專(zhuān)利名稱(chēng)：花鱸白細(xì)胞介素8基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)中的基因領(lǐng)域，特別是關(guān)于花鱸白細(xì)胞介素8基因序列。
背景技術(shù)：
白介素8(interleukin 8 IL-8)基因又稱(chēng)噬中性粒細(xì)胞激活因子或粒細(xì)胞趨化因子，屬C-X-C型趨化性因子，是最早發(fā)現(xiàn)的趨化性因子。它由單核—巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和肥大細(xì)胞等多種細(xì)胞經(jīng)炎癥刺激后產(chǎn)生，具有趨化和激活嗜中性粒細(xì)胞的能力，包括吸引噬中性粒細(xì)胞向炎癥部位遷移，并誘導(dǎo)它們脫顆粒，釋放溶菌酶，啟動(dòng)呼吸代謝爆發(fā)，增加細(xì)胞表面粘附分子的表達(dá)等多種功能，在炎癥發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中有重要的作用，是一種重要的免疫抗病基因。目前隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，病害問(wèn)題日趨嚴(yán)重，因此從魚(yú)體自身入手，提高魚(yú)體免疫力是當(dāng)今病害防治的趨勢(shì)。至今對(duì)花鱸免疫基因的研究還較少，尤其對(duì)IL-8的研究還屬空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過(guò)以近源物種IL8基因的CDS序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)的兼并引物，并用PCR法擴(kuò)增，結(jié)合RACE技術(shù)克隆到花鱸白細(xì)胞介素8(IL-8)基因的全表達(dá)序列。其核苷酸如序列表中SEQ ID NO.1所述；它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。
本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)1、總RNA的提取解剖魚(yú)體取出脾臟，使用Trizol進(jìn)行勻漿，按照使用說(shuō)明提取花鱸總RNA。2、cDNA第一鏈的合成花鱸總RNA與反轉(zhuǎn)錄引物(oligo-dT接頭引物)混合，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
3、引物設(shè)計(jì)依據(jù)，引物合成的方法從GenBank中下載近源物種(如人、牛、虹鱒、牙鲆、鯉魚(yú)等)IL8同源基因CDS序列，利用Clustal W軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，確定保守區(qū)，根據(jù)保守區(qū)序列設(shè)計(jì)兼并引物，擴(kuò)增片段大小約為180bp。引物設(shè)計(jì)后采用β-乙睛亞磷酰胺化學(xué)法進(jìn)行DNA合成。
引物序列為F5’TGCCRCTGCATHGARAC 3’R5’ACTTGTTVATGACYHTCTTVACCCA 3’4、IL-8基因cDNA全序列的克隆以上述合成的第一鏈cDNA作為模板，用兼并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，從凝膠中純化回收目的產(chǎn)物。然后將純化的PCR產(chǎn)物克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM-109感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒DNA。經(jīng)簡(jiǎn)并引物PCR檢測(cè)后，將具有插入片段的質(zhì)粒DNA用M13通用引物進(jìn)行雙向測(cè)序。
根據(jù)已得到的cDNA片段序列設(shè)計(jì)特異性引物，利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)對(duì)目的基因的3′和5′末端進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
在3′RACE中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由外側(cè)引物和接頭引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，所得產(chǎn)物利用內(nèi)側(cè)和接頭引物再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
在5′RACE中，利用末端轉(zhuǎn)移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C)尾后，以加尾后的cDNA作為模板，利用外側(cè)特異性引物和OligodG進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物再利用內(nèi)側(cè)引物和OligodG進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增。
所得到的PCR產(chǎn)物在1.2％的瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行分離檢測(cè)后，將PCR產(chǎn)物純化后，克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM-109感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，用M13引物對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序所得序列再與兼并引物擴(kuò)增所得的序列利用Clustal W軟件進(jìn)行拼接。
5、對(duì)花鱸白細(xì)胞介素8(IL-8)基因的測(cè)定所得到的PCR產(chǎn)物在1.2％的瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行分離檢測(cè)后，將PCR產(chǎn)物純化后，克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM-109感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，用3730測(cè)序儀對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件進(jìn)行同源性測(cè)定，來(lái)確定為花鱸IL-8同源序列。比對(duì)結(jié)果Score ESequences producing significant alignments(Bits) Valuegi|74095881|ref|NP 001027759.1|interleukin-8[Takifugu rubri...1592e-38gi|62901686|gb|AAY18807.1|interleukin 8[Acanthopagrus schlege|1541e-36
gi|19911219|dbj|BAB86884.1|CXC chemokine [Paralichthys olivaceu1463e-34gi|15667642|gb|AAL05442.1|interleukine-8[Paralichthys olivaceu1448e-34gi|52547128|gb|AAU81660.1|interleukin-8[Gadus morhua]1419e-33gi|77621310|emb|CAD59734.2|interleukin-8[Gadus morhua]1387e-32gi|91701717|gb|ABE47600.1|interleukin-8[Cyprinus carpio]1302e-29gi|31087942|gb|AAP42829.1|interleukin 8X[Oncorhynchus mykis...1262e-28本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，病害問(wèn)題日趨嚴(yán)重，一般的抗生素藥物極易引起環(huán)境污染，因此從魚(yú)體自身入手，提高魚(yú)體免疫力是病害防治的趨勢(shì)。因此該基因的獲得，不僅為研究魚(yú)類(lèi)IL-8在炎癥反應(yīng)中的作用，進(jìn)一步探討?hù)~(yú)類(lèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)理奠定基礎(chǔ)，而且通過(guò)氨基酸序列可以獲得具有生物活性的純化蛋白，為研究新型的抗病免疫佐劑提供理論基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式
1.總RNA的提取取鮮活健康花鱸(體重約400g)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暫養(yǎng)2d后(水溫約24℃，氣泵充氣)，從胸腔注射脂多糖(LPS，10μg/mL)200μL。刺激6h后，解剖魚(yú)體取出脾臟約100mg，分別放入1mL Trizol(Gibco，Japan)中進(jìn)行勻漿，按照試劑盒使用說(shuō)明提取總RNA。
2.cDNA第一鏈的合成取花鱸總RNA 5μg與反轉(zhuǎn)錄引物(oligo-dT接頭引物)1μL(10pmol/L)混合，70℃加熱5min后，立即放置冰上，然后加入5×buffer，2.5mmol/L dNTP混合液，Ribonuclease Inhibitor，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)體系為25μL。反應(yīng)過(guò)程為42℃ 60min，70℃ 15min，最后放入-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.引物設(shè)計(jì)依據(jù)，引物合成的方法從GenBank中下載近源物種(如人、牛、虹鱒、牙鲆、鯉魚(yú)等)IL8同源基因CDS序列，利用Clustal W軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，確定保守區(qū)，根據(jù)保守區(qū)序列設(shè)計(jì)兼并引物，擴(kuò)增片段大小約為180bp。引物設(shè)計(jì)后采用β-乙睛亞磷酰胺化學(xué)法進(jìn)行DNA合成。
引物序列為F5’TGCCRCTGCATHGARAC 3’R5’ACTTGTTVATGACYHTCTTVACCCA 3’4.IL-8基因cDNA全序列的克隆以近源物種IL8基因CDS序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)的兼并引物，擴(kuò)增片段大小約為180bp。
以上述合成的第一鏈cDNA作為模板，用兼并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10xPCR反應(yīng)緩沖液5μL，25mmol/L MgCl23μL，2.5mmol/L dNTP2μL，10nmol/L引物dTF和dTR各2μL，Taq酶1.25U，用PCR水將反應(yīng)體系補(bǔ)充至50μL。反應(yīng)條件為1個(gè)循環(huán)，94℃變性5min；35個(gè)循環(huán)94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s；1個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min；4℃保溫。所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，從凝膠中純化回收目的產(chǎn)物。然后將純化的PCR產(chǎn)物克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM-109感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒DNA。經(jīng)簡(jiǎn)并引物PCR檢測(cè)后，將具有插入片段的質(zhì)粒DNA用M13通用引物進(jìn)行雙向測(cè)序。
根據(jù)已得到的cDNA片段序列設(shè)計(jì)特異性引物。利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)對(duì)目的基因的3′和5′末端進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
在3′RACE中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由外側(cè)引物和接頭引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，所得產(chǎn)物稀釋50倍后，取1μL作為模板，利用內(nèi)側(cè)和接頭引物再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
在5′RACE中，利用末端轉(zhuǎn)移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C)尾后，以加尾后的cDNA作為模板，利用外側(cè)特異性引物和OligodG進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物取1μL作為模板，再利用內(nèi)側(cè)引物和OligodG進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增。
所得到的PCR產(chǎn)物在1.2％的瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行分離檢測(cè)后，將PCR產(chǎn)物純化后，克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM-109感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，用M13引物對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序所得序列再與兼并引物擴(kuò)增所得的序列利用Clustal W軟件進(jìn)行拼接。
5.對(duì)花鱸白細(xì)胞介素8(IL-8)基因的測(cè)定所得到的PCR產(chǎn)物在1.2％的瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行分離檢測(cè)后，將PCR產(chǎn)物純化后，克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM-109感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，用3730測(cè)序儀對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件進(jìn)行同源性測(cè)定，來(lái)確定為花鱸IL-8同源序列。比對(duì)結(jié)果Score ESequences producing significant alignments (Bits)Valuegi|74095881|ref|NP 001027759.1|interleukin-8[Takifugu rubri...1592e-38gi|62901686|gb|AAY18807.1|interleukin 8[Acanthopagrus schlegel1541e-36gi|19911219|dbj|BAB86884.1|CXC chemokine[Paralichthys olivaceu1463e-34gi|15667642|gb|AAL05442.1|interleukine-8[Paralichthys olivaceu1448e-34gi|52547128|gb|AAU81660.1|interleukin-8[Gadus morhua]1419e-33gi|77621310|emb|CAD59734.2|interleukin 8[Gadus morhua]1387e-32gi|91701717|gb|ABE47600.1|interleukin 8[Cypr inus carpio]1302e-29gi|31087942|gb|AAP42829.1|interleukin 8X[Oncorhynchus mykis...1262e-28
序列表<110>中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所<120>花鱸白細(xì)胞介素8基因序列<160>2<210>1<211>803<212>RNA<213>花鱸(Lateolabrax Japonicus)<220>
<221>3’UTP<222>(460)…(803)<220>
<221>5’UTP<222>(1)...(159)<220>
<221>CDS<222>(160)...(459)<220>
<221>PolyA site<222>(788)...(803)<400>1ccaagaaaag gaaaagtaga gagagtgaac tcagtgaaag aataaggaat acagaagaat60aaaaaacttc tttactttta tacaggcttc atcagacggc tttctgaagg gcattcatat120ccttagtgat aatttgttgc aaaatttgta aaaggcaaa atg aag agc agc aga 174Met Lys Ser Ser Arg1 5gtg att gtc acc tct act gtg gtg ctc ctg gct ttc ttg gcc atc act 222Val Ile Val Thr Ser Thr Val Val Leu Leu Ala Phe Leu Ala Ile Thr6 12 18gaa ggg atg agt ctg aga agc ctt gga gtg gag ctg cac tgc cgc tgc 270Glu Gly Met Ser Leu Arg Ser Leu Gly Val Glu Leu His Cys Arg Cys22 28 34att gag acg gag agc aaa ccc atc ggc cgc cac att gag aag gtg gag 318Ile Glu Thr Glu Ser Lys Pro Ile Gly Arg His Ile Glu Lys Val Glu38 44 50ctg att cct gcc aac tcc cac tgc gag gag act gag ctc att gcc act 366Leu Ile Pro Ala Asn Ser His Cys Glu Glu Thr Glu Ile Ile Ala Thr54 60 66ctg aag aag aca ggc caa gaa gtt tgc ctg gac ccg gag gct ccc tgg 414Leu Lys Lys Thr Gly Gln Glu Val Cys Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp70 76 82gtc aag aaa gtc atg aac aag ttc ctg tcc aac aga aca ccc tga 459Val Lys Lys Val Met Asn Lys Phe Leu Ser Asn Arg Thr Pro86 92 98
acagatcggg agagatgtgt ttcatgagtc tgaacaattt caaagtacta aaaagtattt519atttgatagt catcacactc aatttaatac aatcaactgt caatttgatc aactgttgaa579aatgacaaca gaatttacca agtaaggtta tgtttgtatc aaacatgtgt gttaacaagc639ctgtgcttgt ttgtatgtca cttgtgtgtg ttactgtgta ttcttatcta taacttattt699gcttaaaata tttattgata tatttatgat gtaaatgtca attgtttagc tctgctgaca759accaattgat ttattaaaaa agtttaccta aaaaaaaaaaa aaa 803<210>2<211>99<212>PRT<213>花鱸(Lateolabrax Japonicus)<400>2Met Lys Ser Ser Arg Val Ile Val Thr Ser Thr Val Val Leu Leu1 7 13Ala Phe Leu Ala Ile Thr Glu Gly Met Ser Leu Arg Ser Leu Gly16 22 28Val Glu Leu His Cys Arg Cys Ile Glu Thr Glu Ser Lys Pro Ile31 37 43Gly Art His Ile Glu Lys Val Glu Leu Ile Pro Ala Asn Ser His46 52 58Cys Glu Glu Thr Glu Ile Ile Ala Thr Leu Lys Lys Thr Gly Gln61 67 73Glu Val Cys Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Val Lys Lys Val Met76 82 88Asn Lys Phe Leu Ser Asn Arg Tht Pro91 9權(quán)利要求
1.一種花鱸白細(xì)胞介素8基因，它的核苷酸序列如序列表中SEQID NO.1所述。
2.一種花鱸白細(xì)胞介素8基因，它的氨基酸序列如序列表中SEQID NO.2所述。
全文摘要
本發(fā)明以近源物種IL8基因的CDS序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)兼并引物，從花鱸魚(yú)的脾臟中提取總RNA，用PCR法擴(kuò)增，結(jié)合RACE技術(shù)克隆到花鱸白細(xì)胞介素8(IL－8)基因的全表達(dá)序列。該基因不僅為研究魚(yú)類(lèi)IL－8在炎癥反應(yīng)中的作用，進(jìn)一步探討?hù)~(yú)類(lèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)理奠定基礎(chǔ)，而且通過(guò)氨基酸序列可以獲得具有生物活性的純化蛋白，為研究新型的抗病免疫佐劑提供理論基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07K14/54GK1869229SQ200610035460
公開(kāi)日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2006年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月15日
發(fā)明者江世貴, 邱麗華, 張漢華, 黃桂菊 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所