/己烷洗脫)純化提供白色固體亞磷酰胺化合物59(0.83g，54%)。NMR和LCMS光譜與結(jié)構一致。31PNMR(CDC13)S:150.29，129.51。實施例8化合物66的制備<formula>formulaseeoriginaldocumentpage44</formula>方案8(a)6-N-苯甲?；｀堰省SA、TMS0Tf、CH3CN、回流8小時；(b)NH3/Me0H;(c)Hg(0Ac)2;AIBN、Bu3SnH;(d)DDQ、CH2C12、H20，rt;(e)Et3N.3HF、Et3N、THF，rt，16小時;(f)DMTCl、妣啶，rt，16小時；(g)CNCH2CH20P(N_iPR2)2、四唑、NMI、DMF。化合物47按照實施例6中舉例說明的流程制備。實施例9化合物73的制備方案9<formula>formulaseeoriginaldocumentpage45</formula>方案9(a)2-氨基_6_氯嘌呤、BSA、TMS0Tf、CH3CN，回流2小時；(b)3_羥基丙睛、NaH、THF、4小時；Hg(0Ac)2;AIBN、Bu3SnH(c)異丁酸酐、DMAP、DMF，60。C24小時;(d)DDQ、CH2C12、H20，rt16小時;(e)Et3N.3HF、Et3N、THF，rt;(f)DMTCl、妣啶，rt;(g)CNCH2CH20P(N-iPR2)2、四唑、NMI、DMF?；衔?7按照實施例6中舉例說明的流程制備。實施例10核苷亞磷酰胺的合成核苷亞磷酰胺的制備根據(jù)本發(fā)明舉例說明的和本領域的方法進行，例如但不限于美國專利6，426，220和公開的PCTWO02/36743。實施例11寡核苷酸和寡核苷的合成如本發(fā)明所述的寡聚化合物可通過公知的固相合成技術進行常規(guī)制備。進行該種合成的設備已由多家銷售商出售，例如，A卯liedBiosystems(FosterCity，CA)。本領域已知的任何其它該類合成方法均可額外或替代性采用。使用類似技術制備寡核苷酸如硫代磷酸酯和烷基化衍生物已眾所周知。寡核苷酸未取代和取代的磷酸二酯(P=0)寡核苷酸可在自動化DNA合成儀(A卯liedBiosystems394型)上采用被碘氧化的標準亞磷酰胺化學法合成得到。除以下區(qū)別外，硫代磷酸酯(P=S)的合成類似于磷酸二酯寡核苷酸采用0.2M的50%3-甲基妣啶苯乙酰二硫化物的乙腈溶液氧化亞磷酸鍵合以產(chǎn)生硫雜化。該硫雜化反應步驟的時間提高至180秒且在此之前進行常規(guī)的帶帽步驟。從CPG柱裂解并在55t:下于濃氨水中去封閉(12-16小時)后，以大于3倍體積的乙醇從1MNH40Ac溶液中沉淀回收寡核苷酸。亞磷酸酯寡核苷酸可參照美國專利5，508，270的描述進行制備。烷基磷酸酯寡核苷酸可參照美國專利4，469，863的描述進行制備。3'-脫氧-3'-亞甲基磷酸酯寡聚核苷酸可參照美國專利5，610，289或5，625，050的描述進行制備。亞磷酰胺寡核苷酸可參照美國專利5，256，775或5，366，878的描述進行制備。烷基硫代磷酸酯寡核苷酸可參照公開的PCT申請PCT/US94/00902和PCT/US93/06976(分別公開為W094/17093和W094/02499)的描述進行制備。3'-脫氧-3'-氨基磷酰胺酯寡核苷酸可參照美國專利5，476，925的描述進行制備。磷酸三酯寡核苷酸可參照美國專利5，023，243的描述進行制備。硼烷磷酸酯寡核苷酸可參照美國專利5，130，302和5，177，198的描述進行制備。寡核苷亞甲基甲亞胺基連接的寡核苷(也被稱為匪I連接的寡核苷)、亞甲基二甲基肼連接的寡核苷(也被稱為MDH連接的寡核苷)、和亞甲基羰基氨基連接的寡核苷(也被稱為酰胺_3連接的寡核苷)、和亞甲基氨基羰基連接的寡核苷(也被稱為酰胺_4連接的寡核苷)，以及具有例如交替的匪I和P=0或P=S鍵合的混合主鏈寡聚化合物可參照美國專利5，378，825、5，386，023、5，489，677、5，602，240和5，610，289的描述進行制備。甲縮醛和硫甲縮醛連接的寡核苷可參照美國專利5，264，562和5，264，564的描述進行制備。環(huán)氧乙烷連接的寡核苷可參照美國專利5，223，618的描述進行制備。實施例12寡核苷酸的分離從可控孔玻璃固相載體上裂解寡核苷酸或寡核苷，在55t:的濃氨水中去封閉12-16小時后，以大于3倍體積的乙醇從1MNH40Ac溶液中沉淀回收寡核苷酸或寡核苷。合成的寡核苷酸可通過電噴霧質(zhì)譜(分子量測定)和毛細管凝膠電泳進行分析。在合成中獲得的硫代磷酸酯和磷酸二酯鍵合的相對數(shù)量可通過正確分子量相對-16amu產(chǎn)品(+/-32+/-48)的比例進行確定。在某些研究中寡核苷酸通過HPLC進行純化，例如描述于Chiang等人，J.Biol.Chem.1991,266，18162-18171。HPLC-純化材料所得的結(jié)果通常類似于從非-HPLC純化材料獲得的結(jié)果。實施例13寡核苷酸的合成-96孔平板形式寡核苷酸可在能夠以96-孔形式同時裝配96個序列的自動化合成器中通過固相P(III)亞磷酰胺化學法合成得到。磷酸二酯核苷酸間鍵合可通過碘水溶液氧化得到。硫代磷酸酯核苷酸間鍵合可通過使用無水乙腈中的3，H_l，2苯并二硫醇-3-酮1，1-二氧化物(Beaucage試劑)硫化得到。標準的堿基被保護的P_氰乙基_二異丙基亞磷酰胺可從銷售商(例如PE-AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA或Pharmacia,Piscataway，NJ)處購得。非標準核苷可參照標準和專利方法進行合成。它們可作為堿基保護的P-氰乙基-二異丙基亞磷酰胺來使用。寡核苷酸從載體上裂解并在升高的溫度(55-60°C)下在濃NH40H中保護12_16小時，在真空下干燥所釋放的產(chǎn)品。將干燥的產(chǎn)品重懸于無菌水中以提供主平板，從該平板上使用機械移液管稀釋得到所有的分析和測試平板樣本。實施例14利用96-孔平板形式的寡核苷酸分析46各微孔中的寡核苷酸濃度可通過稀釋樣本和UV吸收光譜測定。單個產(chǎn)品的全長完整性可以96-孔形式(BeckmanP/ACEMDQ)或針對單獨制備的樣本在商用毛細管電泳設備(例如，BeckmanP/ACE5000，ABI270)上通過毛細管電泳(CE)進行評估。堿基和主鏈組成可采用電噴霧質(zhì)譜對寡聚化合物進行質(zhì)譜分析確定。所有的測試平板均從主平板上采用單和多道機械移液器稀釋得到。如果平板上至少85%的寡聚化合物具有至少85%全長，則可認為該平板可接受。實施例15細胞培養(yǎng)和寡核苷酸處理寡聚化合物對靶標核酸表達的作用可在各種細胞類型中進行測試，只要該靶標核酸以可測水平在該細胞類型中存在。這可通過使用，例如PCR或Northern印跡分析等方法常規(guī)測定。來自多種組織和物種的細胞系可從美國菌種保藏中心(ATCC，Manassas,VA)獲得。下列提供的細胞類型僅供闡述目的，也可常規(guī)采用其它細胞類型，只要靶標在選定的細胞類型中表達。這可通過本領域常規(guī)的方法，例如，Northern印跡分析、核糖核酸酶保護測定或RT-PCR等進行簡便的測定。B.END細胞小鼠腦內(nèi)皮細胞系b.END由MaxPlank研究所(BadNauheim，Germany)的WernerRisau博士提供。b.END細胞常規(guī)培養(yǎng)于添加了10%胎牛血清(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)的高糖DMEM中(InvitrogenLifeTechnologies，Carlsbad,CA)。在匯合度達到約90%時，通過胰蛋白酶化和稀釋進行常規(guī)的細胞傳代。將細胞以大約3000細胞/微孔的密度接種至96-孔板(Falcon-Primaria#353872，BDBiosciences,Bedford,MA)，從而用于包括但不限于寡聚化合物轉(zhuǎn)染實驗。實驗包括用寡聚化合物處理細胞當細胞達到適當?shù)膮R合度時，采用所述的轉(zhuǎn)染方法以寡聚化合物對其進行處理。LIP0FECTIN當細胞達到65-75%匯合度時，以寡核苷酸對其進行處理。將寡核苷酸與LIP0FECTIN(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)在0pti-MEMTM-l低血清培養(yǎng)基(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)中混合，以達到寡核苷酸的理想濃度，且LIPOFECTIN的濃度為每100nM寡核苷酸2.5或3yg/mL。將該轉(zhuǎn)染混合物在室溫下孵育約0.5小時。細胞生長于96-孔板時，以100iiL0PTI-MEM-1洗滌微孔一次，然后以130iiL轉(zhuǎn)染混合物處理。類似地，用適當體積的培養(yǎng)基和寡核苷酸處理生長于24-孔板或其它標準組織培養(yǎng)板中的細胞。重復兩次或三次處理細胞并取得數(shù)值。在37t:下處理約4-7小時后，以新鮮培養(yǎng)基替換含轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基。寡核苷酸處理后16-24小時采集細胞。本領域已知的其它適用轉(zhuǎn)染試劑包括但不限于CYT0FECTINTM、LIP0FECTAMINE、oligofectaminetm和fugenetm。本領域已知的其它適用的轉(zhuǎn)染方法包括但不限于電穿孔法。實施例16寡核苷酸抑制靶標表達的分析耙標表達的反義調(diào)節(jié)可通過本領域已知的多種方法進行測定。例如，耙標mRNA水平可通過，例如，Northern印跡分析、競爭性聚合酶鏈式反應(PCR)或?qū)崟rPCR進行定量。目前希望采用實時定量PCR。可對總細胞RNA或poly(A)+mRNA進行RNA分析。本發(fā)明的一種RNA分析方法采用總細胞RNA，如本文其它實施例中所描述。RNA分離的方法已為本領域公知。Northern印跡分析也是本領域的常規(guī)方法。實時定量(PCR)通過使用來自PE-AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA的ABIPRISM7600、7700或7900序列檢測系統(tǒng)并參照生產(chǎn)商說明得以便利地實現(xiàn)。靶標蛋白水平可通過本領域公知的多種方法進行定量，例如免疫沉淀、Western印跡分析(免疫印跡)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或熒光激活細胞分類(FACS)。針對靶標的抗體可從多種來源例如抗體的MSRS目錄(AerieCorporation，Birmingham,MI)鑒定并獲得，或者可通過本領域公知的常規(guī)單克隆或多克隆抗體生成方法制備得到。制備多克隆抗血清的方法可參見，例如，Ausubel，F(xiàn).M.等人，CurrentProtocolsi翻lecularBiology,第2巻，第11.12.1-11.12.9頁，JohnWiley&Sons，Inc.，1997。單克隆抗體的制備可參見，例如，Ausubel，F(xiàn).M.等人，CurrentProtocolsi翻lecularBiology，第2巻，第11.4.1-11.11.5頁，JohnWiley&Sons,Inc.，1997。免疫沉淀法是本領域的標準方法，并可參見例如，Ausubel，F(xiàn).M.等人，CurrentProtocolsinmolecularBiology,第2巻，第10.16.1-10.16.11頁，JohnWiley&Sons，Inc.，1998。Western印跡(免疫印跡)分析是本領域的標準方法，并可參見例如，Ausubel，F(xiàn).M.等人，CurrentProtocolsinmolecularBiology,第2巻，第10.16.1-10.80.21頁，JohnWiley&Sons,Inc.，1997。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)是本領域的標準方法，并可參見例如，Ausubel，F(xiàn).M.等人，CurrentProtocolsi翻lecularBiology,第2巻，第11.4.1-11.2.22頁，JohnWiley&Sons,Inc.，1991。實施例17為靶標抑制劑用途設計表型測定和體內(nèi)研究表型測定—旦通過此處披露的方法鑒定靶標抑制劑，可在一個或多個表型測定中進一步考察該寡聚化合物，其中每個測定具有預示對特定疾病狀態(tài)或癥狀的治療效力的可測端點。表型測定、用于表型測定的試劑盒和試劑已為本領域技術人員公知，并在此處用于考察靶標在健康和疾病中的作用和/或關聯(lián)。代表性的表型測定(可從多個銷售商中購得)包括測定細胞活性、細胞毒性、擴增或細胞存活的測定(MolecularProbes,Eugene,OR;PerkinElmer，Boston,MA)，基于蛋白的測定包括酶法測定(Panvera，LLC,Madison，WI;BDBiosciences,FranklinLakes,NJ;OncogeneResearchProducts,SanDiego，CA)、細胞調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導、炎癥、氧化過程以及凋亡(AssayDesignsInc.，AnnArbor，MI)、甘油三酯積累(Sigma-Aldrich，St丄ouis，M0)、血管生成測定、管道形成測定、細胞因子和激素測定以及代謝測定(ChemiconInternationalInc.，Temecula，CA;AmershamBiosciences,Piscataway，NJ)。在一個非限制性實例中，經(jīng)測定適用于特定表型測定的細胞(即，選擇MCF-7細胞用于乳腺癌研究；用于肥胖研究的脂肪細胞)用經(jīng)體外研究鑒定的靶標抑制劑和對照化合物在最佳濃度下(通過上述方法確定的)處理。在處理末期，用一種或多種對測定特定的方法來分析經(jīng)處理和未經(jīng)處理的細胞從而確定表型結(jié)果和終點。48表型終點包括隨時間或處理劑量的細胞形態(tài)變化以及細胞成分如蛋白、脂質(zhì)、核酸、激素、糖或金屬等的水平變化。細胞狀態(tài)(包括PH、細胞周期階段、細胞對生物指示劑的攝取或排除)的測量值通常也是感興趣的終點。對處理后的細胞中一種或多種基因表達的檢測同樣可用作靶標抑制劑效力或功效的指標。同時檢測經(jīng)處理和未經(jīng)處理的細胞中的標志基因或懷疑與特定疾病狀態(tài)、癥狀或表型有關的那些基因。體內(nèi)研究本文所述的體內(nèi)研究中的個體對象為溫血脊椎動物，包括人。實施例18RNA分離Poly(A)+mRNA分離在某些實施方案中，Poly(A)+mRNA的分離可參照Miura等人的方法(Clin.Chem.，1996，42，1758-1764)。其它的poly(A)+mRNA分離方法為本領域的常規(guī)方法。簡言之，對于生長于96-孔板的細胞，從細胞去除生長培養(yǎng)基并以200iiL冷PBS洗滌每個微孔。向每個微孔添加60iiL裂解緩沖液(10mMTris-HCl，pH7.6，lmMEDTA，0.5mNaCl，0.5%NP-40,20mM氧釩-核糖核苷復合物)，輕柔搖動平板并在室溫下孵育五分鐘。將55iiL裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至涂覆了寡聚d(T)包被的96-孔板(AGCTInc.，IrvineCA)。將平板在室溫下孵育60分鐘，以200iiL洗滌緩沖液(10mMTris-HClpH7.6，lmMEDTA，O.3mNaCl)洗滌3次。末次洗滌后，以紙巾吸去多余的洗滌緩沖液，然后空氣干燥5分鐘。將預熱至7(TC的60iiL洗脫緩沖液(5mMTris-HClpH7.6)添加至各微孔，將平板在9(TC熱板上孵育5分鐘，然后將洗脫物轉(zhuǎn)移至新鮮的96-孔板。生長于100mm或其它標準平板的細胞也可采用適當體積的所有溶液進行類似處理。總RNA分離總RNA可采用由QiagenInc.(Valencia,CA)購得的RNEASY96TM試劑盒和緩沖液并參照生產(chǎn)商的推薦方法進行分離。簡言之，對于生長于96-孔板的細胞，從細胞去除生長培養(yǎng)基并分別以200iiL冷PBS洗滌每個微？L。向每個微孔添加150iiLRLT緩沖液并將平板劇烈搖動20秒。將150iiL的70%乙醇添加至各微孔，然后通過上下吹吸三次混合內(nèi)含物。隨后將樣本轉(zhuǎn)移至裝配了廢物收集盤并連接至真空源的QIAVACTM集流腔所連接的RNEASY96孔板上。抽真空1分鐘。將500iiLRW1緩沖液添加至RNEASY96板的各微孔中并孵育15分鐘，再次抽真空1分鐘。再次將500iiLRW1緩沖液添加至RNEASY96板的各微孔中并再次抽真空2分鐘。然后將lmL的RPE緩沖液添加至RNEASY96tm板的各微孔中并抽真空90秒鐘。重復用RPE緩沖液洗滌，再次吸真空3分鐘。然后從QIAVAC集流腔取走平板并用紙巾吸干。重新將平板連接至裝配了含1.2mL采集管的采集管架的QIAVAC集流腔。然后通過向各微孔中移入140iiL無RNA酶的水，孵育1分鐘，抽真空3分鐘洗脫RNA。重復移液和洗脫步驟可通過QIAGENBio-Robot9604(Qiagen，Inc.，ValenciaCA)自動完成。簡言之，裂解培養(yǎng)平板上的細胞之后，將平板轉(zhuǎn)移至進行移液、DNA酶處理和洗脫步驟的機械平臺上。實施例19耙標mRNA水平的實時定量PCR分析在某些實施方案中，耙標mRNA水平可采用ABIPRISMM7600、7700或7900序列檢測系統(tǒng)(PE-A卯liedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)并參照生產(chǎn)商的說明通過實時定量PCR實現(xiàn)定量。這是一個閉管、非凝膠式熒光檢測系統(tǒng)，其允許對聚合酶鏈式反應(PCR)產(chǎn)物進行實時高通量定量。與擴增產(chǎn)物在PCR完成后定量的標準PCR不同，在實時定量PCR中的產(chǎn)物在其積累時定量。這一點可通過在PCR反應中包含在正向和反向PCR引物之間特異性退火并包含兩個熒光染料的寡核苷酸探針來實現(xiàn)。報告染料(例如，F(xiàn)AM或JOE，來自PE-AppliedBiosystems,FosterCity，CA，OperonTechnologiesInc.，Alameda，CA或IntegratedDNATechnologiesInc.，Coralville，IA)被連接至探針的5'端而淬火染料(例如，TAMRA，來自PE-AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA，OperonTechnologiesInc.,Alameda，CA或IntegratedDNATechnologiesInc.，Coralville,IA)被連接至探針的3'端。當探針和染料完整時，報告染料的發(fā)射被鄰近的3'端淬火染料所淬滅。在擴增過程中，探針與靶標序列的退火生成能被Taq聚合酶的5'-核酸外切酶活性裂解的底物。在PCR擴增周期的延伸階段，Taq聚合酶對探針的裂解從探針的剩余部分(并從而由淬火部分)釋放了報告染料，從而生成了序列特異性熒光信號。在每一個周期中，附加的報告染料分子從其相應的探針中裂解，并可通過整合在ABIPRISMTM序列檢測系統(tǒng)中的激光鏡頭定期監(jiān)測熒光強度。在每一個測定中，一系列包含來自未處理對照樣本的mRNA系列稀釋物的平行反應生成標準曲線，它可用于對測試樣本進行反義寡核苷酸處理后的抑制百分比進行定量。在定量PCR分析之前，對被測靶標基因特異性的引物_探針組與GAPDH擴增反應的"多重性(multiplexed)"能力進行評估。在多重化中，耙標基因和內(nèi)標基因GAPDH在單個樣本中同時擴增。在該分析中，從未處理細胞中分離的mRNA被連續(xù)稀釋。各稀釋物可在僅特異性靶向GAPDH、僅特異性靶向靶標基因("單重")或?qū)烧叨继禺?多重)的引物-探針組的存在下擴增。PCR擴增之后，可同時從單重和多重樣本生成作為稀釋函數(shù)的GAPDH和耙標mRNA信號的標準曲線。如果從多重樣本中生成的GAPDH和耙標信號的斜率和相關聯(lián)系數(shù)均小于從單重樣本所得相應數(shù)值的10%之內(nèi)，則可認為該靶標特異性的引物-探針組具有多重性。其它PCR方法已為本領域所知。RT和PCR試劑可從InvitrogenLifeTechnologies(Carlsbad,CA)獲得。RT，實時PCR可通過向含有30iiL總RNA溶液(20_200ng)的96-孔板添加20yLPCR混合物(2.5X無MgCl2PCR緩沖液，6.6MmMgCl2，dATP、dCTP、dCTP和dGTP各375iiM，正向引物和反向引物各375nM，125nM探針，4單位RNA酶抑制劑，1.25單位PLATINUM⑧Taq，5單位MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶以及2.5XR0X染料)得以實現(xiàn)。RT反應可通過在4『C下孵育30分鐘得以實現(xiàn)。在95t:下孵育10分鐘以激活PLATINU]VfT叫后，進行40個循環(huán)的兩步PCR法95。C下進行is秒(變性)后在S(TC下進行1.5分鐘(退火/延伸)。在某些實施方案中，通過RT，實時PCR得到的基因目標量通過GAPDH(—種表達恒定的基因)的表達水平或通過以RIB0GREEN(MolecularProbes,Inc.Eugene,OR)定量總RNA來進行規(guī)范化(normalize)。GAPDH表達可通過與耙標同時多重或單獨運行實時RT-PCR來定量?？俁NA可采用RiboGreenTMRNA定量試劑(MolecularProbes,Inc.Eugene,OR)進行定量。通過RIB0GREEN進行RNA定量的方法可參見Jones，L.J.，等人，(AnalyticalBiochemistry，1998，265，368—374)。在該測定中，170iiL的RiBOGREEN工作試劑(RIBOGREEN試劑以1:350稀釋于10mMTris-HCl，ImMEDTA，pH7.5)通過移液管移入含有30iiL純化細胞RNA的96-孔板中。在CytoFluor4000(PEA卯liedBiosystems)中讀板，激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為530nm。實施例20靶標-特異性引物和探針可采用公開的序列信息設計探針和引物，與靶標序列雜交。例如，對于人PTEN，可使用公開的序列信息(GENBANK登錄號U92436.1，SEQIDNO:01)設計下列引物-探針組。正向引物AATGGCTAAGTGAAGATGACAATCAT(SEQIDNO:02)反向引物TGCACATATCATTACACCAGTTCGT(SEQIDNO:03)和PCR探針FAM-TTGCAGCAATTCACTGTAAAGCTGGAAAGG-TAMRA(SEQIDNO:04)，其中FAM為熒光染料而TAMRA為淬火染料。實施例21耙標蛋白水平的Western印跡分析Western印跡分析(免疫印跡分析)可采用標準方法進行。在寡核苷酸處理后16-20小時采集細胞，以PBS洗滌一次，懸浮于LaemmLi緩沖液(100y1/微孔)，煮沸5分鐘并上樣至16%SDS-PAGE凝膠。在150V下跑膠1.5小時，并轉(zhuǎn)移到膜上進行western印跡。采用適當?shù)尼槍Π袠说囊豢?，以及針對該一抗的放射標記或熒光標記的二抗。采用PHOSPHORIMAGER(MolecularDynamics，SunnyvaleCA)顯示條帶。實施例22耙向PTEN的反義化合物的體內(nèi)研究結(jié)果向六周大的雄性Balb/c小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)注射一次劑量為3.2、10、32和100mg/kg的耙向PTEN的修飾的寡聚體。在施用后64小時處死小鼠。將肝組織勻漿化并按照標準方法利用實時PCR和RIBOGREEN②RNA定量試劑(MolecularProbes,Inc.Eugene,OR)對PTENmRNA水平進行定量。在用鹽水_處理對照進行規(guī)范化之前測定相對于總RNA(利用Ribogreen)的PTENmRNA水平。所述反義化合物的相對活性以每個反義化合物的mRNA抑制的平均％結(jié)果而呈現(xiàn)，其中鹽水_注射的對照來進行規(guī)范化。<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>每個核苷間連接基團為硫代磷酯，不另外指明的每個核苷為2'-脫氧核糖基核苷，每個MeC為5-CH3C，并且腳注i或1的核苷定義如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage52</formula>腳注i腳注1測定用反義寡聚體394425、411001和425453處理的小鼠中的ALT和AST水平。通過LabCorp檢測設備(SanDiego，CA)分析血清并且相對于鹽水注射的小鼠測定血清中ALT和AST的水平。ALT和AST大致水平列于下列表中。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>本文所引用的所有出版物、專利和專利申請均作為參考并入本文中。盡管在前述的說明書中通過某些優(yōu)選實施方案對本發(fā)明進行了描述，且為了闡述的目的列舉了許多細節(jié)，本領域技術人員顯然理解本發(fā)明可采用其它的實施方案，且此處所述的某些細節(jié)可在不悖離本發(fā)明基本原則的情況下進行相當?shù)母淖?。權利要求具有通式I的雙環(huán)核苷其中Bx為雜環(huán)堿基部分；T1和T2中的一個為H或羥基保護基團并且T1和T2中的另一個為H、羥基保護基團或活性磷基團；q1和q2各自獨立地為鹵素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、OJ1、SJ1、SOJ1、SO2J1、NJ1J2、N3、CN、C(＝O)OJ1、C(＝O)NJ1J2、C(＝O)J1、O-C(＝O)NJ1J2、N(H)C(＝NH)NJ1J2、N(H)C(＝O)NJ1J2或N(H)C(＝S)NJ1J2；或q1和q2一起為＝C(q3)(q4)；q3和q4各自獨立地為H、鹵素、C1-C12烷基或取代的C1-C12烷基；每個取代的基團各自獨立地被獨立地選自鹵素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、OJ1、SJ1、NJ1J2、N3、CN、C(＝O)OJ1、C(＝O)NJ1J2、C(＝O)J1、O-C(＝O)NJ1J2、N(H)C(＝O)NJ1J2或N(H)C(＝S)NJ1J2的取代基團單或多取代；并且每個J1和J2各自獨立地為H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6氨烷基或保護基團。FPA00001045232200011.tif2.權利要求1所述的雙環(huán)核苷，其中Ql和q2中的至少一個為C「Ce烷基或取代的C「Ce院基。3.權利要求1或2任何一項所述的雙環(huán)核苷，其中Ql和q2每個分別為C「Ce烷基或取代的C「Ce烷基。4.權利要求1-3的任何一項所述的雙環(huán)核苷，其中Ql和q2每個分別為甲基、乙基或丙基。5.權利要求1-4的任何一項所述的雙環(huán)核苷，其中Ql和q2均為甲基。6.權利要求1-3的任何一項所述的雙環(huán)核苷，其中Ql和q2的至少一個為取代的C「Ce院基。7.權利要求1-3或6的任何一項所述的雙環(huán)核苷，其中所述取代的(;-Ce烷基包含選自0Ji、S衛(wèi)、NJj2、N3、CN、C(=O)OJ"C(=0)NJJ2、C(=O)衛(wèi)或O-C(=0)NJJ2的至少一個取代基團，其中每個衛(wèi)和J2各自獨立地為H、Q-Ce烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、Q-Ce氨烷基或保護基團。8.權利要求1_3、6或7的任何一項所述的雙環(huán)核苷，其中所述取代的(;-Ce烷基包含選自0JpNJJ2或CN的至少一個取代基團，其中每個衛(wèi)和J2各自獨立地為H、C「Ce烷基或保護基團。9.權利要求1所述的雙環(huán)核苷，其中&和q2—起為=C(q3)(q4)。10.權利要求9的雙環(huán)核苷，其中q3和q4分別為H。11.權利要求1或9任何一項所述的雙環(huán)核苷，其中q3和q4的至少一個為鹵素、C「Ce烷基或取代的Q-Ce烷基。12.權利要求1、9或11任何一項所述的雙環(huán)核苷，其中q3和q4的至少一個為甲基。13.權利要求1、9、11或12任何一項所述的雙環(huán)核苷，其中q3和q4分別為甲基。14.權利要求1-13任何一項所述的雙環(huán)核苷，其中1\和T2的分別為羥基保護基團。15.權利要求l-14任何一項所述的雙環(huán)核苷，其中所述羥基保護基團各自獨立地選自乙?；?、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氫吡喃基、1_乙氧基乙基、l-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷乙基、對氯苯基、2，4-二硝基苯基、節(jié)基、苯甲?；?、對苯基苯甲?；?、2，6-二氯節(jié)基、二苯基甲基、對硝基節(jié)基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲硅烷基、三異丙基甲硅烷基、苯甲?；姿狨?、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰基、9-芴基甲基碳酸脂、甲磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧三苯甲基、三甲氧基三苯甲基或取代的9-苯基黃嘌呤9-基。16.權利要求1-15任何一項所述的雙環(huán)核苷，其中1\為乙?；?、苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或4，4'-二甲氧三苯甲基。17.權利要求1_16任何一項所述的雙環(huán)核苷，其中1\為4，4'-二甲氧三苯甲基。18.權利要求1-13和15-17任何一項所述的雙環(huán)核苷，其中T2為活性磷基團。19.權利要求18任一所述的雙環(huán)核苷，其中所述活性磷基團為二異丙基氰基乙氧基亞磷酰胺或H-磷酸鹽。20.權利要求1-13和15-19任何一項所述的雙環(huán)核苷，其中L為二異丙基氰基乙氧基亞磷酰胺。21.權利要求20所述的雙環(huán)核苷，其中Ql和q2分別為甲基。22.權利要求20所述的雙環(huán)核苷，其中Ql和q2—起為=C(q3)(q4)并且q3和q4分別為H。23.權利要求l-22任何一項所述的雙環(huán)核苷，其中Bx為嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取代的嘌呤。24.權利要求1-23任何一項所述的雙環(huán)核苷，其中Bx為尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-丙炔基_尿嘧啶、5-噻唑-尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-噻唑-胞嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤或2，6-二氨基嘌呤。25.權利要求l-3、6-9、ll、12、14-20、23或24任何一項所述的雙環(huán)核苷，其中每個1和J2各自獨立地為H或Q-Q烷基。26.權利要求1-25任何一項所述的雙環(huán)核苷，具有通式II:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>27.寡聚化合物，其包含至少一個具有通式III的雙環(huán)核苷<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中對于具有通式III的所述至少一個雙環(huán)核苷，各自獨立地Bx為雜環(huán)堿基部分；T3和L各自獨立地為將具有通式III的雙環(huán)核苷連接至所述寡聚化合物的核苷酸間連接基團，或T3和T4中的一個為將具有通式III的雙環(huán)核苷連接至所述寡聚化合物的核苷酸間連接基團，而T3和T4中的另一個為H、羥基保護基團、連接的偶聯(lián)物基團或5'或3'-末端基團；qi和q2各自獨立地為鹵素、CrC12烷基、經(jīng)取代的C「C12烷基、C2_C12烯基、經(jīng)取代的C2_C12烯基、C2_C12炔基、經(jīng)取代的C2_C12炔基、C「C^烷氧基、經(jīng)取代的C「C^烷氧基、0JpSJ!、S0JpS0JpNJj2、N3、CN、C(=O)OJpC(=0)NJJ2、C(=0)J^0-C(=O)NJJ"N(H)C(=NH)NJJ2、N(H)C(=0)NJJ2或N(H)C(=S)NJJ2;或q!和Q2均為二C(q3)(q4);q3和q4各自獨立地為H、鹵素、CrC12烷基或經(jīng)取代的CrC12烷基；每個取代的基團各自獨立地被獨立地選自鹵素、C「Ce烷基、C廠Ce烯基、C廠Ce炔基、0衛(wèi)、SJ"NJJ2、N3、CN、C(=O)OJ"C(=0)NJJ2、C(=O)J"O-C(=0)NJJ2、N(H)C(=0)NJJ2或N(H)C(=S)NJJ2的取代基團單或多取代；并且每個衛(wèi)和J2各自獨立地為H、C「Ce烷基、C廠Ce烯基、C廠Ce炔基、C「Ce氨烷基或保護基團。28.權利要求27所述的寡聚化合物，其中對于具有通式III的所述雙環(huán)核苷，各自獨立地，至少一個Ql和q2為CfCe烷基或取代的CfCe烷基。29.權利要求27或28任何一項所述的寡聚化合物，其中Ql和q2各自獨立地為C「Ce烷基或取代的Q-Ce烷基。30.權利要求27-29的任何一項所述的寡聚化合物，其中^和化各自獨立地為甲基、乙基或丙基。31.權利要求27-30的任何一項所述的寡聚化合物，其中Ql和q2均為甲基。32.權利要求27-29的任何一項所述的寡聚化合物，其中至少每個Ql和q2為取代的C「C6院基。33.權利要求27-29或32的任何一項所述的雙環(huán)核苷，其中至少每個Ql或每個q2為取代的C「Ce烷基，其中所述取代基團選自0JpSJpNJj2、N3、CN、C(=0)0JpC(=0)NJJ2、C(=O)衛(wèi)或O-C(=0)NJJ2，其中每個J!和J2各自獨立地為H、C「C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C「Ce氨烷基或保護基團。34.權利要求27-29、32或33的任何一項所述的寡聚化合物，其中至少每個Ql或每個q2為取代的C「Ce烷基，其中所述取代基團選自0衛(wèi)、NJA或CN，其中每個衛(wèi)并J2各自獨立地為H、C「Ce烷基或保護基團。35.權利要求27所述的寡聚化合物，其中對于具有通式III的所述雙環(huán)核苷，各自獨立地，q丄和化一起為=C(q3)(q4)。36.權利要求35的寡聚化合物，其中q3和q4分別為H。37.權利要求35所述的寡聚化合物，其中至少每個q3或每個q4均為鹵素、烷基或取代的C「Ce烷基。38.權利要求35或37任何一項所述的寡聚化合物，其中至少每個q3或每個q4均為甲基。39.權利要求35、37或38任何一項所述的寡聚化合物，其中每個q3和每個q4均為甲基。40.權利要求27-39任何一項所述的寡聚化合物，其包含至少一個3'或5'-末端基團。41.權利要求27-40任何一項所述的寡聚化合物，其包含連續(xù)序列的連接的核苷，其中核苷間連接基團各自獨立地為磷酸二酯或硫代磷酯。42.權利要求27-41任何一項所述的寡聚化合物，其包含連續(xù)序列的連接的核苷，其中每個核苷間連接基團為硫代磷酯。43.權利要求27-42任何一項所述的寡聚化合物，其中每個雙環(huán)核苷具有通式IV:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>44.權利要求27-43任何一項所述的寡聚化合物，其包含至少兩個連續(xù)的具有通式III的雙環(huán)核苷組成的至少一個區(qū)域。45.權利要求44所述的寡聚化合物，其中至少兩個連續(xù)的具有通式III的雙環(huán)核苷組成的至少一個區(qū)域位于所述寡聚化合物的3'或5'-末端。46.權利要求45所述的寡聚化合物，進一步包含位于所述寡聚化合物的3'或5'-末端另一端的至少一個具有通式III的雙環(huán)核苷。47.權利要求27-43任何一項所述的寡聚化合物，其包含有間隙的寡聚化合物，該有間隙的寡聚化合物具有由約6至約14個單體亞單位組成的內(nèi)部區(qū)域以分開兩個外部區(qū)域，其中所述外部區(qū)域獨立地包含1至約5個具有通式III的連續(xù)的雙環(huán)核苷。48.權利要求47所述的寡聚化合物，其中所述內(nèi)部區(qū)域中基本上每個單體亞單位為P-D-2'-脫氧核糖基核苷。49.權利要求47或48任何一項所述的寡聚化合物，其中所述內(nèi)部區(qū)域包含約8至約14個P-D-2'-脫氧核糖基核苷。50.權利要求47-49任何一項所述的寡聚化合物，其中所述內(nèi)部區(qū)域包含約10至約14個P-D-2'-脫氧核糖基核苷。51.權利要求47-50任何一項所述的寡聚化合物，其中所述內(nèi)部區(qū)域包含約10至約12個P-D-2'-脫氧核糖基核苷。52.權利要求47-51任何一項所述的寡聚化合物，其中所述外部區(qū)域各自獨立地包含2至約3個具有通式III的雙環(huán)核苷。53.權利要求47-51任何一項所述的寡聚化合物，其中所述外部區(qū)域各自獨立地包含2個具有通式III的雙環(huán)核苷。54.權利要求47-53任何一項所述的寡聚化合物，其中所述內(nèi)部區(qū)域包含10個P-D-2'-脫氧核糖基核苷。55.權利要求47-50、52或53任何一項所述的寡聚化合物，其中所述內(nèi)部區(qū)域包含14個P-D-2'-脫氧核糖基核苷。56.權利要求47-52、54或55任何一項所述的寡聚化合物，其中所述外部區(qū)域各自獨立地包含2個具有通式III的雙環(huán)核苷。57.權利要求47-56任何一項所述的寡聚化合物，其中每個雙環(huán)核苷具有通式IV:58.權利要求27-57任何一項所述的寡聚化合物，其在長度上包含約8至約40個單體亞單位。59.權利要求27-57任何一項所述的寡聚化合物，其在長度上包含約8至約20個單體亞單位。60.權利要求27-57任何一項所述的寡聚化合物，其在長度上包含約10至約16個單體亞單位。61.權利要求27-57任何一項所述的寡聚化合物，其在長度上包含約10至約14個單體亞單位。62.抑制基因表達的方法，該方法包括將一種或多種細胞、組織或動物與權利要求27至61任何一項的寡聚化合物相接觸。63.—種方法，其包括將細胞與寡聚化合物接觸，所述寡聚化合物包含至少一個通式III的雙環(huán)核苷其中所述至少一個雙環(huán)核苷各自獨立地具有通式III:Bx為雜環(huán)堿基部分；T3和L各自獨立地為將具有通式III的雙環(huán)核苷連接至所述寡聚化合物的核苷酸間連接基團，或T3和T4中的一個為將具有通式III的雙環(huán)核苷連接至所述寡聚化合物的核苷酸間連接基團，而T3和T4中的另一個為H、羥基保護基團、連接的偶聯(lián)物基團或5'或3'-末端基團；qi和q2各自獨立地為鹵素、CrC12烷基、取代的C「C^烷基、C2_C12烯基、取代的C2_C12烯基、C2_C12炔基、取代的C2_C12炔基、CrC12烷氧基、取代的CrC12烷氧基、OJpSJpS0JpS0JpNJJ2、N3、CN、C(=0)0JpC(=0)NJJ2、C(=0)衛(wèi)、0-C(=0)NJJ2、N(H)C(=NH)NlJ2、N(H)C(=0)NlJ2或N(H)C(=S)NJ丄J2;或q!和Q2均為二C(q3)(q4);q3和q4各自獨立地為H、鹵素、CrC12烷基或取代的CrC12烷基；取代的基團各自獨立地被獨立地選自鹵素、C「Ce烷基、C廠Ce烯基、C廠Ce炔基、0衛(wèi)、S衛(wèi)、NJJ2、N3、CN、C(=O)OJpC(=0)NJJ2、C(=O)J"0_C(=0)JJ2、N(H)C(=0)戦或N(H)C(=S)NJJ2的取代基團單或多取代；L和J2各自獨立地為H、CrC6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C「Ce氨烷基或保護基團；并且其中所述寡聚化合物包含約8至約40個單體亞單位并且與靶標RNA互補。64.權利要求63所述的方法，其中所述細胞為動物。65.權利要求63-64任何一項所述的方法，其中所述細胞為人。66.權利要求63-65任何一項所述的方法，其中所述靶標RNA選自mRNA、pre-mRNA和microRNA。67.權利要求63-66任何一項所述的方法，其中所述靶標RNA為mRNA。68.權利要求63-67任何一項所述的方法，其中所述靶標RNA為人mRNA。69.權利要求63-68任何一項所述的方法，其中所述耙標RNA被裂解從而抑制其功能。70.權利要求63-69任何一項所述的方法，進一步包括評估所述寡聚化合物對所述細胞的反義活性。71.權利要求70所述的方法，其中所述評估包括檢測所述靶標RNA的水平。72.權利要求70所述的方法，其中所述評估包括檢測所述蛋白質(zhì)的水平。73.權利要求70所述的方法，其中所述評估包括檢測一種或多種表型的結(jié)果。全文摘要本發(fā)明描述了6-雙取代雙環(huán)核苷、從其中制備的寡聚化合物和利用所述寡聚化合物的方法。更特別地，每個6-雙取代雙環(huán)核苷包含2’-O-C(R1)(R2)-4’或2’-O-C＝(R3)(R4)-4’橋，其中每個R分別為取代基團并且R1和R2包括H。6-雙取代雙環(huán)核苷可用于增強寡聚化合物的性質(zhì)包括核酸酶耐受性。在某些實施方案中，本發(fā)明提供的寡聚化合物與靶標RNA的一部分雜交而導致靶標RNA喪失正常功能。文檔編號C07H19/04GK101796062SQ200880105715公開日2010年8月4日申請日期2008年7月1日優(yōu)先權日2007年7月5日發(fā)明者埃里克·E·斯威茲,普內(nèi)特·P·塞思申請人:Isis藥物公司