專利名稱：結(jié)合br3的多肽及其用途的制作方法
專利說明結(jié)合BR3的多肽及其用途 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及結(jié)合BR3的抗體和多肽及其用途。

背景技術(shù)：
BAFF(也稱為BlyS、TALL-I、THANK、TNFSF13B或zTNF4)是B細(xì)胞存活和成熟所必需的TNF配體超家族的成員(在Mackay & Browning(2002)Nature Rev.Immunol.2，465-475中進(jìn)行了綜述)。轉(zhuǎn)基因小鼠中BAFF的過表達(dá)導(dǎo)致B細(xì)胞增生和嚴(yán)重自身免疫性疾病的發(fā)生(Mackay，etal.(1999)J.Exp.Med.190，1697-1710；Gross，et al.(2000)Nature 404，995-999；Khare，et al.(2000)Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.97，3370-33752-4)。在患有多種自身免疫性病癥的人類患者中，BAFF水平有升高，該自身免疫性病癥例如全身性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Wegener’s肉芽腫病和Sjogren’s綜合征(Cheema，G.S，et al.，(2001)Arthritis Rheum.44，1313-1319；Groom，J.，et al，(2002)J.Clin.Invest.109，59-68；Zhang，J.，et al.，(2001)J.Immunol.166，6-10；Krumbholz et al.，ANCA Workshop，Prague，Czech Republic，2003)。此外，BAFF水平與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，這表明BAFF在這些疾病的發(fā)病機(jī)制中起直接作用。在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)、狼瘡(例如，BWF1小鼠)、多發(fā)性硬化癥(例如，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE))的動(dòng)物模型中，BAFF阻斷導(dǎo)致所述疾病的緩解。在慢性移植物抗宿主疾病(cGVHD)模型中，BR3Fc治療顯著抑制了與cGVHD相關(guān)的脾大，這不是通過防止B細(xì)胞活化，而是通過抑制B細(xì)胞存活實(shí)現(xiàn)的(Kalled，SL et al.(2005)Curr DirAutoimmun.8206-42)。因此，BAFF阻斷有可能在其它具有強(qiáng)的B細(xì)胞組分的自身免疫性動(dòng)物模型中提供有效性。
另外，已報(bào)道了CD4+和CD8+T細(xì)胞可被重組體BAFF共刺激，以產(chǎn)生I型和II型細(xì)胞因子，并增加CD25表達(dá)(Ng，LG，et al.2004.JImmunol 173807)。此外，報(bào)道了BAFF-RFc阻斷BAFF-介導(dǎo)的人T細(xì)胞增殖(Huard，B，et al.，(2000)J Immunol 1676225)。此外，某些患有B-淋巴惡性腫瘤的患者具有升高的BAFF水平(Kern，C et al.，(2004)Blood103(2)679-88)。根據(jù)一篇報(bào)導(dǎo)，加入可溶性BAFF或APRIL使B-CLL細(xì)胞免于自發(fā)的和藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并刺激NF-κB活化。相反，加入可溶性BCMA-Fc或抗-BAFF和抗APRIL抗體增強(qiáng)B-CLL細(xì)胞凋亡(Kern，C et al.，同上)。BAFF可以作為惡性B細(xì)胞的必要自分泌存活因子(Mackay F，et al.，(2004)Curr Opin Pharmacol.4(4)347-54)。因此，BAFF與多種疾病狀態(tài)相關(guān)。
BAFF結(jié)合TNF受體超家族的三個(gè)成員，TACI、BCMA和BR3(也稱為BAFF-R)(Gross，et al.，同上；8.Thompson，J.S.，et al.，(2001)Science293，2108-2111.Yan，M.，et al.；.(2001)Curr.Biol.11，1547-1552；Yan，M.，et al.，(2000)Nat.Immunol.1，37-41.Schiemann，B.，et al.，(2001)Science293，2111-2114)。在這三個(gè)成員中，只有BR3對(duì)BAFF是特異性的；其它兩種還結(jié)合相關(guān)的TNF家族成員，APRIL。BAFF和受體敲除或突變小鼠的表型比較表明通過BR3的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)了BAFF的B細(xì)胞存活功能(Thompson，et al.，同上；Yan，(2002)，同上；Schiemann，同上)。相反，TACI表現(xiàn)出起抑制性受體的作用(Yan，M.，(2001)Nat.Immunol.2，638-643)，而BCMA的作用較不明確(Schiemann，同上)。
BR3是在B細(xì)胞表面表達(dá)的184-殘基III型跨膜蛋白(Thompson，et al.，同上；Yan，(2002)，同上)。胞內(nèi)區(qū)不具有與公知的結(jié)構(gòu)域或蛋白-蛋白相互作用基序相似的序列。多方面的研究提供了強(qiáng)有力的證據(jù)表明BR3是主要受體，通過它B細(xì)胞接受BAFF介導(dǎo)的存活信號(hào)(在Kalled，S.，et al.，Curr Dir Autoimmun.2005；8206-42中進(jìn)行了綜述)。這已由新近產(chǎn)生的BAFF-R敲除小鼠所證實(shí)，其中這些BAFF-R-/-小鼠(Shulga-Morkskaya，S.et al.，(2004)J Immunol.15；173(4)2331-41)。BR3在包括多發(fā)性骨髓瘤和非何杰金氏淋巴瘤在內(nèi)的多種疾病組織中表達(dá)(Novak，AJ(2004)Blood1042247-2253；Novak，AJ(2004)Blood 103689-694)。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供了新的BR3結(jié)合多肽，其包括BR3結(jié)合免疫粘附素、抗體和缺乏Fc區(qū)的肽，以及它們?cè)诒景l(fā)明方法中的出乎意料的有益特性，包括，例如，它們作為去除B細(xì)胞、刺激B細(xì)胞增殖和存活、用于治療應(yīng)用或診斷應(yīng)用或研究應(yīng)用的有效試劑的用途。
本發(fā)明提供了BR3結(jié)合多肽，該多肽具有如下特性的任一種、或任意組合或全部(1)以如下表觀Kd值結(jié)合人BR3胞外結(jié)構(gòu)域序列500nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低、或1nM或更低；(2)以如下表觀Kd值結(jié)合人BR3胞外結(jié)構(gòu)域序列并結(jié)合小鼠BR3胞外結(jié)構(gòu)域序列500nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低、或1nM或更低；(3)具有人BR3上的包含特異性殘基的功能性表位；(4)抑制人BR3與人BAFF結(jié)合；(5)在人效應(yīng)細(xì)胞存在下具有抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)，或者與野生型IgG相比，在人效應(yīng)細(xì)胞存在下具有增強(qiáng)的ADCC，或者與野生型IgG或天然序列IgG Fc相比，在人效應(yīng)細(xì)胞存在下具有減弱的ADCC；(6)來源于本文公開的任何一種抗體；(7)與具有野生型或天然序列IgG Fc的多肽或母體多肽相比，以更高的親和性結(jié)合人Fc新生受體(FcRn)；以及(8)當(dāng)與基線水平或未用這種抗體處理的陰性對(duì)照相比，在體外或體內(nèi)殺死或去除B細(xì)胞，優(yōu)選殺死或去除至少20％的B細(xì)胞。BR3結(jié)合多肽包括結(jié)合與Fc結(jié)構(gòu)域融合的BR3(例如，來源于噬菌體展示)的肽(例如，肽體(peptibody))。
在一實(shí)施方案中，與用不結(jié)合B細(xì)胞表面抗原的對(duì)照抗體進(jìn)行的處理比較或與處理前的基線水平比較，本發(fā)明的抗體可去除小鼠體內(nèi)如下細(xì)胞群的任一種、任意組合或所有細(xì)胞群中的至少20％B細(xì)胞(1)血液中的B細(xì)胞，(2)淋巴結(jié)中的B細(xì)胞，(3)脾中的濾泡B細(xì)胞，以及(4)脾中的邊緣區(qū)B細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，B細(xì)胞去除率為25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。
本發(fā)明還提供了激動(dòng)型BR3結(jié)合多肽，其具有如下特性的任一種、任意組合或全部(1)以如下表觀Kd值結(jié)合人BR3胞外結(jié)構(gòu)域序列500nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低、或1nM或更低；(2)具有人BR3上的包含特異性殘基的功能性表位；(3)在體外刺激B細(xì)胞增殖；(4)抑制人BR3結(jié)合人BAFF；(5)來源于本文公開的任一種抗體；(6)與具有野生型或天然序列IgG Fc的多肽或母體多肽相比，以更高的親和性結(jié)合人Fc新生受體(FcRn)；以及(7)在體內(nèi)刺激B細(xì)胞增殖或B細(xì)胞存活。根據(jù)一實(shí)施方案，與野生型IgG1或天然IgG1Fc序列或9.1RF抗體相比，該激動(dòng)型抗體具有更弱的或沒有ADCC功能。根據(jù)一實(shí)施方案，本發(fā)明的激動(dòng)型抗體在Fc區(qū)具有至少如下置換D265A/N297A(EU編號(hào)系統(tǒng))。根據(jù)一實(shí)施方案，該激動(dòng)型抗體具有人IgG4的IgG Fc序列。
根據(jù)一實(shí)施方案，本發(fā)明的BR3結(jié)合多肽具有針對(duì)人BR3的包含殘基F25、V33和A34的功能性表位，其中該單克隆抗體不為9.1抗體或2.1抗體。根據(jù)另一實(shí)施方案，該功能性表位還包含殘基R30。根據(jù)一實(shí)施方案，本發(fā)明的BR3結(jié)合多肽具有針對(duì)人BR3的包含殘基P21和A22的功能性表位。根據(jù)一實(shí)施方案，本發(fā)明的BR3結(jié)合多肽具有針對(duì)人BR3的包含殘基L38和L39的功能性表位，其中該抗體不是9.1抗體。根據(jù)一實(shí)施方案，該BR3結(jié)合多肽具有針對(duì)人BR3的包含殘基G36的功能性表位，其中該抗體不是2.1抗體。根據(jù)一實(shí)施方案，本發(fā)明的BR3結(jié)合多肽具有針對(duì)人BR3的包含殘基V29和L28的功能性表位。根據(jù)另一實(shí)施方案，該功能性表位還包含L28和V29。根據(jù)一實(shí)施方案，具有針對(duì)人BR3的包含L38、R39、P21和A22中任一殘基、任意組合或所有殘基的功能性表位的抗BR3抗體為拮抗性BR3結(jié)合抗體。根據(jù)另一實(shí)施方案，具有針對(duì)人BR3的包含G36的功能性表位的抗BR3抗體為激動(dòng)型性BR3結(jié)合抗體。
本發(fā)明提供了表2的抗體、來源于這些抗體的BR3結(jié)合抗體、以及結(jié)合BR3并具有H1、H2、H3、L1、L2或L3區(qū)的抗體，其中該H1、H2、H3、L1、L2或L3區(qū)與附圖中描述的抗體序列的任一劃線部分或與序列表中描述的CDR或高變區(qū)有至少70％同源性。根據(jù)一實(shí)施方案，本發(fā)明的抗體結(jié)合BR3并具有H1、H2和H3區(qū)，其中該H1、H2和H3區(qū)分別與表2中任一抗體的H1、H2和H3區(qū)有至少70％同源性。根據(jù)一實(shí)施方案，本發(fā)明的抗體結(jié)合BR3并具有L1、L2和L3區(qū)，其中該L1、L2和L3區(qū)分別與表2中任一抗體的L1、L2和L3區(qū)有至少70％同源性。根據(jù)一實(shí)施方案，本發(fā)明的抗體結(jié)合BR3并具有VH結(jié)構(gòu)域，其中該VH結(jié)構(gòu)域與表2中任一抗體的VH結(jié)構(gòu)域具有至少70％同源性。
本發(fā)明提供了包含H3高變區(qū)(HVR3)的人源化抗BR3抗體，該H3高變區(qū)含有殘基QVRRALDY(SEQ ID NO212)。根據(jù)另一實(shí)施方案，BR3結(jié)合抗體包含(1)含有殘基QVRRALDY(SEQ ID NO212)的H3高變區(qū)(HVR3)；和(2)含有殘基RDTSKNTF(SEQ ID NO210)的重鏈框架3區(qū)(HC-FR3)。在一實(shí)施方案中，所述BR3結(jié)合抗體還包含HVR1和HVR2，其中該HVR1和HVR2分別包含SEQ ID NO35-36中任一抗體序列的編號(hào)為26-35的殘基和編號(hào)為49-65的殘基(Kabat編號(hào))。在另一實(shí)施方案中，所述抗BR3抗體還在H1高變區(qū)(HVR1)包含殘基GFTVTAYYMS(SEQ ID NO214)和在H2高變區(qū)(HVR2)包含殘基GFIRDKANGYTTEYNPSVKG(SEQ ID NO213)。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗體還在LVR1包含殘基KSSQSLL YSSNQNNYLA(SEQ ID NO232)、在LVR2包含殘基WASTRES(SEQ ID NO233)和在LVR3包含殘基QQSQISPPT(SEQ ID NO231)。
根據(jù)另一實(shí)施方案，抗-BR3結(jié)合抗體包含(1)含有QVRRALDY(SEQ ID NO212)的H3高變區(qū)(HVR3)；(2)含有RDTSKNTL(SEQ IDNO211)的重鏈框架3區(qū)(HC-FR3)。在一實(shí)施方案中，所述BR3結(jié)合抗體包含SEQ ID NO37-73中任一抗體序列的編號(hào)為26-35和49-65的殘基(Kabat編號(hào))。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗體還在LVR1包含殘基KSSQSLLYSSNQNNYLA(SEQ ID NO232)，在LVR2包含殘基WASTRES(SEQ ID NO233)和在LVR3包含殘基QQSQISPPT(SEQ IDNO231)。
根據(jù)另一實(shí)施方案，抗-BR3結(jié)合抗體包含含有式I的L2高變區(qū)(LVR2) W-A-X3-X4-X5-X6-S(SEQ ID NO215)(式I)， 其中X3為Q或S；X4為H、I或T；X5為L或R以及X6為D或E，且其中式I不是WASTRES(SEQ ID NO233)。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗-BR3抗體還包含含有QVRRALDY(SEQ ID NO212)的H3高變區(qū)(HVR3)。根據(jù)一實(shí)施方案，所述LVR2包含選自SEQ ID NO23和25的抗體序列的編號(hào)為50-56(Kabat編號(hào))的殘基。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗體還在HVR1包含殘基GFTVTAYYMS(SEQ ID NO214)和在HVR2中包含殘基GFIRDKANGYTTEYNPSVKG(SEQ ID NO213)。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗體還在LVR1中包含殘基KSSQSLLYSSNQNNYLA(SEQ IDNO232)和在LVR3中包含殘基QQSQISPPT(SEQ ID NO231)。
根據(jù)另一實(shí)施方案，抗-BR3結(jié)合抗體包含含有式II的H1高變區(qū)(HVR1) X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Y-X9-X10(SEQ ID NO216)(式II)， 其中X1為G或D，S，A，V，E或T；X2為L，S，W，P，F(xiàn)，A，V，I，R，Y或D；X3為P，T，A，N，S，I，K，L或Q；X4為M，R，V，Y，G，E，A，T，L，W或D；X5為A，S，T，G，I，R，P，N，D，Y或H；X6為G，A，S，P或T；X7為F，H，Y，R，S，V或N；X9為T，I，M，F(xiàn)，W或V；X10為T，G，S或A，且其中式II不是GFTVTAYYMS(SEQ ID NO214)。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗體還包含含有QVRRALDY(SEQ ID NO212)的H3高變區(qū)(HVR3)。根據(jù)一實(shí)施方案，所述HVR1包含選自SEQ ID NO24、26-34、36和38-73中的抗體序列的編號(hào)為26-35(Kabat編號(hào))的殘基。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗體還在LVR2中包含殘基WASTRES(SEQ ID NO233)。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗體還在LVR1中包含殘基KSSQSLLYSSNQNNYLA(SEQ IDNO232)、在LVR2中包含殘基WASTRES(SEQ ID NO233)和在LVR3中包含殘基QQSQISPPT(SEQ ID NO231)。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗體還在HVR2中包含殘基GFIRDKANGYTTEYNPSVKG(SEQ ID NO213)。
根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明的BR3結(jié)合抗體為包含如下部分的抗體(1)含有QVRRALDY(SEQ ID NO212)的H3高變區(qū)(HVR3)和(2)選自Hu9.1-73、Hu9.1-70、Hu9.1-56、Hu9.1-51、Hu9.1-59、Hu9.1-61、Hu9.1-A、Hu9.1-B和Hu9.1-C抗體的LVR2中編號(hào)為50-56的殘基和HVR1中編號(hào)為26-35的殘基。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗體還在HVR2中包含殘基GFIRDKANGYTTEYNPSVKG(SEQ ID NO213)。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗體還在LVR1中包含殘基KSSQSLLYSSNQNNYLA(SEQ ID NO232)和在LVR3中包含殘基QQSQISPPT(SEQ ID NO231)。
本發(fā)明還提供了包含HVR3的抗-BR3抗體，其中該HVR3含有選自SEQ ID NO7-13和16-18的抗體序列中編號(hào)為94-102(Kabat編號(hào))的殘基。根據(jù)一實(shí)施方案，該抗體還包含HVR1和HVR2，該HVR1和HVR2分別含有SEQ ID NO7-13和16-18中任一抗體序列的殘基26-35和殘基49-65(Kabat編號(hào))。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗體的LVR1、LVR2和LVR3分別含有SEQ ID NO3抗體序列的殘基24-34和殘基50-56和殘基89-97(Kabat編號(hào))。
根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗-BR3包含含有SEQ ID NO22、24和26-73中任一可變重鏈序列的可變重鏈結(jié)構(gòu)域。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗-BR3包含含有SEQ ID NO21、23和25中任一可變輕鏈序列的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域。根據(jù)另一實(shí)施方案，所述抗體包含序列SEQ ID NO74。根據(jù)另一實(shí)施方案，所述抗體包含序列SEQ ID NO76，其中X為A，W，H，Y，S或F。根據(jù)一具體實(shí)施方案，所述抗體包含SEQ ID NO75序列。
本發(fā)明提供了包含HVR3的抗-BR3抗體，該HVR3包含式III X1-X2-X3-X4-X5-G-X7-MDY(SEQ ID NO218)(式III)， 其中X1為N，T或R；X2為A，S，T，L，N或P；X3為N，H或L；X4為P，Y，F(xiàn)，N，T或L；X5為Y，T或D；以及X7為A或E。根據(jù)一實(shí)施方案，式III不為TPHTYGAMDY(SEQ ID NO235)。根據(jù)一實(shí)施方案，式III為NSNFYGAMDY(SEQ ID NO219)。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗體還包含含有殘基RDTSKNTF(SEQ ID NO210)或RDTSKNTL(SEQ IDNO211)的HC-FR3。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗體的LVR1、LVR2和LVR3分別含有抗體序列SEQ ID NO3的殘基24-34、殘基50-56和殘基89-97(Kabat編號(hào))。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗體的HVR1和HVR2分別含有抗體序列SEQ ID NO4的殘基26-35和殘基49-65(Kabat編號(hào))。
此外，本發(fā)明提供了包含HVR3的抗-BR3抗體，該HVR3含有式III X1-X2-X3-X4-X5-G-X7-MDY(SEQ ID NO218)(式III)， 其中X1為N，T或R；X2為A，S，T，L，N或P；X3為N，H或L；X4為P，Y，F(xiàn)，N，T或L；X5為Y，T或D；以及X7為A或E，且所述抗體還包含含有殘基RDTSKNTF(SEQ ID NO210)或RDTSKNTL(SEQ IDNO211)的HC-FR3。根據(jù)一實(shí)施方案，當(dāng)HC-FR3包含RDTSKNTF(SEQID NO210)時(shí)，則該抗體的HVR3包含SEQ ID NO6-9和16-17中任一抗體序列的殘基94-102(Kabat編號(hào))。根據(jù)一實(shí)施方案，當(dāng)HC-FR3包含RDTSKNTL(SEQ ID NO211)時(shí)，則該抗體的HVR3包含SEQ ID NO5和10-13中任一抗體序列的殘基94-102(Kabat編號(hào))。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗體的LVR1、LVR2和LVR3分別包含SEQ ID NO3抗體序列的殘基24-34、殘基50-56和殘基89-97(Kabat編號(hào))。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗體的HVR1和HVR2分別包含SEQ ID NO4抗體序列的殘基26-35和殘基49-65(Kabat編號(hào))。
在一實(shí)施方案中，式III的序列為式IV X1-X2-X3-X4-X5-GAMDY(SEQ ID NO218)(式IV)， 其中X1為N，T或R；X2為S，T，L，N或P；X3為N或L；X4為P，Y，F(xiàn)，N或L；X5為Y或D。
根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗-BR3抗體包含含有式IV序列的HVR3和含有SEQ ID NO210序列的HC-FR3。在另一實(shí)施方案中，所述抗體包含SEQ ID NO14的輕鏈序列。另一實(shí)施方案中，所述抗體包含具有D265A/N297A(EU編號(hào))突變的Fc區(qū)。
根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗-BR3包含含有SEQ ID NO4-13和16-18中任一可變重鏈序列的可變重鏈結(jié)構(gòu)域。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗-BR3包含含有SEQ ID NO3的可變輕鏈序列的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域。根據(jù)另一實(shí)施方案，所述抗體包含SEQ ID NO14的序列。根據(jù)另一實(shí)施方案，所述抗體包含SEQ ID NO15的序列。
本發(fā)明提供了包含可變輕鏈序列SEQ ID NO77和可變重鏈序列SEQ ID NO78的抗-BR3抗體及其變體。根據(jù)一實(shí)施方案，抗-BR3抗體包含SEQ ID NO79的可變輕鏈序列。根據(jù)另一實(shí)施方案，抗-BR3抗體包含SEQ ID NO80-85中任一可變重鏈序列。根據(jù)一實(shí)施方案，抗-BR3抗體包含HVR1，該HVR1含有SEQ ID NO80或82中任一抗體序列的編號(hào)為26-35的殘基(Kabat編號(hào))。根據(jù)一實(shí)施方案，抗-BR3抗體包含HVR2，該HVR2含有SEQ ID NO80、84或85中任一抗體序列的編號(hào)為49-65的殘基(Kabat編號(hào))。根據(jù)一實(shí)施方案，抗-BR3抗體包含HVR3，該HVR3含有SEQ ED NO80、82或83中任一抗體序列的編號(hào)為94-102的殘基(Kabat編號(hào))。在另一實(shí)施方案中，所述抗-BR3抗體包含(1)含有SEQ ID NO81-85中任一抗體序列的殘基94-102(Kabat編號(hào))的HVR3和(2)含有RDTSKNTF(SEQ ED NO210)的重鏈框架3區(qū)(HC-FR3)。根據(jù)一實(shí)施方案，抗-BR3抗體包含SEQ ID NO80-85中任一抗體序列的編號(hào)為26-35、49-65和94-102的殘基。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗-BR3抗體包含LVR1，該LVR1含有SEQ ID NO79抗體序列的編號(hào)為24-34(Kabat編號(hào))的殘基。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗-BR3抗體包含LVR2，該LVR2含有SEQ ED NO79抗體序列的編號(hào)為50-56(Kabat編號(hào))的殘基。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗-BR3抗體包含LVR3，該LVR3含有SEQ ID NO79抗體序列的編號(hào)為89-97(Kabat編號(hào))的殘基。根據(jù)一實(shí)施方案，抗-BR3抗體的LVR1、LVR2和LVR3分別含有SEQ ED NO79的編號(hào)為24-34、50-56和89-97(Kabat編號(hào))的殘基。
根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗-BR3包含含有SEQ ID NO 78和80-85中任一可變重鏈序列的可變重鏈結(jié)構(gòu)域。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗-BR3包含含有SEQ ID NO77和79的可變輕鏈序列的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明提供了包含HVR3的抗-BR3抗體，該HVR3含有SEQ IDNO87-94中任一抗體序列的編號(hào)為95-102的殘基。本發(fā)明提供了包含HVR2的抗-BR3抗體，該HVR2含有SEQ ID NO 87-94，98，100，102，104，106，107，109-110，112，114，116，118，120，122，124-127，129和193中任一抗體序列的編號(hào)為49-58的殘基。本發(fā)明提供了包含HVR1的抗-BR3抗體，該HVR1含有SEQ ID NO87-94，98，100，102，104，106，107，109-110，112，114，116，118，120，122，124-127，129和193中任一抗體序列的編號(hào)為24-34的殘基。本發(fā)明提供了包含LVR1的抗-BR3抗體，該LVR1含有SEQ ED NO86，97，99，101，103，105，108，111，113，115，117，119，121，123，128和194-207中任一抗體序列的編號(hào)為24-34的殘基。本發(fā)明提供了包含LVR2的抗-BR3抗體，該LVR2含有SEQ ID NO86，97，99，101，103，105，108，111，113，115，117，119，121，123，128和194-207中任一抗體序列的編號(hào)為50-56的殘基。本發(fā)明提供了包含LVR3的抗-BR3抗體，該LVR3含有SEQ ID NO86，97，99，101，103，105，108，111，113，115，117，119，121，123，128和194-207中任一抗體序列的編號(hào)為89-97的殘基。根據(jù)一實(shí)施方案，該LVR1、LVR2和LVR3含有SEQ ED NO86，97，99，101，103，105，108，111，113，115，117，119，121，123，128和194-207中任一抗體序列的24-34、50-56和89-97殘基。根據(jù)一實(shí)施方案，該HVR1、HVR2和HVR3含有SEQ ID NO 87-94，98，100，102，104，106，107，109-110，112，114，116，118，120，122，124-127，129和193中任一抗體序列的編號(hào)為24-34、49-58和95-102的殘基。在一實(shí)施方案中，所述抗-BR3抗體包含可變重鏈結(jié)構(gòu)域，該可變重鏈結(jié)構(gòu)域含有SEQ ID NO 87-94，98，100，102，104，106，107，109-110，112，114，116，118，120，122，124-127，129和193中的任一VH序列。在一實(shí)施方案中，所述抗-BR3抗體包含可變輕鏈結(jié)構(gòu)域，該可變輕鏈結(jié)構(gòu)域含有SEQ ID NO86，97，99，101，103，105，108，111，113，115，117，119，121，123，128和194-207中的任一VL序列。
本發(fā)明提供了包含含有RVCYN-X6-LGVCAGGMDY(SEQ EDNO220)(式V)的HVR3的抗-BR3抗體，其中X6為R或H。
本發(fā)明提供了包含LVR1的抗-BR3抗體，該LVR1含有式VI RAS-X4-X5-X6-X7-X8-X9-VA(式VI)， 其中X4為Q或E；X5為D或E；X6為I或E；X7為S或A，X8為S或T以及X9為A或S。
本發(fā)明提供了包含LVR2的抗-BR3抗體，該LVR2含有式VII X1-X2-A-S-X5-L-X7-S(式VII)，其中X1為Y或F；X2為S，A或G；X5為N，F(xiàn)或Y；以及X7為F或Y。
本發(fā)明提供了包含LVR3的抗-BR3抗體，該LVR3含有式VIII Q-X2-S-X4-X5-X6-PPT(式VIII)， 其中X2為Q或H；X4為G，L，R，H，Y，Q或E；X5為N，T，M，S，A，T，I或V；以及X6為T或S。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗-BR3抗體包含含有式I、式II和式III序列的輕鏈。根據(jù)另一實(shí)施方案，所述抗-BR3抗體包含含有式I、式II和式III序列的輕鏈并包含含有式V或SEQ ID NO220序列的HVR3。
本發(fā)明提供了包含H3、H1和H2的抗-BR3結(jié)合抗體，該H3含有RVCYNRLGVCAGGMDY(SEQ ID NO221)；該H1含有殘基SGFTISSNSIH(SEQ ID NO222)，以及該H2含有AWITPSDGNTD(SEQID NO223)。在另一實(shí)施方案中，所述抗-BR3抗體包含H3、H1和H2，該H3含有RVCYNRLGVCAGGMDY(SEQ ID NO221)；該H1含有殘基SGFTISSSSIH(SEQ ID NO224)；以及該H2含有AWVLPSVGFTD(SEQID NO225)。
根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗-BR3包含可變重鏈，該可變重鏈含有SEQID NO 87-96，98，100，102，104，106，107，109-110，112，114，116，118，120，122，124-127，129和193中的任一可變重鏈序列。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗-BR3包含可變輕鏈，該可變輕鏈含有SEQ ID NO86，97，99，101，103，105，108，111，113，115，117，119，121，123，128和194-207中的任一可變輕鏈序列。
在一實(shí)施方案中，所述BR3結(jié)合抗體可競爭性抑制由保藏為3.1(ATCC Deposit PTA-6622)或12B12.1(ATCC Deposit PTA-6624)的雜交瘤產(chǎn)生的抗體與人BR3胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，所述抗體包含由保藏為3.1(ATCC Deposit PTA-6622)或12B12.1(ATCC DepositPTA-6624)的雜交瘤產(chǎn)生的抗人BR3胞外結(jié)構(gòu)域的抗體的可變區(qū)序列。在另一實(shí)施方案中，所述抗體包含由保藏為3.1(ATCC Deposit PTA-6622)或12B12.1(ATCC Deposit PTA-6624)的雜交瘤產(chǎn)生的抗體的高變區(qū)序列。在另一實(shí)施方案中，抗體是由保藏為3.1(ATCC Deposit PTA-6622)或12B12.1(ATCC Deposit PTA-6624)的雜交瘤產(chǎn)生的人源化形式的抗體。
在一實(shí)施方案中，所述BR3結(jié)合抗體可競爭性抑制由保藏為3.1(ATCC Deposit PTA-6622)或12B12.1(ATCC Deposit PTA-6624)的雜交瘤產(chǎn)生的抗體與人BR3的結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，所述抗體包含由保藏為3.1(ATCC Deposit PTA-6622)或12B12.1(ATCC Deposit PTA-6624)的雜交瘤產(chǎn)生的抗人BR3的抗體的可變區(qū)序列。在另一實(shí)施方案中，所述抗體包含由保藏為3.1(ATCC Deposit PTA-6622)或12B12.1(ATCCDeposit PTA-6624)的雜交瘤產(chǎn)生的抗體的高變區(qū)序列。在另一實(shí)施方案中，抗體是由保藏為3.1(ATCC Deposit PTA-6622)或12B12.1(ATCCDeposit PTA-6624)的雜交瘤產(chǎn)生的抗體的人源化形式。
在一實(shí)施方案中，本發(fā)明所述抗體與此處具體描述的任一種抗體結(jié)合相同的表位。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明所述抗體包含所保藏的抗體的序列。
本發(fā)明提供了具有改變的Fc效應(yīng)功能的BR3結(jié)合抗體和免疫粘附素，該Fc效應(yīng)功能例如ADCC、CDC和FcRn結(jié)合。在一實(shí)施方案中，關(guān)注與野生型人IgG1相比具有增強(qiáng)的ADCC活性的抗體和免疫粘附素。根據(jù)另一實(shí)施方案，關(guān)注與野生型人IgG1相比具有減弱的ADCC活性的抗體和免疫粘附素。根據(jù)另一實(shí)施方案，關(guān)注與野生型人IgG1相比具有增強(qiáng)的FcRn結(jié)合親和性的抗體和免疫粘附素。根據(jù)一實(shí)施方案，所述抗體或免疫粘附素在Fc區(qū)中具有選自如下位點(diǎn)的至少一個(gè)置換Fc區(qū)的238，239，246，248，249，252，254，255，256，258，265，267，268，269，270，272，276，278，280，283，285，286，289，290，292，293，294，295，296，298，301，303，305，307，309，312，315，320，322，324，326，327，329，330，331，332，333，334，335，337，338，340，360，373，376，378，382，388，389，398，414，416，419，430，434，435，437，438和439，其中Fc區(qū)中殘基的編號(hào)是基于EU編號(hào)系統(tǒng)。根據(jù)一實(shí)施方案，殘基434是選自A，W，Y，F(xiàn)和H的殘基。根據(jù)另一實(shí)施方案，所述抗體或免疫粘附素具有如下置換S298A/E333A/K334A。根據(jù)另一實(shí)施方案，所述抗體或免疫粘附素具有如下置換K332A。根據(jù)另一實(shí)施方案，所述抗體或免疫粘附素包含SEQID NO134序列，其中X為選自A，W，H，Y和F的任意氨基酸。根據(jù)另一實(shí)施方案，所述抗體或免疫粘附素具有如下置換的任意一種或其任意組合K246H、H268D、E283L、S324G、S239D和I332E。根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明的抗體或免疫粘附素至少具有如下置換D265A/N297A。
根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施方案，所述BR3結(jié)合多肽與細(xì)胞毒劑或化學(xué)治療劑偶聯(lián)(conjugated)。
根據(jù)另一實(shí)施方案，所述抗體為單克隆抗體。根據(jù)另一實(shí)施方案，所述抗體為人源化抗體。根據(jù)另一實(shí)施方案，所述抗體為人抗體。根據(jù)另一實(shí)施方案，所述抗體為嵌合抗體。根據(jù)另一實(shí)施方案，所述抗體選自Fab、Fab’、F(ab)’2、單鏈Fv(scFv)、Fv片段；雙抗體(diabody)和線狀抗體。根據(jù)另一實(shí)施方案，所述抗體為多特異性抗體，如雙特異性抗體。
還提供了包含任一前述實(shí)施方案中的抗體或多肽和載體的組合物。在一實(shí)施方案中，該載體是藥物可接受的載體。可在制品或試劑盒中提供了這些組合物。
本發(fā)明還提供了在組氨酸緩沖液中含有抗-BR3抗體的液體制劑。根據(jù)一實(shí)施方案，該緩沖液是組氨酸硫酸鹽緩沖液。根據(jù)另一實(shí)施方案，將本發(fā)明的制劑或組合物包裝為預(yù)填充注射器。
本發(fā)明還提供了編碼本文公開的任一抗體序列的分離的核酸，包括用于表達(dá)該抗體的表達(dá)載體。
本發(fā)明的另一方面提供了包含前述核酸的宿主細(xì)胞和產(chǎn)生所述抗體的宿主細(xì)胞。在后者的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。本發(fā)明提供了產(chǎn)生這些抗體的方法，該方法包括培養(yǎng)產(chǎn)生抗體的宿主細(xì)胞并從該細(xì)胞培養(yǎng)物中回收該抗體。
本發(fā)明的還一方面是包括容器和容器中所含的組合物以及包裝說明書的制品，其中該組合物包含任一前述實(shí)施方案中的抗體。根據(jù)一實(shí)施方案，該制品為包含本發(fā)明BR3結(jié)合抗體的診斷試劑盒。
本發(fā)明還提供了通過將BR3結(jié)合抗體、其多肽或功能性片段對(duì)哺乳動(dòng)物給藥來治療本發(fā)明所公開的疾病的方法，該哺乳動(dòng)物例如為接受骨髓移植的人類患者和患有諸如自身免疫性疾病、癌癥、B細(xì)胞瘤、BR3陽性癌或免疫缺陷病等疾病的人類患者。在治療自身免疫性疾病、B腫瘤或BR3陽性癌的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，待給藥的BR3結(jié)合多肽或抗體優(yōu)選為拮抗性BR3-結(jié)合抗體或多肽，或者不為激動(dòng)型BR3結(jié)合抗體或多肽。在治療免疫缺陷病的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，待使用的BR3結(jié)合抗體或多肽為本發(fā)明的激動(dòng)型BR3結(jié)合抗體或多肽。根據(jù)一實(shí)施方案，本發(fā)明的待治療的癌癥選自非何杰金氏氏淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、(包括濾泡性淋巴瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、邊緣區(qū)淋巴瘤和套細(xì)胞淋巴瘤)。
在治療自身免疫性疾病、癌癥、B細(xì)胞瘤或BR3陽性癌的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體為與本發(fā)明的9.1RF抗體相比，在pH6.0時(shí)具有增強(qiáng)的結(jié)合FcRn能力的BR3-結(jié)合抗體。在治療自身免疫性疾病、B細(xì)胞瘤或BR3陽性癌的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述BR3結(jié)合抗體為與9.1RF抗體相比，在人效應(yīng)細(xì)胞存在下具有增強(qiáng)的ADCC效應(yīng)功能的BR3-結(jié)合抗體。
在一實(shí)施方案中，所述BR3陽性癌為B細(xì)胞淋巴瘤或白血病，包括非何杰金氏氏淋巴瘤(NHL)或淋巴細(xì)胞為主型何杰金氏病(LPHD)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)或小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤(SLL)。根據(jù)另一實(shí)施方案，所述BR3陽性癌為多發(fā)性骨髓瘤。在另外的實(shí)施方案中，所述治療方法還包括對(duì)所述患者給予至少一種化學(xué)治療劑，其中對(duì)于非何杰金氏氏淋巴瘤(NHL)，所述化學(xué)治療劑選自多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松龍。
本發(fā)明還提供了治療自身免疫性疾病的方法，其包括將治療有效劑量的本發(fā)明的BR3結(jié)合抗體或多肽對(duì)患有自身免疫性疾病的患者給藥。根據(jù)一實(shí)施方案，該自身免疫性疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，包括全身性紅斑狼瘡(SLE)在內(nèi)的狼瘡，Wegener’s病，包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎在內(nèi)的炎癥性腸病，特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)，血栓性血小板減少性紫癜(TTP)，自身免疫性血小板減少癥，多發(fā)性硬化癥，銀屑病，包括IgA腎病、IgM多發(fā)性神經(jīng)病和IgG神經(jīng)病在內(nèi)的Ig神經(jīng)病，重癥肌無力，包括ANCA-相關(guān)的血管炎在內(nèi)的血管炎，糖尿病，Reynaud’s綜合征，干燥綜合征，視神經(jīng)脊髓炎(NMO)，包括副腫瘤性天皰瘡、尋常型天皰瘡和落葉性天皰瘡在內(nèi)的天皰瘡，多發(fā)性肌炎/皮肌炎和腎小球炎。當(dāng)該自身免疫性疾病為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎時(shí)，所述抗體可與另一治療劑聯(lián)合給藥。根據(jù)一實(shí)施方案，該另一治療劑為氨甲喋呤。
在這些自身免疫性疾病、B細(xì)胞瘤、BR3陽性癌的治療方法中，可將所述BR3結(jié)合抗體單獨(dú)給藥或與另一治療劑聯(lián)合給藥，該另一治療劑例如為另一抗體、另一B細(xì)胞去除劑、化學(xué)治療劑、免疫抑制劑或另一種調(diào)節(jié)人免疫應(yīng)答的生物劑(例如，生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑)。該另一抗體可以是結(jié)合CD20或不同B細(xì)胞抗原、或NK或T細(xì)胞抗原的抗體。在一實(shí)施方案中，該抗-CD20抗體選自利妥昔單抗(RITUXAN_)、m2H7(鼠2H7)、hu2H7(人源化2H7)及其所有的功能性變體、hu2H7.v16(v代表變種)、v31、v96、v114和v115(例如，參見WO 2004/056312)。在一實(shí)施方案中，該另一抗體為放射標(biāo)記的抗-CD20抗體。在其它實(shí)施方案中，該CD20結(jié)合抗體與包括毒素或放射性同位素在內(nèi)的細(xì)胞毒劑偶聯(lián)。在其它實(shí)施方案中，該第二種治療劑選自白介素(例如，IL-2、IL-12)、干擾素、氟達(dá)拉濱、環(huán)磷酰胺、靶向TNF-α的抗體(例如Enbrel_、Remicade_和Humira_)、集落刺激因子(例如，CSF、GM-CSF、G-CSF)。在另一實(shí)施方案中，該另一抗體或生物劑可以是另一種BAFF拮抗劑(例如，BR3抗體、抗BAFF抗體、TACI-Fc、BCMA-Fc和BR3-Fc)。根據(jù)一實(shí)施方案，作為用于自身免疫性疾病或癌癥的另一治療劑進(jìn)行給藥的該BAFF拮抗劑不具有ADCC活性。在另一實(shí)施方案中，該另一治療劑選自抗-VEGF抗體(例如，AvastinTM抗體)、抗-CD64抗體、抗-C32a抗體、抗CD16抗體、抗-INFα抗體、抗-CD79a抗體、抗-CD70b抗體、抗-CD52抗體、抗-CD40抗體、CTLA4-Ig、抗-CD22抗體、抗-CD23抗體、抗CD80抗體、抗HLA-DR抗體、抗-MHCII(IA)抗體、抗-IL-7抗體、抗-IL-2抗體、抗-IL-4抗體、抗-IL-21抗體和抗-IL-10抗體。B細(xì)胞去除劑的具體示例包括，但不限于前述的抗-CD20抗體、阿侖單抗(抗CD52抗體)和依帕珠單抗(Epratuzumab)或CMC-544(Wyeth)(抗CD22抗體)。在另一實(shí)施方案中，該另一治療劑為去除B細(xì)胞的小分子或IAP抑制劑。
在另一方面，本發(fā)明提供了治療自身免疫性疾病的方法，該自身免疫性疾病選自皮肌炎、Wegner’s肉芽腫病、ANCA相關(guān)的血管炎(AAV)、再生障礙性貧血、自身免疫性溶血性貧血(AIHA)或因子VIII缺乏、血友病A、自身免疫性嗜中性粒細(xì)胞減少癥、Castleman’s綜合征、Goodpasture’s綜合征、實(shí)體器官移植排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、IgM介導(dǎo)的、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、橋本氏甲狀腺炎、自身免疫性肝炎、淋巴間質(zhì)性肺炎(LIP)、閉塞性毛細(xì)支氣管炎(非移植的)vs.NSIP，格林-巴利綜合征、大血管血管炎(large vessel vasculitis)、巨細(xì)胞(Takayasu’s)動(dòng)脈炎、中等血管血管炎(medium vessel vasculitis)、川畸病、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎，該方法包括將有效量的BR3結(jié)合抗體對(duì)患有所述疾病的患者給藥。
本發(fā)明還提供了治療哺乳動(dòng)物的免疫缺陷病的方法，該方法包括將以治療有效劑量的本發(fā)明的激動(dòng)型BR3結(jié)合抗體或多肽給藥的步驟。
本發(fā)明提供了采用本發(fā)明的抗體分離BR3的方法。本發(fā)明還提供了篩選B細(xì)胞增殖抑制劑的方法，該方法包括如下步驟(a)用BR3激動(dòng)型抗體刺激B細(xì)胞；(b)給予候選化合物；以及(c)檢測BR3活性，如B細(xì)胞增殖。本發(fā)明還提供了鑒別并監(jiān)測BR3途徑的下游標(biāo)志物的方法，該方法包括如下步驟(a)用BR3激動(dòng)型抗體刺激B細(xì)胞以及(b)檢測該細(xì)胞的基因表達(dá)和/或蛋白活性的變化。
本發(fā)明還提供了診斷適于用BR3結(jié)合治療性拮抗劑治療的自身免疫性疾病或癌癥的方法，該方法包括(a)使來自測試個(gè)體的生物樣品與本發(fā)明的BR3結(jié)合抗體或多肽接觸；(b)測定該生物樣品中的BR3多肽水平；以及(c)將該生物樣品中的BR3多肽水平與BR3蛋白的標(biāo)準(zhǔn)水平進(jìn)行比較；其中與該BR3蛋白的標(biāo)準(zhǔn)水平相比，BR3蛋白的出現(xiàn)或其水平的增加表明適于用BR3結(jié)合治療劑進(jìn)行治療的自身免疫疾病或癌癥。
本發(fā)明還提供了檢測BR3多肽的方法，該方法包括如下步驟在測試樣品或個(gè)體中結(jié)合本發(fā)明的抗-BR3抗體或免疫粘附素，并將被結(jié)合的抗體或免疫粘附素與對(duì)照抗體或免疫粘附素比較。在一實(shí)施方案中，所述抗體或免疫粘附素用在選自FACS分析法、免疫組織化學(xué)測定法(IHC)和ELISA測定法的測定中。非BAFF阻斷性抗-BR3抗體具有檢測BR3是否與配體相結(jié)合的并可用于測定游離的和結(jié)合的BR3。
附圖的簡要說明

圖1顯示了根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)的2.1嫁接的抗-BR3抗體的可變區(qū)序列。黑體字母表示與人共有的III序列相比的R71A、N73T和L78A變化。劃線部分指的是包含CDR序列的區(qū)域(H1，H2，H3，L1，L2和L3)。
圖2顯示了根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)的9.1嫁接的抗-BR3抗體的可變區(qū)序列。黑體字母表示與人共有的III序列相比的R71A、N73T和L78A變化。劃線部分指的是包含CDR序列的區(qū)域(H1，H2，H3，L1，L2和L3)。
圖3顯示了根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)的11G9嫁接的抗-BR3抗體的可變區(qū)序列。劃線部分指的是包含CDR序列的區(qū)域(H1，H2，H3，L1，L2和L3)。黑體字母表示與人共有的III序列相比的R71A、N73T和L78A變化。
圖4顯示了將9.1嫁接的抗-BR3抗體的CDR區(qū)進(jìn)行軟隨機(jī)化的結(jié)果和篩選。除了在所示的L2和H1區(qū)中的殘基進(jìn)行了改變，所列抗體的可變區(qū)與該9.1嫁接的可變區(qū)序列相同。
圖5顯示了小鼠VH框架區(qū)與人”RF”和”RL”框架區(qū)的比較。
圖6顯示了與具有被修飾框架的嫁接的Fabs進(jìn)行的抗原結(jié)合。
圖7顯示了第5輪時(shí)從2.1-RL和2.1-RF CDR修復(fù)文庫中選定的序列。除了在所示的H3區(qū)中的殘基的改變以外，所列抗體的可變區(qū)與2.1-RF或2.1-RL的可變區(qū)相同。
圖8顯示了第5輪時(shí)從9.1-RL和9.1-RF CDR修復(fù)文庫中選定的序列。除了在所示的H1區(qū)中的殘基的改變以外，所列抗體的可變區(qū)與9.1-RF或9.1-RL的可變區(qū)相同。
圖9顯示了第5輪時(shí)從11G9-RF CDR修復(fù)文庫中選定的序列。除了在所示的H1、H2和H3區(qū)中的殘基的改變以外，所列抗體的可變區(qū)與11G9-RF的可變區(qū)相同。
圖10顯示了所選的抗-BR3人源化的Mab(單克隆抗體)的BIAcore分析。
圖11顯示了在溶液中與增加量的(A)含有小鼠BR3 ECD的多肽或(B)含有人BR3 ECD的多肽結(jié)合的所選的F(ab)′2噬菌體克隆的溶液結(jié)合競爭性ELISA的結(jié)果。
圖12顯示了根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)的來自噬菌體-衍生的抗-BR3抗體的氨基酸序列?！癓N”指的是在編號(hào)為95-102的殘基之間并包括該殘基的殘基數(shù)?！?”指在篩選過程中選擇的克隆次數(shù)的數(shù)字?！翱寺　敝杆付ǖ氖删w克隆數(shù)。未顯示CDR-H2的殘基I51、P52a、G55、T57。包含每一抗體的剩余的殘基(1-23、35-49、57-88和98-107)如圖15中的V3所述。“X”表示該序列是未知的。
圖13顯示了采用溶液結(jié)合競爭性ELISA的所選的F(ab)’2噬菌體的IC50值以及在BAFF存在下與mBR3或hBR3的胞外區(qū)結(jié)合的F(ab)’2噬菌體的百分比。
圖14顯示了表示在增加的BAFF濃度存在下抑制F(ab)’2噬菌體與mBR3-Fc包被的小孔相結(jié)合的ELISA分析。
圖15顯示了根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)的噬菌體-衍生的V3抗-BR3抗體的可變區(qū)序列。
圖16顯示了(A)來自V3-衍生的克隆的序列，和(B)F(ab)’2噬菌體的IC50值以及對(duì)具有雜交mBAFF的BR3的阻斷結(jié)合。未顯示LC-CDR2的殘基51(A)、52(S)和54(L)。
圖17顯示了來自V3-1衍生的克隆的殘基及其IC50值。
圖18顯示了親和性改進(jìn)的V3-46s噬菌體克隆及它們結(jié)合小鼠BR3和人BR3的噬菌體IC50值。氨基酸顯示了采用Kabat編號(hào)系統(tǒng)的SEQ IDNOS194-207的編號(hào)為27-32(“L1”)、49-55(“L2”)和88-94(“L3”)的殘基。
圖19顯示了抗-BR3 mAb與BJAB細(xì)胞的競爭性結(jié)合和直接結(jié)合。(A)BAFF競爭性結(jié)合分析。(B)直接結(jié)合分析。同種型對(duì)照顯示沒有結(jié)合，以及檢測到抗體與小鼠IgG1、IgG2a和IgG2b等效結(jié)合。
圖20顯示了使用與BJAB細(xì)胞(人BR3)(分別為圖A和圖B)和BHK細(xì)胞(鼠BR3)(分別為圖C和圖D)結(jié)合的V3-1m和B9C11進(jìn)行的競爭性結(jié)合分析和直接結(jié)合分析的結(jié)果。
圖21顯示了用于表征抗-人BR3 mAb的競爭性ELISA。該mAb是在所示濃度下，與恒定量的生物素化的mAb 9.1(圖A)、2.1(圖B)、11G9(圖C)或1E9(圖D)進(jìn)行孵育。
圖22顯示了V3-1m、B 9C11和P1B8與鼠BR3的競爭性結(jié)合。采用生物素化的V3-1m(圖A)和生物素化的B9C11(圖B)實(shí)施競爭性ELISA。
圖23顯示了抗體2.1、11G9和9.1抑制來自兩種不同供體的B細(xì)胞增殖(分別為圖A和圖B)。
圖24顯示了抗體V3-1m抑制由(A)抗IgM(5μg/ml)+BAFF(2ng/ml)或(B)抗IgM(5μg/ml)+BAFF(10ng/ml)刺激的B細(xì)胞增殖。
圖25顯示了9.1-RF阻斷BAFF-依賴性人B細(xì)胞增殖且不激發(fā)。(A)用抗IgM+BAFF+9.1-RF處理的人原始B細(xì)胞。(B)用抗IgM+9.1-RF處理的人原始B細(xì)胞。
圖26顯示了2.1-46刺激B細(xì)胞增殖。(A)用抗IgM+BAFF+2.1-46處理的細(xì)胞。(B)用抗IgM+2.1-46處理的細(xì)胞。
圖27顯示了基于鳥槍法ala-篩選(shotgun ala-scanning)結(jié)果的BR3與抗體11 G9、2.1、9.1和V3-1之間相互作用的多個(gè)點(diǎn)的示意圖。圈起來的殘基表示O-鍵連的糖基化的潛在位點(diǎn)。
圖28顯示了使用抗B細(xì)胞標(biāo)志物的抗體，在慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)患者的外周血中的B細(xì)胞群。圖A、C和D顯示了使用抗-CD19抗體以及或者抗-CD27抗體、抗-CD20抗體或者抗-CD5抗體的FACS分析。圖B為顯示BR3在惡性細(xì)胞群中表達(dá)的直方圖。方框表示該惡性細(xì)胞群。
圖29顯示了使用人源化的抗-BR3抗體以及(A)BJAB細(xì)胞、(B)Ramos細(xì)胞或(C)WIL2s細(xì)胞的ADCC活性分析的結(jié)果。
圖30顯示了在用V3-1、BR3-Fc或?qū)φ湛贵w處理7天后，在血液(圖A-C)、淋巴結(jié)(圖D-F)和脾(圖G-I)中的小鼠B細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)量分析。
圖31顯示了用V3-1、BR3-Fc或?qū)φ湛贵w處理后第1、3、7和15天時(shí)，(A)在1ml血液中所含的小鼠B細(xì)胞的的絕對(duì)數(shù)；(B)在淋巴結(jié)中的B細(xì)胞的％；(C)在脾中的濾泡B細(xì)胞(FO-CD21+CD23+)或(D)邊緣區(qū)B細(xì)胞(MZ-CD21高CD23低)的絕對(duì)數(shù)。
圖32顯示了在用對(duì)照抗體、BR3-Fc或V3-1處理后第15天時(shí)小鼠體內(nèi)的B細(xì)胞群。(A-1至A-6)處理后在小鼠的脾或淋巴集結(jié)中的B細(xì)胞群的FACS分析；(B)處理后脾中的漿母細(xì)胞的直方圖；(C)處理后淋巴集結(jié)中的生發(fā)中心細(xì)胞的直方圖。
圖33顯示了在用具有ADCC活性和BAFF阻斷能力的抗-BR3抗體、無阻斷能力的抗-BR3抗體、Fc-缺陷的突變的抗-BR3抗體或BR3-Fc處理后第6天，在BALB/c小鼠的血液(圖A)和脾(圖B)中B細(xì)胞的減少。
圖34顯示了用抗-BR3抗體、mV3-1、mBR3-Fc和對(duì)照抗體處理NZBxW F1小鼠(狼瘡性腎炎模型)的結(jié)果。(A)顯示了與對(duì)照小鼠比較，抗-BR3抗體處理的小鼠和BR3-Fc處理的小鼠的進(jìn)程的隨時(shí)間減少。(B)顯示了在用BR3-Fc(p＜0.01)、對(duì)照(p＜0.03)和mV3-1(p＜0.001)處理的小鼠中，每ml血液中的B細(xì)胞數(shù)。(C)顯示了用BR3-Fc、對(duì)照和mCB1(p＜0.00001)處理的小鼠的脾中總的B細(xì)胞數(shù)。在(B)和(C)中的水平線表示該組的平均水平。將數(shù)據(jù)表達(dá)為個(gè)體小鼠數(shù)據(jù)點(diǎn)(n＝25) 圖35顯示了用人PBMC和抗BR3抗體或mBR3-Fc處理的SCID模型小鼠中的B細(xì)胞去除(第4天)。(A)活化的/GC B細(xì)胞的百分比(CD19高/CD38int)，(B)活化的/GC B細(xì)胞的數(shù)目，(C)漿母細(xì)胞的百分比(CD19低/CD38高/CD139陰性neg)，(D)漿母細(xì)胞數(shù)以及(E)活化的/GC細(xì)胞的百分比CD19高/CD38+)。
圖36顯示了平衡時(shí)(pH6.0和pH7.4)，9.1RF(圖A)、9.1RF N434A(圖B)和9.1RF N434W(圖C)抗體與人或短尾猴FcRn的結(jié)合。Req為平衡時(shí)來自芯片的反應(yīng)單位。
圖37顯示了使用與抗-BR3抗體或Herceptin(赫賽汀)_抗體(陽性對(duì)照)結(jié)合的Fcγ受體的ELISA分析。圖AFcγRI。圖B；FcγRIIA。圖CFcγRIIB。圖DFcγRIII(F158)。圖EFcγRIII(V158)。
圖38顯示了用抗-BR3抗體(V3-1)與抗-CD20(2H7)處理后第1小時(shí)、第1天、第8天或第15天時(shí)在血液(圖A)和淋巴結(jié)(圖B)中B細(xì)胞水平的分析。
圖39顯示了用抗-BR3抗體(V3-1)與抗-CD20抗體處理后第1天、第8天和第15天時(shí)在濾泡B細(xì)胞(圖A)和邊緣區(qū)B細(xì)胞(圖B)中B細(xì)胞水平的分析。
圖40顯示了用9.1RF處理的短尾猴的血液(圖A)和組織(圖B)中的B細(xì)胞去除。數(shù)據(jù)來自ATA-猴(5只短尾猴用20mg/kg處理；3只短尾猴用2mg/kg處理)。
圖41顯示了用9.1RF或9.1RF N434W處理的短尾猴的血液中B細(xì)胞群水平隨時(shí)間的變化(A)CD20+/CD21+細(xì)胞，(B)CD21+/CD27+細(xì)胞和(C)CD21+/CD27-細(xì)胞。
發(fā)明的詳細(xì)說明 術(shù)語“BAFF”、“BAFF多肽”、“TALL-1”或“TALL-1多肽”、“BLyS”用在本文時(shí)包括“天然序列BAFF多肽”和“BAFF變體”?！癇AFF”是對(duì)由SEQ ID NO143或SEQ ID NO144中任何一種氨基酸序列編碼的多肽及其同源物、片段和變體的命名，它們具有天然序列BAFF的生物活性。BAFF的生物活性可選自促進(jìn)B細(xì)胞存活、促進(jìn)B細(xì)胞成熟、以及結(jié)合到BR3、BCMA或TACI。BAFF變體優(yōu)選與BAFF多肽的天然序列具有至少80％或直至100％之間的任何連續(xù)整數(shù)百分比的氨基酸序列一致性，包括更優(yōu)選的至少90％以及甚至更優(yōu)選的至少95％的氨基酸序列一致性?！疤烊恍蛄小盉AFF多肽包括與從天然衍生的相應(yīng)BAFF多肽的氨基酸序列相同的多肽。例如，BAFF在被furin型蛋白酶從細(xì)胞表面切割后以可溶形式存在?？蓮淖匀唤缰蟹蛛x或通過重組和/或合成的方式生產(chǎn)這些天然序列BAFF多肽。術(shù)語“天然序列BAFF多肽”特別包括該多肽的天然存在的截短的或分泌的形式(例如胞外區(qū)序列)、天然存在的變體形式(例如選擇拼接形式)和天然存在的等位變體(allelic variant)。術(shù)語“BAFF”包括描述在如下文獻(xiàn)中的多肽Shu et al.，J.Leukocyte Biol.，65680(1999)；GenBank登記號(hào)AF136293；1998年5月7日公開的WO 98/18921；1998年10月7日公開的EP 869,180；1998年6月25日公開的WO 98/27114；1999年3月18日公開的WO 99/12964；1999年7月8日公開的WO 99/33980；Moore et al.，Science，285260-263(1999)；Schneider et al.，J.Exp.Med.，1891747-1756(1999)；Mukhopadhyay et al.，J.Biol.Chem.，27415978-15981(1999)。
術(shù)語“BAFF拮抗劑”用在本文時(shí)具有最廣泛的意義，包括如下的任何分子(1)結(jié)合天然序列BAFF多肽或結(jié)合天然序列BR3多肽以部分或全部阻斷BR3與BAFF多肽的相互作用的分子，以及(2)部分或全部阻斷、抑制或消除天然序列BAFF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子。天然序列BAFF多肽信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)尤其促使B細(xì)胞存活和B細(xì)胞成熟。抑制、阻斷或消除BAFF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)尤其導(dǎo)致B細(xì)胞數(shù)量的減少。本發(fā)明的BAFF拮抗劑在體外或體內(nèi)可部分或全部阻斷、抑制或消除BAFF多肽的一種或多種生物活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物學(xué)上有活性的BAFF增強(qiáng)了如下體外或體內(nèi)事件的任何一種或任何組合增強(qiáng)B細(xì)胞存活、增加IgG和/或IgM產(chǎn)生的水平或刺激B細(xì)胞增殖。
術(shù)語“TACI拮抗劑”用在本文時(shí)具有最廣泛的意義，包括如下的任何分子(1)結(jié)合天然序列BAFF多肽或結(jié)合天然序列TACI多肽以部分或全部阻斷TACI與BAFF多肽的相互作用的分子，以及(2)部分或全部阻斷、抑制或消除天然序列BAFF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。
術(shù)語“BCMA拮抗劑”用在本文時(shí)具有最廣泛的意義，包括如下的任何分子(1)結(jié)合天然序列BAFF多肽或結(jié)合天然序列BCMA多肽以部分或全部阻斷BCMA與BAFF多肽的相互作用的分子，以及(2)部分或全部阻斷、抑制或消除天然序列BAFF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子。
如上所述，BAFF拮抗劑可在體外或體內(nèi)以直接或間接的方式部分或全部地阻斷、抑制或消除BAFF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，BAFF拮抗劑可直接結(jié)合BAFF。例如，關(guān)注這樣的抗BAFF的抗體，它在包含殘基162-275和/或選自人BAFF的162、163、206、211、231、233、264和265殘基的鄰近殘基的人BAFF區(qū)域內(nèi)結(jié)合，以致于該抗體立體阻礙了BAFF結(jié)合到BR3。在另一個(gè)實(shí)施例中，直接結(jié)合物為如下多肽其包含諸如TACI、BR3和BCMA的BAFF受體的胞外區(qū)或包含ECD的盒式最小區(qū)域(對(duì)應(yīng)于人BR3的殘基19-35)。作為選擇，BAFF拮抗劑可在體外、原位或體內(nèi)在天然序列BR3的BAFF結(jié)合區(qū)結(jié)合到其胞外區(qū)以部分或全部阻斷、抑制或消除BAFF結(jié)合到BR3。例如，這種間接拮抗劑為抗BR3的抗體，它在包含人BR3的殘基23-38或這些殘基的臨近區(qū)域的BR3區(qū)域處結(jié)合，以致于人BR3結(jié)合到BAFF上受到立體阻礙?？梢允荁AFF拮抗劑的BAFF結(jié)合Fc蛋白的其它例子可參見WO 02/66516、WO 00/40716、WO 01/87979、WO 03/024991、WO 02/16412、WO 02/38766、WO 02/092620和WO 01/12812。BAFF拮抗劑包括WO 02/24909中圖20所列出的以及WO 2003/024991和WO 02/092620中描述的BAFF結(jié)合序列、結(jié)合BAFF的這些序列的片段和包含這些序列的融合蛋白(例如Fc融合蛋白)。
術(shù)語“BR3”、“BR3多肽”或“BR3受體”用在本文時(shí)包括“天然序列BR3多肽”和“BR3變體”(這在本文有進(jìn)一步的定義)?！癇R3”是對(duì)包含SEQ ID NO145-149中任何一種的多肽及其變體或片段的命名?？蓮闹T如人組織類型或從其它來源的多種來源中分離或通過重組和/或合成的方法制備本發(fā)明的BR3多肽。術(shù)語BR3包括描述在WO02/24909和WO 03/14294中的BR3多肽。
“天然序列”BR3多肽包括與從天然衍生的相應(yīng)BR3多肽的氨基酸序列相同的多肽?？蓮淖匀唤缰蟹蛛x或通過重組和/或合成的方法生產(chǎn)這些天然序列BR3多肽。術(shù)語“天然序列BR3多肽”特別包括多肽的天然存在的截短的、可溶的或分泌的形式(例如胞外區(qū)序列)、天然存在的變體形式(例如選擇拼接形式)和天然存在的等位變體。本發(fā)明中的BR3多肽包括包含人BR31至184氨基酸殘基的連續(xù)序列的或由其組成的BR3多肽。
BR3“胞外區(qū)”或“ECD”指基本上無跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的BR3多肽形式。BR3的ECD形式包括含有BR3的氨基酸1至77、2至62、2-71、1-61、8-71、17-42、19-35或2-63中的任何一種。
“BR3變體”指與BR3 ECD的殘基19-35具有至少60％的氨基酸序列一致性并且結(jié)合天然序列BAFF多肽的BR3多肽。(參見Gordon，N.C.，et al.，(2003)Biochemistry 425977-5983)。任選的，BR3變體包括單一的半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域。這些BR3變體多肽包括，例如，在BR3多肽的全長氨基酸序列的N端和/或C端以及在一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部結(jié)構(gòu)域中增加或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。還關(guān)注結(jié)合天然序列BAFF多肽的BR3 ECD的片段。根據(jù)實(shí)施方案，BR3變體多肽與對(duì)應(yīng)于人BR3殘基19-35的部分具有至少約65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的氨基酸序列一致性。
對(duì)于人BR3多肽的殘基或其具體片斷，BR3變體多肽不包括天然BR3多肽序列。通常，BR3變體多肽的長度為至少約17個(gè)氨基酸或更長。
術(shù)語“抗體”具有最廣泛的意義，特別包括，例如，單克隆抗體、多克隆抗體、具有多表位特異性的抗體、單鏈抗體、多特異性抗體和抗體片段。根據(jù)一些實(shí)施方案，本發(fā)明中的多肽被融合進(jìn)例如可變結(jié)構(gòu)域或CDR中的抗體結(jié)構(gòu)，以致于抗體可結(jié)合并抑制BAFF結(jié)合到BR3或BAFF信號(hào)途徑。包括本發(fā)明的多肽的抗體可以是嵌合的、人源化的或人的。包括本發(fā)明的多肽的抗體可以是抗體片段。下面較為詳細(xì)地?cái)⑹隽诉@些抗體和制備它們的方法。作為選擇，可用本發(fā)明的多肽免疫動(dòng)物生產(chǎn)本發(fā)明的抗體。因此，關(guān)注直接針對(duì)本發(fā)明的多肽的抗體。
用在本文時(shí)，術(shù)語“抗BR3”和“結(jié)合BR3”可互換使用并表明了該抗體或多肽結(jié)合BR3多肽。優(yōu)選地，抗-BR3抗體結(jié)合到BR3多肽的具有選自SEQ ID NO145-149的氨基酸序列的表位，不結(jié)合到人TACI或人BCMA。優(yōu)選地，抗-BR3抗體作為Fab在25℃下的BIAcore測定中以表觀Kd值500nM或更小、100nM或更小、50nM或更小、10nM或更小、5nM或更小或1nM或更小結(jié)合人BR3胞外區(qū)序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體或多肽以0.001pM和500nM之間的表觀Kd結(jié)合到BR3。
根據(jù)本發(fā)明，“拮抗性抗BR3抗體”指結(jié)合BR3多肽并抑制BR3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如，抑制BR3相關(guān)的B細(xì)胞增殖、B細(xì)胞存活或抑制B細(xì)胞增殖和存活)的抗體。
根據(jù)本發(fā)明，“激動(dòng)型抗BR3抗體”指結(jié)合BR3多肽和刺激BR3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如，BR3相關(guān)的B細(xì)胞增殖、B細(xì)胞存活或B細(xì)胞增殖和存活)的抗體。
“CD20”抗原為具有分子量約35kD的非糖基化的、跨膜磷蛋白，它存在于外周血或淋巴器官中多于90％的B細(xì)胞表面。在前B細(xì)胞發(fā)育早期表達(dá)CD20，一直保持到漿細(xì)胞分化；在人干細(xì)胞、淋巴祖細(xì)胞或正常漿細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)CD20。CD20存在于正常B細(xì)胞和惡性B細(xì)胞中。CD20在文獻(xiàn)中的其它名稱包括“限于B淋巴細(xì)胞的分化抗原”和“Bp35”。CD20抗原描述在，例如，Clark and Ledbetter，Adv.Can.Res.5281-149(1989)和Valentine et al.J.Biol.Chem.264(19)11282-11287(1989)中。
CD20結(jié)合抗體和抗-CD20抗體在本文可互換使用，其包括以足夠的親和力結(jié)合CD20的所有抗體，以致于該抗體可用作靶向表達(dá)該抗原的細(xì)胞的治療劑，它不與諸如下文測定中的陰性對(duì)照蛋白的其它蛋白進(jìn)行顯著的交叉反應(yīng)。還關(guān)注抗體的一個(gè)臂結(jié)合CD20的雙特異性抗體。這種定義的CD20結(jié)合抗體還包括前述抗體的功能性片段。結(jié)合CD20的抗體以Kd＜10nM結(jié)合CD20。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，以Kd＜7.5nM，更優(yōu)選＜5nM，還更優(yōu)選在1-5nM之間，最優(yōu)選＜1nM結(jié)合。
結(jié)合CD20抗原的抗體的實(shí)例包括“C2B8”，現(xiàn)在稱為“利妥昔單抗”(“RITUXAN_”)(第5,736,137號(hào)美國專利，在此特別引入作為參考)；命名為“Y2B8”或“替伊莫單抗”ZEVALIN_的釔-[90]-標(biāo)記的2B8鼠抗體(第5,736,137號(hào)美國專利，在此特別引入作為參考)；鼠IgG2a“B1”，也稱作“托西莫單抗”(Beckman Coulter)，任選地用131I標(biāo)記以產(chǎn)生“131I-B1”抗體(碘I131托西莫單抗，BEXXARTM)(第5,595,721號(hào)美國專利，在此特別引入作為參考)；鼠單克隆抗體“1F5”(Press et al.Blood 69(2)584-591，1987)和包括“框架被修補(bǔ)的”或人源化1F5的變體(WO 03/002607，Leung，S.)；ATCC保藏HB-96450)；鼠2H7和嵌合2H7抗體(第5,677,180號(hào)美國專利，在此特別引入作為參考)；人源化2H7；huMax-CD20(Genmab，Denmark)；AME-133(AppliedMolecular Evolution)；A20抗體或諸如嵌合或人源化A20抗體的變體(分別為cA20和hA20)(US 2003/0219433，Immunomedics(免疫醫(yī)學(xué)))；可從International Leukocyte Typing Workshop(國際白細(xì)胞分類小組)獲得的單克隆抗體L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2(McMichael，Ed.，p.440，Oxford University Press(1987))。
術(shù)語“利妥昔單抗”或“RITUXAN_”在本文指直接針對(duì)CD20抗原的遺傳工程化的嵌合鼠/人單克隆抗體，在第5,736,137號(hào)美國專利(在此特別引入作為參考)中命名為“C2B8”，并包括保留了結(jié)合CD20能力的其片段。
在具體實(shí)施方案中，抗CD20的抗體結(jié)合人和靈長類CD20。在具體的實(shí)施方案中，結(jié)合CD20的抗體是人源化的或嵌合的。結(jié)合CD20的抗體包括利妥昔單抗(RITUXAN_)、m2H7(鼠2H7)、hu2H7(人源化2H7)和所有抗體的功能性變體，包括但不限于hu2H7.v16(v代表變種)、v31、v73、v75、缺乏海藻糖的變體、以及WO 2004/056312中描述的其它2H7變體。除非說明，本文公開的人源化2H7v.16和其變體的序列為成熟多肽，即，沒有前導(dǎo)序列。
有關(guān)CD20抗體的專利和專利出版物包括第5,776,456、5,736,137、5,843,439、6,399,061和6,682,734號(hào)美國專利，以及第US2002/0197255A1、US 2003/0021781A1、US 2003/0082172 A1、US2003/0095963 A1、US 2003/0147885 A1(Anderson et al.)號(hào)美國專利申請(qǐng)；第6,455,043B1號(hào)美國專利和WO 00/09160(Grillo-Lopez，A.)；WO 00/27428(Grillo-Lopez and White)；WO 00/27433(Grillo-Lopez andLeonard)；WO 00/44788(Braslawsky et al.)；WO 01/10462(Rastetter，W.)；WO 01/10461(Rastetter and White)；WO 01/10460(White andGrillo-Lopez)；US 2001/0018041A1、US 2003/0180292A1、WO 01/34194(Hanna and Hariharan)；第US 2002/0006404號(hào)美國專利申請(qǐng)和WO 02/04021(Hanna and Hariharan)；第US 2002/0012665A1號(hào)美國專利申請(qǐng)和WO 01/74388(Hanna，N.)；第US 2002/0058029A1號(hào)美國專利申請(qǐng)(Hanna，N.)；第US 2003/0103971A1號(hào)美國專利申請(qǐng)(Hariharanand Hanna)；第US 2002/0009444A1號(hào)美國專利申請(qǐng)和WO 01/80884(Grillo-Lopez，A.)；WO 01/97858(White，C)；第US 2002/0128488A1號(hào)美國專利申請(qǐng)和WO 02/34790(Reff，M.)；WO 02/060955(Braslawsky etal.)；WO 2/096948(Braslawsky et al.)；WO 02/079255(Reff and Davies)；第6,171,586B1號(hào)美國專利和WO 98/56418(Lam et al.)；WO 98/58964(Raju，S.)；WO 99/22764(Raju，S.)；WO 99/51642、第6,194,551B1號(hào)美國專利、第6,242,195B1號(hào)美國專利、第6,528,624B1號(hào)美國專利和第6,538,124號(hào)美國專利(Idusogie et al.)；WO 00/42072(Presta，L.)；WO 00/67796(Curd et al.)；WO 01/03734(Grillo-Lopez et al.)；第US2002/0004587A1號(hào)美國專利申請(qǐng)和WO 01/77342(Miller and Presta)；第US 2002/0197256號(hào)美國專利申請(qǐng)(Grewal，I.)；第US 2003/0157108A1號(hào)美國專利申請(qǐng)(Presta，L.)；第6,565,827B1、6,090,365B1、6,287,537B1、6,015,542、5,843,398和5,595,721號(hào)美國專利(Kaminskiet al.)；第5,500,362、5,677,180、5,721,108、6,120,767、6,652,852B1號(hào)美國專利(Robinson et al.)；第6,410,391B1號(hào)美國專利(Raubitschek etal.)；第6,224,866B1號(hào)美國專利和WO 00/20864(Barbera-Guillem，E.)；WO 01/13945(Barbera-Guillem，E.)；WO 00/67795(Goldenberg)；第US2003/0133930A1號(hào)美國專利申請(qǐng)和WO 00/74718(Goldenberg andHansen)；WO 00/76542(Golay et al.)；WO 01/72333(Wolin andRosenblatt)；第6,368,596B1號(hào)美國專利(Ghetie et al.)；第6,306,393號(hào)美國專利和第US 2002/0041847A1號(hào)美國專利申請(qǐng)(Goldenberg，D.)；第US 2003/0026801A1號(hào)美國專利申請(qǐng)(Weiner and Hartmann)；WO 02/102312(Engleman，E.)；第2003/0068664號(hào)美國專利申請(qǐng)(Albitaret al.)；WO 03/002607(Leung，S.)；WO 03/049694、US 2002/0009427A1、和US 2003/0185796A1(Wolin et al.)；WO 03/061694(Sing and Siegall)；US 2003/0219818A1(Bohen et al.)；US 2003/0219433A1和WO03/068821(Hansen et al.)；US 2003/0219818A1(Bohen et al.)；US 2002/0136719A1(Shenoy et al.)；WO 2004/032828(Wahl et al.)，在此特別引入上述所有文獻(xiàn)作為參考。還參見第5,849,898號(hào)美國專利和第330,191號(hào)歐洲專利申請(qǐng)(Seed et al.)；第4,861,579號(hào)美國專利和EP332,865A2(Meyer and Weiss)；USP 4,861,579(Meyer et al.)；WO 95/03770(Bhat et al.)；US 2003/0219433A1(Hansen et al.)。
CD20抗體可以是未修飾的抗體或偶聯(lián)到諸如放射性同位素或毒素的細(xì)胞毒性化合物上。這些抗體包括連接到放射性同位素釔-90的抗體ZevalinTM(IDEC Pharmaceuticals，San Diego，CA)和連接到I-131的BexxarTM(Corixa，WA)。人源化的2H7變體包括在FR具有氨基酸置換和在嫁接的CDR中有變化的親和成熟變體。在CDR或FR中置換的氨基酸不限于在供體或受體抗體中存在的氨基酸。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明抗-CD20抗體還包括在Fc區(qū)域的氨基酸殘基變化，其導(dǎo)致了改進(jìn)的效應(yīng)功能，包括增強(qiáng)的CDC和/或ADCC功能和B細(xì)胞致死(本文也稱作B細(xì)胞去除)。具體地，已鑒定出三種突變可改善CDC和ADCC活性S298A/E333A/K334A(本文也稱作三丙氨酸突變或變體，F(xiàn)c區(qū)域的編號(hào)依EU編號(hào)系統(tǒng)；Kabat et al.，同上)，如上述Idusogie et al.(2001)和上述Shields et al.所描述。
本發(fā)明中其它抗-CD20抗體包括具有改善穩(wěn)定性的特異變化的那些抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合抗-CD20抗體具有鼠V區(qū)和人C區(qū)。一種這樣的特異性抗-CD20抗體為Rituxan_(Rituximab_；Genentech，Inc.)。利妥昔單抗和hu2H7可通過補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)和抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)介導(dǎo)B細(xì)胞溶解。在第6,194,551B1和WO 99/51642號(hào)美國專利中描述了具有改變的Fc區(qū)氨基酸序列和增強(qiáng)的或降低的C1q結(jié)合能力的抗體變體。這些專利中的內(nèi)容在此特別引入作為參考。還見Idusogie et al.J.Immunol.1644178-4184(2000)。
凋亡抑制劑(IAP)指抑制凋亡的蛋白家族(Deveraux，et al.，(1999)Genes Dev 13(3)239-252)。IAP的實(shí)例包括黑素瘤IAP(ML-IAP)和人X染色體連鎖的IAP(XIAP)、細(xì)胞IAP1(cIAP-1)和細(xì)胞IAP2(cIAP-2)，它們抑制caspase 3、caspase 7和caspase 9的活性(Deveraux et al.，J ClinImmunol(1999)，19388-398；Deveraux et al，(1998)EMBO J.17，2215-2223；Vucic et al.，(2000)Current Bio 101359-1366)。
IAP抑制劑的實(shí)例包括直接針對(duì)XIAP、cIAP-1、cLAP-2或ML-LAP的反義寡核苷酸，Smac/DIABLO衍生的肽或阻斷IAP和其caspase相互作用的其它分子、以及抑制IAP介導(dǎo)的抑制caspase活性的分子(Sasaki et al，Cancer Res.，2000，60(20)5659；Lin et al，BiochemJ.，2001，353299；Hu et al，Clin.Cancer Res.，2003，9(7)2826；Arnt et al，J.Biol.Chem.，2002，277(46)44236；Fulda et al，Nature Med.，2002，8(8)808；Guo et al，Blood，2002，99(9)3419；Vucic et al.，J.Biol.Chem.，2002，277(14)12275；Yang et al，Cancer Res.，2003，63(4)831)；WO 2005/097791，WO 2005/094818，US 2005/0197403以及US6,673,917)。
本文中“B細(xì)胞表面標(biāo)志物”或“B細(xì)胞表面抗原”為表達(dá)在B細(xì)胞表面并可被與其結(jié)合的拮抗劑靶向的抗原。B細(xì)胞表面標(biāo)志物的實(shí)例包括但不限于CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD52、D53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86、CD180(RP105)、FcRH2(LRTA4)、CD79A、C79B、CR2、CCR6、CD72、P2X5、HLA-DOB、CXCR5(BLR1)、FCER2、BR3(aka BAFF-R)、TACI、BTLA、NAG14(aka LRRC4)、SLGC16270(ala LOC283663)、FcRH1(LRTA5)、FcRH5(LRTA2)、ATWD578(akaMGC15619)、FcRH3(LRTA3)、FcRH4(LRTA1)、FcRH6(akaLOC343413)以及BCMA(aka TNFRSF17)、HLA-DO、HLA-DrIO和II型MHC。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明中的抗體不包括保藏和表述在WO02/24909中的9.1抗體和2.1抗體。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，“表觀Kd”或“表觀Kd值”用在本文時(shí)指通過諸如進(jìn)行BIAcore_測定的表面等離子體共振(surfaceplasmon resonance)測定。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明中BR3-結(jié)合抗體的表觀Kd值通過進(jìn)行表面等離子體激元共振測定，其中，將BR3 ECD固定在傳感芯片上并使Fab形式的抗-BR3抗體流過固定了BR3 ECD的芯片，或者將IgG形式的抗-BR3抗體固定在傳感芯片上并使BR3 ECD流過固定了IgG的傳感芯片，例如，如本文實(shí)施例8所述。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，傳感芯片固定有蛋白，使得在芯片上具有約10個(gè)反應(yīng)單位(RU)的偶合蛋白。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明FcRn-結(jié)合抗體的表觀Kd值通過進(jìn)行表面等離子體激元共振測定，其中將FcRn多肽固定至傳感芯片并使抗體流過該芯片，例如，如實(shí)施例16所描述的。
根據(jù)本發(fā)明，“功能性表位”指在能量上有助于抗體結(jié)合的抗原的氨基酸殘基?？乖脑谀芰可掀鹱饔玫臍埢娜魏我环N突變(例如，通過丙氨酸突變或同源突變的野生型BR3突變)會(huì)破壞抗體結(jié)合到抗原。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可采用噬菌體展示BR3的丙氨酸突變體或其部分(例如，期望研究的區(qū)域是胞外區(qū)或殘基17-42)，通過鳥槍丙氨酸掃描法測定包含在抗BR3抗體的功能性表位中的殘基。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，可依照實(shí)施例9中描述的方法測定功能性表位。
術(shù)語“可變的”指可變結(jié)構(gòu)域的某些片斷在抗體氨基酸序列之間有很大不同?？勺儏^(qū)介導(dǎo)抗原結(jié)合并限定了特定抗體對(duì)其特定抗原的特異性。然而，可變性并不是均勻地分布在可變結(jié)構(gòu)域的110個(gè)氨基酸長度上。相反地，V結(jié)構(gòu)域包含由被稱作“高變區(qū)”的差異極大的短區(qū)域間隔的相對(duì)恒定的稱為框架區(qū)(FR)的相對(duì)恒定部分，其中每個(gè)框架區(qū)具有15-30個(gè)氨基酸，每個(gè)高變區(qū)具有9-12氨基酸。每個(gè)天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域包括四個(gè)FR，它主要采取β片層結(jié)構(gòu)，并通過三個(gè)高變區(qū)連接，它們形成環(huán)狀(loop)連接，在某些情況下形成部分β片層結(jié)構(gòu)。每條鏈的高變區(qū)通過FR緊密結(jié)合在一起，與另一條鏈的高變區(qū)一起有助于形成抗體的抗原結(jié)合部位(見，Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫上關(guān)注的蛋白序列)，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定結(jié)構(gòu)域不直接參與抗體結(jié)合抗原，但顯示了不同的效應(yīng)作用，如抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)中的抗體參與。
術(shù)語“高變區(qū)”用在本文時(shí)指負(fù)責(zé)結(jié)合抗原的抗體的氨基酸殘基。高變區(qū)通常包括“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如，在VL中的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)附近，在VH中的約31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)附近(Kabat et al.，Sequences ofProteins of Immunological Interest(免疫上關(guān)注的蛋白序列)，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或來自“高變環(huán)(hypervariable loop)”的那些殘基(例如，在VL中的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，VH中的26-32(H1)、52A-55(H2)和96-101(H3)(Chothia and Lesk J.Mol Biol.196901-917(1987))。
高變區(qū)可包括如下“延伸的高變區(qū)”VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97(L3)以及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)?？勺兘Y(jié)構(gòu)域殘基根據(jù)上述Kabat et al.對(duì)這些定義進(jìn)行編號(hào)。
“框架”或“FR”殘基指那些不同于本文所定義的高變區(qū)殘基的可變結(jié)構(gòu)域殘基。例如，輕鏈框架1(LC-FR1)、框架2(LC-FR2)、框架3(LC-FR3)、框架4(LC-FR4)區(qū)分別包含抗體的編號(hào)為1-23、35-49、57-88和98-107(Kabat編號(hào)系統(tǒng))的殘基。在另一個(gè)實(shí)例中，重鏈框架1(HC-FR1)、重鏈框架2(HC-FR2)、重鏈框架3(HC-FR3)、重鏈框架4(HC-FR4)分別包含抗體的殘基1-25、36-48、66-92和103-113(Kabat編號(hào)系統(tǒng))。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，對(duì)應(yīng)于來源于抗體9.1、2.1和11G9的抗體輕鏈CDR區(qū)的大多數(shù)殘基的殘基在圖1-3中加了下劃線。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，對(duì)應(yīng)于來源于抗體V3的抗體重鏈和輕鏈CDR區(qū)的大多數(shù)殘基的殘基在圖15中加了下劃線。
本文提到的“共有序列”或共有V結(jié)構(gòu)域序列指由比較已知的人免疫球蛋白可變區(qū)序列的氨基酸序列所得到的人工序列?；谶@些比較，制備了如下重組核酸序列其編碼與人和人H鏈亞群III V結(jié)構(gòu)域序列共有的V結(jié)構(gòu)域氨基酸。共有V序列不具有任何已知的抗體結(jié)合特異性或親和性。
術(shù)語“單克隆抗體”用在本文時(shí)指一群大體同質(zhì)抗體中的抗體，即，除了單克隆抗體生產(chǎn)過程中存在的可能的變體(這些變體通常以較小量存在)之外，構(gòu)成該群的各個(gè)抗體相同和/或結(jié)合相同表位。這些單克隆抗體通常包括包含結(jié)合靶蛋白的多肽序列的抗體，其中靶結(jié)合多肽序列通過包括如下步驟的方法獲得從多種多肽序列中選擇單一的靶結(jié)合多肽序列。例如，選擇方法可以是從諸如一群雜交瘤細(xì)胞克隆、噬菌體克隆或重組DNA克隆的多種克隆中選擇單克隆。應(yīng)當(dāng)理解，所選擇的靶結(jié)合序列還可進(jìn)一步改變，例如，為了改善對(duì)靶親和力、為了人源化靶結(jié)合序列、改善其在細(xì)胞培養(yǎng)基中的生成、減少其在體內(nèi)的免疫原性、產(chǎn)生多特異性抗體等，并且，改變了靶結(jié)合序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。與多克隆抗體制劑相比，單克隆抗體制劑中的每個(gè)單克隆抗體直接針對(duì)抗原的單一決定簇，而多克隆抗體的制劑通常包括直接針對(duì)不同決定簇(表位)的不同的抗體。除了它們的特異性外，單克隆抗體的制備具有的優(yōu)勢為它們通常不被其它免疫球蛋白所污染。修飾語“單克隆的”指從大體相似的抗體群中獲得的抗體的特性，而不應(yīng)理解為通過特定的方法生產(chǎn)所需的抗體。例如，本發(fā)明所用的單克隆抗體可通過多種方法制備，包括雜交瘤方法(例如Kohler et al.，Nature，256495(1975)；Harlow et al.，AntibodiesALaboratory Manual(抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2nd ed.1988)；Hammerling et al.，Monoclonal Antibodies andT-Cell Hybridomas(單克隆抗體和T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞)563-681，(Elsevier，N.Y.，1981)、重組DNA方法(見，例如第4,816,567號(hào)美國專利)、噬菌體展示技術(shù)(參見，例如Clackson et al.，Nature，352624-628(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)；Sidhu et al.，J.Mol.Biol.338(2)299-310(2004)；Lee et al.，J.Mol Biol.340(5)1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101(34)12467-12472(2004)；以及Lee et al.，J.Immunol.Methods 284(1-2)119-132(2004)和從具有編碼人免疫球蛋白序列的部分或全部人免疫球蛋白位點(diǎn)或基因的動(dòng)物中生產(chǎn)人或人樣抗體(參見，例如WO 98/24893、WO/9634096、WO/9633735和WO/9110741，Jakobovitset al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits et al.，Nature，362255-258(1993)；Bruggemann et al.，Year in Immuno.，733(1993)；美國專利5,545,806，5,569,825，5,591,669(都授予GenPharm)；5,545,807；WO 97/17852，美國專利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，以及Marks et al.，Bio/Technology，10779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature，368856-859(1994)；Morrison，Nature 368812-813(1994)；Fishwild et al.，Nature Biotechnology，14845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology，14826(1996)；andLonberg and Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)。
本文中單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)以及這些抗體的片段，在“嵌合”抗體中部分重鏈和輕鏈與來源于特定物種的抗體或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，而部分剩余的鏈與來源于另一物種的抗體或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，只要它們顯示了所需的生物活性(第4,816,567號(hào)美國專利；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。制備嵌合抗體的方法為本領(lǐng)域所公知。
非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式為嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗體的其它抗原結(jié)合序列)，它們包含來源于非人免疫球蛋白的最小序列。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體為人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)中的殘基被來自諸如小鼠、大鼠或兔子的非人物種(供體抗體)CDR的殘基替代，這些殘基具有期望特異性、親和力和容量。在一些實(shí)例中，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基被對(duì)應(yīng)的非人殘基替代。而且，人源化抗體可包含既不在受體抗體中也不在供體CDR中或框架序列中存在的殘基。通常為了進(jìn)一步改善和最大化抗體性能做出這些修飾。通常，人源化抗體包含至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基本上所有部分，其中所有或基本上所有高變環(huán)來源于非人免疫球蛋白，所有或基本上所有FR區(qū)來源于人免疫球蛋白序列，盡管FR區(qū)可能包括一種或多種氨基酸置換，例如，以改善結(jié)合親和力。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)R中的這些氨基酸置換的數(shù)目通常在H鏈中不大于6，在L鏈中不大于3。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，人源化抗體還包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常為人免疫球蛋白或人共有恒定序列。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)見Joneset al.，Nature，321522-525(1986)；Reichmann et al.，Nature，332323-329(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol，2593-596(1992)。人源化抗體包括PRMATIZED_抗體，其中該抗體的結(jié)合抗原區(qū)來源于例如通過用感興趣抗原免疫獼猴而產(chǎn)生的抗體。制備人源化抗體的方法為本領(lǐng)域所公知。
采用本領(lǐng)域公知的不同的方法，包括噬菌體展示文庫，也可生產(chǎn)人抗體。Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks etal.，J.Mol.Biol.，222581(1991)。Cole等人和Boerner等人的方法也適合于制備人單克隆抗體。Cole et al.，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy(單克隆抗體和癌癥治療)，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner etal.，J.Immunol，147(1)86-95(1991)。又見Lonberg and Huszar，Int.Rev.Immunol.1365-93(1995)。PCT公開號(hào)WO 98/24893、WO 92/01047、WO 96/34096、WO 96/33735；第0598877號(hào)歐洲專利；第5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、5,885,793、5,916,771和5,939,598號(hào)美國專利。
“抗體片段”包括全長抗體的一部分，通常為其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片斷；雙抗體；線狀抗體；單鏈抗體分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。
“Fv”為包含完整抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。這種片斷包括一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域以緊密、非共價(jià)連接的二聚體。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的折疊形成六個(gè)高變環(huán)(從H和L鏈各形成3個(gè)環(huán))，這有助于氨基酸殘基結(jié)合抗原以及使得對(duì)抗體有抗原結(jié)合特異性。然而，甚至單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(或僅包括特異于抗原的三個(gè)CDR的Fv的一半)就具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管與完整結(jié)合位點(diǎn)相比有較低的親和力。
本發(fā)明BR3結(jié)合抗體的“功能性片段”為保留了與衍生該片斷的全長鏈的分子大體相同的與BR3結(jié)合的親和力，并且在選自如下的至少一種測定中具有活性的片段去除B細(xì)胞、抑制B細(xì)胞增殖或抑制BAFF結(jié)合到BR3(通過諸如本文描述的那些體外或體內(nèi)測定法測定)。
抗體“效應(yīng)功能”指歸因于抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū))的那些生物活性，隨抗體的同種型不同?？贵w效應(yīng)功能的實(shí)例包括C1q結(jié)合和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性、Fc受體結(jié)合、抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、吞噬作用、下調(diào)細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體)的和B細(xì)胞活化?！疤烊恍蛄蠪c區(qū)”包含與自然界中發(fā)現(xiàn)的Fc區(qū)氨基酸序列相同的氨基酸序列。Fc序列的實(shí)例描述在SEQID NO133，135-141中，它包括天然序列人IgG1 Fc區(qū)(非A和A同種異型，分別為SEQ ID NO133和135)、天然序列人IgG2 Fc區(qū)(SEQ IDNO136)、天然序列人IgG3 Fc區(qū)(SEQ ID NO137)和天然序列人IgG4Fc區(qū)(SEQ ID NO138)以及其天然存在的變體。天然序列鼠Fc區(qū)的實(shí)例描述在SEQ ID NO139-142(分別為IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)中。
“變體Fc區(qū)”包含這樣的氨基酸序列，其與天然序列Fc區(qū)的氨基酸序列的區(qū)別在于至少一個(gè)根據(jù)本文定義的“氨基酸修飾”。優(yōu)選地，與天然序列Fc區(qū)或母體多肽的Fc區(qū)相比，變體Fc區(qū)具有至少一個(gè)氨基酸置換，例如，在天然序列Fc區(qū)或母體多肽的Fc區(qū)有約1至10個(gè)氨基酸置換，優(yōu)選約1至5個(gè)氨基酸置換。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文中變體Fc區(qū)與天然序列Fc區(qū)(例如SEQ ID NO133)有至少約80％、85％、90％、95％或99％的同源性。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本文中變體Fc區(qū)與母體多肽的Fc區(qū)有至少約80％、85％、90％、95％或99％的同源性。
就本文鑒定的多肽和抗體序列而言，“百分比(％)氨基酸序列一致性”或“同源性”定義為在把任何保守置換看作序列一致性的一部分時(shí)進(jìn)行序列比對(duì)后，與所比較多肽的氨基酸殘基相同的候選序列中的氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)。可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的不同的方法獲得為確定百分比氨基酸序列一致性目的而進(jìn)行的比對(duì)，例如，采用諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件的公眾可獲得的計(jì)算機(jī)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定用于測量比對(duì)的適合參數(shù)，包括獲得所比較序列全長最大比對(duì)所需的任何算法。然而，出于本文的目的，采用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2產(chǎn)生％氨基酸序列一致性的值。ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序由Genentech，Inc.創(chuàng)作，其源碼與用戶文件說明一起提交給美國版權(quán)局(U.S.Copyright Office，Washington D.C.，20559)，并以美國版權(quán)登記號(hào)TXU510087在美國版權(quán)局登記。公眾可從Genentech，Inc.，South San Francisco，California獲得ALIGN-2程序。ALIGN-2程序采用UNIX操作系統(tǒng)編譯，優(yōu)選數(shù)字的UNIX V4.0D。所有序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定而不加以改變。
術(shù)語“包含F(xiàn)c區(qū)的多肽”指包含F(xiàn)c區(qū)的諸如抗體或免疫附著因子(見下文定義)的多肽。Fc區(qū)的C端賴氨酸(根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)殘基447)可被除去，例如，在純化多肽過程中或通過重組設(shè)計(jì)編碼多肽的核酸。因此，包含具有本發(fā)明Fc區(qū)的多肽(包括抗體)的組合物可包括所有K447殘基被除去的多肽群、沒有除去K447殘基的多肽群或具有和沒有K447殘基的多肽混合物的多肽群。
貫穿本說明書和權(quán)利要求，當(dāng)提到可變結(jié)構(gòu)域的殘基時(shí)，通常采用Kabat編號(hào)系統(tǒng)(大概為輕鏈的殘基1-107和重鏈的殘基1-113)(例如Kabat et al.，Sequences of Immunological Interest.(免疫學(xué)關(guān)注的序列)5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。當(dāng)提到免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的殘基時(shí)，通常采用“EU編號(hào)系統(tǒng)”或“EU索引”(例如EU索引的報(bào)道見于Kabat et al.，Sequencesof Proteins of Immunological Interest(免疫上關(guān)注的蛋白的序列)，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)在此特別引入作為參考)。除非本文有其他說明，提及抗體可變結(jié)構(gòu)域的殘基編號(hào)指通過Kabat編號(hào)系統(tǒng)編號(hào)的殘基。除非本文有其他說明，提及抗體恒定結(jié)構(gòu)域的殘基編號(hào)指通過EU編號(hào)系統(tǒng)編號(hào)的殘基(例如，見第60/640,323號(hào)美國臨時(shí)申請(qǐng)，EU編號(hào)圖)。
術(shù)語“Fc受體”或“FcR”用于描述結(jié)合抗體Fc區(qū)的受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中FcR為結(jié)合IgG抗體的受體(γ受體)，它包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類受體，包括這些受體的等位變體和選擇拼接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(“活化受體”)和FcγRIIB(“抑制受體”)，它們具有相同的氨基酸序列，主要在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域處不同?；罨荏wFcγRIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含基于免疫受體酪氨酸的活化基序(motif)(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含基于免疫受體酪氨酸礎(chǔ)的抑制基序(ITIM)。(參見綜述M.in Daёron，Annu.Rev.Immunol.15203-234(1997))。該術(shù)語包括同種異型，如FcγRIIIA同種異型FcγRIIIA-Phe158、FcγRIIIA-Val158、FcγRIIA-R131和/或FcγRIIA-H131。FcR的綜述見于Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol9457-92(1991)；Capel et al.，Immunomethods 425-34(1994)；以及deHaas et al.，J.Lab.Clin.Med.126330-41(1995)。本文的術(shù)語“FcR”包括將來鑒定出的其它FcR。該術(shù)語還包括新生兒受體FcRn，它負(fù)責(zé)將母親的IgG轉(zhuǎn)移至胎兒(Guyer et al.，J.Immunol.117587(1976)以及Kim et al.，J.Immunol.24249(1994))。
術(shù)語“FcRn”指新生兒Fc受體(FcRn)。FcRn結(jié)構(gòu)上類似于主要組織相容性復(fù)合物(MHC)，它由非共價(jià)結(jié)合到β2-微球蛋白上的α鏈構(gòu)成。新生兒Fc受體FcRn的諸多功能的綜述見于Ghetie and Ward(2000)Annu.Rev.Immunol.18，739-766。FcRn在將免疫球蛋白IgG從母親被動(dòng)輸送給嬰兒的過程中起作用，并調(diào)控血清IgG水平。FcRn可作為補(bǔ)救受體起作用，在細(xì)胞內(nèi)和穿過細(xì)胞時(shí)它可結(jié)合和運(yùn)輸完整形式的攝入的IgG，從默認(rèn)的降解通路中援救出IgG。
WO 00/42072(Presta)and Shields et al.J.Biol.Chem.9(2)6591-6604(2001)描述了與FcR具有增強(qiáng)或減弱結(jié)合的抗體變體。在此特別引入這些出版的內(nèi)容作為參考。
人IgG Fc區(qū)的“CH1結(jié)構(gòu)域”(也稱作“H1”結(jié)構(gòu)域的“C1”)通常從約氨基酸118延伸至215(EU編號(hào)系統(tǒng))。
“鉸鏈區(qū)”通常定義為人IgG1的從Glu216至Pro230的一段(Burton，Molec.Immunol.22161-206(1985))?？赏ㄟ^將形成重鏈間二硫鍵的第一和最后一個(gè)半胱氨酸殘基置于相同位置，將與其它IgG同種型的鉸鏈區(qū)與IgG1序列比對(duì)。
Fc區(qū)的“低鉸鏈區(qū)(lower hinge region)”通常定義為緊接著鉸鏈區(qū)C端的殘基，即Fc區(qū)的殘基233至239。在先前的報(bào)道中，結(jié)合FcR通常歸因于IgG Fc區(qū)的低鉸鏈區(qū)的氨基酸殘基。
人IgG Fc區(qū)的“CH2結(jié)構(gòu)域”(也稱作“H2”結(jié)構(gòu)域的“C2”)通常從約氨基酸231延伸至340。CH2結(jié)構(gòu)域是獨(dú)特的，因?yàn)樗慌c其它的結(jié)構(gòu)域緊密配對(duì)。相反地，兩條N連接的分枝的糖鏈介于完整的天然IgG分子的兩個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域之間。據(jù)推測，糖類可提供結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的替代并幫助穩(wěn)定CH2結(jié)構(gòu)域。Burton，Molec.Immunol.22161-206(1985)。
“CH3結(jié)構(gòu)域”(也稱作“H3”結(jié)構(gòu)域的“C2”)包括Fc區(qū)中從CH2結(jié)構(gòu)域C端延伸的區(qū)段(即，從約氨基酸殘基341至抗體序列的C末端，該末端通常在IgG的氨基酸殘基446或447處)。
“功能性Fc區(qū)”具有天然序列Fc區(qū)的“效應(yīng)功能”。示例性的“效應(yīng)功能”包括C1q結(jié)合、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性、Fc受體結(jié)合、抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、吞噬作用、細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體，BCR)的下調(diào)等。這些效應(yīng)功能通常需要Fc區(qū)與結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如抗體可變結(jié)構(gòu)域)的聯(lián)合，并可采用如本文描述的各種分析法評(píng)估。
“C1q”為包括針對(duì)免疫球蛋白的Fc區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)的多肽。C1q與兩個(gè)絲氨酸蛋白酶C1r和C1s一起形成復(fù)合物C1，它為補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)途徑的第一個(gè)組分。人C1q可從例如Quidel，San Diego，CA購得。
術(shù)語“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”指與另一個(gè)分子結(jié)合的多肽區(qū)域。對(duì)于FcR，結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括負(fù)責(zé)結(jié)合Fc區(qū)的多肽鏈部分(例如其α鏈)。一個(gè)有用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)镕cRα鏈的胞外區(qū)。
與母體多肽或包含天然序列Fc區(qū)的多肽相比，具有有“改變的”FcR結(jié)合親和力或ADCC活性的變體IgG Fc的多肽為那些具有增加的或減少的FcR結(jié)合活性(例如FcγR或FcRn)和/或ADCC活性的多肽。
對(duì)FcR“顯示增加的結(jié)合”的變體Fc以比母體多肽或天然序列IgGFc更高的親和力(例如，較低的表觀Kd或IC50值)結(jié)合至少一個(gè)FcR。根據(jù)一些實(shí)施方案，與母體多肽相比改進(jìn)的結(jié)合為約3倍，優(yōu)選5、10、25、50、60、100、150、200、高至500倍或約25％至1000％改進(jìn)的結(jié)合。對(duì)FcR“顯示減少的結(jié)合”的多肽變體以比母體多肽更低的親和力(例如，較高的表觀Kd或較高的IC50值)結(jié)合至少一個(gè)FcR。與母體多肽相比結(jié)合的減少可為約40％或更多。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)FcR顯示減少的結(jié)合的Fc變體對(duì)FcR具有很少或沒有明顯結(jié)合，例如與天然序列IgG Fc區(qū)相比對(duì)有0-20％的結(jié)合，如本文實(shí)施例中所測定的。
“抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”或“ADCC”指一種細(xì)胞毒性形式，其中分泌的Ig結(jié)合到存在于特定細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如自然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)的Fc受體(FcR)上使得這些細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞特異地結(jié)合到攜帶抗原的靶細(xì)胞上并隨后以細(xì)胞毒素殺死靶細(xì)胞?？贵w“武裝”細(xì)胞毒性細(xì)胞且對(duì)這種殺傷是絕對(duì)需要的。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，NK細(xì)胞，僅表達(dá)FcγRIII，然而單核細(xì)胞表達(dá)FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血細(xì)胞中FcR的表達(dá)總結(jié)在Ravetch andKinet，Annu.Rev.Immunol9457-92(1991)的第464頁表3中。為了評(píng)估感興趣分子的ADCC活性，可以進(jìn)行體外ADCC測定，如第5,500,362或5,821,337號(hào)美國專利和下文實(shí)施例中所描述的。這些分析中有用的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細(xì)胞。作為選擇，或補(bǔ)充，可在體內(nèi)評(píng)估感興趣分子的ADCC活性，例如，在諸如Clynes et al.PAAS(USA)95652-656(1998)中公開的動(dòng)物模型中進(jìn)行。
當(dāng)具有變體Fc區(qū)多肽的量和具有野生型Fc區(qū)多肽或母體多肽的量在測定中基本相同時(shí)，與具有野生型IgG Fc的多肽或母體多肽相比，包含變體Fc區(qū)的多肽在體外或體內(nèi)可更有效調(diào)節(jié)ADCC，則包含變體Fc區(qū)的多肽“顯示增加的ADCC”或在存在人效應(yīng)細(xì)胞時(shí)可更有效調(diào)節(jié)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。通常采用本文公開的體外ADCC測定法鑒定這些變體，但也關(guān)注測定ADCC活性的其它測定法或方法(例如，在動(dòng)物模型中)等。在一個(gè)實(shí)施方案中，與野生型Fc(或母體多肽)相比，優(yōu)選的變體為約5倍至100倍，例如，從約25至50倍可更有效調(diào)節(jié)ADCC。
“補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性”或“CDC”指存在補(bǔ)體時(shí)溶解靶細(xì)胞。經(jīng)典補(bǔ)體途徑的活化作用從補(bǔ)體系統(tǒng)(C1q)的第一個(gè)組分結(jié)合到結(jié)合了其相關(guān)抗原的抗體(適合的亞類)上開始。為了評(píng)估補(bǔ)體活化作用，可進(jìn)行CDC測定，例如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods202163(1996)中所描述的。
在第6,194,551B1號(hào)美國專利和WO 99/51642中描述了具有改變的Fc區(qū)氨基酸序列和增加的或減少的C1q結(jié)合能力的多肽變體。在此特別引入這些專利出版的內(nèi)容作為參考。還參見Idusogie et al.J.Immunol.1644178-4184(2000)。
“人效應(yīng)細(xì)胞”為表達(dá)一種或多種FcR并且執(zhí)行效應(yīng)功能的白細(xì)胞。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，該細(xì)胞至少表達(dá)FcγRIII并且執(zhí)行ADCC效應(yīng)功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的實(shí)例包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞?？蓮淖匀粊碓粗?，例如從本文描述的血液或PBMCs中分離效應(yīng)細(xì)胞。
測定結(jié)合到FeRn的方法是公知的(參見例如Ghetie 1997，Hinton2004)，并描述在下文的實(shí)施例中。可在體內(nèi)分析對(duì)人FcRn的結(jié)合以及人FcRn高親和性結(jié)合多肽的血清半衰期，例如在表達(dá)人FcRn的轉(zhuǎn)基因老鼠或轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞系中，或在給予了Fc變體多肽的靈長類中進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有變體IgG Fc的多肽，尤其是本發(fā)明的抗體，與具有野生型IgG Fc的多肽相比，對(duì)人FcRn顯示了增加至少2倍、5倍、10倍、50倍、60倍、70倍、80倍、100倍、125倍、150倍的結(jié)合親和力。在特定的實(shí)施方案中，對(duì)人FcRn的結(jié)合親和力增加了約170倍。
對(duì)FcRn的結(jié)合親和力，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽的EC50或表觀Kd(在pH6.0)小于1μM，更優(yōu)選小于或等于100nM，更優(yōu)選小于或等于10nM。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于對(duì)FcγRIII(F158，即低親和力同種型)增加的結(jié)合親和力，EC50或表觀Kd小于或等于10nM，對(duì)FcγRIII(V158，高親和力同種型)，EC50或表觀Kd小于或等于3nM。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，如果在測試抗體和對(duì)照抗體結(jié)合曲線的中點(diǎn)處的吸收值的比率(例如A450nm(抗體)/A450nm(對(duì)照Ab))小于或等于40％，那么認(rèn)為，相對(duì)于對(duì)照抗體(例如Herceptin_抗體)，抗體結(jié)合到Fc受體的減少相對(duì)于對(duì)照抗體是顯著的。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，如果在測試抗體和對(duì)照抗體結(jié)合曲線的中點(diǎn)處的吸收值的比率(例如A450nm(抗體)/A450nm(對(duì)照Ab))大于或等于125％，那么認(rèn)為，相對(duì)于對(duì)照抗體(例如Herceptin_抗體)，抗體結(jié)合到Fc受體的增加相對(duì)于對(duì)照抗體是顯著的。參見，例如實(shí)施例16。
“母體多肽”或“母體抗體”為包含可從其產(chǎn)生變體多肽或抗體并且將該變體多肽或抗體與其進(jìn)行比較的氨基酸序列的多肽或抗體。典型的母體多肽或母體抗體缺少本文公開的一種或多種Fc區(qū)修飾，且與本文公開的多肽變體相比在效應(yīng)功能上不同。母體多肽可包含天然序列Fc區(qū)或具有預(yù)先存在的氨基酸序列修飾(如增加、刪除和/或置換)的Fc區(qū)。
“融合蛋白”和“融合多肽”指具有共價(jià)連接到一起的兩部分多肽序列的多肽。在大多數(shù)實(shí)施方案中，每個(gè)部分為通常并不天然互相結(jié)合的多肽序列和/或具有不同的特性。該特性可以是生物學(xué)特性，如體外或體內(nèi)活性。該特性也可以是簡單的化學(xué)或物理特性，如結(jié)合到靶分子、反應(yīng)中的催化作用等。兩部分可通過單一肽鍵直接連接或通過含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的肽連接物連接。通常，兩部分彼此同框連接。
“分離的”抗體或多肽為從產(chǎn)生它的環(huán)境的組分中已經(jīng)鑒定和分離和/或回收的抗體或多肽。污染組分可例如為干擾抗體診斷或治療用途的物質(zhì)，包括酶、激素和蛋白質(zhì)的或非蛋白質(zhì)的溶解物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體或多肽被純化到(1)大于如Lowry方法測定的95％抗體重量比，最優(yōu)選大于99％重量比，(2)采用旋杯式順序分析儀足以獲得N端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個(gè)殘基的程度，或(3)在還原或非還原條件下采用考馬斯藍(lán)染色，或優(yōu)選銀染的SDS-PAGE均一性。因?yàn)椴淮嬖诳贵w自然環(huán)境的至少一種組分，分離的抗體或多肽包括重組細(xì)胞內(nèi)原位抗體或多肽。然而，通常分離的抗體或多肽通過至少一個(gè)純化步驟制備。
“分離的”多肽編碼核酸或其它多肽編碼核酸為被鑒定并與至少一種污染核酸分子分離的核酸分子，該污染核酸分子通常在該多肽編碼核酸的自然來源中與其結(jié)合。分離的多肽編碼核酸分子形式上或結(jié)構(gòu)上不同于自然界中存在的核酸分子。分離的多肽編碼核酸分子因此不同于存在于天然細(xì)胞中的該特定多肽編碼核酸分子。然而，分離的多肽編碼核酸分子包括包含在通常表達(dá)所述多肽的細(xì)胞中的該多肽編碼核酸分子，例如，該核酸分子與天然細(xì)胞的在染色體位置上不同。
術(shù)語“控制序列”指在特定宿主生物體中表達(dá)可操作連接的編碼序列所需的DNA序列。適合于原核生物的控制序列，例如，包括啟動(dòng)子、任選地操縱子序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞采用啟動(dòng)子、多腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子。
當(dāng)核酸被置于與另一個(gè)核酸序列處于功能相關(guān)時(shí)，該核酸是“可操作地連接的”。例如，編碼前序列或分泌性前導(dǎo)序列的DNA被認(rèn)為是可操作地連接到編碼多肽的DNA，僅當(dāng)其表達(dá)為參與該多肽分泌的前蛋白；啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可操作地連接到編碼序列，僅當(dāng)其可影響序列的轉(zhuǎn)錄；核糖體結(jié)合位點(diǎn)可操作地連接到編碼序列，僅當(dāng)其被置于在有助于翻譯的位置。通?！翱刹僮鞯剡B接的”指連接的DNA序列是連續(xù)的，在分泌性引導(dǎo)序列的情況下，閱讀相是一致的。然而，增強(qiáng)子不必一定是連續(xù)的。通過在方便的限制性位點(diǎn)處連接實(shí)現(xiàn)該連接。如果不存在這樣的位點(diǎn)，根據(jù)常規(guī)的操作采用合成的寡核苷酸接頭或連接物。
“載體”包括穿梭載體和表達(dá)載體。通常，質(zhì)粒構(gòu)建體還包括復(fù)制起點(diǎn)(例如Co1E1復(fù)制起點(diǎn))和選擇標(biāo)記(例如氨芐青霉素或四環(huán)素抗性)，其分別用于細(xì)菌中質(zhì)粒的復(fù)制和選擇?！氨磉_(dá)載體”指包含在細(xì)菌或真核細(xì)胞中用于表達(dá)包括本發(fā)明抗體片段在內(nèi)的抗體所必須的控制序列或調(diào)控元件的載體。下文公開了適合的載體。
生產(chǎn)本發(fā)明BR3結(jié)合抗體的細(xì)胞包括已將編碼抗體的核酸引入其中的細(xì)菌和真核宿主細(xì)胞。下文公開了適合的宿主細(xì)胞。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易確定“嚴(yán)緊性”的雜交反應(yīng)，通常，它是依據(jù)探針長度、洗滌溫度和鹽濃度的經(jīng)驗(yàn)計(jì)算。通常，較長的探針需要較高溫度來正確退火，而較短的探針需要較低溫度。當(dāng)互補(bǔ)鏈在低于它們的融化溫度的環(huán)境中存在時(shí)，雜交通常取決于變性DNA再退火的能力。探針和雜交序列之間期望的同源性越高，采用的相對(duì)溫度就越高。結(jié)果，較高的相對(duì)溫度趨向使得反應(yīng)條件較嚴(yán)緊，而較低溫度則較不嚴(yán)緊。對(duì)雜交反應(yīng)嚴(yán)緊性的另外的詳細(xì)資料和說明見于Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物學(xué)現(xiàn)行規(guī)程)，Wiley Interscience Publishers，(1995)。
“嚴(yán)緊條件”或“高嚴(yán)緊條件”，如本文所定義的，通過如下進(jìn)行確定(1)洗滌時(shí)采用低離子強(qiáng)度和高溫，例如0.015 M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉，在50C；(2)在雜交過程中采用諸如甲酰胺的變性劑，例如50％(v/v)甲酰胺與0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/具有750mM氯化鈉的50mM磷酸鈉緩沖液pH 6.5，75mM檸檬酸鈉，在42C；或(3)在42C、如下溶液中過夜雜交采用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl，0.075M檸檬酸鈉)、50 mM磷酸鈉(pH6.8)、0.1％焦磷酸鈉、5×Denhardt’s溶液、超聲處理的鮭魚精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，在42C下在0.2×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中洗滌十分鐘，隨后在55C下含有EDTA的0.1×SSC中高嚴(yán)緊性洗滌十分鐘。
“中等嚴(yán)緊性條件”的鑒定描述見于Sambrook et al.，MolecularCloningA Laboratory Manual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，New YorkColdSpring Harbor Press，1989，它包括采用比上述較少嚴(yán)緊的洗滌溶液和雜交條件(例如，溫度、離子強(qiáng)度和％SDS)。中等嚴(yán)緊性雜交的實(shí)例為37℃在如下溶液中過夜孵育包括20％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15 mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml變性的剪切的鮭魚精DNA，隨后在約37-50C下1×SSC中洗滌濾膜。技術(shù)人員知道如何調(diào)節(jié)溫度、離子強(qiáng)度等以適應(yīng)諸如探針長度等的調(diào)節(jié)因素。
術(shù)語“表位標(biāo)記的”用在本文時(shí)指包含融合到“標(biāo)記多肽”的多肽的嵌合多肽。標(biāo)記多肽有足夠的殘基以提供可針對(duì)其而制備抗體的表位，而且，它足夠短以致于不干擾與它融合的多肽的活性。標(biāo)記多肽還優(yōu)選是相當(dāng)獨(dú)特的，以致于該抗體基本不與其它表位交叉反應(yīng)。適合的標(biāo)記多肽通常具有至少6個(gè)氨基酸殘基，通常在約8和50個(gè)氨基酸殘基之間(優(yōu)選在約10和20個(gè)氨基酸殘基之間)。本發(fā)明關(guān)注表位標(biāo)記的多肽和抗體。
就本發(fā)明抗-BR3多肽或抗體而言，“生物學(xué)上有活性的”和“生物學(xué)活性”和“生物學(xué)特征”指所述抗體或多肽結(jié)合BR3。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述抗體結(jié)合人BR3多肽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗BR3-多肽或抗體還具有下述活性的任何一種、任何組合或全部(1)以500nM或更小、100nM或更小、50nM或更小、10nM或更小、5nM或更小或1nM或更小的表觀Kd值結(jié)合人BR3的胞外區(qū)序列；(2)以500nM或更小、100nM或更小、50nM或更小、10nM或更小、5nM或更小或1nM或更小的表觀Kd值結(jié)合人BR3的胞外區(qū)序列和結(jié)合嚙齒類BR3的胞外區(qū)序列；(3)抑制人BR3結(jié)合人BAFF。根據(jù)抗體所期望的用途，所述抗體還包括任何一種如下活性(1)與野生型或天然序列IgG Fc相比，在存在人效應(yīng)細(xì)胞具有抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)；(2)與野生型或天然序列IgG Fc相比，在存在人效應(yīng)細(xì)胞時(shí)具有增加的ADCC或(3)與野生型或天然序列IgG Fc相比，在存在人效應(yīng)細(xì)胞時(shí)具有減少的ADCC。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的抗體以比具有野生型或天然序列IgG Fc的多肽或母體多肽更高的親和力結(jié)合人Fc新生兒受體(FcRn)。
就本發(fā)明拮抗性抗-BR3多肽或抗體而言，“生物學(xué)上有活性的”和“生物學(xué)活性”和“生物學(xué)特征”指抗體或多肽具有下述活性的任何一種、任何組合或全部(1)抑制B細(xì)胞增殖；(2)抑制B細(xì)胞存活；(3)殺死或去除體內(nèi)B細(xì)胞。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)與未用這種抗BR3抗體或多肽處理的基準(zhǔn)水平或適合的陰性對(duì)照相比時(shí)，去除B細(xì)胞至少20％。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，與野生型或天然序列IgG Fc相比，在存在人效應(yīng)細(xì)胞時(shí)拮抗性抗體具有抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)，或與野生型或天然序列IgG Fc相比，在存在人效應(yīng)細(xì)胞時(shí)該拮抗性抗體具有增加的ADCC。
就本發(fā)明激動(dòng)型抗-BR3多肽或抗體而言，“生物學(xué)上有活性的”和“生物學(xué)活性”和“生物學(xué)特征”指該抗體或多肽具有一種或兩種如下活性(1)刺激B細(xì)胞增殖和(2)刺激B細(xì)胞存活。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，與野生型或天然序列IgG Fc相比，在存在人效應(yīng)細(xì)胞時(shí)該激動(dòng)型抗體具有減弱的ADCC。
除非其他說明，本發(fā)明具體公開的氨基酸序列為連續(xù)的氨基酸序列。
例如，可采用用于保守和非保守突變的任何方法和指導(dǎo)，產(chǎn)生本文描述的本發(fā)明的多肽中變化。變化可以是置換、刪除或插入一個(gè)或多個(gè)編碼多肽的密碼子，這導(dǎo)致了多肽氨基酸序列的改變。氨基酸置換可以是用具有相似結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)特性的一種氨基酸替代另一種氨基酸的結(jié)果，如用絲氨酸替代亮氨酸，即保守的氨基酸替代。插入或刪除可任選地在約1至5個(gè)氨基酸范圍內(nèi)。通過在序列中系統(tǒng)地插入、刪除或置換氨基酸并測定所得變體的活性來確定允許的變化，其中該活性為全長或成熟天然序列顯示的活性。
術(shù)語“保守的”氨基酸置換用在本發(fā)明中時(shí)指氨基酸置換為功能上等同的氨基酸的置換。保守的氨基酸變化導(dǎo)致了所得肽的氨基酸結(jié)構(gòu)或功能的最小改變。例如，一個(gè)或多個(gè)相似極性的氨基酸作為功能上的等同物，其導(dǎo)致肽的氨基酸序列內(nèi)的沉默變化。通常，認(rèn)為組內(nèi)的置換是結(jié)構(gòu)和功能保守的。然而，技術(shù)人員知道特定殘基的作用是通過其所在的分子的三維結(jié)構(gòu)內(nèi)的環(huán)境而確定的。例如，Cys殘基可能以氧化(二硫化物)形式存在，它比還原(硫醇)形式有更小的極性。Arg側(cè)鏈的長脂肪族部分構(gòu)成了其結(jié)構(gòu)和功能作用的關(guān)鍵特征，通過非極性置換而不是其它堿性殘基置換可最好地保留這一特性。而且，會(huì)認(rèn)識(shí)到含有芳族基團(tuán)的側(cè)鏈(Trp、Tyr和Phe)可參與離子的-芳族的或“陽離子-π”相互作用。在這種情況下，一個(gè)酸性或不帶電的極性基團(tuán)置換一個(gè)這樣的側(cè)鏈可能是結(jié)構(gòu)和功能保守的。諸如Pro、Gly和Cys(二硫化物形式)的殘基對(duì)主鏈構(gòu)象有直接影響，其置換常引起結(jié)構(gòu)變形。
保守的置換包括下述基于側(cè)鏈相似性的特定置換，以下列出的示例性置換和優(yōu)選的置換。根據(jù)氨基酸側(cè)鏈特性的相似性可將其分類(在A.L. Lehninger，in Biochemistry(生物化學(xué))，second ed.，pp.73-75，Worth Publishers，New York(1975)) (1)非極性Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M) (2)不帶電的極性Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q) (3)酸性Asp(D)、Glu(E) (4)堿性Lys(K)、Arg(R)、His(H) 作為選擇，基于共同的側(cè)鏈特性可將天然存在的殘基分成如下幾組 (1)疏水的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2)中性親水的Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3)酸性的Asp、Glu； (4)堿性的His、Lys、Arg； (5)影響主鏈定向的殘基Gly、Pro； (6)芳族的Trp、Tyr、Phe。
表1 非保守的置換需要把一個(gè)這些類型中的成員換成另一種類型。還將這些置換的殘基引入保守的置換位點(diǎn)，或更優(yōu)選地，引入其余(非保守的)位點(diǎn)。
本發(fā)明范圍內(nèi)的術(shù)語“氨基酸”具有最廣泛的意義，包括天然存在的Lα-氨基酸或殘基。本文采用通用的一個(gè)和三個(gè)字母縮寫代表天然存在的氨基酸(Lehninger，A.L.，Biochemistry(生物化學(xué))，2d ed.，pp.71-92，(1975)Worth Publishers，New York)。該術(shù)語包括D-氨基酸和諸如氨基酸類似物的化學(xué)修飾的氨基酸，和通常不被整合進(jìn)蛋白質(zhì)的諸如正亮氨酸的天然存在的氨基酸，以及具有本領(lǐng)域公知的氨基酸特性的化學(xué)合成的化合物。例如，氨基酸定義包括苯丙氨酸或脯氨酸類似物或模擬物，它與天然Phe或Pro對(duì)肽化合物具有相同的構(gòu)象約束。這些類似物或模擬物在本文稱作氨基酸的“功能等同物”。Roberts andVellaccio(The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology，)(肽分析、合成、生物學(xué))Eds.Gross and Meiehofer，Vol.5 p 341，Academic Press，Inc，N.Y.1983(在此引入作為參考)列出了氨基酸的其它例子。
由本文描述的標(biāo)準(zhǔn)固相合成技術(shù)合成的肽，例如，但不限于由基因編碼的氨基酸，用于涉及氨基酸的置換。通常碰到的非遺傳密碼編碼的氨基酸包括，例如，描述在第WO 90/01940號(hào)國際申請(qǐng)中的氨基酸，以及例如2-氨基己二酸(Aad)置換Glu和Asp；2-氨基庚二酸(Apm)對(duì)Glu和Asp；2-氨基丁酸(Abu)置換Met、Leu和其它脂肪族氨基酸；2-氨基庚酸(Ahe)置換Met、Leu和其它脂肪族氨基酸；2-氨基異丁酸(Aib)置換Gly；環(huán)己基丙氨酸(Cha)置換Val和Leu和Ile；高精氨酸(Har)置換Arg和Lys；2，3-雙氨基丙酸(Dpr)置換Lys、Arg和His；N-乙基甘氨酸(EtGly)置換Gly、Pro和Ala；N-乙基谷胺酰氨(EtAsn)置換Asn和Gln；羥基賴氨酸(Hyl)置換Lys；別羥賴氨酸(AHyl)置換Lys；3-(和4)羥基脯氨酸(3Hyp，4Hyp)置換Pro、Ser和Thr；別異亮氨酸(AIIe)置換Ile、Leu和Val；-脒基苯丙氨酸置換Ala；N-甲基甘氨酸(MeGly，肌氨酸)置換Gly、Pro和Ala；N-甲基異亮氨酸(MeIle)置換Ile；正纈氨酸(Nva)置換Met和其它脂肪族氨基酸；正亮氨酸(Nle)置換Met和其它脂肪族氨基酸；鳥氨酸(Orn或Or)置換Lys、Arg和His；瓜氨酸(Cit)和甲硫氨酸亞砜(MSO)置換Thr、Asn和Gln；-甲基苯丙氨酸(MePhe)、三甲基苯丙氨酸、鹵代(F、Cl、Br和I)苯丙氨酸、三氟苯丙氨酸置換Phe。
可采用本領(lǐng)域公知的方法產(chǎn)生這些變化，如寡核苷酸介導(dǎo)的(定點(diǎn))突變、丙氨酸掃描和PCR突變。在克隆的DNA中進(jìn)行定點(diǎn)突變[Carteret al.，Nucl.Acids Res.，134331(1986)；Zoller et aL，Nucl.Acids Res.，106487(1987)]、盒式突變[Wells et al.，Gene，34315(1985)]、限制性選擇突變[Wells et al.，Philos.Trans.R.Soc.London SerA，317415(1986)]或其它公知的技術(shù)可產(chǎn)生變體DNA。
還可采用掃描氨基酸分析法沿著連續(xù)序列鑒定一個(gè)或多個(gè)氨基酸。優(yōu)選的掃描氨基酸為相對(duì)小的、中性的氨基酸。這些氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸和半胱氨酸。在這些組中丙氨酸是優(yōu)選的掃描氨基酸，因?yàn)樗チ甩?碳原子之外的側(cè)鏈且很少可能改變變體的主鏈構(gòu)象[Cunningham and Wells，Science，2441081-1085(1989)]。丙氨酸通常是優(yōu)選的還因?yàn)樗亲畛Ｒ姷陌被帷６?，?jīng)常在隱藏的和暴露的位置發(fā)現(xiàn)丙氨酸[Creighton，The Proteins(蛋白質(zhì))，(W.H.Freeman & Co.，N.Y)；Chothia，J.Mol.Biol，1501(1976)]。如果丙氨酸置換不產(chǎn)生足夠量的變體，那么可采用isoteric氨基酸。
術(shù)語“檢測”旨在包括測定有或沒有分子或定性或定量測定分子的量。因此該術(shù)語指采用本發(fā)明中的原料、組合物和方法進(jìn)行定性和定量的測定。通常，用于檢測的具體技術(shù)對(duì)本發(fā)明的實(shí)施不是關(guān)鍵的。
例如，本發(fā)明的“檢測”包括例如采用本領(lǐng)域公知的方法檢測分子是否存在、表達(dá)所述多肽的細(xì)胞數(shù)、結(jié)合到靶的分子的水平或量或結(jié)合到分子的靶的水平或量的變化；分子的生物學(xué)功能/活性(例如結(jié)合配體或受體的活性)、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(如NF-kB活化作用)、腫瘤細(xì)胞增殖、B細(xì)胞增殖或存活等)的變化。在一些實(shí)施方案中，“檢測”包括檢測分子的野生型水平(例如mRNA或多肽水平)。檢測可包括與對(duì)照相比時(shí)定量在10％和90％之間的任何值、或在30％和60％之間的任何值、或超過100％的任何值的變化(增加或減少)。檢測包括在2倍至10倍之間的任何值的變化，包括或多于例如100倍。因此，提及BR3分子可指其mRNA或蛋白質(zhì)等。
本文用到的“BR3分子”指與如下大體相同的分子BR3多肽、編碼BR3多肽的核酸分子、以及該多肽或核酸分子的異構(gòu)體、片段、類似物或變體。例如，BR3分子包括來源于哺乳動(dòng)物的BR3多肽的異構(gòu)體、片段、類似物或變體，其中，BR3分子具有結(jié)合BAFF的能力。
“BAFF分子”用在本文時(shí)指與如下大體相同的分子BAFF多肽、編碼BAFF多肽的核酸分子、以及該多肽或核酸分子的異構(gòu)體、片段、類似物或變體。例如，BAFF分子包括來源于哺乳動(dòng)物的BAFF多肽的異構(gòu)體、片段、類似物或變體，其中，BAFF分子具有結(jié)合BR3的能力。
如本文用到的，待治療的個(gè)體為哺乳動(dòng)物(例如，人、非人靈長類動(dòng)物、大鼠、小鼠、牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓等)。該個(gè)體可以是臨床患者、臨床試驗(yàn)的志愿者、試驗(yàn)動(dòng)物等。個(gè)體可能被懷疑患有癌癥或免疫疾病或具有癌癥或免疫疾病的風(fēng)險(xiǎn)，可能被診斷為癌癥或免疫疾病，或可能為確定不是癌癥的對(duì)照個(gè)體。很多癌癥和免疫疾病的診斷方法以及癌癥或免疫診斷的臨床描述在本領(lǐng)域是公知的。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明待治療的個(gè)體為人。
“治療”或“減輕”指措施，其中對(duì)象待阻止或減小(減輕)目標(biāo)病理狀況或病癥或減輕一些病癥的癥狀。需要治療的個(gè)體包括那些已有疾病的個(gè)體和那些傾向于有疾病的個(gè)體或那些需預(yù)防疾病的個(gè)體。如果接受本發(fā)明治療量的多肽或抗體后，患者表現(xiàn)出如下一種或多種的可觀察到的和/或可測量的減少或不存在，那么個(gè)體或哺乳動(dòng)物的癌癥被成功“治療”癌細(xì)胞數(shù)量減少或不存在癌細(xì)胞、腫瘤大小的減少、對(duì)癌細(xì)胞滲入周邊器官包括癌癥擴(kuò)散到軟組織和骨骼的抑制(即，某種程度上減慢，優(yōu)選停止)、腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制(即，某種程度上減慢，優(yōu)選停止)、某種程度上腫瘤生長的抑制、和/或某種程度上減輕與特定腫瘤相關(guān)的一種或多種癥狀、減少的發(fā)病率和死亡率以及生活方面質(zhì)量的改善。就本發(fā)明的多肽可阻止生長和/或殺死存在的癌細(xì)胞來說，它可能是抑制細(xì)胞生長的和/或細(xì)胞毒性的?；颊咭部筛杏X到這些跡象或癥狀的減少。
術(shù)語“治療有效量”指足以“減輕”或“治療”個(gè)體疾病或病癥的本發(fā)明多肽的量。對(duì)于癌癥，治療有效量的藥物可減少癌細(xì)胞數(shù)、減少腫瘤大小、抑制(即，某種程度上減慢，優(yōu)選停止)癌細(xì)胞滲入周邊器官、抑制(即，某種程度上減慢，優(yōu)選停止)腫瘤轉(zhuǎn)移、某種程度上抑制腫瘤生長、和/或某種程度上減輕與癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀。就該藥可阻止生長和/或殺死存在的癌細(xì)胞來說，它可能是抑制細(xì)胞生長的和/或細(xì)胞毒性的。
“慢性的”給藥指以與急性方式相反的連續(xù)方式給藥，以致于在一段時(shí)間內(nèi)維持初始的治療效果(活性)?！伴g歇的”治療不是連續(xù)的進(jìn)行而沒有中斷，而是在性質(zhì)上是周期性的。
“載體”用在本文時(shí)包括藥物可接受的載體、賦形劑、或穩(wěn)定劑，它們?cè)诓捎玫膭┝亢蜐舛葧r(shí)對(duì)接觸的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物是無毒的。藥物可接受的載體常是含水的pH緩沖液。藥物可接受的載體的實(shí)例包括諸如磷酸、檸檬酸和其他有機(jī)酸的緩沖液、包括抗壞血酸在內(nèi)的抗氧化劑；低分子量(小于約10個(gè)殘基)的多肽；諸如血清白蛋白、白明膠或免疫球蛋白的蛋白質(zhì)；諸如聚乙烯吡咯烷酮的親水聚合物；諸如甘氨酸、谷胺酰氨、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸的氨基酸；單糖、二糖、和包括葡萄糖、甘露糖或糊精在內(nèi)的其它碳水化合物；諸如EDTA的螯合劑；諸如甘露醇或山梨醇的糖醇；諸如鈉的成鹽平衡離子；和/或諸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM的非離子表面活性劑。
如本文所用到的，術(shù)語“免疫粘附因子”指抗體樣分子，其將異種蛋白(“粘附素(adhesion)”)的結(jié)合特異性與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)功能結(jié)合在一起。結(jié)構(gòu)上，免疫粘附因子包括將具有不同于抗原識(shí)別和抗體結(jié)合位點(diǎn)的期望的結(jié)合特性的氨基酸序列(即，“異種的”)與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列融合。免疫粘附因子的粘附素部分通常是至少包含受體或配體結(jié)合位點(diǎn)的連續(xù)的氨基酸序列?？蓮闹T如IgG-1、IgG-2、IgG-3、或IgG-4亞型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM的任何免疫球蛋白中獲得免疫粘附因子的免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列。例如，根據(jù)本發(fā)明有用的免疫粘附因子可以是包含多肽的BAFF結(jié)合部分或多肽的BR3結(jié)合部分的多肽(例如，融合到Fc區(qū)的去除了跨膜或胞質(zhì)序列的BAFF受體的一部分、TACI受體胞外區(qū)-Fc或BCMA胞外區(qū)-Fc或BR3胞外區(qū)-Fc)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽序列被融合到免疫球蛋白序列的恒定結(jié)構(gòu)域。
“免疫缺陷疾病”是其中免疫應(yīng)答減弱的疾病或疾病狀態(tài)(例如X連鎖的重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)、常染色體連鎖SCID、腺苷脫氨酶缺乏癥(ADA缺乏癥)、X連鎖無丙種球蛋白血癥(XLA)、布魯頓氏病、先天性無丙種球蛋白血癥、嬰兒X連鎖無丙種球蛋白血癥、獲得性無丙種球蛋白血癥、成年發(fā)病的無丙種球蛋白血癥、遲發(fā)性無丙種球蛋白血癥、異常丙種球蛋白血癥、低丙種球蛋白血癥、嬰兒期暫時(shí)性低丙種球蛋白血癥、非特異低丙種球蛋白血癥、無丙種球蛋白血癥、常見可變型免疫缺陷(CVID)(獲得性)、維-奧綜合征(WAS)、伴高IgM的X連鎖免疫缺陷、伴高IgM的非X連鎖免疫缺陷、選擇性IgA缺乏癥、IgG亞類缺乏癥(伴有或不伴有IgA缺乏)、伴有正?；蚋呙庖咔虻鞍椎目贵w缺乏癥、伴有胸腺瘤的免疫缺陷、免疫球蛋白重鏈缺失、κ鏈缺乏、B細(xì)胞淋巴細(xì)胞增生性疾病(BLPD)、選擇性IgM免疫缺陷、隱性無丙種球蛋白血癥(瑞士型)、網(wǎng)狀組織發(fā)育不全、新生兒中性粒細(xì)胞減少癥、重癥先天性白細(xì)胞減少、胸腺淋巴組織發(fā)育不全-發(fā)育不全或伴有免疫缺陷的發(fā)育不全、共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張癥毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(小腦性共濟(jì)失調(diào)、眼與皮膚的毛細(xì)血管擴(kuò)張癥和免疫缺陷)、短肢侏儒癥、X連鎖淋巴細(xì)胞增生性綜合征(XLP)、尼茲諾夫綜合征-合并免疫球蛋白的免疫缺陷、嘌呤核苷酸磷酸化酶缺乏癥(PNP)、II型MHC缺乏癥(裸淋巴細(xì)胞綜合征)和重癥聯(lián)合免疫缺陷病)、或者與免疫缺陷相關(guān)的疾病狀態(tài)、Janus相關(guān)激酶3(JAK3)缺乏癥、迪喬治綜合征(單一性T細(xì)胞缺乏癥)和相關(guān)綜合征例如唐氏綜合征、慢性皮膚粘膜念珠菌病、高IgE綜合征、慢性肉芽腫病、部分白化病和WHIM綜合征(疣、低丙種球蛋白血癥、感染和骨髓粒細(xì)胞無效增生[白細(xì)胞在增生性髓中駐留])。
本文中“自身免疫疾病”是由個(gè)體自身組織產(chǎn)生且抗個(gè)體自身組織或其共分離或表現(xiàn)的疾病或障礙或其造成的疾病狀態(tài)。自身免疫疾病或障礙的例子包括但不限于關(guān)節(jié)炎(例如急性關(guān)節(jié)炎的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、慢性炎性關(guān)節(jié)炎、變性關(guān)節(jié)炎、感染性關(guān)節(jié)炎、萊姆關(guān)節(jié)炎、增生性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、椎骨關(guān)節(jié)炎、幼年發(fā)病的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)炎、變形性關(guān)節(jié)炎、原發(fā)性慢性多關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊椎炎)；炎性過度增生性皮膚疾病，銀屑病，例如斑塊狀銀屑病、滴狀銀屑病、膿皰性銀屑病和甲銀屑病，皮炎，包括接觸性皮炎、慢性接觸性皮炎、變應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、皰疹樣皮炎和特應(yīng)性皮炎；X連鎖高IgM綜合征；蕁麻疹，例如慢性變應(yīng)性蕁麻疹和慢性特發(fā)性蕁麻疹，包括慢性自身免疫性蕁麻疹；多發(fā)性肌炎/皮肌炎；幼年皮肌炎；中毒性表皮壞死松解癥；硬皮病(包括全身性硬皮病)；硬化，例如全身性硬化、多發(fā)性硬化(MS)，例如spino-optical MS、原發(fā)性進(jìn)展性MS(PPMS)和復(fù)發(fā)-緩解型MS(RRMS)，進(jìn)展性全身性硬化、動(dòng)脈粥樣硬化、頸動(dòng)脈粥樣硬化，多發(fā)性硬化和共濟(jì)失調(diào)的硬化；炎性腸病(IBD)(例如克隆病，自身免疫介導(dǎo)的胃腸疾病，結(jié)腸炎，例如潰瘍性結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、顯微鏡性結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎、息肉狀結(jié)腸炎、壞死性小腸結(jié)腸炎和腸壁全層結(jié)腸炎(transmural colitis)和自身免疫炎性腸疾病)；壞疽性膿皮病，結(jié)節(jié)性紅斑；原發(fā)性硬化性膽管炎；鞏膜炎)；呼吸窘迫綜合征，包括成年或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)；腦膜炎；全部或部分葡萄膜的炎癥；虹膜炎；脈絡(luò)膜炎；自身免疫性血液系統(tǒng)疾??；類風(fēng)濕性脊椎炎；突發(fā)性耳聾；IgE-介導(dǎo)的疾病，例如變態(tài)反應(yīng)以及變應(yīng)性和特應(yīng)性鼻炎；腦炎，例如Rasmussen′s腦炎和邊緣性和/或腦干腦炎；葡萄膜炎，例如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽腫性葡萄膜炎、非肉芽腫性葡萄膜炎、晶體抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫葡萄膜炎；伴有或不伴有腎病綜合征的腎小球腎炎(GN)，例如慢性或急性腎小球腎炎例如原發(fā)性GN、免疫介導(dǎo)性GN、膜性GN(膜性腎病)、特發(fā)性膜性GN或特發(fā)性膜性腎病、膜性-或膜增生性GN(MPGN)，包括I型和II型和急進(jìn)性GN；變應(yīng)性疾病狀態(tài)、變應(yīng)性反應(yīng)；濕疹，包括變應(yīng)性或特應(yīng)性濕疹；哮喘，例如支氣管哮喘哮喘、支氣管哮喘和自身免疫性哮喘；涉及T細(xì)胞滲入的疾病狀態(tài)和慢性炎性反應(yīng)、慢性肺部炎性疾病；自身免疫性心肌炎；白血球粘著缺乏癥；系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)或系統(tǒng)性紅斑狼瘡(lupus erythematodes)，例如皮膚型SLE、亞急性皮膚型紅斑狼瘡、新生兒期狼瘡綜合征(NLE)、播散性紅斑狼瘡；狼瘡(包括腎炎、大腦炎、兒科的、非腎臟的、腎外的、盤狀的、脫發(fā))；幼年發(fā)病的(I型)糖尿病，包括兒科胰島素依賴型糖尿病(IDDM)，成年發(fā)病的糖尿病(II型糖尿病)，自身免疫糖尿，特發(fā)性尿崩癥，與通過細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫應(yīng)答；結(jié)核；結(jié)節(jié)??；肉芽腫病，包括淋巴瘤樣肉芽腫病、韋格納肉芽腫??；粒細(xì)胞缺乏癥；血管炎，包括脈管炎，包括大血管脈管炎(包括風(fēng)濕性多肌痛和巨細(xì)胞(高安)動(dòng)脈炎)、中血管脈管炎(包括川崎病和結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎)、顯微鏡性多動(dòng)脈炎、CNS脈管炎、壞死性、皮膚的或超敏性脈管炎、系統(tǒng)性壞死性脈管炎、和ANCA-相關(guān)脈管炎，例如Churg-Strauss脈管炎或綜合征(CSS))、顳動(dòng)脈炎；再生障礙性貧血、自身免疫性障礙性貧血、Coombs試驗(yàn)陽性貧血、戴-布貧血、溶血性貧血或免疫溶血性貧血，包括自身免疫性溶血性貧血(AJHA)、惡性貧血(anemia perniciosa)、艾迪生病、純紅細(xì)胞貧血或發(fā)育不全(PRCA)、第八因子缺乏癥、血友病A、自身免疫性中性白細(xì)胞減少癥、各類血細(xì)胞減少癥、白細(xì)胞減少癥、涉及白細(xì)胞血球滲出的疾病、CNS炎性疾??；多器官損傷綜合征，例如由敗血病、外傷或出血繼發(fā)的那些；抗原-抗體復(fù)合體介導(dǎo)的疾病、抗腎小球基底膜病、抗磷脂抗體綜合征、過敏性神經(jīng)炎、Bechet′s或貝赫切特病、Castleman′s綜合征、古德帕斯丘綜合征、Reynaud′s綜合征、舍格倫綜合征、斯-約綜合征、類天皰瘡，例如大皰性類天皰瘡和皮膚類天皰瘡，天皰瘡(包括尋常性天皰瘡、落葉性天皰瘡、天皰瘡粘膜類天皰瘡和紅斑性天皰瘡)，自身免疫性多內(nèi)分泌腺疾病、賴特爾病或綜合征、免疫復(fù)合體型腎炎、抗體介導(dǎo)的腎炎；視神經(jīng)脊髓炎；多神經(jīng)??；慢性神經(jīng)病，例如IgM多神經(jīng)病或IgM介導(dǎo)的神經(jīng)??；血小板減少(例如心肌梗死患者中發(fā)展的)，包括血栓性血小板減少性紫癜(TTP)和自身免疫或免疫介導(dǎo)的血小板減少，例如特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)，包括慢性或急性ITP；睪丸和卵巢的自身免疫性疾病，包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎；原發(fā)性甲狀腺功能減退癥，甲狀腺功能減退癥，自身免疫性內(nèi)分泌疾病，包括甲狀腺炎，例如自身免疫性甲狀腺炎，橋本病，慢性甲狀腺炎(橋本甲狀腺炎)或亞急性甲狀腺炎，自身免疫性甲狀腺疾病，特發(fā)性甲狀腺功能減退癥，Grave′s??；多腺體綜合征，例如自身免疫性多腺體綜合征(或多腺體內(nèi)分泌病綜合征)，副癌綜合征，包括神經(jīng)病學(xué)副癌綜合征，例如蘭-伊肌無力綜合征或伊-蘭綜合征、僵人綜合征；腦脊髓炎，例如變應(yīng)性腦脊髓炎或過敏腦脊髓炎和實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)；重癥肌無力，例如胸腺瘤相關(guān)的重癥肌無力、小腦變性、神經(jīng)性肌強(qiáng)直、眼陣攣或眼陣攣-肌陣攣綜合征(OMS)、和感覺神經(jīng)病變、多灶性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病、希恩綜合征；自身免疫性肝炎、慢性肝炎、狼瘡樣肝炎、巨細(xì)胞肝炎、慢性活動(dòng)性肝炎或自身免疫性慢性活動(dòng)性肝炎；淋巴細(xì)胞間質(zhì)性肺炎、閉塞性毛細(xì)支氣管炎(非移植)vs NSP、吉-巴綜合征、Berger′s病(IgA腎病)、特發(fā)性IgA腎病、線狀I(lǐng)gA皮病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肺硬化、自身免疫性腸病綜合征、Celiac病、Coeliac病、乳糜瀉(麩質(zhì)性腸病)、難治性口炎性腹瀉、特發(fā)性口炎性腹瀉、冷球蛋白血癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS；路-蓋里格氏病)、冠狀動(dòng)脈疾??；自身免疫耳病，例如自身免疫內(nèi)耳病(AIED)、自身免疫性耳聾、斜視眼陣攣-肌陣攣綜合征(OMS)；多軟骨炎，例如難治性或復(fù)發(fā)性多軟骨炎；肺泡蛋白沉積癥；淀粉樣變性；鞏膜炎；非癌性淋巴細(xì)胞增多癥、原發(fā)性淋巴細(xì)胞增多癥、其包括單克隆B細(xì)胞淋巴細(xì)胞增多癥(例如，良性單克隆γ球蛋白病和意義未明單克隆γ球蛋白病，MGUS)；周圍神經(jīng)??；副癌綜合征；離子通道病，例如癲癇、偏頭痛、心律失常、肌肉疾病、聾、瞎、周期性麻痹和CNS的離子通道病；孤獨(dú)癥；炎性肌?。痪衷钚怨?jié)段性腎小球硬化(FSGS)；內(nèi)分泌腺眼病，葡萄膜視網(wǎng)膜炎，脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎，自身免疫肝臟學(xué)病，纖維肌痛，多發(fā)性內(nèi)分泌衰竭，施密特綜合征，性腎上腺炎，胃萎縮，早老性癡呆；脫髓鞘性疾病，例如自身免疫脫髓鞘性疾病，糖尿病腎病，心肌梗死后綜合征，斑禿，CREST綜合征(鈣質(zhì)沉著、雷諾氏現(xiàn)象、食管運(yùn)動(dòng)障礙、指(趾)硬化和毛細(xì)血管擴(kuò)張)，雄性和雌性自身免疫不育，混合性結(jié)締組織病，Chagas′病，風(fēng)濕熱，習(xí)慣性流產(chǎn)，農(nóng)民肺，多形紅斑，心臟切開后綜合征，庫欣綜合征，養(yǎng)鳥者肺，變應(yīng)性肉芽腫性血管炎，良性淋巴細(xì)胞性血管炎，奧爾波特綜合征；肺泡炎，例如過敏性肺泡炎和纖維性肺泡炎；間質(zhì)性肺病，輸血反應(yīng)，麻風(fēng)，瘧疾，利什曼病，kypanosomiasis，血吸蟲病，蛔蟲病，曲霉病，Sampter’s綜合征，卡普蘭綜合征，登革熱，心內(nèi)膜炎，心肌心內(nèi)膜纖維化，彌散性間質(zhì)性肺纖維化，間質(zhì)性肺纖維化，特發(fā)性肺纖維化，囊性纖維化，眼內(nèi)炎，持久性隆起性紅斑，胎兒幼紅細(xì)胞增多病，嗜酸性筋膜炎，舒爾曼綜合征，費(fèi)爾蒂綜合征，絲蟲病，睫狀體炎，例如慢性睫狀體炎，異色性睫狀體炎，虹膜睫狀體炎，或Fuch’s睫狀體炎，過敏性紫癜，人免疫缺陷病毒(HIV)感染，?？刹《靖腥荆募〔?，阿耳茨海默病，微小病毒感染，風(fēng)疹病毒感染，接種后綜合征，先天性風(fēng)疹感染，EB病毒感染，流行性腮腺炎，埃文斯綜合征，自身免疫性生殖腺衰竭，西德納姆舞蹈病，鏈球菌感染后腎小球腎炎，血栓閉塞性脈管炎，甲狀腺毒癥，脊髓癆，脈絡(luò)膜炎，巨細(xì)胞多肌痛，內(nèi)分泌眼病，慢性過敏性肺，干燥性結(jié)角膜炎，流行性角結(jié)膜炎，特發(fā)性腎病綜合征，微小病變性腎病，良性家族性和缺血性-再灌注損傷，視網(wǎng)膜自身免疫，關(guān)節(jié)炎，支氣管炎，慢性阻塞性氣道疾病，矽肺，口瘡，口瘡性口炎，動(dòng)脈硬化疾病，無精子生成，自身免疫性溶血，伯克病，冷球蛋白血癥，迪皮特朗攣縮，endophthalmia phacoanaphylactica，過敏性腸炎，麻風(fēng)性結(jié)節(jié)性紅斑，特發(fā)性面癱，慢性疲勞綜合征，風(fēng)濕病病態(tài)，Hamman-Rich′s病，感音神經(jīng)性聾，haemoglobinuria paroxysmatica，性腺功能減退癥，局部回腸炎，白血球減少癥，傳染性單核細(xì)胞增多癥，橫斷性脊髓炎，原發(fā)性特發(fā)性粘液性水腫，腎病，交感性眼炎，肉芽腫性睪丸炎，胰腺炎，急性多脊神經(jīng)根炎，壞疽性膿皮病，奎爾萬甲狀腺炎，獲得性脾萎縮，由于抗精子抗體導(dǎo)致的不育，非-惡性胸腺瘤，白癲風(fēng)，SCID和EB病毒相關(guān)疾病，獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)，寄生蟲病，例如利什曼病，中毒性休克綜合征，食物中毒，涉及T細(xì)胞滲入的疾病狀態(tài)，白血球粘著缺乏癥，與通過細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫應(yīng)答，涉及白細(xì)胞血球滲出的疾病，多器官損傷綜合征，抗原-抗體復(fù)合體介導(dǎo)的疾病，抗腎小球基底膜病，變應(yīng)性神經(jīng)炎，自身免疫多內(nèi)分泌病，卵巢炎，原發(fā)性粘液性水腫，自身免疫萎縮性胃炎，交感性眼炎，風(fēng)濕性疾病，混合性結(jié)締組織病，腎病綜合征，胰島炎，多內(nèi)分泌衰竭，周圍神經(jīng)病，自身免疫性多腺體綜合征I型，成年發(fā)病的特發(fā)性甲狀旁腺功能減退癥(AOIH)，全禿，擴(kuò)張型心肌病，獲得性大皰性表皮松解癥(EBA)，色素沉著病，心肌炎，腎病綜合征，原發(fā)性硬化性膽管炎，化膿性或非化膿性鼻竇炎，急性或慢性鼻竇炎，篩竇炎，額竇炎，上額竇炎或蝶竇炎；嗜酸粒細(xì)胞相關(guān)疾病，例如嗜酸粒細(xì)胞增多，嗜酸粒細(xì)胞增多性肺浸潤，嗜酸粒細(xì)胞增多-肌痛綜合征，勒夫勒綜合征，慢性嗜酸粒細(xì)胞肺炎，熱帶肺嗜酸粒細(xì)胞增多癥，曲霉菌支氣管肺炎，肺曲菌球病或含有嗜酸粒細(xì)胞的肉芽腫；變態(tài)反應(yīng)，血清陰性脊柱關(guān)節(jié)炎，多種內(nèi)分泌腺的自身免疫病，硬化性膽管炎，鞏膜，鞏膜外層，慢性皮膚黏膜念珠菌病，布魯頓綜合征，嬰兒期暫時(shí)性低丙種球蛋白血癥，維-奧綜合征，共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥，與膠原疾病相關(guān)的自身免疫病，風(fēng)濕病，神經(jīng)科疾病，缺血性再灌注障礙，血壓反應(yīng)降低，血管功能不良，血管擴(kuò)張，組織損傷，心血管缺血，痛覺過敏，腦缺血和伴有血管形成的疾病，變應(yīng)性過敏性疾病，血管球性腎炎(glomerulonephritide)，再灌注損傷，心肌或其它組織的再灌注損傷，伴有急性炎性成分的皮膚病，急性化膿性腦膜炎或其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病，眼和眶的炎性疾病，粒細(xì)胞輸血相關(guān)綜合征，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的毒性，急性嚴(yán)重炎癥，慢性難治性炎癥，腎盂炎，肺硬化，糖尿病性視網(wǎng)膜病，糖尿病性大動(dòng)脈疾病，動(dòng)脈內(nèi)膜增生，胃潰瘍，心瓣炎和子宮內(nèi)膜異位。
用在本文中，“B細(xì)胞去除”指與治療前的B細(xì)胞水平相比，在藥物或抗體治療后動(dòng)物或人的B細(xì)胞水平降低?？墒褂霉囼?yàn)來測量B細(xì)胞水平，例如在實(shí)驗(yàn)實(shí)施例中描述的那些。B細(xì)胞清除可以是完全的或部分的。在一實(shí)施方案中，除去至少25％的表達(dá)BR3的B細(xì)胞。不被任一機(jī)理所限制，B細(xì)胞清除的可能機(jī)理包括ADCC、CDC、凋亡、鈣流出調(diào)節(jié)或前述的兩個(gè)或多個(gè)機(jī)理的組合。
本文中“B細(xì)胞表面標(biāo)志物”或“B細(xì)胞表面抗原”是表達(dá)在B細(xì)胞的表面的抗原。
“B細(xì)胞去除劑”指減少外周B細(xì)胞至少25％的試劑。在另一實(shí)施方案中，外周B細(xì)胞的去除為至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，B細(xì)胞去除劑特異結(jié)合白血細(xì)胞而非其它細(xì)胞類型。其它實(shí)施方案中，B細(xì)胞去除劑特異結(jié)合B細(xì)胞而非其它細(xì)胞類型。在一實(shí)施方案中，B細(xì)胞去除劑是抗體。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體是單克隆抗體。其它實(shí)施方案中，所述抗體是與化療劑或細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)的抗體。B細(xì)胞清除劑的特定例子包括但不限于前述的抗CD20抗體。
B細(xì)胞瘤包括何杰金氏病，包括淋巴細(xì)胞為主型何杰金氏病(LPHD)；非何杰金氏淋巴瘤(NHL)；濾泡中心細(xì)胞(FCC)淋巴瘤；急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)；慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)；毛細(xì)胞白血病和BR3-陽性瘤。非何杰金氏淋巴瘤包括低度惡性/濾泡何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴細(xì)胞(SL)NHL、中度惡性/濾泡NHL、中度惡性彌散性NHL、高度惡性免疫母細(xì)胞NHL，、高度惡性淋巴母細(xì)胞NHL、高度惡性小無裂細(xì)胞NHL、巨瘤癥NHL、類質(zhì)漿細(xì)胞淋巴細(xì)胞淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、AIDS相關(guān)淋巴瘤和原發(fā)性巨球蛋白血癥。還試圖對(duì)這些癌癥的復(fù)發(fā)進(jìn)行治療。LPHD是盡管經(jīng)過放療和化療治療依然傾向于經(jīng)常復(fù)發(fā)的何杰金氏病類型，并且可以被BR3陽性惡性細(xì)胞所表征。CLL是白血病的四種主要類型之一。被稱為淋巴細(xì)胞的成熟B細(xì)胞的癌癥，CLL表現(xiàn)為細(xì)胞在血液、骨髓和淋巴組織中的進(jìn)行性積蓄。慢性淋巴瘤是緩慢生長的、可治愈的疾病，其中患者在好轉(zhuǎn)和復(fù)發(fā)的多個(gè)周期后平均存活6至10年。
如本文中所用，術(shù)語“非何杰金氏淋巴瘤”或“NHL”指除何杰金氏淋巴瘤外的淋巴系統(tǒng)癌癥。通?？梢酝ㄟ^Reed-Sternberg細(xì)胞在何杰金氏淋巴瘤中存在和在非何杰金氏淋巴瘤中缺失來區(qū)分何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤。被本文中所用術(shù)語包括的非何杰金氏淋巴瘤的例子包括可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員(例如，腫瘤學(xué)家或病理學(xué)家)根據(jù)本領(lǐng)域已知的分類方案鑒別的任何例子，所述分類方案例如在Color Atlas of Clinical HematologY，Third Edition(臨床血液學(xué)的彩色圖集，第三版)；A.Victor Hoffbrand和John E.Pettit(eds.)(HarcourtPublishers Limited 2000)中描述的修定的歐洲-美國淋巴瘤(REAL)方案(特別參見圖11.57、11.58和/或11.59)。更加具體的例子包括但不限于復(fù)發(fā)性或難治性NHL、一線低度惡性NHL、III/IV期NHL、耐化療NHL、前體B急性淋巴細(xì)胞白血病和/或淋巴瘤、小淋巴細(xì)胞淋巴瘤、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病和/或幼淋巴細(xì)胞白血病和/或小淋巴細(xì)胞淋巴瘤、B細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞白血病、免疫細(xì)胞瘤和/或淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤、邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤、脾邊緣區(qū)淋巴瘤、結(jié)外邊緣區(qū)-MALT淋巴瘤、結(jié)內(nèi)邊緣區(qū)淋巴瘤、毛細(xì)胞白血病、漿細(xì)胞瘤和/或漿細(xì)胞骨髓瘤、低度惡性/濾泡淋巴瘤、中度惡性/濾泡NHL、套細(xì)胞淋巴瘤、濾泡中心型淋巴瘤(濾泡的)、中度惡彌散性NHL、彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤、侵襲性NHL(包括侵襲性一線NHL和侵襲性復(fù)發(fā)性NHL)、自體干細(xì)胞移植后復(fù)發(fā)性或難治性NHL、原發(fā)性縱隔的大B細(xì)胞淋巴瘤、原發(fā)性滲出性淋巴瘤、高度惡性免疫母細(xì)胞NHL、高度惡性原始淋巴細(xì)胞NHL、高度惡性小無裂細(xì)胞NHL、bulky disease NHL巨瘤癥NHL、伯基特淋巴瘤、前體(外周)T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病和/或淋巴瘤、成體T細(xì)胞淋巴瘤和/或白血病、T細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病和/或幼淋巴細(xì)胞白血病、大顆粒淋巴細(xì)胞白血病、蕈樣肉芽腫和/或賽澤里綜合征、結(jié)外自然殺傷細(xì)胞/T細(xì)胞(鼻型)淋巴瘤、腸病型T細(xì)胞淋巴瘤、肝脾型T細(xì)胞淋巴瘤、皮下脂膜炎樣T細(xì)胞淋巴瘤、皮膚(皮)淋巴瘤、間變性大細(xì)胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、腸道T細(xì)胞淋巴瘤、外周T細(xì)胞(非特指型)淋巴瘤和血管免疫母細(xì)胞性T細(xì)胞淋巴瘤。
術(shù)語“癌癥”和“癌癥的”指或描述哺乳動(dòng)物的生理狀態(tài)，其通常被不受調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長所表征。癌癥的離子包括但不限于癌、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。這些癌癥的更具體的例子包括鱗狀細(xì)胞癌、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和肺鱗癌)、腹膜的癌癥、肝細(xì)胞癌、胃癌(包括胃腸癌)、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝臟腫瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)和各種類型的頭頸癌，以及B細(xì)胞淋巴瘤(包括低度惡性/濾泡非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴細(xì)胞(SL)NHL、中度惡性/濾泡NHL、中度惡性彌散性NHL、高度惡性免疫母細(xì)胞NHL、高度惡性原始淋巴細(xì)胞NHL、高度惡性小無裂細(xì)胞NHL、bulky disease NHL；套細(xì)胞淋巴瘤、AIDS相關(guān)淋巴瘤、和原發(fā)性巨球蛋白血癥)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、毛細(xì)胞白血病、慢性原始粒細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤和移植后淋巴增生性疾病(PTLD)。依照一優(yōu)選實(shí)施方案，所述癌癥包括在其表面表達(dá)BR3多肽的腫瘤(BR3-陽性)。依照另一實(shí)施方案，所述表達(dá)BR3的癌癥是CLL癌癥。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗BR3抗體和多肽被用于治療選自下列的任何一種或多種疾病非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、淋巴細(xì)胞為主型何杰金氏病(LPHD)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、小淋巴細(xì)胞淋巴瘤(SLL)、彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡淋巴瘤，它們?yōu)榉呛谓芙鹗狭馨土?NHL)的類型，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和幼年風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)包括狼瘡性腎炎、Wegener′s病、炎性腸疾病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板減少、多發(fā)性硬化、銀屑病、IgA腎病、IgM多神經(jīng)病、重癥肌無力、脈管炎、糖尿病、Reynaud’s綜合征、Sjorgen’s綜合征、血管球性腎炎和多發(fā)性骨髓瘤。
本文中所用術(shù)語“細(xì)胞毒性劑”指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或造成細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語旨在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、Bi213、P32，以及Lu的放射性同位素)、化療劑和毒素，例如小分子毒素或細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體。根據(jù)一實(shí)施方案，所述細(xì)胞毒性劑能夠被內(nèi)化。根據(jù)另一實(shí)施方案，細(xì)胞毒性劑的活性部分為1100kD或更小。根據(jù)一實(shí)施方案，化療劑選自甲氨蝶呤、鹽酸阿霉素、長春堿類(長春新堿、長春堿、依托泊苷)、多柔比星、左旋溶肉瘤素、絲裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔紅霉素或其它插入試劑、酶及其片段，例如核溶解酶、抗生素和毒素，例如小分子毒素或細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來源的酶活性毒素，例如單甲基auristatin(MMAE)，包括其片段和/或變體，以及下文公開的多種抗腫瘤或抗癌劑或生長抑制劑。下文描述其它細(xì)胞毒性劑。
“化療劑”是在治療癌癥中有用的化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎?，例如硫替派和CYTOXAN_環(huán)磷酰胺；烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如卡波醌、meturedopa和uredopa；氮丙啶和methylamelamine類，包括六甲蜜胺、三亞胺嗪、三亞乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亞乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和trimethylolomelamine；己酸配質(zhì)(acetogenin)(特別是布拉他辛和bullatacinone)；喜樹堿(包括合成類似物托泊替康)；苔蘚抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多來新、卡折來新和比折來新合成類似物)；念珠藻環(huán)肽類(cryptophycin)(特別是念珠藻環(huán)肽1和念珠藻環(huán)肽8)；多拉司他??；苯并二毗咯類抗生素(duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、氮芥、鹽酸氧氮芥、美法侖、新氮芥、苯芥膽甾醇、潑尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；硝脲，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫斯汀、尼莫斯汀和雷莫斯??；抗生素，例如烯二炔抗生素類(例如刺孢霉素，特別是刺孢霉素γ1I和刺孢霉素ω1I(參見，例如Agnew，Chem Intl.Ed.Engl.，33183-186(1994))；蒽環(huán)類抗生素，包括蒽環(huán)類抗生素A；二膦酸鹽，例如clodronate氯膦酸鹽；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素發(fā)色團(tuán)和相關(guān)的色蛋白enediyne烯二炔抗生素發(fā)色團(tuán))、阿克拉霉素、放線菌素、authramycin、重氮絲氨酸、爭光霉素、線菌素C、carabicin、洋紅霉素、嗜癌酶素/chromomycinis、放線菌素D、柔紅霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN_阿霉素(包括嗎啉代阿霉素、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯啉并-阿霉素和脫氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、伊達(dá)比星、麻西羅霉素、絲裂霉素例如絲裂霉素C、霉酚酸、諾拉霉素、橄欖霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌羅霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑菌素、鏈佐星、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他汀、佐柔比星；抗代謝物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，例如二甲葉酸、甲氨蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物，例如氟達(dá)拉濱、6-巰嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷；雄激素，例如卡普睪酮、丙酸甲雄烷酮、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酪；以及腎上腺素，例如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補(bǔ)充物，例如frolinic acid；醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安啶；bestrabucil；比生群；依達(dá)曲沙；defofamine；秋水仙胺；地 醌；elfornithine；依利醋銨；埃博霉素；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；lentinan磨茹多糖；氯尼達(dá)明；美登素類化合物(maytansinoids)，例如美登素和安絲菌素；米托胍腙；米托蒽醌；mopidanmol；nitraerine；噴司他?。坏鞍钡?；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基肼；甲基芐肼；PSK_多糖復(fù)合體(JHS NaturalProducts，Eugene，OR)；雷佐生；力索新；西佐喃；鍺螺胺；細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；單端孢霉烯族毒素(特別是T-2毒素、verracurin A、露濕漆斑霉素A和anguidine)；烏拉坦(urethane)；長春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露莫司?。欢甯事洞?；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；硫替派；紫杉醇，例如TAXOL_太平洋紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ.)，ABRAXANETM太平洋紫杉醇的不含聚氧乙烯蓖麻油白蛋白工程化納米顆粒制劑(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)，和TAXOTERE_多烯紫杉醇(Rhone-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；chloranbucil；GEMZAR_吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；鉑類似物，例如順鉑和卡鉑；長春堿；鉑；依托泊苷(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌；長春新堿；NAVELBINE_長春瑞濱；能滅瘤；替尼泊苷；依達(dá)曲沙；柔紅霉素；氨基蝶呤；希羅達(dá)；伊班膦酸鹽；CPT-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；視黃醛衍生物，例如視黃酸；卡培他濱；以及任何上述物質(zhì)的藥物可接受鹽、酸或衍生物。
本定義還包括起調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤作用的抗激素劑，例如抗雌激素劑和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)，包括例如他莫昔芬(包括NOLVADEX_他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羥泰米芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮、以及FARETON托瑞米芬；抑制芳香酶的芳香酶抑制劑，它可調(diào)節(jié)腎上腺中雌激素的產(chǎn)生，例如4(5)-咪唑、氨魯米特、MEGASE_醋酸甲地孕酮、AROMASIN_依西美坦、formestanie、法倔唑、RIVISOR_伏氯唑、FEMARA_來曲唑、以及ARIMIDEX_阿那曲唑；以及抗雄激素類，例如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林、以及戈舍瑞林；以及曲沙他濱(1，3-二氧戊烷核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是那些抑制與異常細(xì)胞增殖密切相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的基因(例如PKC-α、Ralf和H-Ras)的表達(dá)的反義寡核苷酸；核酶，例如VEGF表達(dá)抑制劑(如ANGIOZYME_核酶)和HER2表達(dá)抑制劑；諸如基因治療性疫苗的疫苗，例如ALLOVECTIN_疫苗、LEUVECTIN_疫苗、以及VAXID_疫苗；PROLEUKIN_rIL-2；LURTOTECAN_拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑；ABARELIX_rmRH；以及上述任何物質(zhì)的藥用鹽、酸或衍生物。
本文所使用的“生長抑制劑”指抑制細(xì)胞在體外或體內(nèi)生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑可以是一種顯著減少S期細(xì)胞百分率的藥劑。生長抑制劑的實(shí)例包括阻斷細(xì)胞周期前進(jìn)的藥劑(在除S期外的位置)，例如誘導(dǎo)GI阻滯和M期阻滯的藥劑。標(biāo)準(zhǔn)的M期阻斷劑包括長春堿類(長春新堿和長春堿)、TAXOL_紫杉醇、以及諸如多柔比星、表柔比星、柔紅霉素、依托泊苷、以及博來霉素等拓?fù)銲I抑制劑。這些阻滯GI的藥劑還蔓延到S期阻滯，例如，DNA烷基化劑，如他莫昔芬、潑尼松、達(dá)卡巴嗪、氮芥、順鉑、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、以及阿糖胞苷。其它資料可在The Molecular Basis of Cancer(癌癥的分子基礎(chǔ))，Mendelsohn & Israel，eds.，第一章，題為“Cell cycleregulation，oncogenes，and antieioplastic drugs(細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、癌基因、以及antieioplastic藥物)”Murakaini等人(W B SaundersPhiladelphia，1995)，特別是p.13中找到。
“誘導(dǎo)細(xì)胞死亡”的抗體是一種使存活細(xì)胞變成不存活細(xì)胞的抗體。所述細(xì)胞通常為表達(dá)可與抗體結(jié)合的抗原的細(xì)胞，特別是該細(xì)胞過量表達(dá)所述抗原。優(yōu)選地，該細(xì)胞為癌細(xì)胞，例如乳腺、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、結(jié)腸、甲狀腺、胰臟或膀胱細(xì)胞。在體外，細(xì)胞可以是SKBR3、BT474、Calu3、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SKOV3細(xì)胞?？稍谌鄙傺a(bǔ)體和免疫效應(yīng)細(xì)胞的情況下對(duì)體外細(xì)胞死亡進(jìn)行測定，以辨別是由抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)還是由補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性(CDC)所引起的細(xì)胞死亡。因此，可使用熱滅活血清(例如對(duì)缺少補(bǔ)體的情況)和在缺少免疫效應(yīng)細(xì)胞的情況下對(duì)細(xì)胞死亡進(jìn)行分析。為了確定抗體是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，與未處理細(xì)胞相比，可以通過攝取碘化丙啶(PI)、錐蟲藍(lán)(參見Moore等人，Cytotechnology，171-11(1995))或7AAD對(duì)膜完整性的喪失進(jìn)行分析評(píng)估。
“誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡”的抗體是誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的抗體，該程序性細(xì)胞死亡可通過結(jié)合膜聯(lián)蛋白V(annexin V)、DNA斷裂、細(xì)胞皺縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹、細(xì)胞片段化、和/或膜囊形成(稱為凋落小體)來測定。所述細(xì)胞是表達(dá)可與抗體結(jié)合的抗原的細(xì)胞，并且該細(xì)胞可以是一種過量表達(dá)所述抗原的細(xì)胞。細(xì)胞可以是腫瘤細(xì)胞，例如乳腺、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、結(jié)腸、甲狀腺、胰臟或膀胱細(xì)胞。在體外，細(xì)胞可以是SKBR3、BT474、Calu3、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SKOV3細(xì)胞?？墒褂貌煌姆椒ㄔu(píng)估與細(xì)胞凋亡相關(guān)的細(xì)胞事件。例如，通過膜聯(lián)蛋白結(jié)合測定磷脂酰絲氨酸(PS)易位；如通過本文實(shí)施例中所公開的梯型DNA可評(píng)估DNA斷裂；以及通過任何亞二倍體細(xì)胞的增加評(píng)估伴隨DNA斷裂產(chǎn)生的核/染色質(zhì)濃縮。在膜聯(lián)蛋白結(jié)合分析中，使用表達(dá)可與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗體相結(jié)合的抗原的細(xì)胞。優(yōu)選地，與未處理的細(xì)胞相比，該抗體是一種可使誘導(dǎo)膜聯(lián)蛋白結(jié)合提高約2至50倍，優(yōu)選地提高約5至50倍，以及更優(yōu)選地提高約10至50倍的抗體。
誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗體實(shí)例包括抗-DR5抗體3F1 1.39.7(ATCCHB-12456)；3H3.14.5(ATCC HB-12534)；3D5.1.10(ATCC HB-12536)；以及3H3.14.5(ATCC HB-12534)，包括其人源化和/或高親和性變異體；人抗-DR5受體抗體16E2和20E6，包括其高親和性變異體(WO 98/51793，本文特將其引入作為參考)；抗-DR4抗體4E7.24.3(ATCCHB-12454)；4H6.17.8(ATCC HB-12455)；1H5.25.9(ATCC HB-12695)；4G7.18.8(ATCC PTA-99)；以及5GI1.17.1(ATCC HB-12694)，包括其人源化和/或高親和性變異體。
可運(yùn)用例如在Harlow和Lane，Antibody，A Laboratory Manual(抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，eds.(New YorkCold Spring Harbor Laboratory，1998)中所描述的常規(guī)交叉封閉測定法，篩選結(jié)合與目的抗體結(jié)合的抗原上的表位的抗體。
“偶聯(lián)物”指任何雜交分子，包括融合蛋白和同時(shí)含有氨基酸或蛋白部分和非蛋白部分的分子(例如毒素-抗體偶聯(lián)物、或聚乙二醇化抗體偶聯(lián)物)。通過本領(lǐng)域已知的許多種技術(shù)可合成或設(shè)計(jì)偶聯(lián)物，例如重組DNA技術(shù)、固相合成、液相合成、有機(jī)化學(xué)合成技術(shù)或這些技術(shù)的組合。合成方法的選擇將取決于待產(chǎn)生的具體分子。例如，通過重組技術(shù)和液相技術(shù)的組合可合成實(shí)際上不全部為“蛋白質(zhì)”的雜交分子。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，偶聯(lián)物是與如美國專利5,739,277中所描述的補(bǔ)救受體結(jié)合表位(特別是抗體片段)以共價(jià)鍵連接的抗體或目的多肽。例如，編碼補(bǔ)救受體結(jié)合表位的核酸分子可與編碼本發(fā)明多肽序列的核酸同框(in frame)連接，以使設(shè)計(jì)的核酸分子表達(dá)的融合蛋白包括補(bǔ)救受體結(jié)合表位和本發(fā)明的多肽序列。本文所使用的術(shù)語“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4)的Fc區(qū)的表位，其可用于增加IgG分子的體內(nèi)血清半衰期(例如，Ghetie，V等人，(2000)Ann.Rev.Immunol.18739-766，表1)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(特別是抗體片斷)與血清白蛋白或結(jié)合FcRn受體或血清白蛋白結(jié)合肽的部分血清白蛋白的連接，或與非蛋白質(zhì)聚合物(例如聚乙二醇部分)的連接，可形成偶聯(lián)物。例如，在WO 01/45746中公開了這種多肽序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，待附著的血清白蛋白肽包含DICLPRWGCLW氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過這些方法可增加如本發(fā)明Fab的半衰期。對(duì)于血清白蛋白結(jié)合肽序列，還參見Dennis，M.S.等人，(2002)JBC 277(38)35035-35043。
本文所使用的詞語“標(biāo)記物”指可直接或間接與抗體偶聯(lián)的可檢測化合物或組分。該標(biāo)記可以是自身可檢測的(例如放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)，或在酶標(biāo)記的情況下，其可催化可檢測的底物化合物或組合物的化學(xué)變化。
A.本發(fā)明的組合物與方法 本發(fā)明提供結(jié)合人BR3以及任選地也結(jié)合其它靈長類動(dòng)物BR3的抗體。根據(jù)一實(shí)施方案，H鏈具有非人類抗人BR3抗體(供體抗體)的至少一個(gè)、兩個(gè)或全部H鏈CDR，以及作為受體抗體的人共有抗體(consensus antibody)的基本上全部框架殘基。供體抗體能夠來自多種非人物種，包括小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、兔、馬、靈長類動(dòng)物，但是通常是鼠類抗體。關(guān)于“基本上全部”是指人源化抗體中受體FR區(qū)域可以包括原始不存在于人共有FR序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換。這些FR變化可以包括在受體或供體抗體中未被發(fā)現(xiàn)的殘基。
在一實(shí)施方案中，供體抗體是鼠類9.1抗體、包括SEQ ID NO19和SEQ ID NO20中顯示的每一VH和VL鏈的CDR和FR序列在內(nèi)的V區(qū)域。在一實(shí)施方案中，人Fab框架的殘基對(duì)應(yīng)于或來源于人Vκ亞群I和VH亞群III的共有序列。根據(jù)一實(shí)施方案，本發(fā)明的人源化BR3抗體在H鏈中具有至少一個(gè)鼠類供體抗體的CDR。在一實(shí)施方案中，與人BR3結(jié)合的人源化BR3抗體包含供體抗體H鏈的重鏈CDR。
在全長抗體中，本發(fā)明的人源化BR3結(jié)合抗體包含與人免疫球蛋白C鏈連接的V結(jié)構(gòu)域，例如SEQ ID NO132。在優(yōu)選實(shí)施方案中，H鏈C區(qū)域來自人IgG，例如IgG1或IgG3。根據(jù)一實(shí)施方案，L鏈C結(jié)構(gòu)域來自人κ鏈。根據(jù)另一實(shí)施方案，全長BR3結(jié)合抗體的Fc序列是SEQ ID NO134，其中X選自N、A、Y、F和H。
BR3結(jié)合抗體將至少結(jié)合人BR3。根據(jù)一實(shí)施方案，BR3結(jié)合抗體將結(jié)合其它靈長類動(dòng)物的BR3，例如包括短尾猴、恒河猴和猩猩在內(nèi)的猴類的BR3。根據(jù)另一實(shí)施方案，BR3結(jié)合抗體或多肽結(jié)合嚙齒動(dòng)物的BR3蛋白和人BR3蛋白。在另一實(shí)施方案中，BR3多肽結(jié)合小鼠BR3多肽序列和人BR3多肽序列。
根據(jù)一實(shí)施方案，拮抗性BR3結(jié)合抗體的生物活性是下列活性的任意一種、其任意組合或其全部(1)以500nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低的表觀Kd值與人BR3胞外域序列結(jié)合；(2)以500nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低的表觀Kd值與人BR3胞外域序列結(jié)合以及與小鼠BR3胞外域序列結(jié)合；(3)具有人BR3上的功能性表位，包括殘基F25、V33和A34，其中單克隆抗體；(4)抑制人BAFF和人BR3結(jié)合；(5)在人效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)具有抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)或在人效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)具有增強(qiáng)的ADCC；(6)結(jié)合人Fc新生受體(FcRn)，其親和力高于具有野生型或天然序列IgG Fc的多肽或母體多肽；(9)體外或體內(nèi)殺死或去除B細(xì)胞，當(dāng)與基線水平或不使用抗體治療的合適的陰性對(duì)照相比時(shí)，優(yōu)選體外或體內(nèi)殺死或去除至少20％的B細(xì)胞；(10)抑制B細(xì)胞體外或體內(nèi)增殖以及(11)抑制B細(xì)胞體外或體內(nèi)存活。根據(jù)本發(fā)明的多肽或抗體的一實(shí)施方案，功能性表位還包含殘基R30。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，所述功能性表位還包含殘基L28和V29。
在一實(shí)施方案中，與使用不結(jié)合B細(xì)胞表面抗原的對(duì)照抗體的處理相比，或者與治療前的基線相比，與mIgG2A的Fc區(qū)域融合的本發(fā)明抗體的可變結(jié)構(gòu)域能夠去除小鼠下列任一細(xì)胞群、細(xì)胞群的任意組合或全部細(xì)胞群中至少20％的B細(xì)胞(1)血液中的B細(xì)胞；(2)淋巴結(jié)中的B細(xì)胞；(3)脾臟中的卵泡B細(xì)胞以及(4)脾臟中的邊緣區(qū)B細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，B細(xì)胞去除是25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，在使用抗體處理15天后測量所述去除。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，如本文實(shí)施例18或19所述，進(jìn)行所述去除測定。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，通過治療15天后小鼠的外周B細(xì)胞群測量所述去除。
根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明的激動(dòng)型BR3結(jié)合抗體的生物活性是選自下列活性的任意一種、其任意組合或其全部(1)以500nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低的表觀Kd值與人BR3胞外域序列結(jié)合；(2)具有人BR3上的功能性表位，包括殘基F25、V33和A34，其中該單克隆抗體不是9.1抗體也不是2.1抗體；(3)刺激B細(xì)胞體外增殖或存活；(4)抑制人BAFF和人BR3結(jié)合；(5)刺激B細(xì)胞體內(nèi)增殖或存活；(6)結(jié)合人Fc新生受體(FcRn)，其親和力高于具有野生型或天然序列IgG Fc的多肽或母體多肽。
B細(xì)胞去除的期望水平將取決于疾病。對(duì)于BR3陽性癌癥的治療，可以期望將B細(xì)胞去除最大化，所述B細(xì)胞是本發(fā)明的抗BR3抗體和多肽的靶。因此，對(duì)于BR3陽性B細(xì)胞瘤的治療，期望B細(xì)胞的去除足以至少預(yù)防疾病的進(jìn)展，本領(lǐng)域醫(yī)師能夠例如通過監(jiān)測腫瘤的生長(大小)、癌細(xì)胞類型的增殖、轉(zhuǎn)移、特定癌癥的其它體征和癥狀評(píng)價(jià)所述疾病。根據(jù)一優(yōu)選實(shí)施方案，B細(xì)胞去除足以阻止疾病的進(jìn)展至少2個(gè)月，更優(yōu)選3個(gè)月，甚至更優(yōu)選3個(gè)月，更優(yōu)選5個(gè)月，甚至更優(yōu)選6個(gè)月或更長。在甚至更優(yōu)選實(shí)施方案中，B細(xì)胞清除足以延長好轉(zhuǎn)時(shí)間至少6個(gè)月，更優(yōu)選9個(gè)月，更優(yōu)選1年，更優(yōu)選2年，更優(yōu)選3年，甚至更優(yōu)選5年或更長。在最有選實(shí)施方案中，B細(xì)胞去除足以治愈該疾病。在優(yōu)選實(shí)施方案中，癌癥患者中B細(xì)胞去除至少是治療前基線水平的約75％，并且更優(yōu)選80％、85％、90％、95％、99％、甚至是100％。
對(duì)于自身免疫性疾病的治療，能夠希望根據(jù)個(gè)體患者的疾病和/或疾病狀態(tài)的嚴(yán)重程度，通過調(diào)節(jié)BR3結(jié)合抗體或多肽來調(diào)節(jié)B細(xì)胞的程度。因此，B細(xì)胞去除能夠但不必須完全?？梢云谕谧畛踔委熤卸皇请S后的治療中完成總B細(xì)胞去除，可以調(diào)整劑量以達(dá)到僅部分去除。在一實(shí)施方案中，B細(xì)胞去除是至少20％，即與治療前基線水平相比，80％或更少的BR3陽性B細(xì)胞仍然存在。在其它實(shí)施方案中，B細(xì)胞去除是25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更高。根據(jù)一優(yōu)選實(shí)施方案，B細(xì)胞去除足以中斷疾病的進(jìn)展，更優(yōu)選減緩治療中特定疾病的體征和癥狀，甚至更優(yōu)選治愈所述疾病。
本發(fā)明還提供雙特異性BR3結(jié)合抗體，其中抗體的一個(gè)臂具有本發(fā)明BR3結(jié)合抗體的人源化H和L鏈，并且另一臂具有針對(duì)另一抗原的V區(qū)域結(jié)合特異性。在具體實(shí)施方案中，第二抗原選自CD3、CD64、CD32A、CD16、NKG2D或其它NK活化配體。
不涉及維持抗BR3抗體適當(dāng)構(gòu)象的任何半胱氨酸殘基還可以被置換，通常是被絲氨酸置換，以改善分子的氧化穩(wěn)定性并避免異常交聯(lián)。相反地，可以向抗體加入半胱氨酸鍵以改善其穩(wěn)定性(尤其是當(dāng)抗體是抗體片段時(shí)，例如Fv片段)。
尤其優(yōu)選類型的置換變體涉及置換母體抗體(例如人源化的或人抗體)的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)殘基。通常，為了進(jìn)一步開發(fā)而選擇的所得變體具有與產(chǎn)生其的母體抗體相關(guān)的改善的生物學(xué)性質(zhì)。產(chǎn)生這樣的置換變體的傳統(tǒng)方法涉及噬菌體展示的親和力成熟。簡而言之，突變?nèi)舾筛咦儏^(qū)位點(diǎn)(例如6-7個(gè)位點(diǎn))以在每一位點(diǎn)產(chǎn)生全部的可能氨基酸置換。由此產(chǎn)生的抗體變體以單價(jià)形式由絲狀噬菌體顆粒展示，所述抗體變體與包裹在每一顆粒中的M13基因III產(chǎn)物融合。然后如本文所述篩選噬菌體展示變體的生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)。為了鑒別用于修飾的候選高變區(qū)，可進(jìn)行丙氨酸掃描誘變以鑒別顯著促進(jìn)抗原結(jié)合的高變區(qū)殘基。作為選擇或補(bǔ)充，分析抗原-抗體復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)來鑒別抗體和人BR3之間的接觸點(diǎn)是有利的。這樣的接觸殘基和臨近殘基是根據(jù)本文所述技術(shù)進(jìn)行置換的候選物。一旦產(chǎn)生了這樣的變體，那么如本文所述篩選一組變體，并且可以選擇在一個(gè)或多個(gè)相關(guān)測定中具有優(yōu)良性質(zhì)的抗體以進(jìn)行進(jìn)一步開發(fā)。
抗體的另一類型的氨基酸變體改變抗體的原始糖基化形式。通過改變這意味著刪除抗體中存在的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物部分，和/或添加抗體中不存在的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物部分。
抗體的糖基化通常是N連接的或O連接的。N連接的指碳水化合物部分與天冬酰胺殘基的側(cè)鏈相連。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸是碳水化合物部分與天冬酰胺的酶催化連接的識(shí)別序列，其中X是除了脯氨酸以外的任意氨基酸。因此，存在于多肽中的這些三肽序列的任意一種形成潛在糖基化位點(diǎn)。O連接的糖基化指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖之一與羥氨基酸相連，最常見的羥氨基酸是絲氨酸或蘇氨酸，雖然也可以使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。
向抗體加入糖基化位點(diǎn)通常是通過改變氨基酸序列從而包含一個(gè)或多個(gè)上述的三肽序列(來實(shí)現(xiàn)的對(duì)于N連接的糖基化位點(diǎn))。還可以通過向原始抗體序列中加入或置換一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基進(jìn)行所述改變(對(duì)于O連接的糖基化位點(diǎn))。
通過本領(lǐng)域已知的多種方法制備編碼抗-BR3抗體的氨基酸序列變體的核酸分子。這些方法包括但不限于，從天然來源分離(在天然存在的氨基酸序列變體的情況下)或通過寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn)的)誘變、PCR誘變以及較早制備的變體或抗BR3抗體的非變體形式的盒式誘變來制備。
可能希望出于效應(yīng)作用而修飾本發(fā)明的抗體，以便例如加強(qiáng)抗原依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)和/或抗體的補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性(CDC)。這可以通過在抗體的Fc區(qū)域引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換來實(shí)現(xiàn)。作為選擇或補(bǔ)充，可以在Fc區(qū)域引入半胱氨酸殘基，從而在該區(qū)域中形成鏈間二硫鍵。由此產(chǎn)生的同型二聚抗體具有改善的內(nèi)化能力和/或增加的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)。參見Caron et al，J.Exp Med.1761191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.1482918-2922(1992)。還可以使用如Wolff et al.Cancer Research 532560-2565(1993)所述的異雙功能交聯(lián)劑制備具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性的同型二聚抗體?；蛘撸軌蚬こ袒贵w，其具有雙Fc區(qū)域并且可以借此具有增強(qiáng)的補(bǔ)體介導(dǎo)的溶解和ADCC能力。參見Stevenson et al.Anti-Cancer Drug Design 3219-230(1989)。
為了增強(qiáng)抗體的血清半衰期，例如如美國專利第5,739,277號(hào)所述可以向抗體中并入補(bǔ)救受體結(jié)合表位(尤其是抗體片段)。如本文所用，術(shù)語“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc區(qū)域的表位，其負(fù)責(zé)增加IgG分子的體內(nèi)血清半衰期。
其它抗體修飾 本文考慮了抗體的其它修飾。例如，可以將抗體與多種非蛋白質(zhì)的聚合物相連，所述聚合物例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化乙烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。還可以將抗體包埋在制備的微囊中，例如通過在膠體藥物輸送系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳狀液、毫微型顆粒和毫微型膠囊)或粗乳狀液中凝聚技術(shù)或通過界面聚合法(例如分別使用羥甲基纖維素或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊)。Remington’s Pharmaceutical Sciences，16th edition，Oslo，A.，Ed.，(1980)公開了這樣的技術(shù)。
篩選具有期望特性的抗體 如實(shí)驗(yàn)實(shí)施例所述可以選擇具有某些生物學(xué)性質(zhì)的抗體。例如，能夠在ELISA測定中通過與BR3結(jié)合，更優(yōu)選地與在細(xì)胞表面表達(dá)的BR3結(jié)合(例如BJAB細(xì)胞系)來選擇與BR3結(jié)合的抗體。例如參見 實(shí)施例5。
能夠例如使用內(nèi)源性表達(dá)BR3的細(xì)胞或使用BR3基因轉(zhuǎn)染后表達(dá)BR3的細(xì)胞，通過實(shí)施例或本領(lǐng)域已知的方法來評(píng)價(jià)本發(fā)明的抗BR3抗體的生長抑制作用。例如，在一優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)BR3的原代B細(xì)胞能夠被用于增殖和存活測定(例如實(shí)施例7)。在另一實(shí)施方案中，可以使用不同濃度的本發(fā)明的抗BR3單克隆抗體來處理腫瘤細(xì)胞系和BR3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞若干天(例如2-7天)并使用結(jié)晶紫或MTT染色或通過某些其它的比色測定來進(jìn)行分析。測量增殖的另一方法可以通過對(duì)比在存在或不存在本發(fā)明的抗BR3抗體下被處理細(xì)胞對(duì)3H-胸腺嘧啶核苷的攝入?？贵w處理后，收集細(xì)胞并在閃爍計(jì)數(shù)器中定量測定并入DNA中放射性強(qiáng)度的量。合適的陽性對(duì)照包括使用已知抑制細(xì)胞系生長的生長抑制抗體來處理所選的細(xì)胞系。
為了選擇誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的抗體，可與對(duì)照相比來評(píng)價(jià)例如通過碘化丙錠(PI)、錐蟲藍(lán)或7AAD的吸收表明的膜完整新喪失。能夠在不存在補(bǔ)體和免疫效應(yīng)細(xì)胞下進(jìn)行PI吸收測定。單獨(dú)使用培養(yǎng)基或使用含有例如約10μg/ml合適單克隆抗體的培養(yǎng)基孵育表達(dá)BR3的腫瘤細(xì)胞。將細(xì)胞孵育3天。每一處理后，洗滌細(xì)胞并分裝到35mm帶有濾網(wǎng)帽的12×75試管中(每試管1ml，每處理組3個(gè)試管)以便除去細(xì)胞塊。然后向試管中加入PI(10μg/ml)?？梢允褂肍ACSCANTM流式細(xì)胞測定器和FACSCONVERTTM CellQuest軟件(Becton Dickinson)分析樣品?？梢赃x擇誘導(dǎo)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著水平的細(xì)胞死亡的那些抗體作為誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的抗體，所述細(xì)胞死亡是由PI吸收確定的。
為了篩選BR3上與結(jié)合感興趣抗體的表位結(jié)合的抗體，可進(jìn)行諸如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，EdHarlow and David Lane(1988)中所述的常規(guī)交叉封閉測定。該測定能夠被用于確定測試抗體是否與本發(fā)明的抗BR3抗體結(jié)合相同的位點(diǎn)或表位。作為選擇或補(bǔ)充，能夠通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行表位作圖。例如，能夠例如通過丙氨酸篩選誘變抗體序列，以便鑒別接觸殘基。最初突變抗體與多克隆抗體一起測試結(jié)合，以便確保適當(dāng)?shù)恼郫B。在不同的方法中，與BR3不同區(qū)域?qū)?yīng)的肽能夠被用于使用測試抗體或使用測試抗體和具有特征性或已知表位的抗體的競爭測定。
特定抗BR-3抗體的例子 本發(fā)明的抗體特別包括包含表2(下表)中公開的任一抗體可變重鏈序列的抗體，以及尚未被雜種細(xì)胞產(chǎn)生的它們的BR3結(jié)合片段。本發(fā)明的抗體特別包括包含可變重鏈序列的抗體，所述可變重鏈序列包含SEQ ID NO4-13、15-18、22、24、26-73、75-76、78、80-85、87-96、98、100、102、104、106-107、109-110、112、114、116、118、120、122、124、126和127中的任意一個(gè)，以及它們的BR3結(jié)合片段。依照其它實(shí)施方案，本發(fā)明的抗體包含表2中公開的任一抗體的可變重鏈和可變輕鏈區(qū)，以及它們的BR3結(jié)合片段。依照一實(shí)施方案，所述抗體還包含含有SEQ ID NO134的序列的Fc區(qū)，其中X是選自N、A、W、Y、F和H的氨基酸。依照另一實(shí)施方案，所述抗體包含SEQID NO76或SEQ ID NO131的序列，其中X是選自N、A、W、Y、F和H的氨基酸。
表2抗體序列的例子 本發(fā)明的抗體包括具有H3序列的BR3-結(jié)合抗體以及這些抗體的BR3結(jié)合片段，所述H3序列與SEQ ID NO4-13、15-18、22、24、26-73、75-76、78、80-85、87-96、98、100、102、104、106-107、109-110、112、114、116、118、120、122、124、126和127中任一序列的H3序列有至少約70％的氨基酸序列一致性，或者至少約71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列一致性。
本發(fā)明的抗體包括具有H1、H2和H3序列的BR3結(jié)合抗體，所述H1、H2和H3序列與附圖中描述的任一抗體序列的下劃線部分或者與序列表中描述的高變區(qū)CDR有至少約70％的一致性，或者至少約71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列一致性。
本發(fā)明的抗體包括具有L1、L2和L3序列的BR3結(jié)合抗體，所述L1、L2和L3序列與附圖中描述的任一抗體序列的下劃線部分或者與序列表中描述的高變區(qū)的CDR有至少約70％的一致性，或者至少約71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列一致性。
本發(fā)明的抗體包括具有VH結(jié)構(gòu)域的BR3結(jié)合抗體，所述VH結(jié)構(gòu)域與表2中任一抗體的VH結(jié)構(gòu)域有至少約70％的同源性，或者至少約71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列一致性。
本發(fā)明的抗體包括包含表2抗體序列的重鏈CDR3序列的任何尚未被雜種細(xì)胞產(chǎn)生的BR3結(jié)合抗體。本發(fā)明的抗體包括包含重鏈CDR3序列或包含H3序列的任何BR3結(jié)合抗體，所述重鏈CDR3序列是SEQ ID NO7-13、15-18、36、38-73、78、82-85、87-96、98、100、102、104、106-107、109-110、112、114、116、118、120、122、124、126和127中任意一個(gè)的重鏈CDR3序列，所述H3序列源自SEQID NO7-13、15-18、36、38-73、78、82-85、87-96、98、100、102、104、106-107、109-110、112、114、116、118、120、122、124、126和127中任意一個(gè)的H3序列。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包括包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的任何BR3結(jié)合抗體或者源自包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的抗體，所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3是選自SEQ ID NO7-13、15-18、36、38-73、78、82-85、87-96、98、100、102、104、106-107、109-110、112、114、116、118、120、122、124、126和127中任意一個(gè)序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。本發(fā)明的抗體包括包含表2抗體的重鏈H1、H2和H3序列的任何尚未被雜種細(xì)胞產(chǎn)生的BR3結(jié)合抗體。
本發(fā)明的抗體包括包含由Hu9.1-RF-H-IgG核酸序列編碼的多肽序列的抗體和抗BR3結(jié)合抗體，其中Hu9.1-RF-H-IgG核酸序列于2004年11月17日以保藏號(hào)PTA-6315被保藏到ATCC，所述抗-BR3結(jié)合抗體包含與Hu9.1-RF-H-IgG多肽序列的任一可變區(qū)序列有至少約70％一致性，或者至少約71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列一致性的氨基酸序列。本發(fā)明的抗體包括包含由Hu9.1-RF-L-IgG核酸序列編碼的多肽序列的抗體和抗BR3結(jié)合抗體，其中Hu9.1-RF-L-IgG核酸序列于2004年11月17日以保藏號(hào)PTA-6316被保藏到ATCC，所述抗BR3結(jié)合抗體包含與Hu9.1-RF-L-IgG多肽序列的可變區(qū)序列有至少約70％同一性，或者至少約71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
本發(fā)明的抗體包括包含由Hu2.1-46.DANA-H-IgG核酸序列編碼的多肽序列的抗體和抗BR3結(jié)合抗體，其中Hu2.1-46.DANA-H-IgG核酸序列于2004年11月17日以保藏號(hào)PTA-6313被保藏到ATCC，所述抗BR3結(jié)合抗體包含與Hu2.1-46.DANA-H-IgG多肽序列的可變區(qū)序列有至少約70％一致性，或者至少約71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列一致性的氨基酸序列。本發(fā)明的序列包括包含由Hu2.1-46.DANA-L-IgG核酸序列編碼的多肽序列的抗體和抗BR3結(jié)合抗體，Hu2.1-46.DANA-L-IgG核酸序列于2004年11月17日以保藏號(hào)PTA-6314被保藏到ATCC，所述抗BR3結(jié)合抗體包含與Hu2.1-46.DANA-L-IgG多肽序列的可變區(qū)序列有至少約70％一致性，或者至少約71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
本發(fā)明的抗體包括包含由HuV3-46s-H-IgG核酸序列編碼的多肽序列的抗體和抗BR3結(jié)合抗體，其中HuV3-46s-H-IgG核酸序列于2004年11月17日以保藏號(hào)PTA-6317被保藏到ATCC，所述抗BR3結(jié)合抗體包含與HuV3-46s-H-IgG多肽序列的可變區(qū)序列有至少約70％一致性，或者至少約71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列一致性的氨基酸序列。本發(fā)明的序列包括包含由HuV3-46s-L-IgG核酸序列編碼的多肽序列的抗體和抗BR3結(jié)合抗體，HuV3-46s-L-IgG核酸序列于2004年11月17日以保藏號(hào)PTA-6318被保藏到ATCC，所述抗BR3結(jié)合抗體包含與HuV3-46s-L-IgG多肽序列的可變區(qū)序列有至少約70％一致性，或者至少約71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
本發(fā)明的抗體包括Hu9.1-RF-IgG抗體，其包含ATCC保藏號(hào)為PTA-6315的重鏈序列和ATCC保藏號(hào)為PTA-6316的輕鏈序列。本發(fā)明的抗體包括Hu2.1-46.DANA-IgG抗體，其包含ATCC保藏號(hào)為PTA-6313的重鏈序列和ATCC保藏號(hào)為PTA-6314的輕鏈序列。本發(fā)明的抗體包括HuV3-46s-IgG抗體，其包含ATCC保藏號(hào)為PTA-6317的重鏈序列和ATCC保藏號(hào)為PTA-6318的輕鏈序列。
根據(jù)一優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的抗體特異結(jié)合天然人BR3多肽的序列。根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明的抗體與稱為9.1-RF Ig的抗體相比，在pH6.0時(shí)與FcRn受體有增強(qiáng)的結(jié)合。根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明的抗體與稱為9.1-RF Ig的抗體相比，在人效應(yīng)細(xì)胞存在下，具有增強(qiáng)的ADCC功能。根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明的抗體與稱為9.1-RF Ig的抗體相比，在人效應(yīng)細(xì)胞存在下，具有減弱的ADCC功能。
應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的所有抗體包括缺失信號(hào)序列的抗體和缺失Fc區(qū)的K447殘基的抗體。
載體、宿主細(xì)胞和重組方法 本發(fā)明還提供編碼BR3結(jié)合抗體或BR3結(jié)合多肽的分離核酸、包含該核酸的載體和宿主細(xì)胞、以及用于生產(chǎn)所述抗體的重組技術(shù)。
為了生產(chǎn)BR3結(jié)合抗體和多肽，分離其編碼核酸并且插入到可復(fù)制載體中用于進(jìn)一步克隆(DNA復(fù)制)或表達(dá)。使用常規(guī)方法(例如，通過使用能夠特異結(jié)合編碼所述抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)容易地分離編碼單克隆抗體或多肽的DNA并測序?？梢允褂迷S多載體。載體組分通常包括但不限于下列中的一個(gè)或多個(gè)信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。
(i)信號(hào)序列組分 不僅可以直接重組生產(chǎn)本發(fā)明的抗體或多肽，本發(fā)明的抗體或多肽還可以與異源多肽一起作為融合多肽生產(chǎn)，所述異源多肽優(yōu)選信號(hào)序列或在所述成熟蛋白或多肽的N-末端具有特異切割位點(diǎn)的其它多肽。所選的異源信號(hào)序列優(yōu)選被宿主細(xì)胞識(shí)別并加工(例如，被信號(hào)肽酶切割)。對(duì)于不識(shí)別和加工天然BR3結(jié)合抗體信號(hào)序列的原核宿主細(xì)胞，該信號(hào)序列被例如選自下列的原核信號(hào)序列代替堿性磷酸酶、青霉素酶、1pp或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)序列。對(duì)于酵母分泌，該天然信號(hào)序列可以被例如下列所代替酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列、α因子前導(dǎo)序列(包括釀酒酵母(Saccharomyces)和克魯維酵母(Kluyveromyces)α因子前導(dǎo)序列)、或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列、白色念珠菌(C.albicans)葡萄糖淀粉酶前導(dǎo)序列或WO 90/13646中描述的信號(hào)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，可獲得哺乳動(dòng)物信號(hào)序列以及病毒分泌前導(dǎo)序列，例如單純皰疹gD信號(hào)。
將用于所述前導(dǎo)區(qū)的DNA與編碼BR3結(jié)合抗體的DNA同框連接。
(ii)復(fù)制起點(diǎn) 表達(dá)載體和克隆載體均含有使得該載體能夠在一種或多種所選宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。通常，在克隆載體中，此序列是使得載體能夠獨(dú)立于宿主染色體DNA而復(fù)制的序列，并且包括復(fù)制起點(diǎn)或自主復(fù)制序列。公知多種細(xì)菌、酵母和病毒的這樣的序列。質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適合大多數(shù)革蘭氏陽性菌，2μ質(zhì)粒起點(diǎn)適合酵母，并且多種病毒起點(diǎn)(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的克隆載體。通常，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體不需要復(fù)制起點(diǎn)組分(通常使用SV40起點(diǎn)只是因?yàn)槠浜性缙趩?dòng)子)。
(iii)選擇基因組分 表達(dá)載體和克隆載體可以含有選擇基因，也稱為選擇標(biāo)志物。典型的選擇基因編碼蛋白，該蛋白(a)賦予對(duì)抗生素或其它毒素的抗性，例如，對(duì)氨芐青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四環(huán)素的抗性，(b)補(bǔ)足營養(yǎng)缺陷體的不足，或(c)提供復(fù)合培養(yǎng)基不提供的關(guān)鍵營養(yǎng)，例如，為桿菌(Bacilli)編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。
選擇方案的一個(gè)例子使用藥物來抑制宿主細(xì)胞的生長。被異源基因成功轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞產(chǎn)生賦予藥物抗性的蛋白且因此在選擇下存活。這些顯性選擇的例子使用藥物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
適于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇標(biāo)志物的另一個(gè)例子是那些使得能夠鑒別競爭性吸收BR3結(jié)合抗體核酸的細(xì)胞，所述BR3結(jié)合抗體例如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I和金屬硫蛋白-II，優(yōu)選靈長類金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等等。
例如，通過在含有甲氨蝶呤(Mtx)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所有轉(zhuǎn)化體來首先鑒定被DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，甲氨蝶呤為DHFR的競爭性拮抗劑。當(dāng)使用野生型DHFR時(shí)，適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞是缺乏DHFR活性的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系(例如，ATCC CRL-9096)。
或者，可以通過細(xì)胞在含有用于選擇標(biāo)志物的選擇試劑的培養(yǎng)基中的生長來選擇被編碼BR3結(jié)合抗體、野生型DHFR蛋白和另一選擇標(biāo)志物的DNA序列轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(尤其是含有內(nèi)源DHFR的野生型宿主)，該另一選擇標(biāo)志物例如氨基糖苷3’-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)，所述選擇試劑例如氨基糖苷類抗生素，例如卡那霉素或G418。參見美國專利第4,965,199號(hào)。
適合用在酵母中的選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7上的trp1基因(Stinchcomb et al.，Nature，28239(1979))。trp1基因提供對(duì)缺乏在色氨酸中生長能力的酵母突變株進(jìn)行選擇的選擇標(biāo)志物，所述菌株例如ATCC號(hào)44076或PEP4-1。Jones，Genetics，8512(1977)。然后酵母宿主細(xì)胞基因組中存在的trp1病灶為通過在不含色氨酸下生長來檢測轉(zhuǎn)化提供了有效環(huán)境。類似地，Leu2缺失酵母株(ATCC 20,622或38,626)被帶有Leu2基因的已知質(zhì)粒補(bǔ)足。
此外，衍生自1.6μm環(huán)狀質(zhì)粒pKD1的載體可被用于轉(zhuǎn)化克魯維酵母(Kluyveromyces)?；蛘?，報(bào)道了用K.lactis大量生產(chǎn)重組小牛凝乳酶的表達(dá)系統(tǒng)。Van den Berg，Bio/Technology，8135(1990)。還公開了用于通過克魯維酵母(Kluyveromyces)的工業(yè)株來分泌成熟重組人血清白蛋白的穩(wěn)定的多拷貝表達(dá)載體。Fleer et al.，Bio/Technology，9968-975(1991)。
(iv)啟動(dòng)子組分 表達(dá)載體和克隆載體通常含有被宿主生物體識(shí)別且與編碼BR3結(jié)合抗體的核酸可操作地連接的啟動(dòng)子。適合用于原核宿主的啟動(dòng)子包括phoA啟動(dòng)子、β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、堿性磷酸酶啟動(dòng)子、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)和雜種啟動(dòng)子，例如tac啟動(dòng)子。然而，其它的已知細(xì)菌啟動(dòng)子是合適的。用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動(dòng)子還含有與編碼BR3結(jié)合抗體的DNA可操作地連接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
已知真核生物的啟動(dòng)子序列。事實(shí)上所有的真核基因都具有富含AT的區(qū)域，其位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的約25至30個(gè)堿基處。在許多基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的70至80個(gè)堿基處找到的另一個(gè)序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核基因地3’末端是AATAAA序列，其可能是向編碼序列的3’末端加入多聚A尾部的信號(hào)。所有這些序列都適于插入到真核表達(dá)載體中。
適合用于酵母宿主的啟動(dòng)子序列包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動(dòng)子，所述糖酵解酶例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸歧化酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡糖激酶。
其它酵母啟動(dòng)子，其為具有由生長條件控制轉(zhuǎn)錄的額外優(yōu)勢的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，是乙醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C(isocytochrome C)、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解性酶類、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動(dòng)子區(qū)域。EP 73,657中進(jìn)一步描述了適合用于在酵母中表達(dá)的載體和啟動(dòng)子。酵母增強(qiáng)子與酵母啟動(dòng)子一起使用也是有利的。
可以控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抗體從載體的轉(zhuǎn)錄，例如，通過從病毒的基因組、或者從異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子、或者從熱休克蛋白啟動(dòng)子獲得的啟動(dòng)子，前提條件為這些啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)兼容，所述病毒例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒、猿猴病毒40(SV40)，所述異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子例如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子。
SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子可方便地作為SV40限制片段得到，還片段還含有SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)。人巨細(xì)胞病毒的中早期啟動(dòng)子作為HindIII E限制片段方便地得到。美國專利第4,419,446號(hào)描述了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動(dòng)物宿主中表達(dá)DNA的系統(tǒng)。美國專利第4,601,978號(hào)描述了對(duì)此系統(tǒng)的改進(jìn)。還參見Reyes et al.，Nature 297598-601(1982)關(guān)于在小鼠細(xì)胞中在單純性皰疹病毒的胸苷激酶啟動(dòng)子的控制下表達(dá)人β-干擾素cDNA?；蛘?，勞斯肉瘤病毒的長末端重復(fù)序列可以被用作啟動(dòng)子。
(v)增強(qiáng)子元件組分 經(jīng)常通過向載體中插入增強(qiáng)子序列來提高高等真核生物對(duì)編碼本發(fā)明抗體的DNA的轉(zhuǎn)錄。目前已知許多來自哺乳動(dòng)物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)的增強(qiáng)子。然而，通常使用來自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。例子包括位于復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)(bp100-270)的SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、位于復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤病毒增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子。還參見Yaniv，Nature29717-18(1982)關(guān)于活化真核啟動(dòng)子的增強(qiáng)元件。增強(qiáng)子可以被剪接到載體中抗體編碼序列的5’或3’位置，但是優(yōu)選位于啟動(dòng)子的5’位點(diǎn)。
(vi)轉(zhuǎn)錄終止組分 用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動(dòng)物、人或來自其它多細(xì)胞生物體的有核細(xì)胞)的表達(dá)載體還含有終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所需要的序列。這樣的序列通常由真核或病毒DNA或cDNA的5’，以及偶爾還有3’非翻譯區(qū)來提供。這些序列含有被轉(zhuǎn)錄為編碼抗體的mRNA的非翻譯部分中的多腺苷化片段的核苷酸區(qū)段。一個(gè)有用的轉(zhuǎn)錄終止成分是牛生長激素多腺苷化區(qū)域。參見WO 94/11026以及其中公開的表達(dá)載體。
(vii)宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化 用于克隆或表達(dá)本發(fā)明載體中的DNA的適合宿主細(xì)胞是上述的原核生物、酵母或高等真核生物細(xì)胞。適合此目的的原核生物包括真細(xì)菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，舉例來說，腸桿菌科(Enterobacteriaceae)例如埃希桿菌屬(Escherichia)，例如E.coli，腸桿菌屬(Enterobacter)，歐文菌屬(Erwinia)，克雷白桿菌屬(Klebsiella)，變性桿菌屬(Proteus)，沙門菌屬(Salmonella)，例如鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)，沙雷菌屬(Serratia)，例如粘質(zhì)沙雷菌(Serratia marcescans)和志賀菌屬(Shigella)，以及芽孢桿菌(Bacilli)例如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日出版的DD 266,710中公開的地衣芽孢桿菌41P)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，例如銅綠色假單胞菌(P.aeruginosa)，以及鏈霉菌屬(Streptomyces)。一種優(yōu)選的E.coli克隆宿主是E.coli 294(ATCC31,446)，盡管諸如E.coli B、E.coli X1776(ATCC 31,537)和E.coliW3110(ATCC 27,325)的其它菌株也是合適的。這些例子是說明性的而非限制。
可以在細(xì)菌中生產(chǎn)全長抗體、抗體片段和抗體融合蛋白，特別是當(dāng)不需要糖基化和Fc效應(yīng)功能時(shí)，例如當(dāng)治療性抗體與細(xì)胞毒性劑(例如毒素)偶聯(lián)時(shí)，免疫結(jié)合物自身顯示破壞腫瘤細(xì)胞的效果。全長抗體在循環(huán)中具有更長的半衰期。在E.coli中生產(chǎn)更快且成本更低。關(guān)于在細(xì)菌中表達(dá)抗體片段和多肽，例如參見美國專利第5,648,237號(hào)(Carter等人)、美國專利第5,789,199號(hào)(JoIy等人)和美國專利第5,840,523號(hào)(Simmons等人)，其描述了翻譯起始區(qū)(TIR)和用于最優(yōu)化表達(dá)和分泌的信號(hào)序列，通過引用將這些專利并入此處。表達(dá)后，抗體在可溶部分中被從E.coli細(xì)胞糊狀物中分離且可以被純化，例如通過取決于同種型的蛋白A或蛋白G柱。最終純化可以按照與純化在例如CHO細(xì)胞中表達(dá)的抗體的方法類似地進(jìn)行。
除原核細(xì)胞外，真核微生物例如絲狀真菌或酵母是編碼BR3結(jié)合抗體的載體的合適克隆或表達(dá)宿主。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或普通的面包酵母是低等真核宿主微生物中最常使用的。然而，許多其它屬、種和菌株是通常可獲得的且在本發(fā)明中是有用的，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主，例如乳酸克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、K.wickeramii(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母菌(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、K.thermotolerans和馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)；yarrowia(EP402,226)；甲醇酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；念珠菌屬(Candida)；Trichoderma reesia(EP 244,234)；粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)；許旺酵母屬(Schwanniomyces)，例如西方許旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；以及絲狀真菌，例如鏈孢霉屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、彎頸霉屬(Tolypocladium)和曲霉(Aspergillus)宿主，例如構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
適合表達(dá)糖基化BR3結(jié)合抗體的宿主細(xì)胞來自多細(xì)胞生物。無脊椎動(dòng)物細(xì)胞的例子包括植物和昆蟲細(xì)胞。已經(jīng)鑒別了例如來自草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)和家蠶(Bombyx mori)的許多桿狀病毒株和變體和相應(yīng)的允許昆蟲宿主細(xì)胞。可從公開途徑獲得多種用于轉(zhuǎn)染的病毒株，例如苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica NPV)的L-1變體和家蠶NPV(Bombyx mori NPV)的Bm-5株，并且這些病毒可以被用作根據(jù)本發(fā)明的病毒，特別是用于草地貪夜蛾細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。
棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄和煙草的植物細(xì)胞培養(yǎng)物也可被用作宿主。
然而，最感興趣的是脊椎動(dòng)物細(xì)胞，并且脊椎動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中的繁殖已經(jīng)是常規(guī)操作了。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的例子是被SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎腎系(293或?yàn)樵趹腋∨囵B(yǎng)中生長經(jīng)過亞克隆的293細(xì)胞，Graham et al，J.Gen Virol.3659(1977))；小倉鼠(baby hamster)腎細(xì)胞(BHK，ATCCCCL 10)；中國倉鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CHO，Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.ScL USA 774216(1980))；小鼠Sertoli cells(TM4，Mather，Biol.Reprod.23243-251(1980))；猴腎細(xì)胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCCCCL 2)；犬腎細(xì)胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝細(xì)胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細(xì)胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細(xì)胞(Hep G2，HB 8065)，小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI細(xì)胞(Mather etal，Annals N.Y.Acad.ScL 38344-68(1982))；MRC5細(xì)胞；FS4細(xì)胞和人肝細(xì)胞瘤系(Hep G2)。
用上述用于抗體生產(chǎn)的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并且在經(jīng)修飾以適合誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增編碼希望序列的基因的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
(viii)培養(yǎng)宿主細(xì)胞 可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生產(chǎn)本發(fā)明抗體的宿主細(xì)胞?？缮藤彽呐囵B(yǎng)基例如Ham′s F10(Sigma)、Minimal Essential Medium((MEM)，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium((DMEM)，Sigma)適合于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。此外，Ham et al.，Meth.Enz.5844(1979)，Barnes et al.，Anal Biochem.102255(1980)，美國專利第4,767,704號(hào)、第4,657,866號(hào)、第4,927,762號(hào)、第4,560,655號(hào)或第5,122,469號(hào)，WO 90/03430，WO 87/00195或美國專利Re.30,985中描述的任何培養(yǎng)基均可以作為宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基。可以根據(jù)需要向任何這些培養(yǎng)基中補(bǔ)充激素和/或其它生長因子(例如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽類(例如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如GENTAMYCINTM藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機(jī)化合物)和葡萄糖或等效的能量來源。還可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適濃度包括任何其它需要的補(bǔ)充物。培養(yǎng)條件，例如溫度、pH等等，是之前就用于所選用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的那些，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。
(ix)抗體純化 當(dāng)使用重組技術(shù)時(shí)，抗體可以在細(xì)胞內(nèi)、在壁膜間隙中產(chǎn)生或者直接分泌到培養(yǎng)基中。如果抗體在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，作為第一步，除去或者是宿主細(xì)胞或者是溶胞片斷的顆粒碎片，例如通過離心或超濾。Carter et al.，Bio/Technology 10163-167(1992)描述了分離分泌到E.coli的壁膜間隙中的抗體的過程。簡而言之，在乙酸鈉(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下解凍細(xì)胞糊狀物約30分鐘?？梢酝ㄟ^離心除去細(xì)胞碎片。當(dāng)抗體被分泌到培養(yǎng)基中時(shí)，通常首先使用可商購的蛋白濃縮濾膜來濃縮該表達(dá)系統(tǒng)的上清液，所述濾膜例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元?？梢栽谇笆鋈魏尾襟E中包括進(jìn)蛋白酶抑制劑例如PMSF來抑制蛋白水解，且還可以包括抗生素來防止外來污染物的生長。
可以純化從細(xì)胞制備的抗體組合物，例如使用羥磷灰石色譜、疏水作用色譜法、凝膠電泳、透析和親和色譜，且親和色譜為通常優(yōu)選的純化步驟之一。蛋白A作為親和配體的穩(wěn)定性依賴于物種和抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的同種型?？梢允褂玫鞍譇來純化基于人γ1、γ2或γ4重鏈的抗體(Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.621-13(1983))。推薦蛋白G用于所有小鼠同種型以及用于人γ3(Guss etal.，EMBO J.515671575(1986))。親和配體所附著的基質(zhì)最經(jīng)常為瓊脂糖，但其它基質(zhì)也可使用。機(jī)械穩(wěn)定的基質(zhì)，例如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯，使得能夠?qū)崿F(xiàn)比瓊脂糖更快的流速和更短的處理時(shí)間。當(dāng)抗體包含CH3結(jié)構(gòu)域時(shí)，Bakerbond ABXTM樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)對(duì)于純化是有用的。根據(jù)要回收的抗體，還提供蛋白純化的其它技術(shù)，例如離子交換柱分級(jí)分離、乙醇沉淀、反相HPLC、硅膠色譜法、肝素SEPHAROSETM色譜法、陰離子或陽離子交換樹脂(例如聚天冬氨酸柱)色譜法、層析聚焦法、SDS-PAGE和硫酸氨沉淀。
在任何初步純化步驟后，可以使包含感興趣的抗體和污染物的混合物經(jīng)歷低pH疏水作用色譜，使用pH為約2.5-4.5的洗脫液，優(yōu)選在低鹽濃度下進(jìn)行(例如，約0-0.25M鹽)。
抗體偶聯(lián)物 抗體可以被偶聯(lián)到細(xì)胞毒性試劑，例如毒素或放射性同位素。在某些實(shí)施方案種，該毒素為刺孢霉素(calicheamicin)，類美登醇(maytansinoid)、多拉司他汀(dolastatin)、auristatin E及其類似物或衍生物為優(yōu)選的。
優(yōu)選的藥物/毒素包括DNA損傷劑、微管聚合或解聚的抑制劑以及抗代謝物。優(yōu)選細(xì)胞毒素劑的種類例如包括諸如二氫葉酸還原酶抑制劑和胸苷酸合成酶抑制劑的酶抑制劑、DNA嵌入劑、DNA切割劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、蒽環(huán)族藥物、長春花藥物、絲裂霉素類、博來霉素類、細(xì)胞毒性核苷類、蝶啶族藥物、diynene類、鬼臼毒素、以及分化誘導(dǎo)劑。這些種類中尤其有用的成員例如包括氨甲喋呤，甲基葉酸，二氯氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶，6-巰基嘌呤，阿糖胞苷，美法侖，洛諾生(leurosine)，洛諾西丁(leurosideine)，放線菌素，柔紅霉素，多柔比星，N-(5，5-二乙酰氧基戊基)多柔比星，嗎啉代多柔比星，1-(2-二氯乙基(choroehthyl))-1，2-二甲磺酰肼，N8-乙酰基亞精胺，氨基蝶呤甲基葉酸，埃斯波霉素(esperamicin)，絲裂霉素C，絲裂霉素A，放線菌素，博來霉素，洋紅霉素，氨基蝶呤，他利霉素，鬼臼毒素和諸如依托泊苷或依托泊苷磷酸脂的鬼臼毒素衍生物，長春堿，長春新堿，長春地辛，紫杉醇，泰索帝，視黃酸，丁酸，N8-乙酰基亞精胺，喜樹堿，刺孢霉素，草苔蟲素類(bryostatins)，吡嗪雙甾體類(cephalostatins)，安絲菌素(ansamitocin)，布拉地新(actosin)，諸如DM-1、美登素、美登醇、N-脫甲基-4，5-脫環(huán)氧美登醇、C-19-脫氯美登醇、C-20-羥基美登醇、C-20-脫甲氧基美登醇、C-9-SH美登醇、C-14-烷氧基甲基美登醇、C-14-羥基或乙酰氧基甲基美登醇、C-15-羥基/乙酰氧基美登醇、C-15-甲氧基美登醇、C-18-N-脫甲基美登醇以及4，5-脫氧美登醇的類美登醇，諸如auristatin E、M、PHE和PE的auristatin類；諸如dolostatin A、dolostatinB、dolostatin C、dolostatin D、dolostatin E(20-epi和11-epi)、dolostatinG、dolostatin H、dolostatin I、dolostatin 1、dolostatin 2、dolostatin 3、dolostatin 4、dolostatin 5、dolostatin 6、dolostatin 7、dolostatin 8、dolostatin 9、dolostatin 10、deo-dolostatin 10、dolostatin 11、dolostatin12、dolostatin 13、dolostatin 14、dolostatin 15、dolostatin 16、dolostatin17、以及dolostatin 18的dolostatin類；諸如吡嗪雙甾體1、吡嗪雙甾體2、吡嗪雙甾體3、吡嗪雙甾體4、吡嗪雙甾體5、吡嗪雙甾體6、吡嗪雙甾體7、25’-epi-吡嗪雙甾體7、20-epi-吡嗪雙甾體7、吡嗪雙甾體8、吡嗪雙甾體9、吡嗪雙甾體10、吡嗪雙甾體11、吡嗪雙甾體12、吡嗪雙甾體13、吡嗪雙甾體14、吡嗪雙甾體15、吡嗪雙甾體16、吡嗪雙甾體17、吡嗪雙甾體18、以及吡嗪雙甾體19的吡嗪雙甾體類。
類美登醇為有絲分裂抑制劑，其通過乙酯微管素聚合起作用。美登醇起初從東非灌木齒葉美登木(Maytenus serrata)中分離(美國專利號(hào)3,896,111)。隨后，發(fā)現(xiàn)某些微生物也產(chǎn)生類美登醇，如美登醇和C-3美登醇脂(美國專利號(hào)4,151,042)。合成的美登醇及其衍生物和類似物例如公開于第4,137,230號(hào)、第4,248,870號(hào)、第4,256,746號(hào)、第4,260,608號(hào)、第4,265,814號(hào)、第4,294,757號(hào)、第4,307,016號(hào)、第4,308,268號(hào)、第4,308,269第號(hào)、第4,309,428號(hào)、第4,313,946號(hào)、第4,315,929號(hào)、第4,317,821號(hào)、第4,322,348號(hào)、第4,331,598號(hào)、第4,361,650號(hào)、第4,364,866號(hào)、第4,424,219號(hào)、第4,450,254號(hào)、第4,450,254號(hào)、第4,362,663號(hào)以及第4,371,533號(hào)美國專利，通過引用將它們的公開內(nèi)容明確并入本文。
美登素和類美登醇已被偶聯(lián)到特異結(jié)合腫瘤細(xì)胞抗原的抗體。含有類美登醇的免疫偶聯(lián)物和它們的治療用途例如已被公開于第5,208,020號(hào)、第5,416,064號(hào)美國專利以及歐洲專利EP 0425 235 B1中，通過引用將它們的公開內(nèi)容明確并入本文。Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 938618-8623(1996)描述了包含命名為DM1的類美登醇的免疫偶聯(lián)物，其中該DM1連接到抗人結(jié)腸直腸癌的單克隆抗體C242。該偶聯(lián)物被發(fā)現(xiàn)對(duì)培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞有很強(qiáng)毒性，并在體內(nèi)腫瘤生長測定中顯示了抗腫瘤活性。Chari et al.Cancer Research 52127-131(1992)描述了這樣的免疫偶聯(lián)物，其中類美登醇通過二硫化物連接物偶聯(lián)到結(jié)合人結(jié)腸癌細(xì)胞系上的抗原的鼠抗體A7，或偶聯(lián)到結(jié)合HER-2/neu癌基因的另一鼠抗體TA.1。
現(xiàn)有技術(shù)中已知有很多連接基團(tuán)用于制備抗體-類美登醇偶聯(lián)物，例如包括公開于第5,208,020號(hào)美國專利或歐洲專利0 425 235 B1以及Chari et al.Cancer Research 52127-131(1992)中的那些。所述連接基團(tuán)包括二硫化物基團(tuán)、硫醚基團(tuán)、酸敏感基團(tuán)、光敏基團(tuán)、肽酶敏感基團(tuán)或酯酶敏感基團(tuán)，如公開于上述專利中的那些，二硫化物和硫醚基團(tuán)是優(yōu)選的。
抗體和類美登醇的偶聯(lián)物可以通過采用多種雙功能蛋白偶合劑來制備，所述雙功能蛋白偶聯(lián)劑例如為N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯、硫醇亞胺(iminothiolane，IT)、亞胺酯(imidoester)類的雙功能衍生物(例如二甲基adipimidate HCL)、活性酯類(例如二琥珀酰亞胺辛二酸酯)、醛類(例如戊二醛)、雙疊氮基化合物(例如雙(對(duì)疊氮基苯甲?；?己二胺)、雙重氮基衍生物(例如雙-(對(duì)重氮基苯甲?；?-乙二胺)、二異氰酸酯類(例如甲苯2，6-二異氰酸酯)、以及雙活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。尤其優(yōu)選的偶聯(lián)劑包括N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson et al.，Biochem.J.173723-737[1978])和N-琥珀酰亞胺基-4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)來提供二硫鍵。
所述連接物可以在不同位置連接到類美登醇分子，這取決于連接的類型。例如，可以通過采用常規(guī)偶聯(lián)技術(shù)與羥基基團(tuán)反應(yīng)形成酯鍵。該反應(yīng)可以發(fā)生在具有羥基基團(tuán)的C-3位、以羥甲基修飾的C-14位、以羥基基團(tuán)修飾的C-15位、以及具有羥基基團(tuán)的C-20位。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該鍵在美登醇或美登醇類似物的C-3位形成。
刺孢霉素 另一令人感興趣的免疫偶聯(lián)物包含偶聯(lián)到一個(gè)或多個(gè)刺孢霉素分子的BR3結(jié)合抗體。刺孢霉素族抗生素能夠在亞皮摩爾濃度下產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂。關(guān)于制備刺孢霉素族的偶聯(lián)物，參見第5,712,374號(hào)、第5,714,586號(hào)、第5,739,116號(hào)、第5,767,285號(hào)、第5,770,701號(hào)、第5,770,710號(hào)、第5,773,001號(hào)、第5,877,296號(hào)美國專利(都屬于American Cyanamid Company)。可以使用的刺孢霉素結(jié)構(gòu)類似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙?；?γ1I、PSAG和θ1I(Hinman et al.CancerResearch 533336-3342(1993)，Lode et al.Cancer Research 582925-2928(1998)以及上述American Cyanamid的美國專利)。抗體可偶聯(lián)的另一抗腫瘤藥物為抗葉酸素(antifolate)的QFA。刺孢霉素和QFA都具有分子內(nèi)作用位點(diǎn)，并且不易跨過質(zhì)膜。因此，通過抗體介導(dǎo)的內(nèi)化來進(jìn)行這些試劑的細(xì)胞攝取顯著地增強(qiáng)它們的細(xì)胞毒性效應(yīng)。
放射性同位素 對(duì)于腫瘤的選擇性破壞，抗體可以包含高放射性原子。有多種放射性同位素可用于產(chǎn)生放射偶聯(lián)的抗BR3抗體。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212以及Lu的放射性同位素。當(dāng)所述偶聯(lián)物用于診斷，它可以包括用于閃爍法研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也稱為磁共振成像，mri)的自旋標(biāo)記物，例如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
放射或其它標(biāo)記物可以通過已知方式摻入偶聯(lián)物。例如，肽可以被生物合成或被人工合成，其中采用包括例如氟-19替換氫的合適的氨基酸前體來進(jìn)行化學(xué)氨基酸合成。諸如tc99m或I123、Re186、Re188以及In111的標(biāo)記物可通過肽中的半胱氨酸殘基連接。釔-90可通過賴氨酸殘基連接。IODOGEN方法(Fraker et al.(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.8049-57)可用于摻入碘-123?！癕onoclonal Antibodies inImmunoscintigraphy”(Chatal，CRC Press 1989)詳細(xì)描述了其它方法。
抗體和細(xì)胞毒素劑的偶聯(lián)物可以通過采用多種雙功能蛋白偶合劑來制備，所述雙功能蛋白偶聯(lián)劑例如為N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯、硫醇亞胺(IT)、亞胺酯類的雙功能衍生物(例如二甲基adipimidate HCl)、活性酯類(例如二琥珀酰亞胺辛二酸酯)、醛類(例如戊二醛)、雙疊氮基化合物(例如雙(對(duì)疊氮基苯甲?；?己二胺)、雙重氮基衍生物(例如雙-(對(duì)重氮基苯甲?；?-乙二胺)、二異氰酸酯類(例如甲苯2，6-二異氰酸酯)、以及雙活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可按Vitetta et al.Science 2381098(1987)中的描述來制備。碳-14-標(biāo)記的1-異硫氰酸根合芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于偶聯(lián)放射性核素到抗體的示例性螯合劑。參見WO 94/11026。連接物可以是“可切割的連接物”，有助于在細(xì)胞中釋放細(xì)胞毒性藥物。例如，可以使用酸敏感的連接物、肽敏感的連接物、光敏感的連接物、二甲基連接物或含有二硫化物的連接物(Chari et al.Cancer Research 52127-131(1992)；美國專利號(hào)5,208,020)。
BR3結(jié)合抗體的治療用途 本發(fā)明的BR3結(jié)合抗體可用于治療眾多惡性和非惡性疾病，包括自身免疫性疾病和相關(guān)疾病狀態(tài)，以及包括B細(xì)胞淋巴瘤和白血病的BR3陽性癌。骨髓中的干細(xì)胞(B細(xì)胞的祖細(xì)胞)缺乏BR3抗原，使得健康B細(xì)胞能夠在治療后再生并在幾個(gè)月內(nèi)返回到正常水平。
自身免疫性疾病或自身免疫性相關(guān)疾病狀態(tài)包括關(guān)節(jié)炎(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎)、牛皮癬、包括特應(yīng)性皮炎在內(nèi)的皮炎；慢性自身免疫性蕁麻疹、多發(fā)性肌炎/皮肌炎、中毒性表皮壞死松解癥、全身性硬皮病和硬化、與炎性腸病(IBD)(克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎)有關(guān)的反應(yīng)、呼吸窘迫綜合征、成年呼吸窘迫綜合征(ARDS)、腦膜炎、變應(yīng)性鼻炎、腦炎、眼色素層炎、結(jié)腸炎、腎小球性腎炎、變應(yīng)性疾病狀態(tài)、濕疹、哮喘、涉及T細(xì)胞濾過和慢性炎性應(yīng)答的疾病狀態(tài)、動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫性心肌炎、白細(xì)胞粘附缺陷、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、狼瘡(包括腎炎、非腎臟的、盤狀的、脫發(fā))、青少年型糖尿病、多發(fā)性硬化、變應(yīng)性腦脊髓炎、與細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)性超敏反應(yīng)有關(guān)的免疫反應(yīng)、結(jié)核、肉樣瘤病、包括韋格納肉芽腫病在內(nèi)的肉芽腫病、粒細(xì)胞缺乏癥、血管炎(包括ANCA)、再生障礙性貧血、Coombs試驗(yàn)陽性貧血、戴-布貧血、包括自身免疫性溶血性貧血(AJHA)在內(nèi)的免疫性溶血性貧血、惡性貧血、單純紅細(xì)胞再生障礙(PRCA)、因子VIII缺陷、血友病A、自身免疫性中性白細(xì)胞減少癥、各類血細(xì)胞減少癥、白細(xì)胞減少癥、涉及白細(xì)胞血球滲出的疾病、CNS炎性疾病、多器官損傷綜合征、重癥肌無力、抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病、抗腎小球基底膜病、抗磷脂抗體綜合征、過敏性神經(jīng)炎、Bechet病、Castleman綜合征、古德帕斯丘綜合征、Lambert-Eaton肌無力綜合征、雷諾氏綜合征、舍格倫綜合征、斯-約綜合征、實(shí)體器官移植排斥(包括對(duì)高群體反應(yīng)性抗體滴度的預(yù)處理、IgA在組織中沉積，等等)、移植物抗宿主病(GVHD)、大皰性類天皰瘡、天皰瘡(所有的，包括尋常性天皰瘡、落葉性天皰瘡)、自身免疫性多內(nèi)分泌腺疾病、賴特爾病、硬漢綜合征、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、免疫復(fù)合物腎炎、IgA腎病、IgM多發(fā)性神經(jīng)病或IgM介導(dǎo)的腎炎、特發(fā)性血小板減少性紫癲(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板減少癥、包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎的睪丸和卵巢自身免疫性疾病、原發(fā)性甲狀腺功能減退癥、包括自身免疫性甲狀腺炎的自身免疫性內(nèi)分泌疾病、慢性甲狀腺炎(橋本甲狀腺炎)、亞急性甲狀腺炎、特發(fā)性甲狀腺功能減退癥、阿狄森病、Grave’s病、自身免疫性多腺體綜合征(或多腺體內(nèi)分泌病綜合征)、也稱為胰島素依賴型糖尿病的I型糖尿病以及希恩綜合征；自身免疫性肝炎、淋巴樣間質(zhì)性肺炎(HIV)、梗阻性細(xì)支氣管炎(非移植的)vs NSIP、格-巴二氏綜合征、大脈管血管炎(包括風(fēng)濕性多肌病和巨細(xì)胞(Takayasu’s)動(dòng)脈炎)、中脈管血管炎(包括川畸病和結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎)、強(qiáng)直性脊柱炎、Berger’s病(IgA腎病)、急進(jìn)性腎小球性腎炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、口炎性腹瀉(麩質(zhì)腸病)、冷球蛋白血癥、ALS、冠狀動(dòng)脈疾病。
BR3陽性癌癥為那些包括在細(xì)胞表面表達(dá)BR3的細(xì)胞的異常增殖的癌癥。BR3陽性B細(xì)胞瘤包括BR3陽性何杰金氏病，包括淋巴細(xì)胞為主的何杰金氏病(LPHD)；非何杰金氏淋巴瘤(NHL)；濾泡中心細(xì)胞(FCC)淋巴瘤；急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)；慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)；毛細(xì)胞白血病。非何杰金氏淋巴瘤包括低度惡性/濾泡何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴細(xì)胞淋巴瘤(SLL)、中度惡性/濾泡NHL、中度惡性彌散性NHL、高度惡性免疫母細(xì)胞NHL、高度惡性淋巴母細(xì)胞NHL、高度惡性小無裂細(xì)胞NHL、巨瘤癥NHL、類質(zhì)漿細(xì)胞淋巴細(xì)胞淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、AIDS相關(guān)淋巴瘤和原發(fā)性巨球蛋白血癥。還涉及了對(duì)這些癌癥的復(fù)發(fā)的治療。LPHD是盡管經(jīng)過放療和化療治療但依然傾向于經(jīng)常復(fù)發(fā)的何杰金氏病類型，并且可以被BR3陽性惡性細(xì)胞所表征。CLL是白血病的四種主要類型之一。被稱為淋巴細(xì)胞的成熟B細(xì)胞的癌癥，CLL表現(xiàn)為細(xì)胞在血液、骨髓和淋巴組織中的進(jìn)行性積蓄。
在具體的實(shí)施方案中，所述BR3結(jié)合抗體及其功能性片段用于治療非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、淋巴細(xì)胞為主的何杰金氏病(LPHD)、小淋巴細(xì)胞淋巴瘤(SLL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和青少年型風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、包括狼瘡性腎炎的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、韋格納病、炎性腸病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板減少癥、多發(fā)性硬化癥、牛皮癬、IgA腎炎、IgM多發(fā)性神經(jīng)病、重癥肌無力、血管炎、糖尿病、雷諾氏綜合征、舍格倫綜合征以及血管球性腎炎。
BR3結(jié)合抗體或其功能性片段可用作例如復(fù)發(fā)的或難治愈的低度或?yàn)V泡的、BR3陽性B細(xì)胞NHL的單一藥劑治療，或可在多藥物方案中與其它藥物一起給予患者。
緩慢進(jìn)展淋巴瘤是緩慢生長的不可治愈疾病，其中普通患者在多個(gè)好轉(zhuǎn)和復(fù)發(fā)期后存活6至10年。在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化的BR3結(jié)合抗體或其功能性片段用于治療緩慢進(jìn)展NHL。
用于評(píng)估腫瘤治療的有效性或是否成功的參數(shù)對(duì)于該適合疾病領(lǐng)域的熟練醫(yī)師來說是已知的。通常，熟練醫(yī)師會(huì)關(guān)注特定疾病體征和癥狀的減弱。參數(shù)可包括疾病進(jìn)展的中值時(shí)間，好轉(zhuǎn)、疾病穩(wěn)定的時(shí)間。
以下的參考文獻(xiàn)描述了淋巴瘤和CLL、它們的診斷、治療以及檢測治療有效性的標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)程序。
以下的參考文獻(xiàn)描述了淋巴瘤和CLL、它們的診斷、治療以及測量治療有效性的標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)程序。Canellos GP，Lister，TA，Sklar JLTheLymphomas(淋巴瘤).W.B.Saunders Company，Philadelphia，1998；vanBesien K和Cabanillas，F(xiàn)Clinical Manifestations，Staging andTreatment of Non-Hodgkin’s Lymphoma (非何杰金氏淋巴瘤的臨床表現(xiàn)、分期和治療)，Chap.70，pp 1293-1338，inHematology，BasicPrinciples and Practice，3rd ed.Hoffman et al.(編者).ChurchillLivingstone，Philadelphia，2000；以及Rai，K和Patel，DChronicLymphocytic Leukemia(慢性淋巴性白血病)，Chap.72，pp 1350-1362，inHematology，Basic Principles and Practice，3rd ed.Hoffman et al.(等人).Churchill Livingstone，Philadelphia，2000。
用于評(píng)估自身免疫疾病或自身免疫相關(guān)疾病的治療的有效性或是否成功的參數(shù)對(duì)于該適當(dāng)疾病領(lǐng)域的熟練醫(yī)師來說是已知的。通常，熟練醫(yī)師會(huì)關(guān)注特定疾病體征和癥狀的減弱。以下的描述是示例性的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)。RA以多個(gè)關(guān)節(jié)炎癥、軟骨喪失和骨質(zhì)侵蝕為特征，其導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞并最終減弱關(guān)節(jié)功能。此外，由于RA為系統(tǒng)性疾病，它可對(duì)其它組織有影響，例如肺、眼、和骨髓。少于50％的患者在患有RA長于10年后仍能繼續(xù)工作或逐漸功能正常。
抗體可用作患有早期RA的患者(即沒有用氨甲喋呤(MTX)治療的)的一線療法，并作為單一療法，或與例如MTX或環(huán)磷酰胺聯(lián)合?；蛘撸隹贵w可作為二線療法用在對(duì)DMARD和/或MTX治療不顯療效的患者的治療中，并作為單一療法或與例如MTX聯(lián)合。人源化BR3結(jié)合抗體可用于在RA中防止和控制關(guān)節(jié)損傷、延遲結(jié)構(gòu)性損傷、減小與炎癥有關(guān)的疼痛，通常在中度至嚴(yán)重RA中減弱體征和癥狀。該RA患者可在用其它治療RA的藥物治療之前、之后或同時(shí)(參見以下的聯(lián)合治療)用人源化的BR3抗體治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，之前用緩解疾病的抗風(fēng)濕性藥物治療無效和/或?qū)为?dú)的氨甲喋呤無充分反應(yīng)的患者以本發(fā)明的人源化BR3結(jié)合抗體治療。在這種治療的一個(gè)實(shí)施方案中，患者在17日治療方案中接受單獨(dú)人源化BR3結(jié)合抗體(第1和第15天靜脈輸注1g)；BR3結(jié)合抗體加環(huán)磷酰胺(第3和第17天靜脈輸注750mg)；或BR3結(jié)合抗體加氨甲喋呤。
評(píng)價(jià)RA治療有效性的一種方法基于美國風(fēng)濕病學(xué)學(xué)院(AmericanCollege of Rheumatology，ACR)標(biāo)準(zhǔn)，其測量觸痛和腫脹關(guān)節(jié)的改善百分比以及其它事項(xiàng)。與無抗體治療(例如治療前的基線水平)或以安慰劑治療相比，RA患者可評(píng)分為例如ACR 20(改善20％)。評(píng)價(jià)抗體治療有效性的其它方式包括用于評(píng)價(jià)諸如骨質(zhì)侵蝕和關(guān)節(jié)腔變窄的結(jié)構(gòu)性損傷的X射線評(píng)分，例如Sharp X射線評(píng)分。也可基于健康評(píng)定問卷[HAQ]評(píng)分對(duì)患者在防止殘疾或在殘疾改善方面作出評(píng)價(jià)。ACR 20標(biāo)準(zhǔn)可以包括在觸痛(疼痛)關(guān)節(jié)數(shù)和腫脹關(guān)節(jié)數(shù)上的20％改善加上在5項(xiàng)以下測量中的至少3項(xiàng)中的20％改善 1.通過直觀類比尺度(VAS)的患者疼痛評(píng)價(jià)， 2.疾病活躍性的患者整體評(píng)價(jià)(VAS)， 3.疾病活躍性的醫(yī)師整體評(píng)價(jià)(VAS)， 4.通過健康評(píng)定問卷的患者自評(píng)殘疾，以及 5.急性期反應(yīng)物，CRP或ESR。
類似地定義ACR 50和70。優(yōu)選地，所述患者被給予有效量的本發(fā)明BR3結(jié)合抗體以實(shí)現(xiàn)至少ACR 20，優(yōu)選至少ACR 30，更優(yōu)選至少ACR 50，甚至更優(yōu)選至少ACR 70，最有選ACR 75和更高。
牛皮癬性關(guān)節(jié)炎具有獨(dú)特和不同的放射學(xué)特征。對(duì)于牛皮癬性關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)侵蝕和關(guān)節(jié)腔變窄也可通過Sharp評(píng)分來評(píng)價(jià)。本發(fā)明的人源化BR3結(jié)合抗體可用于防止關(guān)節(jié)損傷以及減弱該病癥的體征和癥狀。
本發(fā)明的另一方面是通過給予患有SLE的患者治療有效量本發(fā)明BR3結(jié)合抗體來治療狼瘡(Lupus)或SLE的方法。SLEDAI提供了疾病活躍性的數(shù)值定量。SLEDAI為24個(gè)與疾病活躍性有關(guān)的臨床和實(shí)驗(yàn)室參數(shù)的加權(quán)指數(shù)，數(shù)值范圍在0-103。參見Bryan Gescuk & John Davis，“Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus(系統(tǒng)性紅斑狼瘡的新治療劑)”in Current Opinion in Rheumatology 2002，14515-521。針對(duì)雙鏈DNA的抗體被認(rèn)為會(huì)引起腎炎癥和其它狼瘡表現(xiàn)?？杀O(jiān)視接受抗體治療的患者的腎炎癥的進(jìn)程，腎炎癥被定義為血清肌酸酐、尿蛋白或尿血的顯著的、可重現(xiàn)的增加?；蛘?，或另外，可監(jiān)測患者抗核抗體和抗雙鏈DNA抗體的水平。對(duì)SLE的治療包括大劑量的皮質(zhì)激素和/或環(huán)磷酰胺(HDCC)。
脊椎關(guān)節(jié)病是一組關(guān)節(jié)疾病，包括強(qiáng)直性脊柱炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎和克羅恩病(Crohn’s disease)?？赏ㄟ^確認(rèn)的患者和醫(yī)師的整體評(píng)價(jià)測量手段來確定治療的成功。
多種藥物處理可用于治療牛皮癬；治療的不同直接與疾病嚴(yán)重性有關(guān)?；加休^輕型的牛皮癬通常采用局部治療來控制疾病，例如采用局部類固醇、蒽啉、卡泊三烯(calcipotriene)、氯倍他索和他佐羅汀，而患有中度和重度牛皮癬的患者更可能采用全身性(氨甲喋呤、視黃酸類、環(huán)磷酰胺、PUVA和UVB)療法。焦油也被使用。這些療法具有合并的安全顧慮、耗時(shí)的治療方案或不便的治療過程。此外，一些療法需要昂貴的設(shè)備和診所中的專用空間。全身性藥物處理可產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，包括高血壓、高脂血癥、骨髓抑制、肝病、腎臟病和胃腸不適。另外，光療的使用可增加皮膚癌的發(fā)病率。除了與使用局部療法相關(guān)的不變和不適之外，光療和全身性治療還要求使患者循環(huán)接受和停止治療，并且由于它們的副作用還監(jiān)測終身接觸量(lifetimeexposure)。
對(duì)牛皮癬的治療通過監(jiān)測疾病臨床體征和癥狀的變化來進(jìn)行，這包括與基線狀況相比的醫(yī)師的整體評(píng)價(jià)(PGA)變化以及牛皮癬面積和嚴(yán)重性指數(shù)(PASI)評(píng)分、牛皮癬癥狀評(píng)價(jià)(PSA)?；颊呖稍谥委熎陂g定期進(jìn)行測量，該測量基于用于表明在特定時(shí)間點(diǎn)感受的搔癢程度的直觀類比標(biāo)度。
患者可能在他們首次輸注治療抗體時(shí)經(jīng)歷輸液反應(yīng)或輸液相關(guān)癥狀。這些癥狀的嚴(yán)重性不同，通常在醫(yī)學(xué)干預(yù)下會(huì)逆轉(zhuǎn)。這些癥狀包括但不限于流感樣發(fā)熱、寒戰(zhàn)/僵直、惡心、蕁麻疹、頭疼、支氣管痙攣、血管性水腫。本發(fā)明的疾病治療方法最小化輸液反應(yīng)是所期望的。因此，本發(fā)明的另一方面是通過給予BR3結(jié)合抗體的疾病治療方法，其中所述抗體具有減小的或無補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性。
劑量 取決于待治療的適應(yīng)癥和本領(lǐng)域醫(yī)師熟知的與給藥有關(guān)的因素，本發(fā)明的抗體將以有效治療該適應(yīng)癥并使毒性和副作用最小化的劑量給藥。為了治療癌癥、自身免疫疾病或免疫缺陷疾病，該治療有效劑量可為50mg/劑至2.5g/m2。在一個(gè)實(shí)施方案中，該給藥劑量為約250mg/m2至約400mg/m2或500 mg/m2。在一個(gè)實(shí)施方案中，該劑量為約250-375mg/m2。在另一實(shí)施方案中，該劑量范圍為275-375mg/m2。
在一個(gè)治療本文描述的BR3陽性B細(xì)胞瘤(例如慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、濾泡性淋巴瘤(FL)或多發(fā)性骨髓瘤)的實(shí)施方案中，所述抗體以50mg/劑至2.5g/m2給藥。對(duì)于治療患有諸如非何杰金氏淋巴瘤的B細(xì)胞淋巴瘤的患者的治療，在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗BR3抗體和人源化抗BR3抗體將以10mg/kg或375mg/m2的劑量給予人類患者。對(duì)于治療NHL，一種給藥方案為在治療的第一周以10mg/kg的劑量給予一劑抗體組合物，間歇兩周，然后給予同樣量的第二劑。通常，NHL患者可一年接受這種治療一次，但是一旦有淋巴瘤復(fù)發(fā)，可重復(fù)這種治療。在另一給藥方案中，所治療的患有低度NHL的患者接受4周的抗BR3抗體(375mg/m2每周)，在第5周后是3個(gè)附加療程的所述抗體加上標(biāo)準(zhǔn)的CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松)或CVP(環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松)化療，其每三周進(jìn)行一次，循環(huán)三次。
對(duì)于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，在一個(gè)實(shí)施方案中，抗BR3抗體的劑量范圍為125mg/m2(等于約200mg/劑)至600mg/m2，以兩劑給藥，例如在第一天給予200mg的第一劑，隨后在第15天給予200mg的第二劑。在不同的實(shí)施方案中，所述劑量選自250mg/劑、275mg/劑、300mg/劑、325mg/劑、350mg/劑、375mg/劑、400mg/劑、425mg/劑、450mg/劑、475mg/劑、500mg/劑、525mg/劑、550mg/劑、575mg/劑以及600mg/劑。
在疾病治療中，本發(fā)明額BR3結(jié)合抗體可長期地或間歇地給予患者，這由熟悉該疾病的醫(yī)師來決定。
通過靜脈內(nèi)輸注或皮下給藥的患者可能經(jīng)歷一些不良反應(yīng)，例如發(fā)熱、寒戰(zhàn)、灼熱感、無力和頭痛。為了減輕或最小化這些不良反應(yīng)，患者可以接受起始的調(diào)整劑量的抗體，隨后為治療劑量。該調(diào)整劑量低于治療劑量以使患者耐受更高劑量。
本發(fā)明的BR3結(jié)合抗體(1)缺乏ADCC功能或與包含野生型人IgGFc的抗體相比具有減小的ADCC功能；(2)缺乏部分地或全部抑制BAFF結(jié)合到BR3的能力或(3)缺乏ADCC功能或與包含野生型人IgGFc的抗體相比具有減小的ADCC功能，并且缺乏部分地或全部抑制BAFF結(jié)合到BR3的能力，這樣的BR3結(jié)合抗體是有用的，例如用在對(duì)抑制BAFF和BR3結(jié)合以及具有ADCC功能的抗BR3抗體療法具有或預(yù)計(jì)具有顯著不良反應(yīng)的患者的補(bǔ)充療法、替代療法或維持療法中。例如，考慮患者可首先用抑制BAFF和BR3結(jié)合以及具有ADCC功能的抗BR3抗體治療，然后以如下抗BR3抗體治療即其(1)缺乏ADCC功能或與包含野生型人IgG Fc的抗體相比具有減小的ADCC功能；(2)缺乏部分地或全部抑制BAFF結(jié)合到BR3的能力或(3)缺乏ADCC功能或與包含野生型人IgG Fc的抗體相比具有減小的ADCC功能，并且缺乏部分地或全部抑制BAFF結(jié)合到BR3的能力。
給藥途徑 所述BR3結(jié)合抗體按照已知方法給予人類患者，例如靜脈內(nèi)給藥，例如作為快速注射(bolus)或通過在一段時(shí)間內(nèi)的連續(xù)輸注，通過皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)或吸入途徑，通常通過靜脈內(nèi)或皮下給藥。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗BR3抗體與作為輸注載體的0.9％氯化鈉溶液一起通過靜脈內(nèi)輸注給藥。在另一實(shí)施方案中，所述抗BR3抗體以預(yù)裝注射器給藥。
聯(lián)合治療 本發(fā)明的BR3結(jié)合抗體或多肽可與第二治療劑聯(lián)合使用來治療疾病。應(yīng)理解術(shù)語第二治療劑并不排除以其它另外的療法治療該個(gè)體。提及第二治療劑旨在將該治療劑與也在使用的特異的BR3結(jié)合抗體或多肽區(qū)別開。在一個(gè)實(shí)施方案中，以BR3結(jié)合抗體或多肽治療自身免疫疾病或癌癥的患者可用生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(BRM)同時(shí)、順序(之前或之后)或交替治療，以刺激或恢復(fù)免疫系統(tǒng)功能以在多藥物方案中對(duì)抗疾病和/或感染。BRM可包括單克隆抗體，例如靶向TNF-α或IL-1的抗體(例如Enbrel_、Remicade_、以及Humira_)、干擾素、白介素(例如IL-2、IL-12)和各種類型的集落刺激因子(CSF、GM-CSF、G-CSF)。例如，BRM可能干擾炎癥活性，最終減小關(guān)節(jié)損傷。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二治療劑為IAP抑制劑。
在另一實(shí)施方案中，以BR3結(jié)合抗體或多肽治療自身免疫疾病或癌癥的患者可用B細(xì)胞去除劑同時(shí)、順序(之前或之后)或交替治療。
在一個(gè)實(shí)施方案中，以BR3結(jié)合抗體或多肽治療自身免疫疾病或癌癥的患者可用BAFF拮抗劑同時(shí)、順序(之前或之后)或交替治療。
在另一實(shí)施方案中，對(duì)于上述的癌癥和腫瘤，所述患者可在多藥物方案中用本發(fā)明的BR3結(jié)合抗體聯(lián)合一種或多種諸如化療劑的治療劑進(jìn)行治療。所述BR3結(jié)合抗體可與所述化療劑同時(shí)、順序(之前或之后)或交替給藥，或在對(duì)其它療法無反應(yīng)后給藥。對(duì)淋巴瘤治療的標(biāo)準(zhǔn)化療可以包括環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、美法侖、以及米托蒽醌加美法侖。CHOP是治療非何杰金氏淋巴瘤的最常用化療方案。以下為用在CHOP方案中的藥物環(huán)磷酰胺(商品名稱cytoxan，neosar)；阿霉素(多柔比星/羥基多柔比星)；長春新堿(Oncovin)；以及潑尼松龍(有時(shí)稱為Deltasone或Orasone)。在具體的實(shí)施方案中，所述BR3結(jié)合抗體與化療劑多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松龍中的一種或多種聯(lián)合向有需要的患者給藥。在具體的實(shí)施方案中，患有淋巴瘤的患者用本發(fā)明的抗BR3抗體與CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松龍)療法聯(lián)合治療。在另一實(shí)施方案中，患者癌癥或腫瘤可用本發(fā)明的BR3結(jié)合抗體聯(lián)合CVP(環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松龍)化療進(jìn)行治療。在具體的實(shí)施方案中，患有BR3陽性NHL的患者用人源化抗BR3抗體與CVP聯(lián)合治療。在治療慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)的具體實(shí)施方案中，所述BR3結(jié)合抗體與使用一種或多種核苷類似物化學(xué)療法聯(lián)合給藥，或與使用環(huán)磷酰胺的化學(xué)療法聯(lián)合給藥，所述核苷類似物例如為氟達(dá)拉濱、克拉屈濱(2-氯脫氧腺苷，2-CdA[Leustatin])、噴司他丁(Nipent)。
在治療上述自身免疫疾病或自身免疫相關(guān)疾病狀態(tài)中，例如在多藥物方案中，所述患者可用本發(fā)明的BR3結(jié)合抗體與第二化療劑聯(lián)合治療，該化療劑例如為免疫抑制劑。BR3結(jié)合抗體可與免疫抑制劑同時(shí)、順序或交替給藥，或在對(duì)其它治療無反應(yīng)時(shí)給藥。所述免疫抑制劑可以等于或少于現(xiàn)有技術(shù)中指出的劑量給藥。優(yōu)選的輔助免疫抑制劑取決于很多因素，包括所治療的病癥的類型以及患者的病史。
這里所用的用于輔助治療的“免疫抑制劑”指用作抑制或掩蓋患者的免疫系統(tǒng)的物質(zhì)。這些試劑包括抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生、下調(diào)或抑制自身抗原的表達(dá)、或掩蓋MHC抗原的物質(zhì)。這些試劑的實(shí)例包括類固醇，如糖皮質(zhì)激素，如潑尼松、甲基潑尼松和地塞米松；2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(參見美國專利4,665,077)、硫唑嘌呤(或環(huán)磷酰胺，如果對(duì)硫唑嘌呤有副反應(yīng))；溴隱定；戊二醛(其掩蓋MHC抗原，如美國專利4,120,649所述)；針對(duì)MHC抗原和MHC片段的抗獨(dú)特型抗體； 環(huán)孢素A；細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體拮抗劑，包括抗干擾素γ、β、或α的抗體；抗腫瘤壞死因子-α抗體；抗腫瘤壞死因子-β抗體；抗白介素-2抗體和抗IL-2受體抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細(xì)胞球蛋白；pan(泛)-T抗體、優(yōu)選抗-CD3或抗--CD4/CD4a抗體；含有LFA-3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可溶肽(WO 90/08187，1990年7月26日公開)；鏈激酶；TGF-β；鏈道酶；來自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脫氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷怕霉素(rapamycin)；T細(xì)胞受體(美國專利5,114,721)；T細(xì)胞受體片段(Offner et al.，Science 251430-432(1991)；WO 90/11294；以及WO 91/01133)；以及T細(xì)胞受體抗體(EP340,109)，如T10B9。
對(duì)于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，所述患者可用本發(fā)明的BR3抗體與以下藥物的一種或多種聯(lián)合治療DMARDS(緩解疾病的抗風(fēng)濕性藥物(例如氨甲喋呤)、NSAI或NSAID(非類固醇抗炎藥物)、HUMIRA_(阿達(dá)木單抗；Abbott Laboratories)、ARAVA_(來氟米特)、REMICADE_(英夫利昔單抗；Centocor Inc.，ofMalvern，Pa)；ENBREL_(依那西普；Immunex，WA)；COX-2抑制劑。通常用于RA的DMARDs為羥基cloroquine、柳氮磺吡啶、氨甲喋呤、來氟米特、依那西普、英夫利昔單抗、硫唑嘌呤、D-青霉胺、金制劑(口服)、金制劑(肌內(nèi))、米諾環(huán)素、環(huán)孢素、葡萄球菌蛋白A免疫吸附。阿達(dá)木單抗是結(jié)合TNF的人單克隆抗體。英夫利昔單抗是結(jié)合TNF的嵌合單克隆抗體。依那西普是“免疫粘合素”融合蛋白，由人75kD(p75)腫瘤壞死因子受體(TNFR)的細(xì)胞外配體結(jié)合部分連接到人IgG1的Fc部分構(gòu)成。對(duì)于RA的常規(guī)治療，參見例如“Guidelines for the management of rheumatoidarthritis”Arthritis & Rheumatism 46(2)328-346(2002年2月)。在具體的實(shí)施方案中，該RA患者用本發(fā)明的BR3抗體與氨甲喋呤(MTX)聯(lián)合治療。示例性的MTX劑量為約7.5-25mg/kg/wk。MTX可口服和皮下給藥。
對(duì)于治療強(qiáng)直性脊柱炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎和克羅恩病，患者可用本發(fā)明的BR3結(jié)合抗體與例如Remicade_(英夫利昔單抗；來自Centocor Inc.，of Malvern，Pa.)、ENBREL_(依那西普；Immunex，WA)聯(lián)合治療。
治療SLE包括高劑量的皮質(zhì)激素和/或環(huán)磷酰胺(HDCC)。
對(duì)于治療牛皮癬，患者可給予BR3結(jié)合抗體并結(jié)合局部治療，例如局部類固醇、蒽啉、卡泊三烯、氯倍他索以及他佐羅汀，或者結(jié)合氨甲喋呤、類視黃醇、環(huán)孢素、PUVA和UVB療法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述牛皮癬患者用BR3抗體與環(huán)孢素順序或同時(shí)治療。
藥物制劑 通過將具有所需純度的抗體與任選的藥物可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980))混合，來制備用于儲(chǔ)存的本發(fā)明所用BR3結(jié)合抗體的治療制劑，形式為凍干制劑或水溶液?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在使用劑量和濃度下對(duì)接受者無毒性，并包括諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸的緩沖劑；包括抗壞血酸和蛋氨酸在內(nèi)的抗氧化劑；防腐劑(例如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯化六甲銨；苯扎氯銨、芐索氯銨；苯酚、丁基或芐基醇；烷基對(duì)羥基苯甲酸酯類，如甲基或丙基對(duì)羥基苯甲酸酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；以及間甲酚)；低分子量(少于約10殘基)多肽；蛋白，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，如olyvinylpyrrolidone；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖以及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成鹽的抗衡離子，如鈉；金屬復(fù)合物(例如Zn-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
示例性的抗BR3抗體制劑描述在WO 98/56418中，將其通過參考明確并入本文。另一種制劑為液體多劑量制劑，包含40mg/mL的抗BR3抗體、25mM醋酸鹽、150mM海藻糖、0.9％芐醇、0.02％聚山梨醇酯20，pH5.0，其在2-8℃貯存具有最少兩年的保存期。另一感興趣的抗BR3制劑包含在9.0mg/mL氯化鈉、7.35mg/mL二水合檸檬酸鈉、0.7mg/mL聚山梨醇酯80以及無菌注射用水中的10mg/mL抗體，pH6.5。另一含水藥物制劑包含約pH4.8至約pH5.5(優(yōu)選pH5.5)的10-30mM的醋酸鈉、0.01-0.1％v/v的量的作為表面活性劑的聚山梨醇酯、約2-10％w/v的量的海藻糖以及作為防腐劑的芐醇(U.S.6,171,586)。適于皮下給藥的凍干制劑描述在WO 97/04801中。這類凍干制劑可以與合適的稀釋劑重新配制成高蛋白濃度，并且重新配制的制劑可以皮下給予待治療的哺乳動(dòng)物。
一種用于人源化抗BR3抗體的制劑為在10mM組氨酸、6％蔗糖、0.02％聚山梨醇酯20中的12-14mg/mL抗體，pH5.8。
在具體的實(shí)施方案中，抗BR3抗體，尤其是9.1RF、9.1RF(N434突變體)或V3-46s以20mg/mL抗體配制在10mM組氨酸硫酸鹽、60mg/ml蔗糖、0.2mg/ml聚山梨醇酯20，以及無菌注射用水中，pH5.8。
如應(yīng)治療的適應(yīng)癥所需，這里的制劑還可以含有多于一種活性化合物，優(yōu)選具有互補(bǔ)活性且相互間無不良影響的那些。例如，可能希望進(jìn)一步提供細(xì)胞毒素劑、化療劑、細(xì)胞因子或免疫抑制劑(例如，作用于T細(xì)胞的試劑，如環(huán)孢素，或結(jié)合T細(xì)胞的抗體，如結(jié)合LFA-1的抗體)。這類其它試劑的有效量取決于存在于制劑中的抗體量、疾病或病癥或治療的類型、以及以上討論的其它因素。它們通常以與這里描述的劑量和給藥途徑相同的方式使用，或者以之前采用的劑量的約1至99％使用。
也可以將活性成分納入例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合技術(shù)制備的微囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微囊和聚甲基丙烯酸甲酯微囊)中、膠體給藥系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)或粗乳狀液(macroemulsion)中。這些技術(shù)公開在Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)中。
可以制備緩釋制劑。合適的緩釋制劑的例子包括含有所述拮抗劑的固體疏水聚合物的半通透基質(zhì)，這些基質(zhì)為有形物，例如膜或微囊。緩釋基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-甲基丙烯酸羥乙酯)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利3,773,919)、L-谷氨酸和乙基L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羥乙酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(可注射的微球，由乳酸-羥乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成)、以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
用于體內(nèi)給藥的制劑必需是無菌的。這可容易地通過濾過無菌過濾膜來完成。
制品和試劑盒 本發(fā)明的另一實(shí)施方案為含有可用于治療自身免疫疾病和相關(guān)疾病狀態(tài)以及BR3陽性癌(如非何杰金氏淋巴瘤)的物質(zhì)的制品。本發(fā)明的又一實(shí)施方案為含有可用于治療免疫缺陷疾病的物質(zhì)的制品。所述制品包括容器和置于容器上或伴隨容器的標(biāo)簽或藥品說明書。適合的容器例如包括瓶、小瓶、注射器等。這些容器可以從多種材料形成，例如玻璃或塑料。所述容器容納有有效治療所述疾病狀態(tài)的組合物，并且可能具有無菌入口(例如該容器可能為靜脈注射溶液袋，或具有皮下注射針可刺入的塞子的小瓶)。所述組合物中的至少一種活性劑為發(fā)明的BR3結(jié)合抗體。所述標(biāo)簽或藥品說明書指明所述組合物可用于治療特定疾病狀態(tài)。所述標(biāo)簽或藥品說明書進(jìn)一步包括關(guān)于向患者給予抗體組合物的說明。還涉及包含本文描述的聯(lián)合療法的制品和試劑盒。
藥品說明書指通常包括在治療產(chǎn)品的商業(yè)包裝中的說明書，含有關(guān)于適應(yīng)癥、用法、給藥、禁忌癥和/或關(guān)于使用這種治療產(chǎn)品的告誡事項(xiàng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥品說明書表明所述組合物可用于治療非何杰金氏淋巴瘤。
此外，所述制品可以進(jìn)一步包括包括第二容器，其中包含藥物可接受的緩沖劑，如滅菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。其可進(jìn)一步包括其它從商業(yè)和使用者立場來看所需的其它物質(zhì)，包括其它的緩沖劑、稀釋劑、濾器、針和注射器。
還提供了可用于多個(gè)目的的試劑盒，例如用于B細(xì)胞殺傷測定、作為陽性對(duì)照用于凋亡測定、用于從細(xì)胞純化或免疫沉淀BR3。對(duì)于分離和純化BR3，所述試劑盒可含有偶合到小珠(例如瓊脂糖小珠)的抗BR3抗體。可提供含有用于在體外例如在ELISA或Western印跡中檢測和定量BR3的抗體的試劑盒。如同所述制品，該試劑盒包含容器和置于容器上或伴隨容器的標(biāo)簽或說明書。該容器容納有包含至少一種本發(fā)明的抗BR3抗體的組合物?？梢园硗獾娜萜?，其含有例如稀釋劑和緩沖劑、對(duì)照抗體。所述標(biāo)簽或說明書可以提供對(duì)所述組合物的描述以及對(duì)體外預(yù)期或診斷用于的說明。
單克隆抗體 抗BR3抗體可為單克隆抗體。單克隆抗體可通過例如使用雜交瘤方法制備，如Kohler and Milstein，Nature，256495(1975)中所描述的，或可通過重組DNA方法(美國專利4,816,567)制備，或可通過在以下實(shí)施例部分描述的方法產(chǎn)生。在雜交瘤方法中，小鼠、倉鼠或其它適合的宿主動(dòng)物通常被免疫劑免疫，以刺激產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生特異結(jié)合該免疫劑的抗體的淋巴細(xì)胞?；蛘?，淋巴細(xì)胞可以在體外被免疫。
所述免疫劑通常包括BR3多肽或其融合蛋白。通常，需要人類細(xì)胞時(shí)，使用外周血淋巴細(xì)胞(“PBL”)，需要非人哺乳動(dòng)物來源時(shí)，使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。隨后采用適合的融合劑，如聚乙二醇，使淋巴細(xì)胞與永生化的細(xì)胞株融合以形成雜交瘤。Goding，MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice(單克隆抗體原理與實(shí)踐)(New YorkAcademic Press，1986)，pp.59-103。永生化的細(xì)胞株通常為轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，尤其是嚙齒動(dòng)物、牛、和人類的骨髓瘤細(xì)胞。通常采用大鼠或小鼠骨髓瘤細(xì)胞株。雜交瘤細(xì)胞可在適合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有一種或多種抑制未融合的永生化細(xì)胞生長或存活的物質(zhì)。例如，如果母體細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則雜交瘤的培養(yǎng)基典型地包括次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(“HAT培養(yǎng)基”)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞的生長。
優(yōu)選的永生化細(xì)胞株能有效融合、支持所選擇的抗體表達(dá)細(xì)胞穩(wěn)定的高水平表達(dá)抗體，并且對(duì)諸如HAT培養(yǎng)基的培養(yǎng)基敏感。更優(yōu)選的永生化細(xì)胞株為鼠骨髓瘤細(xì)胞株，其例如可從Salk Institute CellDistribution Center(索爾克研究所細(xì)胞分配中心)，San Diego，California和American Type Culture Collection(美國典型培養(yǎng)物收藏所)，Manassas，Virginia得到。人骨髓瘤和小鼠-人雜種骨髓瘤細(xì)胞株也被描述用于產(chǎn)生人單克隆抗體。Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications(單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)和應(yīng)用)(Marcel Dekker，Inc.NewYork，1987)pp.51-63。
然后，可對(duì)雜交瘤細(xì)胞在其中培養(yǎng)的培養(yǎng)基測定是否存在針對(duì)BR3多肽的單克隆抗體。優(yōu)選地，雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測定(如放射免疫測定，RIA，或酶聯(lián)免疫吸附測定)來確定。這類技術(shù)和測定在本領(lǐng)域是已知的。單克隆抗體的結(jié)合親和性例如可通過Munson和Pollard的Scatchard分析法(Anal.Biochem.，107220(1980))確定。
在鑒定所需的雜交瘤細(xì)胞后，這些克隆可通過有限稀釋程序進(jìn)行亞克隆，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)。Goding，如上。出于這種目的的適合培養(yǎng)基例如包括Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(達(dá)爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基)和RPMI-1640培養(yǎng)基?；蛘撸鲭s交瘤細(xì)胞可在哺乳動(dòng)物體內(nèi)作為腹水生長。
由所述亞克隆分泌的單克隆抗體可通過常規(guī)的免疫球蛋白純化操作從培養(yǎng)基或腹水中分離或純化，這些免疫球蛋白純化操作例如為蛋白A瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。
所述單克隆抗體也可通過重組DNA方法制備，例如描述在第4,816,567號(hào)美國專利中的那些方法。編碼本發(fā)明的單克隆抗體的DNA可容易地通過常規(guī)操作被分離和測序(例如，通過能夠特異結(jié)合編碼鼠抗體的重和輕鏈的寡核苷酸探針)。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞用作這種DNA的優(yōu)選來源。一旦分離出來，該DNA可被置于表達(dá)載體中，該表達(dá)載體隨后轉(zhuǎn)染進(jìn)不產(chǎn)生其它免疫球蛋白的諸如猿COS細(xì)胞、中國倉鼠(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞的宿主細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)在重組宿主細(xì)胞中合成單克隆抗體，。所述DNA可被修飾，例如將編碼人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的序列代替同源的鼠序列(美國專利4,816,567；Morrison et al.，如上)，或?qū)⒎敲庖咔虻鞍锥嚯牡娜炕虿糠中蛄泄矁r(jià)連接到所述免疫球蛋白的編碼序列。這種非免疫球蛋白可替換本發(fā)明抗體的恒定區(qū)，或可替換本發(fā)明抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)以產(chǎn)生嵌合二價(jià)抗體。
所述抗體可為單價(jià)抗體。制備單價(jià)抗體的方法在本領(lǐng)域是已知的。例如，一種方法涉及重組表達(dá)免疫球蛋白輕鏈和修飾的重鏈。該重鏈通常在Fc區(qū)的任意位點(diǎn)被截短以便防止重鏈交聯(lián)。或者，有關(guān)的半胱氨酸殘基被其它氨基酸殘基替代或被刪除以便防止交聯(lián)。
體外方法可適于制備單價(jià)抗體。采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)可實(shí)現(xiàn)消化抗體以產(chǎn)生其片段，尤其是Fab片段。
人和人源化抗體 所述抗BR3抗體可進(jìn)一步包括人源化抗體或人抗體。人源化形式的非人(例如鼠)抗體為嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2、或抗體的其它抗原結(jié)合亞序列)，它們通常含有衍生自非人免疫球蛋白的最小限度序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者CDR的殘基被來自諸如小鼠、大鼠或兔的非人物種CDR的具有所需的特異性、親和性和容量的殘基(供者抗體)所替代。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架殘基被相應(yīng)的非人殘基所替代。人源化抗體還可包含既不存在于接受者抗體也不存在于引入的CDR或框架序列中的殘基。通常，所述人源化抗體包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)可變區(qū)的幾乎全部，其中全部或幾乎全部CDR區(qū)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR區(qū)，并且全部或幾乎全部FR區(qū)為人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗體還優(yōu)選包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常為人免疫球蛋白的恒定區(qū)。Jones et al.，Nature，321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature.332323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992)。
一些人源化非人抗體的方法在現(xiàn)有技術(shù)中和以下實(shí)施例中有描述。通常，人源化抗體具有從非人來源引入的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱為“輸入的”殘基，其通常取自“輸入的”可變區(qū)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，人源化可基本上按照Winter及其合作者的方法(Jones et al.，Nature，321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science，2391534-1536(1988))進(jìn)行，用嚙齒動(dòng)物CDR或CDR序列替代人抗體的對(duì)應(yīng)序列。因此，這種“人源化的”抗體中大大少于完整人可變區(qū)的部分被對(duì)應(yīng)的來自非人種類的序列所替代(美國專利4,816,567)。實(shí)際上，人源化的抗體通常為人抗體，其中一些CDR殘基以及可能還有一些FR殘基被來自嚙齒動(dòng)物抗體中相似位點(diǎn)的殘基所替代。
作為人源化的替代，可生成人抗體。例如，現(xiàn)在可能產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)，它們?cè)诿庖吆罂稍诓划a(chǎn)生內(nèi)源免疫球蛋白情況下產(chǎn)生人抗體的所有組成部分。例如，已有報(bào)道，在嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失導(dǎo)致完全抑制內(nèi)源抗體產(chǎn)生。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移進(jìn)這種種系突變小鼠會(huì)導(dǎo)致在抗原激發(fā)后產(chǎn)生人抗體。參見，例如Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits et al.，Nature，362255-258(1993)；Bruggemann et al.，Year in Immune，733(1993)；美國專利5,545,806，5,569,825，5,591,669(均為GenPharm所有)；5,545,807以及WO97/17852?；蛘?，可通過將人免疫球蛋白基因座位引入內(nèi)源免疫球蛋白基因被部分地或全部失活的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)中來制備人抗體。在激發(fā)后，在所有方面都觀察到近似于在人體中看到的人抗體產(chǎn)生，包括基因重排、裝配和抗體所有成分。這種方法例如描述在美國專利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；661,016以及下列科學(xué)出版物中Marks et al.，Bio/Technology，10779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature，368856-859(1994)；Morrison，Nature，368812-813(1994)；Fishwild et al.，Nature Biotechnology，14845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology，14826(1996)；Lonberg andHuszar，Intern.Rev.Immunol.，1365-93(1995)。
或者，噬菌體展示技術(shù)(McCafferty et al.，Nature 348552-553[1990])可用于在體外從未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因所有組成部分(repertoire)生產(chǎn)人抗體和抗體片段。按照這項(xiàng)技術(shù)的一個(gè)實(shí)施方案，將抗體V區(qū)序列框內(nèi)(in-frame)克隆進(jìn)絲狀噬菌體(如M13或fd)的大或小外殼蛋白基因，并作為功能性抗體片段展示在噬菌體顆粒的表面。噬菌體展示可以多種形式進(jìn)行，例如在以下實(shí)施例部分所描述的，或在例如Johnson，Kevin S.and Chiswell，David J.，CurrentOpinion in Structural Biology3564-571(1993)中所綜述的形式。幾個(gè)來源的V基因片段可用于噬菌體展示。Clackson et al.，Nature，352624-628(1991)從免疫小鼠的脾來源的V基因小隨機(jī)組合庫分離了大量不同的抗噁唑酮抗體。基本上按照Marks et al.，J.MoI.Biol.222581-597(1991)或Griffith et al.，EMBO J.12725-734(1993)的描述的技術(shù)，可構(gòu)建來自未免疫人供體的V基因所有組成部分，并可分離針對(duì)大量不同陣列抗原(包括自身抗原)的抗體。還參見美國專利5,565,332和5,573,905。
如上所述，人抗體也可通過在體外活化B細(xì)胞來產(chǎn)生(參見美國專利5,567,610和5,229,275)。人抗體也可采用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來產(chǎn)生，其中包括噬菌體展示庫。Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.，222581(1991)。Cole et al.and Boemer et al.的技術(shù)也可用于制備人單克隆抗體。Cole et al.Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)和Boemer et al.，J.Immunol.，147(1)86-95(1991)。
多特異性抗BR3抗體 多特異性抗體為單克隆的、優(yōu)選為人的或人源化的抗體，其具有對(duì)兩種或多種不同抗原具有結(jié)合特異性(例如雙特異性抗體具有對(duì)至少兩種抗原的結(jié)合特異性)。例如，一種結(jié)合特異性可針對(duì)BR3多肽，另一種可針對(duì)任何其它抗原。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，該其它抗原為細(xì)胞表面蛋白或受體亞基。例如細(xì)胞表面蛋白可以是自然殺傷(NK)細(xì)胞受體。因此，根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的雙特異性抗體可結(jié)合BR3并結(jié)合NK細(xì)胞，以及任選地活化NK細(xì)胞。
對(duì)制備雙特異性抗體的方法的實(shí)例已有描述。通常，重組產(chǎn)生雙特異性抗體基于兩免疫球蛋白重鏈/輕鏈對(duì)的共表達(dá)，其中兩重鏈具有不同的特異性。Milstein and Cuello，Nature，305537-539(1983)。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)配對(duì)，這些雜交瘤(細(xì)胞雜交瘤)產(chǎn)生10種不同抗體分子的可能的混合物，其中只有1種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。對(duì)正確分子的純化一般通過親和層析步驟完成。類似的操作描述在1993年5月13日公開的WO 93/08829以及Traunecker et al.，EMBO J.，103655-3659(1991)中。
具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變區(qū)可被融合到免疫球蛋白恒定區(qū)序列。優(yōu)選與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合，該重鏈恒定區(qū)至少包含鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)。優(yōu)選使含有輕鏈結(jié)合所需的位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)存在于至少一種融合蛋白中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合蛋白的DNA，如果需要，還有編碼免疫球蛋白輕鏈融合蛋白的DNA，插入獨(dú)立的表達(dá)載體中，并共轉(zhuǎn)染進(jìn)適合的宿主有機(jī)體。對(duì)于進(jìn)一步的產(chǎn)生雙功能抗體的細(xì)節(jié)，參見例如Suresh et al.，Methods in Enzymology，121210(1986)。
制備和直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)物分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)都已有描述。例如，已采用亮氨酸拉鏈產(chǎn)生雙特異性抗體。Kostelny etal.，J.Immunol.，148(5)1547-1553(1992)。通過基因融合將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽連接到兩不同抗體的Fab’部分?？贵w同型二聚體在鉸鏈區(qū)被還原，以形成單體，然后再氧化形成抗體異型二聚體。這種方法也可用于產(chǎn)生抗體同型二聚體。Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)描述的“diabody(雙特異抗體)”技術(shù)提供了另一種制備雙特異性抗體片段的機(jī)制。所述片段包含通過接頭連接到VL的VH，該接頭過短而使得相同鏈上的兩結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)。因此，一個(gè)片段的VH和VL結(jié)構(gòu)域被迫與另一片段的互補(bǔ)VL和VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)，由此形成兩抗原結(jié)合位點(diǎn)。也報(bào)道了另一使用單鏈Fv(sFv)二體制備雙特異性抗體片段的策略。參見Gruber et al.，J.Immunol.，1525368(1994)。
也涉及高于二價(jià)的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt et al.J.Immunol.14760(1991)。
雜偶聯(lián)抗體 雜偶聯(lián)抗體由兩共價(jià)連接的抗體組成。例如，這些抗體已被提出用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向有害細(xì)胞(美國專利4,676,980)并且用于治療HIV感染。WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089?？紤]所述抗體可在體外通過合成蛋白質(zhì)化學(xué)中已知的方法制備，其中包括那些涉及交聯(lián)劑的方法。舉例而言，可采用二硫化物交換反應(yīng)或通過形成硫醚鍵構(gòu)建免疫毒素。用于這種目的的適合的試劑的例子包括亞氨基硫醇鹽和甲基-4-mercaptobutyrimidate以及例如描述在美國專利4,676,980中的那些。
效應(yīng)功能工程化 需要在效應(yīng)功能方面對(duì)本發(fā)明的抗體進(jìn)行修飾，以便增強(qiáng)例如抗體在治療癌癥中的有效性。例如，可將半胱氨酸殘基引入Fc區(qū)，由此使得在該區(qū)域形成鏈內(nèi)二硫鍵。由此產(chǎn)生的同源二聚體抗體具有改進(jìn)的內(nèi)化能力和/或增強(qiáng)的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)。參見Caron et al.，J.Exp.Med.，1761191-1195(1992)和Shopes，J.Immunol.，1482918-2922(1992)。具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性的同源二聚體抗體也可采用雜雙功能交聯(lián)劑來制備，如Wolff et al.，Cancer Research，532560-2565(1993)中所述?；蛘?，抗體可被工程化，以具有雙Fc區(qū)域，由此可具有增強(qiáng)的補(bǔ)體溶解和ADCC能力。參見Stevenson et al.，Anti-Cancer Drug Design，3219-230(1989)。
可在Fc區(qū)域序列中產(chǎn)生突變或改變以改善FcR結(jié)合(例如FcgammaR，F(xiàn)cRn)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的抗體具有至少一種改變的效應(yīng)功能，其選自ADCC、CDC和與天然IgG或母體抗體相比改進(jìn)的FcRn結(jié)合。幾個(gè)有益的特異性突變的例子例如描述在Shields，RL et al.(2001)JBC 276(6)6591-6604；Presta，L.G，(2002)BiochemicalSociety Transactions 30(4)487-490；以及WO公開號(hào)WO 00/42072。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，F(xiàn)c受體突變?yōu)樵谝韵轮辽僖粋€(gè)位置處的置換，所述位置選自位于Fc區(qū)的238，239，246，248，249，252，254，255，256，258，265，267，268，269，270，272，276，278，280，283，285，286，289，290，292，293，294，295，296，298，301，303，305，307，309，312，315，320，322，324，326，327，329，330，331，332，333，334，335，337，338，340，360，373，376，378，382，388，389，398，414，416，419，430，434，435，437，438或439，其中Fc區(qū)中的殘基編號(hào)遵循EU編號(hào)系統(tǒng)。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方案，所述置換為選自N434A、N434F、N4343Y和N434H的434殘基置換。根據(jù)另一實(shí)施方案，所述置換為D265A/N297A突變。根據(jù)另一實(shí)施方案，所述置換為S298A/E333A/K334A或S298A/K326A/E333A/K334A。根據(jù)另一實(shí)施方案，所述置換為K322A。
天然序列人IgG Fc區(qū)序列的例子，humIgG1(非A和A同種異型)(分別為SEQ ID NOs133和135)、humIgG2(SEQ ID NO136)、humIgG3(SEQ ID NO137)以及humIgG4(SEQ ID NO138)之前已有描述。天然序列鼠IgG Fc區(qū)序列的例子，murIgG1(SEQ ID NO139)、murIgG2A(SEQ ID NO140)、murIgG2B(SEQ ID NO141)以及murIgG3(SEQ ID NO142)之前已有描述。
免疫偶聯(lián)物 本發(fā)明還涉及免疫偶聯(lián)物，其包含偶聯(lián)到細(xì)胞毒素劑的抗體，所述細(xì)胞毒素劑例如為化療劑、毒素(例如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶聯(lián)物)。
可用于產(chǎn)生這類免疫偶聯(lián)物的化療劑在上文已有描述?？捎玫拿富钚远舅丶捌淦伟ò缀鞟鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin)A鏈、α-帚曲菌素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、Phytolacaamericana蛋白(PAPI、PAPII、以及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、sapaonaria officinalis抑制劑、白樹毒素、米托潔林(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素以及鐮刀菌毒素(tricothecene)。多種放射性核素可用于產(chǎn)生放射偶聯(lián)的抗體。實(shí)例包括212Bi、131I、131In、90Y以及186Re。
可用多種雙功能蛋白偶合劑來制備抗體和細(xì)胞毒素劑的偶聯(lián)物，例如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、硫醇亞胺(IT)、亞胺酯類的雙功能衍生物(例如二甲基adipimidate HCl)、活性酯類(例如二琥珀酰亞胺辛二酸酯)、醛類(例如戊二醛)、雙疊氮基化合物(例如雙(對(duì)疊氮基苯甲?；?己二胺)、雙重氮基衍生物(例如雙-(對(duì)重氮基苯甲?；?-乙二胺)、二異氰酸酯類(例如甲苯2，6-二異氰酸酯)、以及雙活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可按Vitetta et al.Science，2381098(1987)中的描述來制備。碳-14-標(biāo)記的1-異硫氰酸根合芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于偶聯(lián)放射性核素到抗體的示例性螯合劑。參見WO 94/11026。
在另一實(shí)施方案中，所述抗體可被偶聯(lián)到“受體”(例如鏈親和素)用于腫瘤預(yù)靶向，其中抗體-受體偶聯(lián)物被給予患者，然后使用清除劑從循環(huán)中除去未結(jié)合的偶聯(lián)物，接著給予偶聯(lián)到細(xì)胞毒素劑(例如放射性核素)的“配體”(例如抗生物素蛋白)。
免疫脂質(zhì)體 本文公開的抗體也可配制為免疫脂質(zhì)體。含有抗體的脂質(zhì)體可通過本領(lǐng)域已知的方法制備，這些方法例如描述在Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774030(1980)；以及美國4,485,045和4,544,545。在美國專利5,013,556中公開了具有延長的循環(huán)時(shí)間的脂質(zhì)體。
尤其有用的脂質(zhì)體可通過反相蒸發(fā)方法產(chǎn)生，其脂質(zhì)組合物包含磷脂酰膽堿、膽固醇、以及PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)。從具有定義孔徑的濾器中濾出脂質(zhì)體以產(chǎn)生具有期望直徑的脂質(zhì)體?？梢繫artin et al.，J.Biol.Chem.，257286-288(1982)中描述的方法通過二硫化物互換反應(yīng)將本發(fā)明抗體的Fab’片段偶聯(lián)至脂質(zhì)體。該脂質(zhì)體中任選地含有化療劑(例如多柔比星)。參見，Gabizon et al.，J.NationalCancer Inst.，81(19)1484(1989)。
抗體和多肽的藥物組合物 能夠以以下的藥物組合物的形式給予本文鑒定的特異性結(jié)合BR3多肽的抗體、以及使用上文中公開的篩選實(shí)驗(yàn)鑒定的其它分子來治療上述的多種病癥。
Lipfectins(脂轉(zhuǎn)染劑)或脂質(zhì)體能夠被用于將多肽和抗體或本發(fā)明的組合物輸送至細(xì)胞。當(dāng)使用抗體片段時(shí)，優(yōu)選與靶蛋白結(jié)合區(qū)域特異性結(jié)合的最小抑制片段。例如，根據(jù)抗體的可變區(qū)序列，能夠設(shè)計(jì)保持結(jié)合靶蛋白序列能力的肽分子。能夠化學(xué)合成和/或通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生這樣的肽。例如參見Marasco et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，907889-7893(1993)。
本文所述的制劑還能夠包含待治療的具體適應(yīng)癥所需的多于一種的活性化合物，優(yōu)選地，所述活性化合物具有補(bǔ)充活性，該補(bǔ)充活性不具有相互間的不良反應(yīng)?；蛘呋虼送?，組合物能夠包含加強(qiáng)其功能的劑，例如細(xì)胞毒性劑、化療劑或生長抑制劑。這樣的分子適于以有效達(dá)到期望目的的量出現(xiàn)在組合中。
還能夠?qū)⒒钚猿煞旨{入在制備的微囊中，例如通過在膠體藥物輸送系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒和納米型膠囊)或粗乳狀液中分別使用羥甲基纖維素或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊的凝聚技術(shù)或通過界面聚合法。上述的Remington’sPharmaceutical Sciences公開了這樣的技術(shù)。
用于體內(nèi)給藥的制劑必須是無菌的。這易于通過使用無菌過濾膜進(jìn)行過濾來完成。
能夠制備緩釋制劑。緩釋制劑的合適實(shí)例包括含有抗體的固體疏水聚合物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)是有形物，例如膜或微囊。緩釋基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-甲基丙烯酸羥乙酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利第3,773,919號(hào))、L-谷氨酸和L-谷氨酸-γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羥乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球)的可降解的乳酸-羥乙酸共聚物以及聚-D-(-)-3-羥丁酸。雖然諸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-羥乙酸的聚合物能夠持續(xù)超過100天釋放分子，但是某些水凝膠持續(xù)更短的時(shí)間釋放蛋白質(zhì)。當(dāng)被包被的抗體在體內(nèi)長時(shí)間停留時(shí)，在37℃下暴露于水分中的結(jié)果是它們能夠變性或凝聚，這導(dǎo)致生物活性的喪失和免疫原性可能的改變。根據(jù)所涉及的機(jī)理能夠設(shè)計(jì)合理的策略用于穩(wěn)定化。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)理是通過硫-二硫化物交換形成分子間S-S鍵，那么能夠通過修飾巰基殘基、凍干酸性溶液、控制水分含量、使用合適的添加劑以及開發(fā)特殊的聚合物基質(zhì)組合物來實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定化。
診斷用途與成像 與BR3特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體及其衍生物和類似物能夠被用于診斷目的以檢測、診斷或監(jiān)測與本發(fā)明的多肽的表達(dá)、異常表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病和/或病癥。根據(jù)一優(yōu)選實(shí)施方案，在涉及向個(gè)體中注射抗BR3抗體的診斷分析或成像分析中使用的抗BR3抗體是不阻斷BAFF和BR3之間相互作用或僅部分阻斷BAFF和BR3之間相互作用的抗體。本發(fā)明提供檢測BR3多肽異常表達(dá)，其包括(a)使用一種或多種本發(fā)明的抗體測定個(gè)體細(xì)胞或體液中BR3多肽的表達(dá)以及(b)將基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)水平對(duì)照，借此與標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平相對(duì)照，測定的基因表達(dá)水平的增高或降低表示異常表達(dá)。
本發(fā)明提供使用本發(fā)明的抗BR3抗體或多肽用于診斷待治療病癥的診斷分析，其包括(a)使用本發(fā)明的抗體測定個(gè)體細(xì)胞或體液中BR3多肽的表達(dá)，(b)將BAFF基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)水平對(duì)照，借此與標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平相對(duì)照，測定的基因表達(dá)水平的增高或降低以及體液或病癥組織中BR3多肽的存在表示欲用抗BR3抗體或多肽治療的病癥。關(guān)于癌癥，個(gè)體活組織中BR3的存在或BR3轉(zhuǎn)錄相對(duì)較高的量可以表明疾病發(fā)生的素因，或者可以在出現(xiàn)實(shí)際臨床癥狀之前提供鑒定疾病的手段。這種更加確定的診斷允許保健專家早期利用預(yù)防措施或積極療法，從而預(yù)防癌癥的發(fā)生或進(jìn)一步的進(jìn)展。
使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的傳統(tǒng)免疫組織學(xué)方法，本發(fā)明的抗體能夠被用于分析生物樣品中的蛋白質(zhì)水平(例如參見Jalkanen，et al.，J.Cell.Biol.101976-985(1985)；Jalkanen，et al.，J.Cell.Biol.1053087-3096(1987))。其它用于檢測蛋白質(zhì)基因表達(dá)的基于抗體的方法包括免疫分析，例如酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)和放射免疫分析(RIA)。本領(lǐng)域已知合適的抗體分析標(biāo)記物，其包括酶標(biāo)記物，例如葡糖氧化酶；放射性同位素，例如碘(131I、125I、123I、121I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，銦(115mIn、113mIn、112In、111In)和锝(99Tc、99mTc)，鉈(201Ti)，鎵(68Ga，67Ga)，鈀(103Pd)，鉬(99Mo)，氙(133Xe)，氟(18F)，153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru；魯米諾以及熒光標(biāo)記物，例如熒光素和若丹明，以及生物素。
本領(lǐng)域已知的技術(shù)可以用于標(biāo)記本發(fā)明的抗體。這樣的技術(shù)包括但不限于使用雙工能的偶聯(lián)劑(例如參見美國專利第5,756,065、5,714,631、5,696,239、5,652,361、5,505,931、5,489,425、5,435,990、5,428,139、5,342,604、5,274,119、4,994,560和5,808,003號(hào)，以參考的方式引入每一專利的全部內(nèi)容)。
動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物并且最有選人類中BR3分子表達(dá)或異常表達(dá)相關(guān)的疾病或病癥的診斷能夠包括測定哺乳動(dòng)物BR3分子的步驟。在一實(shí)施方案中，診斷包括(a)向哺乳動(dòng)物分別給予(例如腸胃外、皮下或腹膜內(nèi))有效劑量的標(biāo)記的抗BR3抗體或多肽，所述標(biāo)記的抗BR3抗體或多肽與BR3分子特異性結(jié)合；(b)給藥后等待一段時(shí)間間隔，使得標(biāo)記分子優(yōu)先在個(gè)體表達(dá)BR3分子的位點(diǎn)處聚集(并且對(duì)于未結(jié)合的標(biāo)記分子，被清除至背景水平)；(c)確定背景水平；以及(d)測定個(gè)體中的標(biāo)記分子，從而高于背景水平的標(biāo)記分子的測定表明個(gè)體患有與BR3表達(dá)或異常表達(dá)相關(guān)的特定疾病或病癥。能夠通過多種方法確定背景水平，包括將被測定的標(biāo)記分子的量與先前確定的特定體系的標(biāo)準(zhǔn)值相對(duì)比。根據(jù)具體實(shí)施方案，本發(fā)明的抗體被用于定量或定性B細(xì)胞系的細(xì)胞或單核細(xì)胞系的細(xì)胞濃度。
根據(jù)一具體實(shí)施方案，通過評(píng)價(jià)細(xì)胞表面上存在的BR3水平或細(xì)胞分泌的BR3水平(例如通過使用抗BR3抗體或抗BAFF抗體；FACS分析等)，在診斷或預(yù)后分析中確定BR3多肽表達(dá)或過表達(dá)。或者或此外，可以測量細(xì)胞中編碼BR3多肽的核酸或mRNA的水平，例如通過熒光原位雜交，其使用對(duì)應(yīng)于編碼BR3的核酸或其互補(bǔ)序列的基于核酸的探針；(FISH；參見1998年10月公開的WO 98/45479)，Southern印跡，Northern印跡或多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，例如實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)。還能夠通過測量諸如血清的生物液體中脫落的抗原，例如使用基于抗體的分析(例如參見1990年6月12日授權(quán)的美國專利第4,933,294號(hào)；1991年4月18日公開的WO 91/05264；1995年3月28日授權(quán)的美國專利第5,401,638號(hào)以及Sias et al.，J.Immunol.Methods 13273-80(1990))研究BR3分子或BAFF分子過表達(dá)。除了上述測定以外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得多種體內(nèi)分析。例如，能夠?qū)⒉溉閯?dòng)物機(jī)體中的細(xì)胞暴露于抗體，該抗體被可檢測的標(biāo)記任選地標(biāo)記，所述可檢測的標(biāo)記例如放射性同位素，并且能夠評(píng)價(jià)抗體與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的結(jié)合，例如通過外部掃描放射性強(qiáng)度或通過分析取自之前暴露于抗體的哺乳動(dòng)物的活組織。
分析 本發(fā)明的激動(dòng)性抗BR3抗體被用于直接刺激BR3的生物學(xué)途徑但是并不刺激TACI或BCMA受體的途徑(即“BR3特異性的”)。這樣的激動(dòng)性抗體能夠被用于鑒別BR3特異性信號(hào)途徑的下游標(biāo)志物。因此，鑒別BR3途徑的下游標(biāo)志物的分析能夠包括向在其表面上表達(dá)BR3的細(xì)胞給予激動(dòng)性BR3結(jié)合、BR3特異性抗體或多肽，以及測定細(xì)胞的基因表達(dá)(例如微陣列或ELISA測定)或細(xì)胞的蛋白質(zhì)活性變化的步驟。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，激動(dòng)性抗體能夠被用于篩選BR3途徑特異性抑制劑。所述篩選方法能夠例如包括向在其表面上表達(dá)BR3的細(xì)胞給予激動(dòng)性BR3結(jié)合、BR3特異性抗體或多肽，向所述細(xì)胞給予候選化合物以及確定所述候選化合物是否抑制了細(xì)胞的增殖或細(xì)胞的存活或上述二者的步驟。
因此以參考的方式引入本文引用的所有出版物(包括專利和專利申請(qǐng))的全部內(nèi)容，包括2004年12月31日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)第60/640,323號(hào)。
下列DNA序列根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款保藏于位于10801University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，USA的美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏內(nèi)容具體如下 拉料保藏號(hào) 保藏日期 Hu9.1-RF-H-IgG PTA-63152004年11月17日 Hu9.1-RF-L-IgG PTA-63162004年11月17日 Hu2.1-46.DANA-H-IgG PTA-63132004年11月17日 Hu2.1-46.DANA-L-IgG PTA-63142004年11月17日 HuV3-46s-H-IgG PTA-63172004年11月17日 HuV3-46s-L-IgG PTA-63182004年11月17日 鼠類B細(xì)胞12B 12.1 PTA-66242005年3月3日 鼠類B細(xì)胞3.1 PTA-66222005年3月3日 根據(jù)《(國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約》(布達(dá)佩斯條約)進(jìn)行了本文的保藏。這確保從保藏日起30年保存保藏物的活培養(yǎng)物。根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款以及Genentech，Inc.與ATCC的協(xié)議，從ATCC可以得到所述保藏物，所述協(xié)議保證根據(jù)授權(quán)的相關(guān)美國專利或者根據(jù)任何對(duì)公眾公開的美國或國外專利申請(qǐng)，公眾永久地并且不受限制地得到保藏物培養(yǎng)物的后代，并且保證根據(jù)35 U.S.C.122并依據(jù)局長細(xì)則(包括特別參考886 OG 638的37 C.F.R.1.14)授權(quán)美國專利商標(biāo)局局長所確定的人員可以得到所述后代。
本申請(qǐng)的受讓人已經(jīng)同意，如果當(dāng)合適的條件下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，保藏材料的培養(yǎng)物死亡或丟失或損毀，那么應(yīng)該通知使用相同的材料立即進(jìn)行替換。保藏材料的可獲得性不應(yīng)被理解為允許違背政府根據(jù)其專利法所授予的權(quán)利而實(shí)施本發(fā)明。
除非另有說明，根據(jù)制造商的說明使用實(shí)施例中提及的商業(yè)上可以得到的試劑。下列實(shí)施例和整個(gè)說明書中由ATCC編號(hào)鑒別的細(xì)胞來源是位于Manassas，VA的美國典型培養(yǎng)物保藏中心。除非另有說明，本發(fā)明使用重組DNA技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)步驟，例如上文所述的以及下列教科書中所述的上文引用的Sambrook et al；Ausubel et al，CurrentProtocols in Molecular Biology(現(xiàn)代分子生物手冊(cè))(Green PublishingAssociates and Wiley Interscience，N.Y.，1989)；Innis et al，PCRProtocolsA Guide to Methods and Applications(PCR實(shí)驗(yàn)方案方法與應(yīng)用的指南)(Academic Press，Inc.N.Y.，1990)；Harlow et al，AntibodiesA Laboratory Manual(抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))(Cold Spring Harbor PressCold Spring Harbor，1988)；Gait，Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸的合成)(IRL PressOxford，1984)；Freshney，Animal Cell Culture(動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物)，1987；Coligan et al.，Current Protocols in Immunology(免疫學(xué)的通用實(shí)驗(yàn)方案)，1991。
在本說明書和權(quán)利要求中，應(yīng)該將詞語“包含(comprise)”或其變化，例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”理解為其意味著包括所述整體或整體組，但是不排除任何其它整體或整體組。
上述書面描述被認(rèn)為足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。僅僅是為了說明的目的提供下列實(shí)施例，并且并不意味著以任何方式限制本發(fā)明的范圍。事實(shí)上，除了那些本文顯示的和描述的以外，通過上述描述本發(fā)明的各種變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的并且落入所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
實(shí)施例 實(shí)施例1-材料 從利用聚集的人BR3-Fc免疫的小鼠中產(chǎn)生結(jié)合BR3的鼠單克隆抗體。這些抗體包括從雜交瘤產(chǎn)生的稱為11G9，8G4，7B2，1E9，12B12，1E9，1A11，8E4，10E2和12B12的那些抗體。稱為2.1和9.1的產(chǎn)生鼠單克隆抗體的雜交瘤為已知的(International Patent Application PCT/US01/28006(WO 02/24909))并保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號(hào)分別為ATCC NO.3689和ATCC NO.3688(10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，USA)。B9C11抗體為倉鼠抗小鼠BR3抗體，其對(duì)鼠BR3特異但不結(jié)合人BR3，以及來自雜交瘤3.1的抗體，均從Biogen Idee，Inc.公司獲得。
在Pioneer肽合成儀(PE Biosystems)上采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc化學(xué)合成作為C-末端氨基化合物的小BR3(miniBR3)肽(TPCVPAECFDLLVRHCVACGLLR(SEQ ID NO150)。通過5％三異丙基硅烷的TFA溶液室溫處理1.5-4小時(shí)從樹脂中切除肽。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除TFA后，加入乙醚來沉淀肽，隨后，用反相HPLC(乙腈/H2O/0.1％TFA)純化。通過電噴霧質(zhì)譜來證實(shí)肽的身份。凍干后，用HPLC純化氧化的肽。利用NH4OH將含有還原的小BR3的HPLC組分的pH調(diào)節(jié)至約9；隨后通過加入少量過量的K3Fe(CN)6以在半胱氨酸24和35間形成二硫化合物，并用HPLC來純化氧化的肽。通過用少量過量的I2對(duì)HPLC洗出液處理約4h去除Acm基團(tuán)(有另一二硫化合物伴隨形成)。分析HPLC來監(jiān)測氧化的進(jìn)程，并用HPLC來再次純化終產(chǎn)物。當(dāng)在樹脂上時(shí)，小BR3在氨末端被生物素化，隨后如上所述來準(zhǔn)確地去除和純化得到未修飾的肽。
通過將其序列亞克隆至pET32a表達(dá)載體(Novagen)，在細(xì)菌中產(chǎn)生人BR3胞外區(qū)(hBR3-ECD)和小鼠BR3胞外區(qū)(mBR3-ECD)構(gòu)建體，產(chǎn)生與隨后是腸激酶蛋白酶位點(diǎn)的N-末端硫氧還原蛋白(TRX)-His-標(biāo)簽的融合。使E.coli(大腸桿菌)BL21(DE3)細(xì)胞(Novagen)生長在30℃并用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。通過Ni-NTA(Qiagen)柱子來純化TRX-BR3，用咪唑梯度來洗脫，并用腸激酶(Novagen)來切除。在S-Sepharose柱上純化BR3，在PBS，pH7.8，含有3mM氧化和1mM還原的谷胱甘肽中重折疊過夜，用PBS透析，在MonoS柱子上再純化，濃縮，并透析入PBS中。所用的人BR3胞外序列為 MRRGPRSLRGRDAPAPTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLRTPRPKPAGASSPAPRTALQPQE(SEQ ID NO151)。小鼠胞外序列為 MGARRLRVRSQRSRDSSVPTQCNQTECFDPLVRNCVSCELFHTPDTGHTSSLEPGTALQPQEGS(SEQ DD NO152)。
如以往所述(Pelletier，M.，et al.，(2003)J.Biol.Chem.278，33127-33133)在中華倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)中產(chǎn)生人和小鼠BR3-Fc蛋白。小鼠BR3-Fc序列mBR3-Fc)最初描述在Yan et al.，(2001)CurrentBiology 11，1547-1552中。小鼠BR3-Fc序列為MSALLILALVGAAVASTGARRLRVRSQRSRDSSVPTQCNQTECFDPLVRNCVSCELFHTPDTGHTSSLEPGTALQPQEGQVTGDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO153)。變體人BR3-Fc融合體(vBR3-Fc)通常與Fc融合蛋白有關(guān)，包括天然產(chǎn)生的人BR3序列的ECD序列的變體序列，該變體同樣結(jié)合BAFF并且具有低于天然人BR3序列的聚集的傾向。
可根據(jù)已有描述(Gordon，N.C，et al.，(2003)Biochemistry 42，5977-5983)表達(dá)和純化本文所用的人BAFF。將編碼BAFF殘基82-285的DNA片段克隆至pET15b(Novagen)表達(dá)載體，產(chǎn)生與隨后是凝血酶切位點(diǎn)的N-末端His-標(biāo)簽的融合。在37℃，在含50mg/L羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基中將E.coli BL21(DE3)(Novagen)培養(yǎng)物生長為中對(duì)數(shù)期，隨后在用1.0mM IPTG誘導(dǎo)前冷卻至16℃。12小時(shí)進(jìn)一步生長后利用離心來收集細(xì)胞并儲(chǔ)存在-80℃。將該細(xì)胞沉淀重懸在50mM Tris，pH8.0，和500mM NaCl中并在冰上超聲破碎。離心后，將上清液加載到Ni-NTA瓊脂糖柱子上(Qiagen)。用50mM Tris，pH8.0，500mM NaCl，和20mM咪唑洗滌該柱子，隨后用步進(jìn)梯度在含有250mM咪唑的相同的緩沖液中洗提。合并含BAFF的餾分，加入凝血酶，在4℃用20mM Tris，pH8.0，和5mM CaCl2透析樣品過夜。在monoQ(Pharmacia)柱子最終在S-200體積排阻柱上在20mM Tris，150mM NaCl和5mM MgCl2中進(jìn)一步純化蛋白。
在一些實(shí)驗(yàn)中，使用雜種BAFF分子。該雜種BAFF分子包括重組融合至小鼠BAFF殘基128-309的N-末端的人BAFF殘基82-134。該重組蛋白在細(xì)菌中表達(dá)并如上所述進(jìn)行純化。添加人的序列有助于mBAFF蛋白的表達(dá)。在另外一些實(shí)驗(yàn)中，表達(dá)在CHO細(xì)胞中的人BAFF用于B細(xì)胞增殖測定。
實(shí)施例2-競爭ELISA測定 采用競爭ELISA測定來檢測抗-BR3抗體對(duì)人BR3胞外區(qū)和小BR3的相對(duì)親和性。在一些實(shí)驗(yàn)中，生物素化的BR3-ECD對(duì)吸附在微滴定板(Nunc MaxiSorp)小孔上的抗體的結(jié)合被未標(biāo)記的BR3-ECD或小BR3競爭。在室溫下與10倍摩爾過量的硫代-NHS-生物素(Pierce)反應(yīng)2小時(shí)來生物素化BR3-ECD。在室溫下、在包被緩沖液(50mM碳酸鈉，pH9.6)中以5μg/mL包被抗體2小時(shí)，隨后用PBS/0.05％Tween-20/2.5％(重量/體積)的脫脂奶粉來封閉1小時(shí)。確定用鏈親和素-HRP測定后在492nm產(chǎn)生約1.0的吸光度所需的生物素-BR3-ECD的含量。對(duì)于單克隆抗體Mab3.1和12B12，所需生物素-BR3-ECD的濃度為5nM，對(duì)于8G4和11G9，其為2nM，對(duì)于2.1和9.1，該生物素-BR3-ECD的濃度為200pM。制備含有這些生物素-BR3-ECD濃度的溶液和不同濃度的未標(biāo)記的BR3-ECD或小-BR3并加入到由抗體包被的微滴定板的各孔中。搖動(dòng)孵育2小時(shí)后，倒出溶液，用PBS/.05％Tween-20沖洗小孔6次。加入鏈親和素-HRP(0.5μg/mL)，搖動(dòng)孵育30分鐘，隨后清空小孔并如上洗滌。通過加入含PBS、0.01％過氧化氫和0.8mg/mL鄰苯二胺的溶液測定結(jié)合的HRP。生色20分鐘，并隨后通過添加等體積的1 M磷酸終止反應(yīng)。在平板閱讀儀(Thermo LabSy stems)上檢測492nm的吸光度。通過采用四參數(shù)等式(1)來確定生物素-BR3-ECD結(jié)合抑制的IC50來分析作為競爭劑濃度的函數(shù)的吸光度 (1)((m1-m4)/(1+(m0/m3)＾m2))+m4 其中m1為無競爭劑時(shí)的吸光度，m4為無窮大的抑制劑濃度時(shí)的吸光度，m0為競爭劑濃度，以及m3為IC50值。
表3. 2.1、9.1、8.G4和11G9結(jié)合的26殘基小BR3具有與全長BR3胞外區(qū)類似的親和性(表3)。如以下所示，這些抗體也阻斷BR3對(duì)BAFF的結(jié)合。不結(jié)合小BR3的3.1和12B12抗體，同樣也不阻斷BAFF-BR3間的相互作用。
實(shí)施例3-人源化抗體 (a)材料與方法 根據(jù)Kabat(Kabat et al.，Sequences of proteins of immunologicalinterest，5th Ed.，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))指定以下所提及的殘基數(shù)目。使用單字母氨基酸縮寫。利用IUB密碼表示DNA兼并密碼(N＝AICIGIT，D＝A/G/T，V＝AJCIG，B＝C/G/T，H＝A/C/T，K＝G/T，M＝A/C，R＝A/G，S＝G/C，W＝A/T，Y＝C/T)。
將高變區(qū)直接嫁接在接受者人共有框架上- 將來自鼠2.1、11G9和9.1的VL和VH區(qū)與人共有κI(huKI)和人亞組III共有VH(huEI)區(qū)比對(duì)。為產(chǎn)生CDR嫁接物，采用huKI和接受者VH框架，其在3個(gè)位點(diǎn)不同于人亞組III共有VH區(qū)R71A、N73T和L78A(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 894285(1992))。參見圖1-3中的粗體字母。將來自鼠2.1(mu2.1)、11G9(mul 1G9)和9.1(mu9.1)抗體的高變區(qū)工程化入接受者人共有框架以產(chǎn)生直接CDR-嫁接物(2.1嫁接物，11G9嫁接物和9.1嫁接物)(圖1-3)。在VL區(qū)，以下區(qū)域被嫁接到人共有接受者位置24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)(Kabat編號(hào)系統(tǒng))。在VH區(qū)，嫁接位置26-35(H1)、49-65(H2)和94-102(H3)(Kabat編號(hào)系統(tǒng))(圖1-3)。MacCallum等人(MacCallum et al.J. Mol.Biol.262732-745(1996))已經(jīng)分析了抗體和抗原復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu)并發(fā)現(xiàn)重鏈的位置93和94為部分接觸區(qū)，因此當(dāng)人源化抗體時(shí)，在CDR-H3的定義中包括這些位置似乎是有理由的。編碼嫁接的CDR-人框架序列的核酸序列被包含在噬菌粒中。該噬菌體為單價(jià)Fab-g3展示載體并包括在phoA啟動(dòng)子控制下的2個(gè)開放閱讀框。第一個(gè)開放閱讀框由融合至接受者輕鏈的VL和CH1區(qū)的stII信號(hào)序列組成，第二個(gè)由融合至接受者重鏈的VH和CH1區(qū)的stII信號(hào)序列組成，隨后是小噬菌體外殼蛋白P3。
對(duì)于每一高變區(qū)利用單獨(dú)的寡核苷酸通過Kunkel突變來產(chǎn)生直接嫁接物變體。通過DNA測序來評(píng)價(jià)正確的克隆。
高變區(qū)的軟隨機(jī)化-對(duì)于每一嫁接的抗體，利用軟隨機(jī)化策略向每一高變區(qū)引入序列變異，該策略能夠維持向鼠高變區(qū)的偏好。這可通過首次由Gallop et al.，J.Med.Chem.371233-1251(1994)描述的中毒寡核苷酸合成策略來實(shí)現(xiàn)。對(duì)于欲突變的高變區(qū)中的給出位置，利用70-10-10-10的核苷酸混合物來使編碼野生型氨基酸的密碼中毒，可產(chǎn)生在每一位置的平均50％的突變率。
軟隨機(jī)化寡核苷酸在鼠高變區(qū)序列后設(shè)置并包括由直接高變區(qū)嫁接物定義的相同區(qū)域。利用密碼RGC，將位于VH區(qū)中的H2(位置49)起始的氨基酸限定為序列變異A，G，S或T。
噬菌體文庫的產(chǎn)生-為每一高變區(qū)設(shè)計(jì)的隨機(jī)化寡核苷酸池在6次20μl的反應(yīng)中分別磷酸化，該反應(yīng)含660ng的寡核苷酸，50mM Tris pH7.5，10mM MgCl2，1mM ATP，20mM DTT和5U多聚核苷酸酶，在37℃進(jìn)行1小時(shí)。隨后將該6個(gè)磷酸化寡核苷酸池與20μg的50mM Tris pH7.5，10mM MgCl2中的Kunkel模板混合，其終體積為500μl，寡核苷酸對(duì)模板的比值為3。在90℃、4分鐘，50℃、5分鐘將該混合物退火，隨后在冰上冷卻。通過QIAQUICK PCR純化試劑盒(Qiagen kit 28106)去除過量的非未退火的寡核苷酸，其中利用改良的方案來防止退火的DNA的過度變性。向500μl的退火混合物中，加入150μl的PB，將該混合物分入2個(gè)硅膠柱子中。用750μl的PE洗滌每一柱子并用超旋轉(zhuǎn)來干燥柱子后，利用110μl的10mM Tris，1mM EDTA，pH8洗脫每一個(gè)柱子。隨后加入1μl 100mM ATP，10μl 25mM dNTPs(每一種dATP，dCTP，dGTP和dTTP為25mM)，15μl100mM DTT，25μl 10X TM緩沖液(0.5M Tris pH7.5，0.1M MgCl2)，2400 UT4連接酶和30UT7聚合酶在室溫進(jìn)行3小時(shí)來填滿退火和清潔的模板(220μl)。
在Tris-醋酸-EDTA/瓊脂糖凝膠(Sidhu et al.，Methods in Enzymology328333-363(2000))上分析填滿的產(chǎn)物。通?？梢娙齻€(gè)條帶底端條帶為正確的填滿并被連接的產(chǎn)物，中間條帶為填滿但未被連接的的條帶，頂端的條帶為取代鏈。頂端的條帶是T7聚合酶的固有的副作用產(chǎn)生的并很難避免(Lechner et al.，J.Biol.Chem.25811174-11184(1983))；但是，此條帶轉(zhuǎn)化效率低于頂端條帶的30倍，并通常對(duì)文庫沒有貢獻(xiàn)。中間的條帶是由于缺乏用于最終連接反應(yīng)的5’磷酸而產(chǎn)生的；此條帶有效地轉(zhuǎn)化，遺憾的是主要產(chǎn)生野生型序列。
隨后清洗該填滿的產(chǎn)物并提供電穿孔引入SS320細(xì)胞，根據(jù)Sidhu etal.，Methods in Enzymology 30 328333-363(2000)所述在有M13/KO7輔助噬菌體存在下增殖。文庫大小為1-2×109獨(dú)立克隆。測序起始文庫中的隨機(jī)克隆來評(píng)價(jià)文庫的質(zhì)量。
噬菌體的篩選-人BR3ecd或變體BR3-Fc融合體(vBR3-Fc)用作噬菌體篩選的靶標(biāo)(Kayagaki et al.Immunity 17515-524(2002)and Pelletier etal.J.Biol.Chem.27833127-33133(2003))。將PBS中的10μg/ml BR3ecd或vBR3-Fc包被在MaxiSorp微滴定板上(Nunc)。對(duì)于第一輪篩選，采用8個(gè)小孔的靶標(biāo)；單個(gè)小孔的靶標(biāo)用于后續(xù)的篩選。利用酪蛋白封閉劑(Casein Blocker，Pierce)來封閉小孔1小時(shí)。從培養(yǎng)上清液中收集噬菌體并懸浮在含1％BSA和0.05％Tween 20(PBSBT)的PBS中。對(duì)小孔結(jié)合2小時(shí)后，通過過量的含0.05％Tween 20(PBST)的PBS洗滌來去除未結(jié)合的噬菌體。通過將小孔與50mM HCl，0.5M KCl孵育30分鐘洗脫結(jié)合的噬菌體。利用Top 10細(xì)胞和M13/KO7輔助噬菌體擴(kuò)增噬菌體并在37℃、在2YT，50μg/ml carbenacillin中增長過夜。比較從包被的小孔中洗脫的噬菌體滴度與從靶標(biāo)未包被的小孔中恢復(fù)的噬菌體滴度來評(píng)價(jià)富集作用。
還利用溶液分選方法(solution sorting method)(Lee，C.V.，et al.(2004)J.Mol.Biol 340(5)1073-93)將噬菌體文庫分選。利用硫代-NHS-LC-生物素(Pierce)(b-vBR3-Fc)將vBR3-Fc生物素化。在4℃用10μg/ml PBS中中性鏈親和素(neutravidin)包被微滴定小孔過夜，并隨后利用酪蛋白封閉劑(Pierce)封閉1小時(shí)。利用標(biāo)準(zhǔn)板分選方法通過固化的vBR3-Fc來進(jìn)行第一輪淘洗(panning)。對(duì)于第二輪篩選，將200μl懸浮在含0.05％Tween20(PBST)和1％BSA的PBS中的噬菌體與100nM b-vBR3-Fc混合2小時(shí)。將結(jié)合了b-vBR3-Fc的噬菌體捕獲到中性鏈親和素包被的小孔5分鐘，并用PBST洗除未包被的噬菌體。利用100mM HCl洗脫噬菌體30分鐘，中和，并在含有KO7輔助噬菌體(New England Biolabs)的XL1藍(lán)細(xì)胞(blue cell，Strategene)中增殖。類似地進(jìn)行后續(xù)輪次的篩選，除了以下不同在第3輪中，b-vBR3-Fc終濃度為20nM，在第4和5輪中，b-vBR3-Fc終濃度為1nM。在第5輪中建立噬菌體結(jié)合1h后，在中性鏈親和素上捕獲之前，將1μM未生物素化的vBR3-Fc加入到該混合物中孵育64h。
噬菌體ELISA-用10μg/ml PBS中的人vBR3-Fc包被MaxiSorp微滴定板過夜隨后用酪蛋白封閉劑(Pierce)封閉。將來自培養(yǎng)上清液中的噬菌體與在含1％BSA PBST中系列稀釋的vBR3-Fc在組織培養(yǎng)微滴定板中孵育1h，之后，將80μl的混合物轉(zhuǎn)移至靶包被的小孔中15分鐘，以捕獲未結(jié)合的噬菌體。用PBST洗滌該板并加入HRP結(jié)合的抗-M13(Amersham Pharmacia Biotech)(在含1％BSA的PBST為1∶5000)40分鐘。用PBST洗滌該板通過加入四甲基聯(lián)苯胺底物來生色(Kirkegaard andPerry Laboratories，Gaithersburg，MD)。將405nm的吸光度作為溶液中的靶標(biāo)的濃度函數(shù)來作圖，來確定IC50。這用作展示在噬菌體表面上的Fab克隆的親和性評(píng)估。
Fab產(chǎn)生與親和性測定 為表達(dá)用于親和性檢測的Fab蛋白，將中止密碼引入到噬菌體載體中的重鏈與g3之間。將克隆轉(zhuǎn)化入E.coli 34B8細(xì)胞，并在30℃在AP5培養(yǎng)基中生長(Presta et al.Cancer Res.574593-4599(1997))。通過離心收集細(xì)胞，懸浮在10mM Tris，1mM EDTA pH8并用微流體儀(microfluidizer)破裂細(xì)胞。利用蛋白G親和層析來純化Fab。利用BIAcoreTM-2000通過表面等離子體共振進(jìn)行親和性測定。將vBR3-Fc或hBR3ecd在10mM醋酸pH4.5(分別為220或100反應(yīng)單位(RU))固化在CM5傳感器芯片上，并且注入Fab在PBST中的系列2倍稀釋液(6.25至100nM)。用2分鐘結(jié)合(association)和20分鐘解離(dissociation)來分析每一樣品。每次注射后利用10mM Glycine pH1.5再生該芯片。通過從空白流細(xì)胞減去RU來校正結(jié)合反應(yīng)。將kon和koff的同時(shí)擬合的1∶1 Languir模型用于動(dòng)力學(xué)分析。
(b)結(jié)果與討論 2.1、11G9和9.1的人源化-用于人源化的人接受者框架是基于用于Herceptin_抗體的框架并由共有人κIVL區(qū)和人亞組III共有的VH區(qū)組成。該變體VH區(qū)具有3來自人共有R71A、N73T和L78A的三個(gè)改變。每一鼠2.1、11G9和9.1的VL和VH區(qū)均與人κI和亞組III區(qū)比對(duì)；鑒定每一互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)并嫁接入人接受者框架以產(chǎn)生CDR嫁接物，其可在噬菌體上以Fab展示。當(dāng)檢測噬菌體展示2.1、11G9或9.1 CDR嫁接物對(duì)固化vBR3-Fc的結(jié)合時(shí)，觀察到低的結(jié)合親和性。
對(duì)每一抗體產(chǎn)生CDR修復(fù)文庫，其中每一CDR嫁接物的CDR區(qū)被軟隨機(jī)化。每一CDR嫁接物文庫針對(duì)固化的vBR3-Fc淘洗進(jìn)行四輪的篩選。僅觀察到對(duì)應(yīng)9.1的CDR嫁接物的富集。挑選克隆用于DNA測序分析并顯示靶定在CDR-L2和CDR-H1(圖4)的序列變化。利用vBR3-Fc噬菌體ELISA來篩選克隆，并且所選克隆利用表達(dá)的Fab蛋白通過Biacore進(jìn)一步分析。相對(duì)于嵌合9.1 Fab，兩個(gè)克隆9.1-70和9.1-73顯示改進(jìn)的對(duì)vBR3-Fc的結(jié)合(圖10)。
因?yàn)槔肅DR修復(fù)，沒有將結(jié)合募集在2.1-嫁接物和11G9-嫁接物上，我們觀察了鼠和接受者框架的不同。有趣的是，在位置71和78，2.1和11G9以及9.1比我們最初使用的接受者框架更類似人共有亞組III序列(圖5)。這促使我們來利用2個(gè)新框架“RL”和“RF”探討CDR修復(fù)。這些框架不同于受者框架，因?yàn)榇嬖谟诠灿行蛄兄械腞71被恢復(fù)，并且位置78被改變?yōu)楣灿辛涟彼?RL)或通過引入苯丙氨酸(RF)在該位置被修飾成類似鼠的框架。這些框架的改變導(dǎo)致2.1和11G9噬菌體結(jié)合vBR3-Fc的適度改善。嫁接到RL或RF框架的9.1 CDR(9.1-RL或9.1-RF)的結(jié)合顯著改善(圖6)。
如上述，利用軟隨機(jī)化策略，同時(shí)在用于每一抗體/框架嫁接物(2.1-RL，2.1-RF，351 1G9-RL，11G9-RF，9.1-RL和9.1-RF)的6個(gè)CDR的每一個(gè)，產(chǎn)生的CDR修復(fù)文庫。對(duì)于這些篩選，采用溶液分選方法來增強(qiáng)基于親和性的噬菌體篩選方法效率。通過操縱生物素化靶標(biāo)的濃度，減少噬菌體捕獲時(shí)間，來降低背景，并且未生物素化靶標(biāo)的加入可去除具有更快解離率的克隆，優(yōu)先選擇高親和性的克隆(Lee，C.V.，et al.J.MoI.Biol.(2004)340(5)1073-93)。根據(jù)以上在方法中的描述，利用b-vBR3-Fc獨(dú)立分選12個(gè)文庫。
5輪篩選后，分析來自每一文庫的單獨(dú)克隆的DNA序列。利用vBR3-Fc噬菌體ELISA篩選克隆，并進(jìn)一步通過BIAcore表面等離子體共振(SPR)利用表達(dá)的Fab蛋白來分析所選擇的克隆。幾個(gè)克隆被鑒定為具有相當(dāng)或超過嵌合抗體的單體親和性的BR3結(jié)合親和性。對(duì)于9.1-RL和9.1-RF文庫，序列改變?cè)俅渭性贑DR-H1，表明此CDR的重新設(shè)計(jì)對(duì)抗原結(jié)合的恢復(fù)是重要的(圖8)。特別是，突變M34I常包括在不同的克隆中。在CDR-H1中其它的常見改變包括A31G和T28P，盡管無數(shù)的CDR-H1中的其它取代表現(xiàn)為較好的耐受。這些結(jié)果清楚地表明，存在有能夠修復(fù)嫁接到人框架上的9.1親和性的多序列改變，以及可以通過框架改變(例如9.1-RF)或CDR修復(fù)(例如9.1-70和9.1-73)來人源化此抗體，產(chǎn)生超過原始的鼠抗體的親和性的親和性。
對(duì)于11G9文庫，當(dāng)采用11G9-RF作為模板用于CDR修復(fù)文庫時(shí)才觀察到富集，其中在CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3觀察到序列改變(圖8)。但是2個(gè)最高的親和性克隆的每一個(gè)具有與CDR-H3類似的改變；兩個(gè)克隆均包括D96N、G97D和W100L的改變。這些克隆的親和性超過單體鼠11G9的親和性＞10倍。
在2.1-RL和2.1-RF文庫中均觀察到富集(圖7)。有趣的是，在兩個(gè)文庫中均觀察到類似的序列改變、靶向CDR-H3。事實(shí)上，在這兩種情況下，CDR-H3的改變?cè)谖膸?94-97NSNF和95-97TLP)間是相同的。由于文庫的設(shè)計(jì)而產(chǎn)生的潛在的序列多樣性是令人驚奇的。在兩種文庫中觀察到的序列的共同類別包括T94N和H96N，與位置95和97(例如，94-97NSNF、94-97NLNY和94-97NANY)的其它改變結(jié)合。這些變體傾向于具有對(duì)vBR3-Fc或hBR3ecd的最高親和性。事實(shí)上，克隆2.1-30(94-97NLNY)的親和性超過單體鼠2.1的親和性。
人源化改變的小結(jié) 從6種鼠9.1 CDR(定義為位置24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、26-35(H1)、49-65(H2)和94-102(KB))嫁接入人共有κIVL和亞組IIIVH區(qū)，鑒定了此抗體的人源化的2個(gè)途徑。除了新CDR-H1序列和CDR-L2中2個(gè)改變的選擇之外，第一個(gè)采用在Herceptin_抗體(R71A，N73T andL78A)存在的3個(gè)框架改變。這產(chǎn)生了高于嵌合9.1 Fab的親和性近2倍的人源化變體(9.1-70)。第二個(gè)途徑采用在框架中添加2個(gè)改變(N73T和L78F)而對(duì)CDR(9.1-RF)沒有改變，再次產(chǎn)生高于嵌合9.1 Fab的親和性近2倍的親和性。
從6種鼠11G9 CDR(定義為位置24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、26-35(H1)、49-65(H2)和94-102(KB))嫁接入人共有κIVL和亞組III VH區(qū)開始，在框架中添加2個(gè)改變(N73T和L78F)及在CDR-H3中3個(gè)改變(D96N，G97D和W100L)產(chǎn)生相對(duì)于嵌合11G9 Fab親和性，具有＞10倍改善的親和性的全人11G9抗體(11G9-46)。
從6種鼠2.1 CDR(定義為位置24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、26-35(H1)、49-65(H2)和94-102(H3))嫁接入人共有κIVL和亞組III VH區(qū)開始，在框架中添加單個(gè)改變(N73T)及在CDR-H3中4個(gè)改變(T94N，P95L，H96N和T97Y)，相對(duì)于嵌合2.1Fab親和性，產(chǎn)生具有改善親和性的全人2.1抗體(2.1-30)。
利用所選擇的克隆的Biacore結(jié)合分析結(jié)果如圖10所示。
實(shí)施例4-衍生自天然噬菌體文庫的抗BR3抗體 最初從噬菌體展示合成抗體文庫中挑選其它的結(jié)合BR3的抗體，在在重鏈的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)內(nèi)的溶劑暴露位置引入合成的多樣性，在單個(gè)人框架構(gòu)建該文庫。
(a)用于文庫構(gòu)建的噬菌粒載體 設(shè)計(jì)噬菌粒pV0350-2b和pV0350-4分別用于在M13噬菌體顆粒表面單價(jià)和雙價(jià)地展示Fab模板。
該Fab模板基于h4D5抗體，該抗體為人源化抗體，其特異識(shí)別稱為Her-2(erbB2)的癌相關(guān)抗原。通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)利用humAb4D5變種8(“humAb4D5-8”)來獲得h4D5序列(Carter et al.，(1992)PNAS894285-4289)。該h4D5核酸序列編碼來自對(duì)Her-2特異的小鼠單克隆抗體的修飾的CDR區(qū)，該抗體位于人共有的序列Fab框架。具體地，該序列包含VH和CH1結(jié)構(gòu)域(HC區(qū))上游的κ輕鏈(LC區(qū))。產(chǎn)生抗-Her-2抗體的方法以及可變區(qū)序列的鑒定由美國專利第5,821,337號(hào)和第6,054,297提供。
所述載體pV0350-2b通過修飾前述的噬菌粒(pHGHam-gIII)，該噬菌體在phoA啟動(dòng)子控制下已經(jīng)被用于人生長激素(hGH)的的噬菌體展示。在phGHam-gIII中編碼融合至M13小包被蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域P3(cP3)的stII分泌信號(hào)序列和hGH的開放閱讀框被含有兩個(gè)開放閱讀框的DNA片段取代。第一閱讀框編碼cP3的h4D5輕鏈(變種8)，第二閱讀框編碼h4D5重鏈的可變區(qū)(VH)和第一恒定區(qū)(CH1)，這些區(qū)域均融合至cP3；N-末端stII信號(hào)序列指導(dǎo)每一蛋白的分泌。刪除在重鏈片段和cP3間的琥珀型終止密碼子，因已經(jīng)證實(shí)此修飾能夠增加展示在噬菌體上的Fab的水平。將表位標(biāo)簽加入到h4D5輕鏈C末端(gD標(biāo)簽)。二價(jià)展示載體(pV0350-4)與pV0350-2b相同，除了編碼如上述的在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域和cP3之間的GCN4亮氨酸拉鏈的DNA片段的插入之外。在3個(gè)位置進(jìn)一步修飾兩種噬菌體中的輕鏈基因來編碼在天然抗體序列的Kabat數(shù)據(jù)庫中最常見的氨基酸；具體是，Arg66被改變?yōu)镚ly，Asn30和His91被改變?yōu)镾er。發(fā)現(xiàn)這些改變可增加Fab表達(dá)以及在噬菌體上的展示。利用Kunkel et al.(Kunkel，J.D.，et al.，(1987)Methods Enzymol 154367-82)方法進(jìn)行定點(diǎn)突變。
(b)文庫的構(gòu)建 利用已知的定向寡核苷酸的突變和pV0350-2b或pV0350-4的“終止模板”變體(Lee，C.V.，et al.，(2004)J.Immunol.Methods 284119-132；Lee，C.V.，et al.，(2004)JMB 3401073-1093)產(chǎn)生噬菌體展示文庫。將終止密碼子(TAA)植入到所有的三個(gè)重鏈CDR。通過簡并寡核苷酸的混合物在突變反應(yīng)中修補(bǔ)它們，該寡核苷酸在編碼CDR-H1、-H2和-H3的序列上退火，并用特制的簡并密碼子來取代所選擇用于隨機(jī)化位置的密碼子。將突變反應(yīng)物電穿孔至E.coli SS320細(xì)胞，并且在30℃下在添加KO7輔助噬菌體、50g/ml的carbenicillin和50g/ml的卡那霉素的2YT肉湯中將培養(yǎng)物生長過夜。根據(jù)已知方法(Sidhu，S.S.et al.，(2000)，Methods Enzymol.328333-363)來從培養(yǎng)基中收集噬菌體并用PEG/NaCl沉淀。每一電穿孔反應(yīng)使用約1011的E.coli細(xì)胞和約10μg的DNA并產(chǎn)生1×109-5×109的轉(zhuǎn)化體。
利用適于模擬CDR-H1和CDR-H2的天然多樣性的簡并寡核苷酸來建立不同的文庫(Lee，CV，et al.，(2004)，JMB，supra，Table 1)具有Fab.zip模板的文庫3(Lib-3)。參見上述引用的Lee，CV，et al.，(2004)描述的Lib-3。CDR-H1和CDR-H2的2至4個(gè)寡核苷酸組合來增加天然多樣性的覆蓋性。Lib-3分別采用寡核苷酸HIa和HIb(比值2∶1)及CDR-H1和CDR-H2的H2a-c(比值1∶2∶0.1)(參見上述引用的Lee，CV.et al.(2004)，JMB的表1對(duì)寡核苷酸的描述)。
對(duì)于CDR-H3的位置95-100，Lib-3由具有延伸的CDR-H3長度的一組文庫組成，該延伸的CDR-H3長度含有NNS密碼子(或NNK密碼子)或修飾版本的NNS密碼子(XYZ密碼子)，該版本在三聯(lián)密碼子的每一位置含有不相等的核苷酸比例。NNS密碼子涵蓋32密碼子并編碼所有20個(gè)氨基酸。X含有38％G，、9％A、26％T和17％C；Y含有31％G、34％A、17％T和18％C；以及Z含有24％G和76％C。在上述引用的Lee，CV.et al.，(2004)表5中描述了Lib-3的CDR-H3設(shè)計(jì)。除了一起進(jìn)行電穿孔的7個(gè)和8個(gè)殘基長度之外，單獨(dú)進(jìn)行突變反應(yīng)并將每一長度的CDR-H3進(jìn)行電穿孔。
通過檢測48個(gè)隨機(jī)挑選的克隆對(duì)抗gD抗體的結(jié)合來檢驗(yàn)每一文庫中全部Fab的噬菌體展示水平。對(duì)于Lib-3，對(duì)于不同的CDR-H3長度觀察到了相似的展示水平，除了整合最長的CDR-H3(15-19殘基)具有降低的Fab展示克隆百分比(15-30％)外。這反映出在使用較長的合成寡核苷酸時(shí)會(huì)降低突變效率。
噬菌體分選 在板上針對(duì)BR3(mBR3-ECD)的小鼠胞外區(qū)、融合到IgG1(mBR3-Fc)的Fc區(qū)的小鼠BR3胞外區(qū)、人BR3胞外區(qū)(hBR3-ECD)和融合到IgG1(vBR3-Fc)的Fc區(qū)人BR3胞外區(qū)，分選F(ab)′2(隨機(jī)化的CDR-H1/H2/H3)合成噬菌體抗體文庫。采用在包被緩沖液中(0.05M碳酸鈉緩沖液，pH9.6)的100μl/孔的靶抗原(mBR3-ECD，mBR3-Fc，hBR3-ECD和vBR3-Fc)(5μg/ml)將96孔Nunc Maxisorp板在4℃包被過夜或在室溫包被2小時(shí)。用65μl 1％封閉蛋白30分鐘和40μl 1％Tween20另一30分鐘封閉該板(封閉蛋白(1st第一輪-牛血清白蛋白(BSA)，2nd輪-卵清蛋白，3rd輪-奶，4th輪-BSA)。隨后，用含0.1％Tween 20的1％BSA將噬菌體文庫稀釋3-5O.D/ml(1 O.D.＝1.13×1013噬菌體/ml)。通常，噬菌體的加入為第1輪3-5 O.D./ml，第2輪3O.D./ml，第3輪0.5-1 O.D/ml以及第4輪加入0.1-0.5 O.D/ml。在室溫孵育該稀釋的噬菌體30分鐘。連續(xù)用PBS和0.05％Tween 20洗滌小孔至少5次。將封閉的噬菌體文庫100μl/孔加入至8個(gè)靶抗原包被孔及2個(gè)未包被的孔1小時(shí)。連續(xù)用PBS和0.05％Tween 20洗滌該板至少10次。在室溫用100μl/孔的100mM HCl洗脫噬菌體20分鐘。將洗脫的噬菌體(來自包被的孔)和背景噬菌體(來自未包被的孔)收集在單獨(dú)的管中。通過向兩個(gè)管中加入1/10體積的1M Tris pH11.0來中和洗脫的收集物。向洗脫噬菌體的管中加入BSA至終濃度0.1％。在62℃加熱該洗脫的噬菌體20分鐘。為滴定該噬菌體，用10μl洗脫的噬菌體或背景噬菌體在37℃感染90μl的對(duì)數(shù)期XL-I(OD 600nm約0.1-0.3)30分鐘。隨后，用90μl 2YT以10倍增加系列稀釋感染的細(xì)胞。將每個(gè)羧芐青霉素板用10μl等份的感染細(xì)胞鋪板。
為增殖噬菌體，在37℃采用大約400μl的洗脫噬菌體感染約4ml指數(shù)期的XL-1湯(OD 600nm約0.1-0.3)30-45分鐘。在37℃將輔助噬菌體，KO7，和羧芐青霉素加入至感染中至終濃度1×1010pfu/ml KO7和50μg/ml羧芐青霉素，1小時(shí)。在37℃將培養(yǎng)物過夜(或至少17小時(shí))生長在含50μg/ml羧芐青霉素和50μg/ml卡那霉素的終體積為20-25ml的2YT中。第二天，將培養(yǎng)物在30℃生長另外2小時(shí)來增加噬菌體產(chǎn)量。
通過以8000rpm離心沉降細(xì)胞10分鐘來純化噬菌體。收集上清液。以上清液體積的1/5加入20％PEG/2.5M NaCl，混合并放置在冰上5分種。12000rpm離心噬菌體15分鐘形成沉淀。收集上清液并在5000rpm再次離心5分鐘。將沉淀重懸在1ml PBS中并在12000rpm離心15分鐘來清除碎片。從PEG/NaCl添加起始的步驟在重懸的沉淀中重復(fù)。在270nm讀取重懸的噬菌體沉淀的OD值。提高重復(fù)如上所述的噬菌體分選步驟來完成第二、第三和第四輪噬菌體分選。
ELISA篩選分析 通過ELISA分析來篩選來自第三和第四輪克隆的特異性和親和性。陽性克隆(結(jié)合克隆，binder)為具有高于背景結(jié)合至靶抗原(mBR3-ECD和hBR3-ECD)而不對(duì)諸如牛血清白蛋白的封閉蛋白結(jié)合的克隆。
首先，用20μl每孔的(1μg/ml包被緩沖液)mBR3-ECD，hBR3-ECD和抗gD將384孔微滴定板的小孔在4℃包被過夜和在室溫包被2小時(shí)。
在另一96孔板中，來自第三和第四輪的克隆，在37℃在含有50μg/ml羧芐青霉素和輔助噬菌體KO7的150μl 2YT培養(yǎng)基中生長過夜。在2500rpm離心該板20分鐘。在包被孔的板中，將50μl的上清液加入至120μl的ELISA緩沖液(含0.5％BSA和0.05％Tween20的PBS)。將30μl的混合物加入至384孔包被板的每一四分部分，并在室溫孵育1小時(shí)。通過室溫加入75μl/孔的含0.5％BSA和0.05％Tween20的PBS中的辣根過氧化氫酶(HRP)-結(jié)合的抗M13抗體30分鐘(Sidhu et al.，如上引用)來對(duì)結(jié)合定量。利用PBS-0.05％Tween20洗滌至少5次。隨后，將100μl/孔的1∶1比例的3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)過氧化氫酶底物和過氧化氫酶溶液B(H2O2)((Kirkegaard-Perry Laboratories(Gaithersburg，MD))加入到小孔中并在室溫孵育5分鐘。通過向每個(gè)小孔添加100μl 1M的磷酸(H3PO4)并在室溫孵育5分鐘來終止反應(yīng)。利用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA平板閱讀儀來在450nm測定每孔中黃顏色的OD值。選擇對(duì)mBR3-ECD和hBR3-ECD的結(jié)合高于對(duì)BSA的結(jié)合3倍的克隆(圖11)。
測序所選擇的結(jié)合克隆。發(fā)現(xiàn)15個(gè)獨(dú)特的克隆(1個(gè)克隆來自對(duì)mBR3-ECD的分選，6個(gè)克隆來自對(duì)mBR3-Fc的分選，8個(gè)克隆來自對(duì)hBR3-ECD的分選，沒有克隆來自對(duì)hBR3-Fc的分選)(圖12)。
溶液結(jié)合競爭ELISA 為測定所選擇的F(ab)′2噬菌體的結(jié)合親和性，進(jìn)行競爭ELISA。首先，增殖并純化噬菌體。37℃用克隆感染30分鐘的10μl的XL-1細(xì)菌鋪板在羧芐青霉素板上。挑選克隆并在37℃生長在2ml(2YT and50μg/ml羧芐青霉素)3-4小時(shí)。將輔助噬菌體KO7以終濃度1010pfu/ml加入到培養(yǎng)物中，并在37℃再培養(yǎng)1小時(shí)。20ml的培養(yǎng)基(將含50μg/ml羧芐青霉素和50μg/ml卡那霉素的2YT)加入到培養(yǎng)物中，在37℃生長過夜。根據(jù)以上所述純化噬菌體。
其次，確定優(yōu)化以用于以下競爭ELISA分析的純化的噬菌體的濃度(即，在包被板上的大約90％的最大結(jié)合能力)。用2μg/ml包被緩沖液中的mBR3-ECD或mBR3-Fc對(duì)96孔Nunc Maxisorp板在4℃包被過夜或在室溫包被2小時(shí)。通過添加65μl 1％BSA，30分鐘，隨后是40μl 1％Tween20另一30分鐘，來封閉該小孔。接下來，利用PBS-0.05％Tween20洗滌小孔5次。在ELISA緩沖液中(PBS-0.5％BSA和0.05％Tween20)將F(ab)′2噬菌體稀釋至0.1O.D./ml，并隨后添加到小孔中室溫15分鐘。隨后利用PBS-0.05％Tween20洗滌小孔至少3次。每孔加入75μl的HRP-偶聯(lián)的抗-M13抗體(Amersham，用ELISA緩沖液做1/5000稀釋)并在室溫孵育30分鐘。再次用PBS-0.05％Tween20洗滌小孔至少5次。接下來，將100μl/孔的1∶1比例的3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)過氧化氫酶底物和過氧化氫酶溶液B(H2O2)((Kirkegaard-Perry Laboratories(Gaithersburg，MD))加入到小孔中，并在室溫孵育5分鐘。利用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA平板閱讀儀來在450nm測定每孔中顏色的光密度值。將噬菌體的稀釋度相對(duì)于O.D.讀取值作圖。
第三，實(shí)施進(jìn)行ELISA。用2μg/ml的mBR3-ECD或mBR3-Fc對(duì)96孔Nunc Maxisorp板在4°包被過夜或在室溫包被2小時(shí)。通過添加65μl 1％BSA，30分鐘，隨后是40μl 1％Tween20另一30分鐘，來封閉該小孔。利用PBS-0.05％Tween20洗滌小孔5次。根據(jù)上述的結(jié)合分析，將50μl的能夠產(chǎn)生約90％的對(duì)包被的結(jié)合的稀釋的噬菌體與50μl的ELISA緩沖液中的不同濃度的mBR3-ECD或mBR3-Fc或hBR3-ECD或hBR3-Fc(0.1至1000nM)在小孔中室溫孵育2小時(shí)。通過轉(zhuǎn)移75μl的該小孔混合物至用mBR3-ECD或mBR3-Fc預(yù)包被的第二96孔板并在室溫孵育15分鐘來分析未結(jié)合的噬菌體。用PBS-0.05％Tween20洗滌第二板的小孔至少3次。每孔加入75μl的HRP-結(jié)合的抗M13抗體(Amersham，用ELISA緩沖液做1/5000稀釋)并在室溫孵育30分鐘。再次用PBS-0.05％Tween20洗滌小孔至少5次。接下來，將100μl/孔的1∶1比例的3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)過氧化氫酶底物和過氧化氫酶溶液B(H2O2)((Kirkegaard-Perry Laboratories(Gaithersburg，MD))加入到小孔中，并在室溫孵育5分鐘。通過向每個(gè)小孔添加100μl 1M的磷酸(H3PO4)并在室溫孵育5分鐘來終止反應(yīng)。利用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA平板閱讀儀來在450nm測定每孔中顏色的光密度值。將競爭劑mBR3-ECD或mBR3-Fc或hBR3-ECD或hBR3-Fc相對(duì)于O.D.讀取值作圖。IC50，抑制50％的F(ab)′2-噬菌體的mBR3-ECD或mBR3-Fc或hBR3-ECD或hBR3-Fc的濃度，代表所述的親和性(圖13)。V3克隆對(duì)小鼠和人BR3的結(jié)合均具有高親和性。
mBAFF阻斷ELISA 為了發(fā)現(xiàn)這些獨(dú)特的克隆具有與配體(BAFF)相似的結(jié)合表位，如下進(jìn)行mBAFF阻斷ELISA用2μg/ml包被緩沖液中的mBR3-Fc對(duì)96孔Nunc Maxisorp板在4°包被過夜或在室溫包被2小時(shí)。通過添加65μl1％BSA，30分鐘，隨后是40μl 1％Tween20另一30分鐘，來封閉該小孔。接下來，利用PBS-0.05％Tween20洗滌小孔5次。將在ELISA緩沖液中的不同濃度的mBAFF-Flag蛋白在小孔中室溫孵育30分鐘。隨后，向每孔加入具有獨(dú)特序列的F(ab)′2噬菌體，10分鐘，在沒有mBAFF-Flag蛋白存在下該加入的噬菌體濃度通常能夠產(chǎn)生90％結(jié)合能力。利用PBS-0.05％Tween20洗滌小孔5次。
通過加入含0.5％BSA和0.05％Tween20的PBS中75μl/孔的辣根過氧化物酶(HRP)-偶聯(lián)的抗M13抗體，在室溫30分鐘(Sidhu et al.，如上引用)定量結(jié)合。利用PBS-0.05％Tween20洗滌小孔至少5次。接下來，將100μl/孔的1∶1比例的3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)過氧化氫酶底物和過氧化氫酶溶液B(H2O2)((Kirkegaard-Perry Laboratories(Gaithersburg，MD))加入到小孔中，并在室溫孵育5分鐘。通過向每個(gè)小孔添加100μl 1M的磷酸(H3PO4)并在室溫孵育5分鐘來終止反應(yīng)。利用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA平板閱讀儀來在450nm測定每孔中溶液的OD值。結(jié)果如圖13和圖14所示。
還進(jìn)行了另一單價(jià)形式的BAFF阻斷ELISA。通過利用mBR3-ECD包被的板，使ELISA緩沖液中的不同濃度的雜種BAFF蛋白在小孔中室溫孵育30分鐘。隨后，向每孔加入具有獨(dú)特序列的F(ab)′2噬菌體，10分鐘，在沒有雜種BAFF蛋白存在下該加入的噬菌體濃度通常能夠產(chǎn)生90％結(jié)合能力。以下步驟如上所述。結(jié)果如圖13所示。
圖14顯示了克隆3(V3)較容易地阻斷BAFF-BR3結(jié)合。圖15中描述了V3的可變區(qū)序列。
改變V3骨架的F(ab)′2形式為Fab形式 因?yàn)閂3具有最好的BAFF的阻斷活性，并具有對(duì)mBR3和hBR3的跨物種結(jié)合活性，V3是進(jìn)一步的親和性改善的抗體候選物。為了證實(shí)單價(jià)親和性的進(jìn)一步的親和性改善，利用F220寡序列(5′-TCT TGT GACAAA ACT CAC AGT GGC GGT GGC TCT GGT-3′)(SEQ ID NO154)通過Kunkel突變?nèi)コ涟彼崂?。此外，為了證實(shí)隨機(jī)形式的CDR-L3摻入，將終止密碼子(TAA)摻入到在CDR-L3中預(yù)多樣化的位置。F9寡序列(5′-TAT TAC TGT CAG CAA CAT TAA TAA AGG CCT TAA CCTCCC ACG TTC GGA-3′)(SEQ ID NO155)被用在CDR-L3區(qū)添加終止密碼子。
用于親和性改善的V3骨架上的構(gòu)建體文庫 將硬和軟的隨機(jī)設(shè)計(jì)用來親和性改善。硬隨機(jī)表示限定的位置被隨機(jī)化為全部的20個(gè)氨基酸。軟隨機(jī)表示在某些位置隨機(jī)化保留50％的親代氨基酸和50％的19個(gè)其它的氨基酸或終止密碼子。通過Kunkel突變已經(jīng)構(gòu)建了基于V3骨架的4個(gè)文庫。
V0902-1CDR-L1(F111+F202＝1∶1)/L2(F201+F203＝1∶1)/L3(F133a∶133b∶133c∶133d＝1∶1∶1∶1) V0902-2CDR-L3軟(F232)/H1軟(F226)/L2(F201+F203＝1∶1) V0902-3CDR-H3軟(F228+F229+F230+F231＝1∶1∶0.5∶0.5)/L3軟(F232) V0902-4CDR-L3軟(F232)/H1軟(F226)/H2軟(F227) 寡序列 L1 F111(5′-ACC TGC CGT GCC AGT CAG RDT RKT RVW ANW THTGTA GCC TGG TAT CAA CAG AAA C-3′)(SEQ ID NO156) F202(5′-ACC TGC CGT GCC AGT CAG RDT RKT RVW ANW THTCTG GCC TGG TAT CAA CAG AAA C-3′)(SEQ ID NO157) L2 F201(5′-CCG AAG CCT CTG ATT TAC KBG GCA TCC AVC CTCTAC TCT GGA GTC CCT-3′)(SEQ ID NO158) F203(5′-CCG AAG CTT CTG ATT TAC KBG GCA TCC AVC CTCGMA TCT GGA GTC CCT TCT CGC-3′)(SEQ ID NO159) L3 F133a(5′-GCA ACT TAT TAC TGT CAG CAA TMT DMC RVT NHTCCT YKG ACG TTC GGA CAG GGT ACC-3′)(SEQ ID NO160) F133b(5′-GCA ACT TAT TAC TGT CAG CAA TMT DMC RVT NHTCCT TWT ACG TTC GGA CAG GGT ACC-3′)(SEQ ID NO161) F133c(5′-GCA ACT TAT TAC TGT CAG CAA SRT DMC RVT NHTCCT YKG ACG TTC GGA CAG GGT ACC-3′)(SEQ ID NO162) F133d(5′-GCA ACT TAT TAC TGT CAG CAA SRT DMC RVT NHTCCT TWT ACG TTC GGA CAG GGT ACC-3′)(SEQ ID NO163) 軟隨機(jī)寡序列符號(hào)5(70％A，10％G，10％C，10％T) 6(70％G，10％A，10％C，10％T) 7(70％C，10％A，10％G，10％T) 8(70％T，10％A，10％G，10％C) L3軟F232(5′-GCA ACT TAT TAC TGT CAG CAA 567 857 577 577CCG 776 ACG TTC GGA CAG GGT ACC-3′)(SEQ ID NO164) H1軟F226(5′-TGT GCA GCT TCT GGC TTC WCC NTT 567 567 557567 587 757 TGG GTG CGT CAG GCC-3′)(SEQ ID NO165) H2軟F227(5′-AAG GGC CTG GAA TGG GTT GST 866 ATC 577 776567 658 668 557 577 658 TAT GCC GAT AGC GTC AAG-3′)(SEQ ID NO166) H3軟 F228(5′-GCC GTC TAT TAT TGT GCT CGT 768 686 TGC 857 567567 686 768 668 TGC 676 668 676 ATG GAC TAC TGG GGT CAA G-3′)(SEQ ID NO167) F229(5′-GCC GTC TAT TAT TGT GCT CGT 768 686 867 857 567567 686 768 668 867 676 668 676 ATG GAC TAC TGG GGT CAA G-3′)(SEQ ID NO168) F230(5′-GCC GTC TAT TAT TGT GCT 768 768 686 TGC 857 567567686 768 GGC TGC GCG GGG GCA ATG-3′)(SEQ ID NO169) F23 1(5′-GCT CGT CGG GTC TGC TAC 567 567 686768 668 TGC676 668 676 ATG GAC TAC TGG GGT CAA G-3′)(SEQ ID NO170) 噬菌體的表達(dá) 利用上述的突變DNA通過電穿孔轉(zhuǎn)化E.coli菌株SS320/KO7(KO7感染的)。在30℃將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞生長在含50μg/ml羧芐青霉素和50μg/ml卡那霉素的2YT培養(yǎng)基中20小時(shí)。根據(jù)已知方法(Sidhu et al.，Methods Enzymol.(2000)，328333-363)來收集噬菌體。簡而言之，首先利用聚乙二醇從過夜的培養(yǎng)基中沉淀噬菌體并重懸在PBS來純化噬菌體。
利用分光光度計(jì)通過其在268nm的讀數(shù)(1OD＝1.13×1013/ml)來定量噬菌體。
相對(duì)于V3產(chǎn)生親和性改善的噬菌體分選策略 對(duì)于親和性改善篩選，將噬菌體文庫進(jìn)行第一輪的板分選并隨后進(jìn)三輪的溶液分選。在第一輪板分選中，分別針對(duì)mBR3-ECD和hBR3-ECD包被的板(NUNC Maxisorp板)進(jìn)行4個(gè)文庫的分選。加入的噬菌體大約為3O.D/ml(在1％BSA和0.1％Tween20中)。以下步驟如上噬菌體分選部分所述。將針對(duì)mBR3-ECD或hBR3-ECD的來自文庫V0902-2，V0902-3和V902-4的洗脫的噬菌體合并進(jìn)行增殖。
第一輪板分選后，進(jìn)行三輪的溶液分選來增加篩選的嚴(yán)緊性。
A)mBR3-ECD和hBR3-ECD的生物素化 在生物素化之前，將靶蛋白放入不含胺的緩沖液中，理想地在高于7.0的pH并在＞0.5mg/ml的濃度下。首先，通過使用Amicon Mltra 5K管將含有mBR3-ECD和hBR3-ECD的緩沖液交換入PBS中。其次，制備NHS-生物素反應(yīng)劑在PBS中的新鮮儲(chǔ)存液(100X)。將大約3∶1摩爾比例的MHS-生物素反應(yīng)劑和靶蛋白在室溫孵育30分鐘至1h。隨后，在室溫下加入0.1M Tris pH7.530分鐘，以淬滅未反應(yīng)的NHS。
B)用PBS中的100μl/孔的中性鏈親和素(5μg/ml)對(duì)96孔NuncMaxisorp板在4℃包被過夜和在室溫包被2小時(shí)。利用65μl Superblock(Pierce)封閉該板30分鐘，并用40μl 1％Tween20封閉另外30分鐘。
C)將從第一輪板分選中增殖的1O.D./ml噬菌體與100nM的生物素化的mBR3-ECD或hBR3-ECD在150-200μl含Superblock 0.5％和0.1％Tween20的緩沖液中在室溫下一起孵育至少1小時(shí)。利用Superblock0.5％對(duì)該混合物做5-10X的進(jìn)一步稀釋，并以100μl/孔施加到中性鏈親和素包被的小孔中室溫5分鐘，同時(shí)通過柔和的搖動(dòng)使得生物素化的靶標(biāo)能夠結(jié)合噬菌體。利用PBS-0.05％Tween20洗滌小孔8次。為了確定背景結(jié)合，將含有具有未生物素化的靶標(biāo)的噬菌體的對(duì)照孔捕獲在中性鏈親和素包被的板上。對(duì)于另一對(duì)照(中性鏈親和素結(jié)合的對(duì)照)，將生物素化靶標(biāo)與噬菌體混合并孵育在未用中性鏈親和素包被的小孔中。0.1NHCl洗脫結(jié)合的噬菌體20分鐘，用1/10體積的1M Tris pH11中和，并滴定和增殖用于下一輪。接下來，利用降低濃度至5nM和1nM的生物素化mBR3-ECD或BR3-ECD來實(shí)施另兩輪的溶液分選，以增加嚴(yán)緊性。而且，將噬菌體的加入減少至0.5O.D/ml和0.1O.D/ml來降低背景噬菌體結(jié)合。
高通量親和性篩選ELISA(單點(diǎn)競爭) 從第三和第四輪篩選中挑選克隆并在37℃過夜生長在96孔板(Falcon)中的含50μg/ml羧芐青霉素和1e10/ml KO7的2YT培養(yǎng)基中。從相同的板中，挑選XL-1感染的V3噬菌體克隆作為對(duì)照。
利用100μl/孔包被緩沖液中的mBR3-ECD(2μg/ml)對(duì)96-孔 NuncMaxisorp板在在4°包被過夜或在室溫包被2小時(shí)。通過65μl 1％BSA，30分鐘，隨后是40μl 1％Tween20另一30分鐘，來封閉該板。
將噬菌體上清液在100μl總體積的ELISA緩沖液(含0.5％BSA，0.05％Tween20的PBS)中作1∶10稀釋，該緩沖液含或不含100nMmBR3-ECD或hBR3-ECD，并在F板(NUNC)中室溫(RT)孵育至少1小時(shí)。將75μl的混合物，含有和不含mBR3-ECD或者含有hBR3-ECD平行地轉(zhuǎn)移至mBR3-ECD包被的板中。將該板輕柔搖動(dòng)10-15分鐘使得將未結(jié)合的噬菌體捕獲至mBR3-ECD包被的板上。通過添加ELISA緩沖液中的辣根過氧化物酶(HRP)-結(jié)合的抗M13抗體(1∶5000)并在室溫孵育30分鐘來定量該結(jié)合。用PBS-0.05％Tween20洗滌該板至少5次。接下來，將100μl/孔的1∶1比例的3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)過氧化氫酶底物和過氧化氫酶溶液B(H2O2)((Kirkegaard-Perry Laboratories(Gaithersburg，MD))加入到小孔中，并在室溫孵育5分鐘。通過向每個(gè)小孔添加100μl1M的磷酸(H3PO4)并在室溫孵育5分鐘來終止反應(yīng)。利用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA平板閱讀儀來在450nm測定每孔中黃色的OD值。通過以下等式來計(jì)算OD的降低值(％)。
OD450nm降低值(％)＝(含競爭劑孔的OD450nm)/(不含競爭劑孔的OD450nm)*100 與V3噬菌體(100％)小孔的OD450nm降低值(％)比較，挑選對(duì)mBR3-ECD和hBR3-ECD的OD450nn降低值(％)均低于50％的克隆。僅從針對(duì)mBR3-ECD分選的V0902-2，3，4混合文庫中挑選出14種克隆。無論從針對(duì)mBR3-ECD分選的V0902-1 LC硬隨機(jī)文庫，還是從針對(duì)hBR3-ECD分選的兩種文庫中，均無命中。對(duì)這14種克隆進(jìn)行測序。最終，存在4種獨(dú)特序列(V3-1、V3-11、V3-12和V3-13)。所有4個(gè)獨(dú)特克隆具有與V3克隆相同的CDR-L1和CDR-H2，其與4D5文庫模板相同。V3-1、V3-11和V3-12來自文庫V0902-3，而V3-13來自文庫V0902-2。
圖16A顯示L2、L3、H1和H3區(qū)域的部分序列。
新克隆的功能特征 對(duì)V3-衍生的克隆進(jìn)行BAFF阻斷ELISA，來檢測與V3克隆比較的BAFF阻斷活性。所有的4個(gè)克隆顯示對(duì)雜合的BAFF的完全阻斷活性。這表明，所有4個(gè)克隆對(duì)BR3具有與BAFF相似的結(jié)合表位。
此外，實(shí)施競爭ELISA來測定這些噬菌體克隆對(duì)mBR3-ECD、hBR3-ECD和小-BR3的親和性。小BR3為26個(gè)殘基肽段，其對(duì)BAFF具有完全的親和性。阻斷ELISA和噬菌體競爭ELISA的結(jié)果總結(jié)如圖16B。
用于細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的Fab構(gòu)建體 通過去除病毒cP3序列，用含有5′-GCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATG-3′(SEQ ID NO171)的終止序列取代它們，并去除編碼gD標(biāo)簽的序列(分別為pwO276-V3，pwO276-V3-1，pwO276-V3-11和pw0276-V3-12)，來修飾V3、V3-1、V3-11、V3-12和V3-13噬菌體。將所有構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入E coli 34B8細(xì)胞。挑選單個(gè)克隆，并生長在含25μg/ml羧芐青霉素完全的CRAP培養(yǎng)基中，30℃，至少22小時(shí)。通過蛋白G高陷阱柱子(high trap column，AmershamPharmacia)來純化所表達(dá)的蛋白。
利用在BIAcoreTM-2000上的Biacore檢測表面等離子體共振分析來測定抗BR3Fab的親和性。在CM5芯片上的固化的mBR3-ECD和hBR3-ECD約150反應(yīng)單位(RU)。從3nM至500nM增加濃度的Fab樣品以20μl/分鐘注射，并通過從空白流細(xì)胞減去RU來校正對(duì)mBR3-ECD或hBR3-ECD的結(jié)合反應(yīng)。對(duì)于動(dòng)力學(xué)分析，利用kon和koff同時(shí)擬合的1∶1 Languir模型。將表觀kD值報(bào)告在表4中。
表4. 利用V3-1構(gòu)建文庫以進(jìn)一步改善親和性 利用軟和較軟的隨機(jī)化來進(jìn)行進(jìn)一步的親和性改善。軟隨機(jī)化表示在某些位置，50％保留親代氨基酸，而另50％為另外19種氨基酸或終止密碼子。較軟隨機(jī)化表示在某些位置保留75％為親代氨基酸，而另25％為其它的19種氨基酸和終止密碼子。通過Kunkel突變基于V3-1骨架構(gòu)建4個(gè)文庫。
V1008-1L3(F279+F280+F293＝1∶1∶0.2)/H3(F285+F286＝1∶1) V1008-2L3(F279)/H3(F283+F284＝1∶1) V1008-3H1(F281)/H2(F282)/L3(F279) V1008-4L3(F280+F293＝1∶4)/H3(F283+F284+F266+F267＝1∶1∶1∶1) 寡序列 I3軟 F279(5′-ACT TAT TAC TGT CAG CAA 568 767 587 577 CCG 777ACG TTC GGA CAG GGT-3′)(SEQ ID NO172) F280(5′-ACT TAT TAC TGT CAG CAA 568 767 587 577 568 CCG777 ACG TTC GGA CAG GGT-3′)(SEQ ID NO173) F293(5′-ACT TAT TAC TGT CAG CAA 878 NNK NNK NNK 878CCG CCC ACG TTC GGA CAG GGT-3′)(SEQ ID NO174) H1軟 F281(5′-GCA GCT TCT GGC TTC WCC ATT 568 568 568 878 ATACAC TGG GTG CGT C-3′)(SEQ ID NO175) H2軟 F282(5′-CTG GAA TGG GTT GCT TGG RTT 578 CCT 878 657 GGT878 ACT 657 TAT GCC GAT AGC GTC AAG-3′)(SEQ ID NO176) H3軟 F283(5′-GTC TAT TAT TGT GCT CGT 766 687 TGC 857 557 767788 668 688 TGC GCT GGT GGG ATG-3′)(SEQ ID NO177) F284(5′-GTC TAT TAT TGT GCT CGT 766 687 TGC 857 557 767CTT GGT GTT TGC 678 668 668 ATG GAC TAC TGG GGT CAA-3′)(SEQ ID NO178) F285(5′-GTC TAT TAT TGT GCT CGT 766 687 RST 857 557 767788 668 688 RST GST GST GSG ATG GAC TAC TGG GGT-3′)(SEQ IDNO179) F286(5′-TAT TAT TGT GCT CGT CGG 687 RST 857 557 767 788668 688 RST 678 668 668 ATG GAC TAC TGG GGT C-3′)(SEQ ID NO180) H3較軟 F266(5′-GTC TAT TAT TGT GCT CGT 766 687 TGC 857 557767788 668 688 TGC GCT GGT GGG ATG-3′)(SEQ ID NO181) F267(5′-GTC TAT TAT TGT GCT CGT 766 687 TGC 857 557 767CTT GGT GTT TGC 678 688 668 ATG GAC TAC TGG GGT CAA-3′)(SEQ ID NO182) 較軟隨機(jī)化的寡序列符號(hào)5(85％A，5％G，5％C，5％T) 6(85％G，5％A，5％C，5％T) 7(85％C，5％A，5％G，5％T) 8(85％T，5％A，5％G，5％C) 產(chǎn)生相對(duì)于V3-1的親和性改善的噬菌體分選策略 通過降低生物素化mBR3-ECD和hBR3-ECD的濃度在4種文庫(V1008-1、V1008-2、V1008-3和V1008-4)中進(jìn)行4輪的溶液分選。噬菌體加入量第一輪為3O.D/ml，后三輪為1、0.5、0.1。對(duì)于文庫V 1008-1，在第一輪使用100nM的生物素化的靶標(biāo)。隨后在后三輪使用10nM，10nM和2nM的生物素化靶標(biāo)。對(duì)于其它的三個(gè)文庫(V1008-2，V1008-3和V1008-4)，第一輪使用20nM的生物素化的靶標(biāo)。隨后在后三輪中使用1nM，1nM和0.5nM的生物素化靶標(biāo)。分選方法如上所述。為了增加嚴(yán)緊性，在第四輪，將生物素化的靶標(biāo)與噬菌體文庫在37℃孵育3小時(shí)。接下來，加入1000倍過量的未生物素化的靶標(biāo)，并在該生物素化的材料被捕獲在中性鏈親和素板之前將該混合物在室溫孵育30分鐘競爭掉高解離率(off-rate)結(jié)合物。
高通量親和性篩選ELISA(單點(diǎn)競爭) 如上所述實(shí)施該方法。將10nM mBR3-ECD和hBR3-ECD用于單點(diǎn)競爭。
與V3-1噬菌體孔(80％)的OD450nm降低(％)比較，挑選對(duì)mBR3-ECD和hBR3-ECD的OD450nn降低值(％)均低于50％的克隆。挑選、測序并分析12種克隆(圖17)。結(jié)果總結(jié)在圖17中。
克隆41和克隆46為最佳的兩種V3-1親和性改善變體。因克隆41具有更多的天冬酰胺殘基(N)，選擇克隆46用于進(jìn)一步的表征。在克隆46的CDR-H1區(qū)存在潛在的糖基化位點(diǎn)(N-S-S/T)。為去除該潛在的糖基化位點(diǎn)，在位點(diǎn)31制備3種單一CDR-H1突變體(N31A、N31S和N31Q)來檢測mBR3-ECD與hBR3-ECD結(jié)合活性。實(shí)施競爭ELISA來測定它們對(duì)mBR3-ECD和hBR3-ECD的親和性。結(jié)果顯示如下。在這三種突變體中，N31S的親和性最接近于V3-46親代克隆(表5)。
表5. 該V3-46的N31S突變體被重命名為V3-46s。根據(jù)以上所述方法來制備V3-46s的Fab。利用在BIAcoreTM-2000上的Biacore檢測通過表面等離子體共振分析來測定V3-46s Fab的親和性。結(jié)果總結(jié)在以下表中(表6和表7)。與V3-1Fab比較，V3-46s Fab對(duì)mBR3-ECD的結(jié)合率(on-rate)得到改進(jìn)。相對(duì)于V3-1，V3-46s Fab對(duì)hBR3-ECD的結(jié)合率和解離率得到顯著改善。
mBR3-ECD 表6. hBR3-ECD 表7. 在V3-46s骨架上構(gòu)建同源鳥槍文庫以進(jìn)一步改善親和性。
對(duì)于進(jìn)一步的親和性改善，利用V3-46s噬菌粒作為模板來制備同源鳥槍文庫。在所有3種輕鏈CDR中通過引入TAA密碼子來構(gòu)建終止模板。設(shè)計(jì)突變的寡核苷酸來使用二名(binominal)密碼子，其在需要的位點(diǎn)僅編碼野生型和類似的氨基酸(JMB 2002320[415-418])。通過Kunkel突變方法，修復(fù)終止密碼子并將突變引入所需要的位點(diǎn)(Kunkel et al1987)。
通過將如下所述的所有6種同源鳥槍寡序列混合來制備文庫1109-3。對(duì)于CDR-H1、H2和H3，除原同源鳥槍寡序列外，我們還囊括了突變每一其它位置的寡序列(a和b)來保證對(duì)BR3的最初結(jié)合活性沒有被破壞。
V1 109-3 L1∶L2∶L3∶H1∶H2∶H3＝1∶1∶1∶0.5∶1∶1.5 L1(F349)/L2(F350)/L3(F351)/H1(F352+F352a+F352b＝1∶1∶1)/H2(F355+F35 5a+F355b＝1∶1∶1)/H3(F356+F356a+F356b＝1∶1∶1) 寡序列 <CDR-L1> F349(5′-ACC TGC CGT GCC AGT SAA GAM RTT KCC ASC KCT GTA GCC TGG TAT CAA CAG AAA C-3′)(SEQ ID NO181) <CDR-L2> F350(5′-CCG AAG CTT CTG ATT TWC KCC GCA TCC TWC CTC TWC TCT GGA GTC CCT TCT CGC-3′)(SEQ ID NO182) <CDR-L3> F351(5′-GCA ACT TAT TAC TGT CAG CAS KCC SAA RTT KCC CCGS SCA ACG TTC GGA CAG GGT ACC-3′)(SEQ ID NO183) CAS密碼子編碼Gln和His。
<CDR-H1> F352(5′-GCA GCT TCT GGC TTC ACC ATT KCC KCC KCC KCC ATA CAC TGG GTG CGT CAG-3′)(SEQ ID NO1 84) F352a (5′-GCA GCT TCT GGC TTC ACC ATT AGT KCC AGC KCC ATA CAC TGG GTG CGT CAG-3′)(SEQ E)NO185) F352b(5′-GCA GCT TCT GGC TTC ACC ATT KCC AGC KCC TCT ATA CAC TGG GTG CGT CAG-3′)(SEQ ID NO186) <CDR-H2> F355(5′-AAG GGC CTG GAATGG GTT GCA TKG RTT MTC SCA KCC RTT GST TWC ASC GAM TAT GCC GAT AGC GTC AAG GGC- 3′)(SEQ ID NO187) F355a (5′-AAG GGC CTG GAA TGG GTT GCT TGG RTT CTT SCA TCT RTT GGT TWC ACT GAM TAT GCC GAT AGC GTC AAG GGC- 3′)(SEQ ID NO188) F355b (5′-AAG GGC CTG GAA TGG GTT GCT TKG GTT MTC CCT KCC GTG GST TTT ASC GAC TAT GCC GAT AGC GTC AAG GGC-3′) (SEQ ID NO189) <CDR-H3> F356 (5′-ACT GCC GTC TAT TAT TGT GCA ARA ARA RTT TGC TWC RAC ARA MTC GST RTT TGC KCT GST GST ATG GAC TAC TGG GGT CAA-3′)(SEQDDNO190) F356a(5′-ACT GCC GTCTAT TAT TGT GCT CGT ARA GTC TGC TWC AAC ARACTTGSTGTT TGC KCT GGTGST ATG GAC TAC TGG GGT CAA-3′)(SEQIDNO191) F356b(5′-ACT GCC GTC TAT TAT TGT GCT ARA CGG RTT TGC TAC RACCGC MTCGGT RTTTGC GCTGST GGT ATG GAC TAC TGG GGT CAA-3′)(SEQ ID NO192) 參見Vajdos，et al.，(2002)J.MoI.Biol.320415-418的表1，用于說明編碼wt殘基和其同源殘基的密碼子用法。
用于V3-46s親和性篩選的噬菌體分選 通過降低生物素化mBR3-ECD和hBR3-ECD的濃度在V1109-3中進(jìn)行3輪溶液分選。噬菌體加入量第一輪為2O.D/ml，在后兩輪為0.5、0.1O.D/ml。在第一輪使用1nM的生物素化的靶標(biāo)。隨后在后兩輪使用0.2和0.1nM的生物素化靶標(biāo)。分選方法如上所述。為了增加嚴(yán)緊性，在第三輪，將生物素化的靶標(biāo)與噬菌體文庫在37℃孵育3小時(shí)。接下來，加入1000倍過量的未生物素化的靶標(biāo)，并在該生物素化的材料被捕獲在中性鏈親和素板之前將該混合物在室溫孵育30分鐘競爭掉高解離率結(jié)合物。
高通量親和性篩選ELISA(單點(diǎn)競爭) 如上所述，利用1nM mBR3-ECD和hBR3-ECD進(jìn)行單點(diǎn)競爭。將檢測孔的OD450nm降低值(％)與V3-46s噬菌體(95％)的比較。挑選在mBR3-ECD和hBR3-ECD存在下OD450nn降低值(％)均低于50％的克隆。挑選、測序并分析14個(gè)克隆。
圖18顯示，與WT V3-46s比較，噬菌體親和性IC50選則V3-46s克隆用于mBR3-ECD或hBR3-ECD。所有14種克隆，對(duì)于mBR3-ECD和hBR3-ECD，均是好于V3-46s(WT)的結(jié)合物。除V3-46s-12之外，大多數(shù)克隆具有與WT V3-46s相同的CDR-HC序列，而該V3-46s-12在其CDR-H1不同于WT。參見圖18和SEQ ID NO193。如圖18所示，所有這些克隆在CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3均具有改變。與親代V3-46s克隆比較，大多數(shù)親和性改善變體為2至5倍的親和性改善。V3-46s-42對(duì)mBR3-ECD和hBR3-ECD的結(jié)合改善為6至8倍，增加至pM范圍。
為了證實(shí)親和性改善克隆的蛋白親和性，通過以上所述方法來制備V3-46s-9和V3-46s-42Fab。利用在BIAcoreTM-3000上的表面等離子共振分析來確定這些Fabs的親和性。結(jié)果總結(jié)在以下表中。與V3-46s Fab比較，V3-46s-42Fab對(duì)mBR3-ECD和hBR3-ECD的結(jié)合率得到改善。其Kds與噬菌體IC50值具有良好的一致性。參見如下。
實(shí)施例5-BJAB細(xì)胞結(jié)合分析 將BJAB細(xì)胞，人伯基特淋巴瘤細(xì)胞株，在RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有10％FBS、青霉素(100U/ml，Gibco-Invitrogen，Carlsbad，CA)、鏈霉素(100μg/ml，Gibco)和L-谷氨酰胺(10mM)。通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行的受體表達(dá)分析表明，BJAB細(xì)胞表達(dá)高水平的BR3和不可測水平的BCMA和TACI。為進(jìn)行結(jié)合分析，用冷的分析緩沖液(含1％胎牛血清(FBS)的磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH7.4)洗滌細(xì)胞。將細(xì)胞密度調(diào)至1.25×106/ml，并將200μl細(xì)胞懸浮液等分置入96孔圓底聚丙烯培養(yǎng)板(NUNC，Neptune，NJ；250,000細(xì)胞/孔)的孔中。將含有細(xì)胞的培養(yǎng)板在4℃和1200rpm條件下離心5分鐘，小心地將上清液從細(xì)胞沉淀上吸除。V3-1m(或mV3-1)和V3-1h分別指與小鼠IgG2a或人IgG1的恒定區(qū)融合的V3-1抗體的可變區(qū)。術(shù)語嵌合11G9、嵌合2.1或嵌合9.1分別指11G9、2.1或9.1的可變區(qū)與人IgG1的恒定區(qū)的融合。對(duì)這些實(shí)驗(yàn)，使用全長抗體(IgG)。
按照如下進(jìn)行直接結(jié)合分析和競爭結(jié)合分析。對(duì)直接結(jié)合分析，將IgG抗體樣本在冷的分析緩沖液中系列稀釋至濃度為300-0.02nM。將樣本(100μl)加入所述細(xì)胞沉淀中，將培養(yǎng)板在冰上孵育45分鐘。然后向每孔中再加入100μl分析緩沖液，并將培養(yǎng)板在4℃和1200rpm條件下離心5分鐘。小心地吸除上清液后，再用200μl分析緩沖液清洗細(xì)胞兩次。適當(dāng)?shù)?，加入在冷的分析緩沖液中以1/10,000稀釋的抗-小鼠IgG Fc-HRP或山羊抗-人IgG Fc-HRP(100μl/孔，JacksonImmunoResearch，West Grove，PA)，并將培養(yǎng)板在冰上孵育45分鐘。用200μl冷的分析緩沖液清洗兩次后，加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB，Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)，并讓其顯色10分鐘。加入100微升1M H3PO4來終止反應(yīng)。然后在微量培養(yǎng)板閱讀器上在450nm并使用620mn參照來對(duì)所述培養(yǎng)板進(jìn)行讀數(shù)。在該直接結(jié)合分析中，將標(biāo)明濃度的mAbs加入BJAB細(xì)胞中，并檢測結(jié)合的mAb。
在競爭結(jié)合分析中，抗-BR3 mAbs與生物素化的BAFF競爭性地結(jié)合細(xì)胞表面的BR3。如前所述(Podriguez，C.F.，et al.，(1998)J.Immunol.Methods 21945-55)，用NHS-X-生物素(Research Organics，Cleveland，OH)對(duì)在Genentech表達(dá)且純化的人BAFF進(jìn)行生物素化。將抗-BR3抗體系列稀釋并與等體積的生物素-BAFF合并，以得到最終濃度333-0.15nM mAb和10ng/ml生物素-BAFF。將稀釋的樣本加入上述的96孔培養(yǎng)板中的沉淀的BJAB細(xì)胞中。在冰上孵育45分鐘后，用200μl冷的分析緩沖液清洗細(xì)胞兩次，并加入在分析緩沖液中以1/5,000稀釋的鏈親和素-HRP(AMDEX，Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)(100μl/孔)。將培養(yǎng)板在冰上孵育最后45分鐘。用冷的分析緩沖液清洗兩次后，用TMB使其產(chǎn)色，用H3PO4終止反應(yīng)，并如上所述對(duì)培養(yǎng)板進(jìn)行讀數(shù)。
圖19顯示了抗體結(jié)合BJAB細(xì)胞上的BR3。圖20顯示雖然V3-1m能競爭性地替代BAFF對(duì)表達(dá)在BJAB細(xì)胞上的人BR3的結(jié)合(插圖A)，以及直接結(jié)合BJABs(插圖B)，B9C11顯示出在任一分析方式中都沒有能力結(jié)合人BR3(分別為插圖A和B)。相比之下，V3-1m和B9C11均能完全阻斷BAFF對(duì)表達(dá)在BHK細(xì)胞上的鼠類BR3的結(jié)合(插圖C)，并且能直接結(jié)合到所述細(xì)胞(插圖D)。對(duì)用V3-1m(小鼠IgG)和B9C11(倉鼠IgG)進(jìn)行的直接結(jié)合分析，需要不同的檢測抗體。
基于BJAB結(jié)合分析的結(jié)果，所述抗體可以分為阻斷型或非阻斷型。在該競爭性分析中，四種mAbs(11G9，2.1，9.1和V3-1)完全地阻斷了生物素-BAFF的結(jié)合，而三種其它(IE9，7B2和8G4)導(dǎo)致部分抑制(圖19和20，表8)。發(fā)現(xiàn)MAbs 1A11，8E4，10E2，12B 12和3.1為非阻斷型(圖19)。在這些非阻斷型抗體中，1A11和8E4在直接結(jié)合分析中對(duì)BJAB的結(jié)合相對(duì)較差，而與其它mAbs相比10E12和12B12的結(jié)合給出了更高的最大信號(hào)。小鼠IgG1、IgG2a和IgG2b同種型對(duì)照未顯示出可檢測的對(duì)BJAB的結(jié)合，HRP-結(jié)合的抗-小鼠IgG Fc檢測抗體顯示出對(duì)這些同種型同等地結(jié)合。在BJAB和BHK結(jié)合分析中均對(duì)MAbs V3-1m和B9C11進(jìn)行評(píng)價(jià)(圖20)。雖然這些阻斷型抗體均與鼠類BR3結(jié)合，僅V3-1m結(jié)合人BR3。V3-1h的結(jié)果與V3-1m觀測的結(jié)果類似。
實(shí)施例6-抗原表位定位ELISA 通過酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)進(jìn)行抗原表位定位研究，其中未標(biāo)記的mAbs的稀釋曲線與生物素化的2.1，9.1，11G9或1E9競爭性地結(jié)合vhBR3-Fc(圖2)。完全阻斷mAbs的結(jié)果(11G9，2.1和9.1)表明抗原表位對(duì)11G9結(jié)合在空間上位于對(duì)mAbs2.1及9.1的抗原表位之間，表明2.1和9.1均有效地替代了生物素化的11G9的結(jié)合，但是對(duì)彼此間的替代僅顯示出最低的能力。在競爭性BJAB結(jié)合分析中，三種mAbs(1E9，7B2和8G4)表現(xiàn)為部分阻斷劑。在該抗原表位定位的ELISA中，如果它們僅部分抑制11G9，2.1和9.1的結(jié)合，這些mAbs顯示出結(jié)合至中心BAFF阻斷位點(diǎn)的周圍。最終，如果它僅可被部分阻斷劑1E9替代，非阻斷mAb，12B12顯示出結(jié)合至距離阻斷抗體區(qū)域更遠(yuǎn)的位置。
同時(shí)也進(jìn)行定位研究來評(píng)價(jià)V3-1m、B9C11和P1B8對(duì)小鼠BR3的結(jié)合。結(jié)果證明，兩種阻斷mAb(V3-1m和B9C11)能交叉競爭地結(jié)合小鼠BR3，而非阻斷mAb P1B8顯示出結(jié)合獨(dú)立的抗原表位(圖22)。
下表是競爭性BJAB細(xì)胞結(jié)合分析結(jié)果的總結(jié)(表8)。搜集了幾個(gè)月內(nèi)進(jìn)行的分析的結(jié)果。根據(jù)標(biāo)明的實(shí)驗(yàn)數(shù)“n”計(jì)算平均IC50。
表8 n/a＝未檢測到抑制或不能計(jì)算IC50 +/-＝抗體部分抑制的生物素化的BAFF結(jié)合 下表是直接BJAB細(xì)胞結(jié)合分析結(jié)果的總結(jié)(表9)。搜集了幾個(gè)月內(nèi)進(jìn)行的分析的結(jié)果。雖然多數(shù)抗體顯示出顯著的劑量依賴的信號(hào)，三種mAb顯示出僅產(chǎn)生部分結(jié)合，而與其它相比兩種mAb重復(fù)地顯現(xiàn)出更高的最大信號(hào)。根據(jù)標(biāo)明的實(shí)驗(yàn)數(shù)“n”計(jì)算平均EC50。
表9 n/a未檢測到結(jié)合或不能計(jì)算EC50 +/-＝部分結(jié)合 人源化的抗-BR3抗體(IgG)也阻斷BAFF對(duì)BJAB細(xì)胞上的BR3的結(jié)合，并結(jié)合BJAB細(xì)胞上的BR3。參見如下表10。
表10 *“h”表示人源化的；“ch”表示嵌合體。
實(shí)施例7-抗BR3抗體對(duì)B細(xì)胞增殖的拮抗作用和激動(dòng)作用 (a)2.1、9.1和11G9抑制人B細(xì)胞增殖 利用CD19 MACS珠(Miltenyi Biotec)通過陽性選擇從外周血單個(gè)核細(xì)胞中分離B細(xì)胞。對(duì)增殖分析，B細(xì)胞在平底96孔板中配置為2×105細(xì)胞/孔細(xì)胞，配置三份。將細(xì)胞與抗-IgM(10mg/ml)(JacksonImmunoresearch)，mBAFF(5μg/ml)及表明的抗BR3抗體培養(yǎng)5天，或與蛋白培養(yǎng)5天。所用抗體為嵌合在hIgG1背景中并從組織培養(yǎng)物中純化的嵌合抗體。然后在培養(yǎng)的最后6小時(shí)，將細(xì)胞用1mCi/孔的氚標(biāo)記的脫氧胸腺嘧啶苷進(jìn)行沖擊，收集到過濾器上并計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖23所示。
(b)V3-1抑制鼠B細(xì)胞增殖 用來自Miltenyi的B細(xì)胞分離試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)，從2-4個(gè)月齡的C57BL/6小鼠或抗-HEL BCR轉(zhuǎn)基因小鼠制備脾臟B細(xì)胞。我們始終獲得純度超過95％的B細(xì)胞。將B細(xì)胞在含有10％熱滅活的FCS，青霉素/鏈霉素，2mM L-谷氨酰胺和5×10-2μMβ-巰基乙醇的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
在存在或不存在各種濃度的抗-BR3 mAb的條件下，將純化的B細(xì)胞(105 B細(xì)胞最終體積200μl)用抗-小鼠IgM Ab 5μg/ml(IgG，F(xiàn)(ab’)2片段)(Jackson ImmunoResearch Laboratories)或卵溶菌酶(Hen EggLysozyme(Sigma))，以及用或不用BAFF(2ng/ml或10ng/ml)，進(jìn)行培養(yǎng)。通過48小時(shí)刺激過程中最后8小時(shí)的3H-脫氧胸腺嘧啶苷(1μCi/孔)攝取來檢測增殖。在某些實(shí)驗(yàn)中，將抗-BR3 mAb及BR3-Fc融合蛋白用PCR儀預(yù)沸騰5分鐘以使其失活(對(duì)照)。
圖24顯示，象BR3-Fc一樣，在抗-IgM介導(dǎo)的原代鼠類B細(xì)胞增殖過程中，B9C11和V3-1m均能抑制BAFF共同刺激活性。在存在或不存在各種劑量的抗-IgM抗體的條件下，B9C11和V3-1m均不顯示任何對(duì)B細(xì)胞增殖的直接作用(數(shù)據(jù)未示出)。還觀察到V3-1m和B9C11(非煮沸過的V3-1m或B9C11)對(duì)來自抗-HEL BCR轉(zhuǎn)基因小鼠的B細(xì)胞的增殖的抑制(數(shù)據(jù)未示出)。兩種抗體均非激動(dòng)性的，因?yàn)樗鼈儽旧頉]有觸發(fā)正常鼠類B細(xì)胞增殖。
(b)其它抗體 利用CD19 MACS磁珠，根據(jù)制造商的方案(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)，通過陽性選擇從外周血單個(gè)核細(xì)胞中分離人B細(xì)胞。細(xì)胞或者分離后直接使用，或者在液氮中冷凍留待后續(xù)使用；在該分析中新鮮細(xì)胞和冷凍細(xì)胞效果相當(dāng)。將B細(xì)胞以1×105細(xì)胞/孔在帶有清潔的平底孔的黑色96-孔板(PE Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)中進(jìn)行培養(yǎng)。
為評(píng)價(jià)抗-BR3抗體的拮抗作用，將細(xì)胞用可溶重組BAFF(10ng/ml)和F(ab’)2山羊抗-人IgM(Fc特異性)抗體(4μg/ml)(JacksonImmunoResearch，West Grove，PA)，在存在或不存在濃度在100nM至1.3pM(15μg/ml-1ng/ml)范圍的各種濃度的抗-BR3抗體的條件下，進(jìn)行孵育。在第6天通過向每一分析孔中加入Celltriter Glo(Promega，Madison，WI，根據(jù)制造商的指導(dǎo)重組)來評(píng)估B細(xì)胞增殖。在室溫孵育10分鐘后，在光度計(jì)中對(duì)培養(yǎng)板進(jìn)行讀數(shù)。
通過在僅有抗-IgM抗體(4μg/ml)存在或者在抗-IgM加“交聯(lián)”的F(ab’)2山羊抗-人IgG Fc抗體(Pierce，Rockford，IL，30μg/ml)存在，且不存在BAFF的條件下通過孵育抗-BR3抗體(100nM至1.3pM)來評(píng)估抗-BR3抗體激動(dòng)性刺激B細(xì)胞增殖的潛力。如上所述，在第6天用Celltiter Glo來對(duì)增殖進(jìn)行評(píng)估。
圖25顯示9.1-RF阻斷BAFF-依賴的B細(xì)胞增殖，但不會(huì)激動(dòng)。
圖26顯示在抗-IgM存在下2.1-46刺激B細(xì)胞增殖，表明其作為激動(dòng)劑發(fā)揮作用。
實(shí)施例8-使用BIACORE進(jìn)行親和性檢測 材料和方法 通過用Pharmacia BIAcore_3000(BIAcore AB，Uppsala，Sweden)在室溫進(jìn)行表面等離子體共振來檢測實(shí)時(shí)生物特異性相互作用(Karlsson，R.，et al.(1994)Methods697-108；Morton，T.A.和Myszka，D.G.(1998)Methods in Enzymology 295268-294)。通過伯胺基團(tuán)將人BR3 ECD或vBR3-Fc固化至傳感器芯片(CM5)。通過以5μl/分鐘的速度注射20μl的0.025M N-羥基琥珀酰亞胺與0.1M N-乙基-N’(二甲基氨基丙基)碳化二亞胺的混合物，來使羧甲基化的傳感器芯片表面基質(zhì)活化。以5μl/分鐘的速度注射5-10μl的溶于10mM醋酸鈉中的5μg/ml的BR3 ECD或vBR3-Fc溶液，pH4.5。偶聯(lián)后，通過注射20μl的1M乙醇胺，pH8.5，來封閉芯片上未被占據(jù)的位點(diǎn)。流動(dòng)緩沖液(runningbuffer)為含0.05％聚山梨酯20的PBS。對(duì)于動(dòng)力學(xué)檢測，以30μl/分鐘的流量向流動(dòng)細(xì)胞中注入抗-BR3抗體在流動(dòng)緩沖液中的兩倍系列稀釋液(6.2-100nM或12.5-200nM)，并使結(jié)合的抗-BR3抗體解離20分鐘。通過注入20-30μl 10mM甘氨酸·HCl(pH1.5)來使結(jié)合表面再生。使用流動(dòng)細(xì)胞一作為參照細(xì)胞，該細(xì)胞經(jīng)活化但不具有固化的BR3 ECD或BR3-Fc。沒有明顯的抗-BR3抗體對(duì)流動(dòng)細(xì)胞一的非特異性結(jié)合。使用1∶1的結(jié)合模型采用全局?jǐn)M合法(global fitting)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。同時(shí)擬合結(jié)合和解離速度常數(shù)(BIAevaluation software)。對(duì)選定的測試抗體，無論樣本是以濃度遞增還是濃度遞減的順序操作，都得到類似的結(jié)果。
通過BIAcore檢測抗-BR3抗體對(duì)BR3 ECD或BR3-Fc的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。將BR3 ECD或vBR3-Fc固化到傳感器芯片上，并將抗體的系列稀釋液注入到流動(dòng)細(xì)胞上(表11和12)。或者，將抗-BR3抗體固化到傳感器芯片上，并將BR3 ECD的系列稀釋液注入到流動(dòng)細(xì)胞上(表13)。采用高流率來使物質(zhì)輸送作用最小。將人源化的Fab和人源化的IgG抗體的結(jié)果并列比較。使用溶液中的IgG獲得的表觀結(jié)合親和性高于使用溶液中的Fab獲得的結(jié)果，這可能歸因于親合力作用(avidityeffects)因?yàn)镮gG是二價(jià)的。來自9.1、2.1、11G9以及V3-1抗體系列的抗-BR3抗體的表觀動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表11-13所示。
A.BR3 ECD在芯片上 表11 BR3-Fc在芯片上 表12 B.抗體在芯片上(ECD在溶液中) 表13 實(shí)施例9-功能性抗原表位定位 使用以下實(shí)驗(yàn)來功能性地定位BR3上的對(duì)抗-BR3抗體結(jié)合至關(guān)重要的抗原表位。
用于小BR3鳥槍篩選(miniBR3 Shotgun Scanning)的文庫構(gòu)建。通過前述噬菌粒pW1205a的連續(xù)突變構(gòu)建了顯示M13噬菌體上的抗原表位標(biāo)簽的小BR3的文庫(Weiss，G.A.，et al.，(2000)Proc Natl Acad SciUSA 978950-4；Gordon，N.et al.，(2003)Biochemistry 425977-83)。該噬菌粒編碼融合至人生長激素的N-末端，其后為M13基因-8的主要外殼蛋白的肽抗原表位標(biāo)簽(MADPNRFRGKDLGG)。pW1205a用作Kunkel誘變的模板(Kunkel，J.D.，et al.，(1987)Methods Enzymol154367-82)以產(chǎn)生用于小BR3鳥槍文庫構(gòu)建的適當(dāng)模板。在待突變區(qū)，用編碼包含TAA終止密碼子的小BR3的部分序列的DNA片段對(duì)編碼人生長激素的pW1205a片段進(jìn)行寡核苷酸替代。產(chǎn)生兩個(gè)新的模板，模板1(編碼殘基34-42)和模板2(編碼殘基17-25)，如前所述將每一模板用于構(gòu)建小BR3文庫(Sidhu，H.et al.，Metods Enzymol 328333-63)。將每一“部分小BR3”模板用作利用突變的寡核苷酸的Kunkel突變的模板，該突變的寡核苷酸設(shè)計(jì)用來以小BR3的互補(bǔ)區(qū)域替代模板的終止密碼子，同時(shí)在所需位點(diǎn)引入突變。在突變位點(diǎn)，野生型位點(diǎn)被相應(yīng)的鳥槍丙氨酸密碼子(Weiss，如上所引用)替代。這兩個(gè)文庫中每一個(gè)都允許在小BR3的11個(gè)殘基處突變，但在文庫之間沒有相同的突變位置。文庫1編碼位置17，18，20-23，25，27，28，30和33處的鳥槍密碼子，而文庫2編碼位置26，29，31，34和36-42處的鳥槍密碼子。每一文庫都包含2×109個(gè)成員，使得可以充分代表理論多樣性(＞104倍過量)。
文庫的分選和分析。將來自上述兩個(gè)文庫中每一文庫的噬菌體進(jìn)行相對(duì)于固化在96-孔Nunc Maxisorp免疫培養(yǎng)板上的中和抗體9.1，2.1，8G4，11G9(功能篩選(functional selection))和V3-1或抗-標(biāo)簽抗體(3C82F4，Genentech，Inc.)(展示篩選(display selection))的幾輪次的結(jié)合篩選。將展示篩選包括在內(nèi)，以標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)于文庫成員之間的表達(dá)差異的抗-BR3抗體結(jié)合篩選。將從每一靶標(biāo)上洗脫的噬菌體在E.coliXL1-藍(lán)中繁殖；將擴(kuò)增的噬菌體用于相對(duì)前一輪中的相同靶標(biāo)的篩選。兩輪篩選后，將來自每一文庫和篩選的48個(gè)獨(dú)立克隆生長在96孔板形式中含有羧芐青霉素和KO7輔助噬菌體的400L 2YT培養(yǎng)基中。將這些培養(yǎng)物的上清直接用于噬菌體ELISA，以測定能結(jié)合抗體靶標(biāo)的噬菌體-展示的小BR3變體，對(duì)它們進(jìn)行相對(duì)選擇以確認(rèn)結(jié)合。
通常根據(jù)如下進(jìn)行噬菌體ELISA。在室溫下，將Maxisorp免疫培養(yǎng)板(96孔)用捕獲靶蛋白(抗-BR3抗體)包被兩小時(shí)(100μl，在50mM碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中為5μg/ml)。然后將培養(yǎng)板用磷酸鹽緩沖液(PBS)中的0.2％BSA封閉1小時(shí)，用PBS，0.05％Tween 20清洗8次。將噬菌粒系列稀釋入BSA封閉緩沖液中，并將100μl轉(zhuǎn)移至包被后的小孔中。1小時(shí)后，用PBS，0.05％Tween 20清洗培養(yǎng)板8次，與100μl位于BSA封閉緩沖液中的1∶3000辣根過氧化物酶/抗-M13抗體偶聯(lián)物孵育30分鐘，然后用PBS，0.05％Tween 20清洗8次及PBS清洗兩次。培養(yǎng)板用二鹽酸鄰苯二胺/H2O2溶液(100μl)顯色，用2.5M H2SO4(50μl)終止，并在492nm檢測吸光度。
發(fā)現(xiàn)所有測試的克隆在其各自的ELISA中均顯陽性，然后如前所述進(jìn)行測序(Weiss，如上引用)。翻譯并比對(duì)具有可接受質(zhì)量的序列。
預(yù)先檢測BAFF結(jié)合及展示篩選的數(shù)據(jù)(Gordon，如上引用)。類似地計(jì)算抗-BR3結(jié)合和展示篩選的數(shù)據(jù)。通常，在兩輪對(duì)抗-BR3抗體或抗-標(biāo)簽抗體結(jié)合的選擇后，將在已測序克隆中發(fā)現(xiàn)的野生型殘基(wt)和每一丙氨酸突變(mut)的數(shù)量制表。將野生型殘基的數(shù)量除以突變體的數(shù)量以確定每一位置的每一突變的wt/mut比例(未示出)。
如前所述計(jì)算F-值(Weiss，如上引用；Gordon，如上引用)。通常，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化的頻率比(F)以定量化每一BR3突變對(duì)BAFF或抗BR3-抗體結(jié)合的作用，同時(shí)計(jì)算展示效率即F＝[wt/突變體(BAFF或抗-BR3抗體篩選)]除以[wt/突變體(展示篩選)]。有害的突變具有＞1的比值，而有益的突變具有＜1的比值；粗體表示＞10倍的作用。顯示出高于10倍作用(即F＞10或F＜0.1)的突變視為特別顯著。
表14.F值 數(shù)據(jù)顯示11G9、9.1和2.1利用人和小鼠BR3之間的序列變體區(qū)域(表14)。V3-1的功能性抗原表位模擬在人與小鼠BR3之間高度保守的BAFF的功能性抗原表位。該數(shù)據(jù)的示意圖如圖27所示。圖27中畫圈的殘基表示小-BR3序列外的潛在的O-連接的糖基化作用。11G9，2.1，9.1和V3-1抗體不需要BR3糖基化來結(jié)合。9.1抗體的功能性抗原表位包括L38和R39。2.1的功能性抗原表位包括G36。V3-1的功能性抗原表位包括L28和L29。11G9的功能性抗原表位包括P21和A22。在該分析中，A34、F25和V33殘基的丙氨酸篩選突變也破壞9.1、2.1、11G9和V3-1對(duì)BR3的結(jié)合，這些殘基對(duì)保持BR3在噬菌體中的結(jié)構(gòu)完整性可能是至關(guān)重要的。
實(shí)施例10-CLL表達(dá) 將來自慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)患者的外周血細(xì)胞用抗B細(xì)胞標(biāo)志物(CD19、CD27、CD20、CD5和BR3)抗體染色(圖28)。用V3-1染色BR3。雖然該特定患者在其B細(xì)胞上沒有CD20表達(dá)(CD19+左底部)，但BR3以顯著的水平表達(dá)(參看直方圖的峰-盤B)。對(duì)來自12位其它CLL患者的12個(gè)樣本進(jìn)行了評(píng)價(jià)。12個(gè)樣品中有12個(gè)表達(dá)BR3。這些數(shù)據(jù)顯示抗-BR3抗體將對(duì)這一指征有治療價(jià)值。
實(shí)施例11-抗體依賴的細(xì)胞毒性 基本如所述(Shields et al，J.Biol.Chem.2766591-6604(2001))使用乳酸脫氫酶(LDH)讀出裝置，分析抗-BR3嵌合單克隆抗體介導(dǎo)BJAB細(xì)胞(表達(dá)CD20的Burkitt’s淋巴瘤B細(xì)胞株)的天然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)溶解的能力(ADCC活性)。使用RosetteSep_人NK細(xì)胞富集雞尾酒劑(StemCeLl Technologies，Vancouver，B.C.)，根據(jù)制造商的方案，從來自正常人供體的100mL肝素化血液制備NK細(xì)胞。將血液用等體積的硫酸鹽緩沖液稀釋，在15mL FicoL1-PaqueTM(AmershamBioscience，Uppsala，Sweden)上分層，并在1450rpm離心20分鐘。將層間界面處的白細(xì)胞分配至4個(gè)干凈的50-mL管中，這些管中充滿含有15％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基。將管在1450rpm離心20分鐘并棄去上清液。將NK細(xì)胞在分析培養(yǎng)基(F12/DMEM 50∶50不含甘氨酸，1mM HEPES緩沖液pH7.2，青霉素/鏈霉素(100單位/mL；Gibco)，谷氨酰胺，和1％熱滅活的胎牛血清)中稀釋至2×106細(xì)胞/mL。
將抗體在分析培養(yǎng)基中的系列稀釋液(0.05mL)加入96孔圓底組織培養(yǎng)板中。將BJAB細(xì)胞在分析緩沖液中稀釋至濃度4×105/mL。將BJAB細(xì)胞(0.05mL每孔)與96孔板中的稀釋的抗體混合，并在室溫孵育30分鐘以使得抗體結(jié)合至BR3(調(diào)理作用)。
通過向每孔中加入0.05mL NK細(xì)胞來啟動(dòng)ADCC反應(yīng)。在對(duì)照孔中，加入2％的Triton X-100。然后將培養(yǎng)板在37℃孵育4小時(shí)。使用細(xì)胞毒性(LDH)檢測試劑盒(Kit#1644793，Roche Diagnostics，Indianapolis，Indiana)，按照制造商的指導(dǎo)，檢測釋放的LDH水平。向每孔中加入0.1mL的LDH顯色劑，隨后混合10秒。然后將培養(yǎng)板用鋁箔覆蓋，并在室溫和黑暗條件下孵育15分鐘。然后讀取490nm處的光密度，并通過除以對(duì)照孔中測量的總LDH來計(jì)算溶解(lysis)％。將溶解作為抗體濃度的函數(shù)來作圖，并使用4-參數(shù)曲線擬合(KaleidaGraph)來去定EC50濃度。
所有人源化的抗-BR3抗體在引導(dǎo)NK細(xì)胞介導(dǎo)的BJAB細(xì)胞(人Brukitt’s淋巴瘤)溶解中具有高度活性，其相對(duì)效力濃度低于1nM(圖29)。用Ramos(人Burkitt’s淋巴瘤)和WIL2s細(xì)胞(人B-細(xì)胞淋巴瘤)替代BJAB細(xì)胞來進(jìn)行類似的分析。圖29A和圖29B分別顯示了借助抗-BR3抗體的Ramos和WIL2s細(xì)胞的ADCC殺傷。使用抗-Her2抗體(4D5)作為陰性對(duì)照。通常，對(duì)BR3具有高親和性的抗體在抗體依賴的細(xì)胞殺傷分析中效力更高。
實(shí)施例12-利用BR3-Fc或抗-BR3抗體的B細(xì)胞去除 將抗-BR3抗體去除B細(xì)胞的能力與BR3-Fc相對(duì)比。六周大的BALB/c小鼠在第0天時(shí)用500μg對(duì)照(小鼠IgG2a)、小鼠BR3-Fc或抗-BR3(V3-1)抗體進(jìn)行腹膜內(nèi)處理。在第1、3、7和15天將每組的小鼠處死。圖30顯示了處理第7天的血液、淋巴結(jié)和脾臟中的B細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析。與BR3-Fc和對(duì)照處理的動(dòng)物相比，在V3-1處理的小鼠中血液、淋巴結(jié)和脾臟顯示出更少的B細(xì)胞(CD21+CD23+和CD21高CD23低)。與對(duì)照Fc處理的動(dòng)物相比，BR3-Fc處理先前顯示為明顯減少B細(xì)胞的數(shù)量。圓圈邊上的粗體數(shù)字表示該特定區(qū)域(圓圈)中所含的淋巴細(xì)胞的百分比。
在類似條件下的另一實(shí)驗(yàn)中，與BR3-Fc和對(duì)照處理的動(dòng)物相比，在V3-1處理的小鼠中血液、淋巴結(jié)和脾臟的FACS分析通常顯示出更少的B細(xì)胞(CD21+CD23+和CD21高CD23低)(圖31)。與對(duì)照動(dòng)物相比，特別是在后期的時(shí)間點(diǎn)，BR3-Fc處理顯著減少B細(xì)胞的數(shù)量。
圖31顯示了第1、3、7和1 5天時(shí)1ml血液中所含的B細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量；淋巴結(jié)中的B細(xì)胞％，以及脾臟中的濾泡(FO-CD21+CD23+)或邊緣區(qū)(MZ-CD21高CD23低)的絕對(duì)數(shù)量。數(shù)據(jù)表示為平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)誤的形式(n＝4)。
在類似條件下的另一實(shí)驗(yàn)中，脾臟中的漿母細(xì)胞(頂行-IgM+Syn+)以及生發(fā)中心細(xì)胞(中間行-B220+CD38低)的FACS分析顯示出抗-BR3抗體(V3-1)可以去除某些漿母細(xì)胞和生發(fā)中心細(xì)胞(圖32)。與對(duì)照動(dòng)物相比，BR3-Fc顯著減少漿母細(xì)胞的數(shù)量。插圖A中記載的數(shù)字代表在該特定區(qū)域中所含的淋巴細(xì)胞的百分比。在圖上的直方圖中數(shù)據(jù)表示為平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)誤的形式(n＝4)。
數(shù)據(jù)顯示，與BR3-Fc處理相比，用抗-BR3處理后觀察到更大程度的B細(xì)胞去除，該融合蛋白BR3-Fc阻斷BAFF對(duì)BR3的結(jié)合但不具有ADCC功能。
實(shí)施例13-最大程度減少B細(xì)胞的Fc-依賴的細(xì)胞殺傷和BAFF阻斷 用單劑量10mg/kg的抗-BR3抗體(mV3-1)，帶有D265A/N297A突變的mV3-1，非-BAFF阻斷抗-BR3抗體PIH11或BR3-Fc來處理BALB/c小鼠。在處理后第6天通過流式細(xì)胞術(shù)來分析來自脾臟或外周血的B細(xì)胞。處理后外周血B細(xì)胞(B220+)和脾臟濾泡B細(xì)胞(CD21+CD23+)的絕對(duì)數(shù)量分別在圖33A和圖33B中顯示。數(shù)據(jù)表示為平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)誤的形式(n＝4)。D265A/N297A Fc突變?nèi)コ薋cγRIII的體外結(jié)合。該結(jié)果表明雖然兩種非阻斷抗體，具有缺失Fcγ受體結(jié)合的抗-BR3抗體和BR3-Fc，均可減少B細(xì)胞群，同時(shí)具有Fc-依賴的細(xì)胞殺傷活性和BAFF-阻斷活性的抗-BR3抗體是強(qiáng)力得多的B細(xì)胞減少/去除劑。這歸因于將兩種活性即抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)和B細(xì)胞存活阻斷合并在一個(gè)分子中。
實(shí)施例14-狼瘡小鼠模型 在狼瘡小鼠模型中測試抗-BR3抗體。為進(jìn)行這些研究，在第0天和第7天用200μg的mIgG2a(抗-gp120)(對(duì)照)或mBR3-Fc或mV3-1(抗-BR3抗體)處理(ip)約8月齡的NZB/W狼瘡-傾向(prone)陽性小鼠。通過流式細(xì)胞術(shù)來分析血液、淋巴結(jié)和脾臟(濾泡-FO和邊緣區(qū)-MZ)中的B細(xì)胞。數(shù)據(jù)表達(dá)為獨(dú)立的小鼠數(shù)據(jù)點(diǎn)(n＝4)。類似BR3Fc，抗-BR3抗體能減少這種小鼠自免疫株中的B細(xì)胞(數(shù)據(jù)未示出)。
在長期研究中，對(duì)顯示大約100mg/dl蛋白尿的7月大的NZBxWF1小鼠(狼瘡腎炎小鼠模型)用300μg mV3-1，mBR3-Fc或?qū)φ誱IgG2a抗體(抗gp120)每周兩次處理約6個(gè)月時(shí)間。每一處理組含25只小鼠。每月評(píng)估所有小鼠在疾病隨時(shí)間的進(jìn)展的改善(圖34A)。隨時(shí)間的進(jìn)展檢測為存活小鼠或具有低于300mg/dl蛋白尿水平的小鼠的百分比。此外，在處理后約6個(gè)月，將存活小鼠處死，并在FACS分析中分析?？?BR3抗體處理小鼠中的外周B細(xì)胞(定義為B220+)的中位數(shù)低于BR3-Fc處理小鼠和對(duì)照小鼠(圖34B)?？?BR3抗體處理小鼠和BR3-Fc處理小鼠中的總脾臟B細(xì)胞(B220+)的中位數(shù)低于對(duì)照小鼠(圖34C)?？?BR3抗體和BR3-Fc處理小鼠中的活化的脾臟B細(xì)胞(B220+CD69+)的中位數(shù)低于對(duì)照小鼠(數(shù)據(jù)未示出)?？?BR3抗體(p＜0.00001)和BR3-Fc(p＜0.02)處理小鼠中的脾臟漿細(xì)胞/漿母細(xì)胞(CD138+)的中位數(shù)也低于對(duì)照小鼠(數(shù)據(jù)未示出)。BR3-Fc(p＜0.02)和抗-BR3抗體(p＜0.00001)處理小鼠中的脾臟生發(fā)中心B細(xì)胞(B220+CD38低)的中位數(shù)明顯低于對(duì)照小鼠(數(shù)據(jù)未示出)。
實(shí)施例15-SCID模型 在重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)模型中測試抗-BR3抗體的B細(xì)胞去除活性。在第0天，將在B細(xì)胞和CD4 T(＞90％)細(xì)胞中磁性富集的4千萬人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，，脾內(nèi)轉(zhuǎn)移至亞致死量照射(350拉德)的6周大的scid米色小鼠中。在第0天，用500μg抗-BR3抗體(具有人IgG2a恒定區(qū)2.1或V3-1)，人IgG2a同種型對(duì)照或小鼠BR3-Fc處理小鼠。在第4天將小鼠處死，并通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其脾臟進(jìn)行人B細(xì)胞分析。通過抗-BR3處理能顯著減少活化的/生發(fā)中心(GC)B細(xì)胞(頂部)和漿母細(xì)胞(底部)，而通過BR3-Fc僅顯著減少活化的/GC細(xì)胞(圖35A-D)。描述了10只獨(dú)立小鼠/組，并對(duì)每組平均。
在其它實(shí)驗(yàn)中，將人PBMC中的CD8 T細(xì)胞，CD16/CD56 NK細(xì)胞和CD14單核細(xì)胞磁性去除，并脾內(nèi)注射入經(jīng)輻射的scid-米色小鼠(40×106/小鼠)。同一天，用300μg/小鼠人抗-人BR3(9.1RF)或同種型對(duì)照(人IgG1)處理小鼠。七天后，將小鼠處死，用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其脾臟中的人B細(xì)胞活化進(jìn)行評(píng)估。在用抗BR3處理的組中活化的及生發(fā)中心B細(xì)胞(CD19高CD38+)顯著減少(圖35E)。
在另一試驗(yàn)中，用標(biāo)準(zhǔn)方法從來自正常人供體(Blood Centers ofthe Pacific，San Francisco，CA)的Leukopack分離人PBMC。將PBMC重懸在40×106/30μl PBS中，并在脾內(nèi)注射過程中始終保持在冰上。使用銫137源以350拉德對(duì)受體小鼠進(jìn)行亞致死量輻射。輻射4小時(shí)后，所有小鼠接受30μl PBS中的40×106人PBMC的脾內(nèi)注射(i.s.)。在麻醉下，對(duì)手術(shù)位點(diǎn)刮毛并用聚維酮碘和70％酒精處理。在緊靠肋緣下方的左脅開1cm的皮膚切口，隨后開腹壁和腹膜切口。小心地暴露脾臟，并注射30μl細(xì)胞懸浮液。分別用5-OVicryl和手術(shù)釘封閉肌肉層和皮膚中的切口。在第0天，在細(xì)胞轉(zhuǎn)移前4小時(shí)，用單次300μg劑量的溶于200μl鹽水的Ab溶液的靜脈內(nèi)注射液對(duì)所有小鼠進(jìn)行處理。輻射后的7天中，向飲水中加入多粘菌素B 110mg/升和新霉素1.1g/升。
實(shí)驗(yàn)組 組1賦形劑(n＝9)。
組2抗-BR3(9.1RF)(n＝9)。
組3抗-BR3(9.1RF N434A)(n＝9)。
在第4天對(duì)所有的小鼠實(shí)施安樂死。通過流式細(xì)胞術(shù)分析對(duì)其脾臟內(nèi)的B淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行定量。在第4天收集血清樣本(100μl)，以確認(rèn)在時(shí)間終點(diǎn)的Ab血清濃度。
在轉(zhuǎn)移入scid/米色小鼠后，人PBMC衍生的B細(xì)胞迅速擴(kuò)展并活化。細(xì)胞轉(zhuǎn)移后第4天之前，脾臟中的主要B細(xì)胞種群顯示出活化的B細(xì)胞CD19高/CD38int表型(抗-CD19和抗-CD38抗體)。安慰劑處理組中的活化B細(xì)胞平均百分率為10.1％，而在9.1RF處理組中的活化B細(xì)胞平均百分率為0.46％。在轉(zhuǎn)移后的第4天，當(dāng)將9.1RF和9.1RFN434A抗體的減少B細(xì)胞前體以及通過BAFF阻斷抑制活化B細(xì)胞擴(kuò)展的活性進(jìn)行對(duì)比，均顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的抑制作用(使用Dunnett’s檢驗(yàn)，與安慰劑對(duì)照組比較，9.1RF和9.1RF N434A的p值均＜0.0001)。
參見如下。
結(jié)果 平均和標(biāo)準(zhǔn)差 抗-BR3Ab(9.1RF和9.1RF N343A)均對(duì)人-scid體內(nèi)模型中的B細(xì)胞存活顯示出明顯的降低和抑制作用。由于該模型體內(nèi)測試ADCC和BAFF存活阻斷，兩種Ab均具有足夠的性能和潛能來治療具有B細(xì)胞成分和B細(xì)胞惡性腫瘤的人自身免疫性疾病。
實(shí)施例16-FcRn結(jié)合 改變9.1RF IgG抗體(SEQ ID NOs74和75)的殘基N434(根據(jù)EU編號(hào)體系)，以增強(qiáng)對(duì)人FcRn受體的結(jié)合。在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生IgG抗體。
使用BIAcore-3000系統(tǒng)(BIAcore Inc.)測定9.1RF及其突變體的結(jié)合親和性。使用pH4的10mM醋酸鈉，根據(jù)制造商的指導(dǎo)，通過氨基偶聯(lián)劑將人和短尾猴FcRn固定到CM5芯片上。在25℃進(jìn)行偶聯(lián)。所得最終密度是700-1000RU。
通過在25℃注射9.1RF或其突變體在pH 6的流動(dòng)緩沖液(PBS pH6，0.05％Tween-20)中的三倍系列稀釋液2分鐘，流率為20μl/分鐘，來進(jìn)行動(dòng)力學(xué)檢測。所用的抗體最大濃度為1μM。檢測解離速率10分鐘。通過注射20μl的10mM Tris pH9，150mM NaCl注射液來再生表面，結(jié)合活性損失最小。結(jié)果如下表15所示的ka、kc和KDa值。
通過在25℃注射9.1RF或其突變體在流動(dòng)緩沖液中的三倍系列稀釋液6分鐘，流率為2μl/分鐘，來進(jìn)行平衡結(jié)合實(shí)驗(yàn)。解離持續(xù)2分鐘。所用的抗體最大濃度為1μM。平衡結(jié)合實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)緩沖液為PBSpH6，0.05％Tween-20或者PBS pH7.4，0.0％Tween-20。通過注射20μl的10mM Tris pH9，150mM NaCl注射液來再生表面。使用BIAevaluation v3.2軟件來評(píng)估Sensorgram。結(jié)果顯示在圖36中，并如下表15所示的KD值(KDb)。
綜上所述，結(jié)果顯示與9.1RF相比，9.1RF的N434A和N434W突變體在pH6.0和pH7.4時(shí)對(duì)人FcRn和短尾猴FeRn具有更大的親和性。并且，與N434A突變體相比，N434W突變體在pH6.0和pH7.4時(shí)對(duì)人FcRn和短尾猴FcRn具有更大的親和性。該數(shù)據(jù)表明，與具有9.1RF的Fc序列的抗體相比，每一突變體都具有提高的對(duì)人和短尾猴FcRn受體的親和性以及更長的體內(nèi)半衰期。
表15 實(shí)施例17-Fcγ受體結(jié)合 如前所述(Shields，R.L.，et al.，(2001)JBC 2766591-6604)制備缺少其跨膜及細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、且在其C末端包含His-標(biāo)簽的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)序列的人FcγR(以下也稱為hFcgR)。
在4℃，將MaxiSorp 96孔微孔板(Nunc，Roskilde，Denmark)用2μg/ml抗-GST(克隆8E2.1.1，Genentech)包被，100μl/孔在50mM碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中。用含0.05％聚山梨酯的PBS，pH7.4(清洗緩沖液)清洗培養(yǎng)板，并用150μl/孔的含0.5％BSA的PBS(pH7.4)封閉。在室溫孵育1小時(shí)后，用清洗緩沖液清洗培養(yǎng)板。將人Fcγ受體以在含0.5％BSA，0.05％聚山梨酯20的pH7.4的PBS(分析緩沖液)的形式以0.25μg/ml，100μl/孔加入培養(yǎng)板中。孵育1小時(shí)后，用清洗緩沖液清洗培養(yǎng)板。對(duì)低親和性的Fcγ受體IIa，IIb，III(F158)和高親和性III(V158)，將抗體與山羊F(ab’)2抗-κ(Cappel，ICN pharmaceuticals，Inc.，Aurora，Ohio)或抗-γ(BioSource，CamariLlo，CA)抗體以1∶2(w/w)的比例孵育1小時(shí)，以形成抗體復(fù)合物。將11個(gè)在分析緩沖液中的復(fù)合的IgG抗體(1.17-5000ng/ml在三倍系列稀釋液中)的兩倍系列稀釋液加入培養(yǎng)板中。對(duì)高親和性FcγRI，將11個(gè)在分析緩沖液中的未復(fù)合的IgG抗體(0.017-1000ng/ml在三倍系列稀釋液中)的兩倍系列稀釋液加入培養(yǎng)板中。孵育兩小時(shí)后，用清洗緩沖液清洗培養(yǎng)板。通過以100μl/孔加入分析緩沖液中的過氧化物酶標(biāo)記的山羊F(ab’)2抗-人IgG F(ab’)2(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)來檢測結(jié)合的IgG。孵育1小時(shí)后，用清洗緩沖液清洗培養(yǎng)板，并以100μl/孔加入底物3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(Kirkegaard & Perry Laboratories)。通過以100μl/孔加入1M磷酸來終止反應(yīng)。在multiskan Ascent分析儀(ThermoLabsystems，Helsinki，F(xiàn)inland)上讀取450nm處的吸光度。
計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)的吸光度(mid-OD vs.ng/ml)。用四參數(shù)非線性回歸曲線擬合程序(KaleidaGraph，Synergy software，Reading，PA)從滴定曲線確定該mid-OD的對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)濃度和樣本濃度。通過用標(biāo)準(zhǔn)mid-OD濃度除以樣本的mid-OD濃度來計(jì)算相對(duì)活性。先前顯示為結(jié)合Fcγ受體的Herceptin_Ab在此用作陽性對(duì)照。
對(duì)所有的FcγR，所報(bào)導(dǎo)的結(jié)合值為每一9.1-RF變體相對(duì)于9.1RF的結(jié)合，假定(A450nm(變體)/A450nm(9/1RF))對(duì)FcγRII和FcγRIIIA為0.33或1μg/ml，對(duì)FcγRI為2μg/ml。大于1的值表明相對(duì)于9.1RF，變體的結(jié)合得到提高，而低于1的比例表明相比9.1RF結(jié)合降低。hFcγRIII(F158)和hFcγRIII(V158)分別指對(duì)人IgG具有更低親和性和更高親和性的hFcγRIII同種型。
表16和圖37顯示，測試的9.1抗-BR3抗體類似地結(jié)合FcγR并應(yīng)當(dāng)促進(jìn)ADCC。
表16 實(shí)施例18-用抗-CD20和抗-BR3抗體去除B細(xì)胞 用200μg mIgG2a(對(duì)照)、或m2H7(鼠抗-人CD20抗體)或mV3-1對(duì)6周齡的人CD20轉(zhuǎn)基因陽性小鼠進(jìn)行處理?？贵w處理后，1小時(shí)、1天、8天及15天時(shí)分析血液中的B細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù)分析來自血液、淋巴結(jié)的B細(xì)胞。數(shù)據(jù)表示為平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)誤(n＝4)。
雖然在早期時(shí)間點(diǎn)(1小時(shí))和1天時(shí)，與抗BR3抗體相比抗-CD20抗體去除更多的細(xì)胞，在第8天和第15天時(shí)，抗BR3抗體產(chǎn)生的去除超過抗-CD20抗體產(chǎn)生的去除。圖38顯示了血液及淋巴結(jié)中的處理后B細(xì)胞水平分析。
實(shí)施例19-濾泡及邊緣區(qū)B細(xì)胞的去除 用200μg mIgG2a(對(duì)照)、或m2H7(小鼠抗-人CD20)或mV3-1對(duì)6周齡的人CD20轉(zhuǎn)基因陽性小鼠進(jìn)行處理。mAb處理后，1天、8天及15天時(shí)分析血液中的B細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù)分析來自脾臟的B細(xì)胞。將上述三種處理的脾臟內(nèi)濾泡(FO-CD21+CD23+)或邊緣區(qū)(MZ-CD21高CD23低)的絕對(duì)數(shù)字進(jìn)行對(duì)比。數(shù)據(jù)表示為平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)誤(n＝4)。
雖然在1天時(shí)，與抗BR3抗體相比抗-CD20抗體去除更多的細(xì)胞，在第8天和第15天時(shí)，抗BR3抗體在濾泡及邊緣區(qū)B細(xì)胞中產(chǎn)生的去除均超過抗-CD20抗體產(chǎn)生的去除(圖39)。
實(shí)施例20-在短尾猴中的半衰期 將對(duì)FcRn具有不同結(jié)合親和性的三種人源化單克隆抗-BR3抗體(9.1RF，9.1RF N434A和9.1RF N434W)在短尾猴中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)進(jìn)行對(duì)比。將4-5年齡體重2-4kg的17只公短尾猴和17只母短尾猴按重量隨機(jī)分入三個(gè)組中。組1、2和3的動(dòng)物分別接受單iv劑量的20mg/kg野生型、N434A突變體、或N434W突變體。該研究的設(shè)計(jì)如下。
Conc.＝濃度 a基于最新的體重計(jì)算總劑量體積(mL)。對(duì)劑量體積進(jìn)行插值至非常接近0.1mL。
在以下時(shí)間點(diǎn)，從每一動(dòng)物的外周靜脈收集約1.0mL用于藥代動(dòng)力學(xué)分析的血液 ·給藥前 ·在研究日1，給藥后30分鐘和6小時(shí) ·在研究日2、3、4、5、8、11、15、18、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85、92、99、106、113、120、127和134各一次 在以下時(shí)間點(diǎn)，從每一動(dòng)物的外周靜脈收集約1.0mL用于抗-治療抗體分析的血液 ·給藥前 ·在研究日15、29、43、57、71、85、99、113、127和134各一次 將用于藥代動(dòng)力學(xué)(PK)和抗-治療抗體(ATA)分析的血液樣本收集入血清分離管中，并在室溫凝結(jié)約30-80分鐘。通過離心(室溫2000×g，15分鐘)得到血清(約0.5mL)。將血清樣本轉(zhuǎn)移至預(yù)先標(biāo)記的1.5mL埃彭道夫管(eppendorf)中，并在設(shè)定為保持在-60℃至-80℃的冰箱中保存，直至在干冰上打包直至分析。
通過使用ELISA分析測定每一血清樣本中每種抗體的濃度。血清中的定量分析下限(L1QQ)為0.05μg/mL。低于該界限的值記為低于可報(bào)告值(LTR)。使用橋接ECLA分析測定每一樣本中的抗-治療抗體。
在數(shù)據(jù)分析中，使用與方案偏差最小的標(biāo)稱劑量和樣本收集時(shí)間。雄性和雌性短尾猴中的血清9.1RF、9.1RFN434A和9.1RFN434W濃度的平均值和SD值使用Excel(2000版，Microsoft Corporation，Redmond，WA)計(jì)算，并用SigmaPlot(9.0版；Systat Software，Inc.，Point Richmond，CA)繪圖。從所有數(shù)據(jù)分析中排除低于可報(bào)告值的血清濃度。當(dāng)n≤2時(shí)不計(jì)算SD值。結(jié)果顯示為三張重要的圖。
使用Gauss-Newton(Levenberg和Hartley)二室模型，以1 over y hat加權(quán)方式(WinNolin3.2版；Pharsight Corporation；Mountain View，CA)來估算每一動(dòng)物的PK參數(shù)。組1的10只短尾猴中有8只(野生型；9.1RF)和組3的10只短尾猴中有5只(9.1RFN434W)在第57日前出現(xiàn)ATA。通常，特定時(shí)刻檢測到ATA與血清濃度在該期間或之后急劇下跌相關(guān)，這導(dǎo)致更短的終半衰期及降低的藥物暴露。為了理解ATA響應(yīng)對(duì)PK作用的強(qiáng)度，用兩種方法計(jì)算每一組的平均PK參數(shù)。在方法1中，用來自每組的全部10只短尾猴的數(shù)據(jù)計(jì)算PK參數(shù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。在方法2中，僅使用未在第57日前出現(xiàn)抗-治療抗體的短尾猴(組1為n＝2，組2為n＝10，組3為n＝5)的數(shù)據(jù)來計(jì)算PK參數(shù)。對(duì)組1和3，與方法2相比，方法1產(chǎn)生較低的終半衰期(t1/2，β)和暴露(AUC)估算值。然而，使用這兩種方法的總體結(jié)論是類似的。因此，本文報(bào)導(dǎo)的平均PK參數(shù)是采用方法1計(jì)算的(例如包括來自所有短尾猴的數(shù)據(jù))。
結(jié)果 在單次iv快速注射(bolus)給藥20mg/kg的9.1RF(野生型抗體)、9.1RFN434A(N434變體)和9.1RFN434W(N434W變體)后，血清濃度顯示出兩相分配，快速初始分布相其后是緩慢消失相(圖1)。對(duì)每組估算的PK參數(shù)顯示在表2中，并包括來自每組的所有10只短尾猴的數(shù)據(jù)。9.1RF(野生型抗體)的終半衰期(平均值±SD)是6.15±2.01天，并在10只短尾猴中的變化范圍是4.24-11.0天。在兩只57日時(shí)未出現(xiàn)ATA的短尾猴中的9.1RF平均終半衰期(t1/2，β)是8.95天。對(duì)9.1RFN434A(N434A變體)，平均終半衰期是14.1±1.55天，比9.1RF高1.6-2.3倍(p＜0.05)。對(duì)9.1RFN434W(N434W變體)，10只短尾猴中的平均值±SD的終半衰期是9.55±2.49天。該數(shù)值明顯高于10只短尾猴中9.1RF(野生型抗體)的總平均t1/2，β(p＜0.05)，但類似于在兩只未出現(xiàn)可檢測的ATA的短尾猴中的9.1RF的平均t1/2，β值(8.95天)。上述觀測到的9.1RF(野生型抗體)和9.1RFN434W(N434W變體)之間的t1/2，β差別可能是由這兩組中的ATA響應(yīng)混淆了。
濃度-時(shí)間曲線下的面積推導(dǎo)出9.1RF(野生型抗體)的極限值(AUC)為2440±398天*μg/mL，且對(duì)10只短尾猴的范圍為1740-3140天*μg/mL。兩只57日時(shí)未出現(xiàn)ATA的短尾猴中的9.1RF的平均AUC為2850天*μg/mL。對(duì)9.1RFN434A(N434A變體)，平均AUC為4450±685天*μg/mL，比9.1RF(野生型抗體)高1.6-1.8倍(p＜0.05)。在9.1RF(野生型抗體)和9.1RFN434W的AUC之間沒有差異。
總之，在對(duì)短尾猴單iv劑量給藥20mg/kg后，測試了9.1RF、9.1RFN434A和9.1RF434W的藥代動(dòng)力學(xué)。對(duì)9.1RF在56日前10只短尾猴中有8只出現(xiàn)了抗-治療抗體(ATA)，而對(duì)9.1RFN434W在56日前10只短尾猴中有5只出現(xiàn)了ATA。對(duì)9.1RFN434A在56日前沒有短尾猴出現(xiàn)ATA。相比9.1RF(野生型抗體)，9.1RFN434A顯示出增加的終半衰期和增加的AUC(p＜0.05)。相比9.1RF，9.1RFN434W顯示出輕微增加的終半衰期；但觀測到的這種差別可能是由對(duì)9.1RF和9.1RFN434W的抗-治療抗體響應(yīng)混淆的。
*在WT&9.1RFN434W組中8/10和5/10短尾猴中的抗-藥物抗體的存在可能會(huì)混淆WT&9.1RFN434W的PK參數(shù)(例如降低AUC和降低t1/2，β) **與WT不同，p＜0.05 實(shí)施例21-短尾猴中的B細(xì)胞消耗 抗-BR3(9.1RF稱為WT)及FcRn變體N434A(稱為9.1RFN434A)。在以下研究設(shè)計(jì)中用WT或9.1RFN434A對(duì)51只短尾猴給藥。
在所有組中通過FACS監(jiān)測外周B細(xì)胞(總的及B細(xì)胞亞群)隨時(shí)間的去除，并表示為各動(dòng)物基線的百分比。每一動(dòng)物的基線值是給藥前三個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)的平均值。在每一尸檢時(shí)間點(diǎn)通過FACS分析來分析組織B細(xì)胞亞群。對(duì)B細(xì)胞去除的組織分析包括脾臟、下頜淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)(圖40A和圖40B)。
給藥后，在所有給藥組的血液中觀測到明顯的B細(xì)胞去除。在給藥量20mg/kg×4劑的WT和9.1RFN434A組中，在第29日(尸檢時(shí)間點(diǎn))組織B細(xì)胞被清除。在WT 2mg/kg組中，組織內(nèi)的B細(xì)胞去除較不顯著。圖41A-C顯示了治療后的B細(xì)胞亞群。
實(shí)施例22-具有增強(qiáng)ADCC活性的抗BR3抗體 設(shè)計(jì)了抗-BR3抗體9.1RF的Fc部分的氨基酸替代子，以增強(qiáng)該分子對(duì)B細(xì)胞瘤株的ADCC活性。通過定位的突變，該抗體的Fc區(qū)域突變?yōu)镾298A/K326A/E333A/K334A或S298A/E333A/K334A (EU編號(hào)系統(tǒng))?；瘜W(xué)合成了氨基酸替代子特異的寡核苷酸，并根據(jù)Kunketet al.的方案(Methods in Enzymology(1987)154，367-382)用于編碼9.1RF的質(zhì)粒的寡核苷酸-定向的突變。通過基于二脫氧核苷酸的測序來確認(rèn)變體的序列。使用Qiagen，Inc.描述的gigaprep方案，從E.coliXL-1 Blue(Stratagene，Inc.)的1L培養(yǎng)物(含50μg/mL carbenecillin的2YT基質(zhì))中純化質(zhì)粒DNA，該菌株用相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，并在200rpm的振蕩條件下在37℃生長。通過使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的純化的質(zhì)粒DNA，表達(dá)蛋白。通過在Protein A-Sepharose上進(jìn)行色譜分離隨后在SP-Sepharose上進(jìn)行陽離子交換色譜，從1L培養(yǎng)物上清液中純化出抗體。通過SDS-PAGE和氨基末端測序確認(rèn)了純化蛋白的身份。通過分析凝膠過濾色譜，所有純化的抗體產(chǎn)生同一的峰，從靜態(tài)光散射數(shù)據(jù)計(jì)算的摩爾質(zhì)量為150,000±5000，且具有低于3％的聚集體含量。通過MALDI-TOF的N-連接的低聚糖分析顯示了典型的重組抗體的碳水化合物組合物。
使用基于ELISA的分析評(píng)估變體抗體對(duì)Fcγ受體的結(jié)合。人Fcγ受體I，IIa，IIb，IIIa(F158)，IIIa(V158)和小鼠Fcγ受體I，II和III的細(xì)胞外區(qū)在CHO細(xì)胞中表達(dá)為His-標(biāo)簽的GST融合蛋白，并根據(jù)Shieldset al.(J.Biol.Chem.2766591-6604(2001))中所述進(jìn)行純化。對(duì)于ELISA分析，在包被有抗-GST抗體的微滴定板的小孔上俘獲融合蛋白。加入變體抗體的稀釋液，并使其結(jié)合，隨后清洗所述小孔以去除未結(jié)合的抗體。對(duì)較弱的結(jié)合抗體，在將樣本加入所述孔之前，將樣本與抗-huκ-鏈抗體的Fab’s片段復(fù)合。用山羊抗-huFab’s抗體的HRP-偶聯(lián)的Fab’s片段檢測結(jié)合的抗體。通過使用4-參數(shù)方程評(píng)估結(jié)合曲線以計(jì)算EC50值，得到飽和時(shí)信號(hào)的50％的抗體濃度。在這些分析中，使用Herceptin_作為對(duì)照抗體，從EC50值的比例(EC50赫賽汀/EC50樣本)計(jì)算結(jié)合的增強(qiáng)倍數(shù)。
這些數(shù)據(jù)顯示所有抗-BR3抗體對(duì)人FcγRIIIa的F158和V158異型均具有增強(qiáng)的親和性。所有變體在對(duì)人FcγRI的親和性上的變化不明顯。
基本如所述(Shields et al，J.Biol.Chem.2766591-6604(2001))使用乳酸脫氫酶(LDH)讀出裝置，分析抗-BR3抗體介導(dǎo)天然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)溶解BJAB細(xì)胞(表達(dá)BR3和CD20的Burkitt’s淋巴瘤B細(xì)胞系)的的能力(ADCC活性)。在該分析中，以5∶1的效應(yīng)子靶標(biāo)比例使用分離自對(duì)CD16的F/V158異型雜合的供體的NK細(xì)胞。使用RosetteSep_人NK細(xì)胞富集雞尾酒劑(StemCell Technologies，Vancouver，B.C.)，根據(jù)制造商的方案，從100mL肝素化血液制備NK細(xì)胞。將血液用等體積的磷酸鹽緩沖鹽水稀釋，在15mL Ficoll-PaqueTM(Amersham Bioscience，Uppsala，Sweden)上分層，并在1450rpm離心20分鐘。將層間界面處的白細(xì)胞分配至4個(gè)干凈的50-mL管中，這些管中充滿含有15％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基。將所述管在1450RPM離心20分鐘并棄去上清液。將NK細(xì)胞在分析培養(yǎng)基(F12/DMEM50∶50不含甘氨酸，1mM HEPES緩沖液pH7.2，青霉素/鏈霉素(100單位/mL；Gibco)，谷氨酰胺，和1％熱滅活的胎牛血清)中稀釋至2×106細(xì)胞/mL。
將抗體在分析培養(yǎng)基中的系列稀釋液(0.05mL)加入96孔圓底組織培養(yǎng)板中。將BJAB細(xì)胞在分析緩沖液中稀釋至濃度4×105/mL。將BJAB細(xì)胞(0.05mL每孔)與96孔板中的稀釋的抗體混合，并在室溫孵育30分鐘以使得抗體結(jié)合至BR3(調(diào)理作用)。
通過向每孔中加入0.05mL NK細(xì)胞來初始化ADCC反應(yīng)。在對(duì)照孔中，加入2％的Triton X-100。然后將培養(yǎng)板在37℃孵育4小時(shí)。使用細(xì)胞毒性(LDH)檢測試劑盒(Kit#1644793，Roche Diagnostics，Indianapolis，Indiana)，按照制造商的指導(dǎo)，檢測釋放的LDH水平。向每孔中加入0.1mL的LDH顯色劑，隨后混合10秒。然后將培養(yǎng)板用鋁箔覆蓋，并在室溫和黑暗條件下孵育15分鐘。然后讀取490nm處的光密度，并通過除以對(duì)照孔中測量的總LDH來計(jì)算溶解％。將溶解作為抗體濃度的函數(shù)來作圖，并使用4-參數(shù)曲線擬合(KaleidaGraph)來確定EC50濃度。
所有抗-BR3變體在ADCC分析中均具有活性，得到低于1nM的EC50值(殺傷％vs抗體濃度)。Fc替代子通過減小EC50及增大最大殺傷％導(dǎo)致相對(duì)9.1的效力上升(數(shù)據(jù)未示出)。在該分析中，相對(duì)9.1wt，S298A/K326A/E333A/K334A突變體具有3倍高的ADCC活性(相對(duì)EC50值)。在該分析中，相對(duì)9.1wt，S298A/EE333A/K334A突變體具有2.8倍高的ADCC活性(相對(duì)EC50值)。
序列表
<110>基因技術(shù)公司
拜奧根IDEC馬薩諸塞公司
柯里斯蒂娜·M·安布魯瓦茲
梅塞德茲·巴拉日
勞拉·德福爾熱
馬克·S·丹尼斯
熱爾梅娜·富
斯蒂芬·D·赫斯特
LEE，Chingwei V
亨利·B·洛曼
弗萊維厄斯·馬丁
杰拉爾德·R·納卡穆拉
達(dá)亞·塞莎賽義迪
梅麗莎·斯塔羅瓦斯尼克
杰弗里·S·湯普森
<120>結(jié)合BR3的多肽及其用途
<130>P2142R1
<140>
<141>
<150>60/640,323
<151>2004-12-31
<160>236
<170>PatentTn version 3.3
<210>1
<211>106
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>1
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
15 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asp Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Thr Asp Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Ser
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Lys Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr
100 105
<210>2
<211>122
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<213>Mus musculus
<400>2
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20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Phe Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
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Leu Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly
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<213>人工序列
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<223>人工列的描述合成多肽
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr
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Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Ser
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<223>人工序列的描述合成多肽
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<213>人工序列
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<223>人工序列的描述合成多肽
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly
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<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Asn Ser Asn Phe Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>14
<211>237
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>14
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val
35 40 45
Asp Asp Tyr Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asp Leu Glu Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110
Gln Thr Ser Lys Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
115 120 125
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
130 135 140
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
145 150 155 160
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
165 170 175
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
180 185 190
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
195 200 205
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
210 215 220
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210>15
<211>441
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>15
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly Tyr Trp Asn Trp Val
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr
35 40 45
Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
65 70 75 80
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Asn Ser Asn Phe Tyr
85 90 95
Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
130 135 140
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145 150 155 160
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
180 185 190
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
195 200 205
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210>16
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Thr Asn His Leu Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>17
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Pro His Asn Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>18
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Pro His Asn Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>19
<211>108
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>19
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
8590 95
Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
100 105
<210>20
<211>123
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>20
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile Ser Gly Phe Thr Val Thr Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Phe Tyr Leu Gln Me1 Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly
115 120
<210>21
<211>114
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210>22
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Thr Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>23
<211>114
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Gln His Leu Asp Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210>24
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Pro Me1 Ala Gly Phe
20 25 30
Tyr Thr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>25
<211>114
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro LVs Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Asp Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210>26
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Ser Pro Arg Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>27
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Trp Pro Val Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu lyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>28
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>29
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Pro Ala Val Ala Pro His
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>30
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Tyr Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>31
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Gly Gly Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>32
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Glu Ser Ala Tyr
20 25 30
Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>33
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>33
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Tyr
20 25 30
Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>34
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人序列的描述合成多肽
<400>34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ala Thr Gly Ile Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val lyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>35
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Thr Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>36
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Trp Thr Glu His Gly His
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>37
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Thr Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>38
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Arg Arg Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
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65 70 75 80
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<223>人工序列的描述合成多肽
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<223>人工序列的描述合成多肽
<400>59
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<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>60
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<211>118
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<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
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<211>118
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<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>62
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<223>人工序列的描述合成多肽
<400>63
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<211>118
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<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>64
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<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>65
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<223>人工序列的描述合成多肽
<400>66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp ryr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>67
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>67
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Leu Thr Gly Ser
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>68
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工的序列的描述合成多肽
<400>68
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ile Gly Ser
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>69
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>69
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ala His
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>70
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>70
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Tyr Thr Glu Asn Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>71
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>71
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Glu Gly Gly Phe
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>72
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>72
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Glu Asp Ser Tyr
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>73
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>73
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Gly Gly Thr Phe
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Tle Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>74
<211>220
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>74
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Asn ASn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210>75
<211>447
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>75
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Thr Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val phe Leu phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210>76
<211>447
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<220>
<221>M0D_RES
<222>(435)..(435)
<223>Ala，Trp，His，Tyr of Phe
<400>76
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Thr Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Xaa His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210>77
<211>108
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>77
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr
100 105
<210>78
<211>123
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>78
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Leu Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Leu Asp Gly Leu Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120
<210>79
<211>114
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>79
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210>80
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>80
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Leu Asp Gly Leu Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>81
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>81
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Leu Asp Gly Leu Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>82
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Asn Phe Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Leu Asn Asp Leu Phe Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>83
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>83
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Leu Asn Asp Leu Tyr Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>84
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>84
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asn Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Gly Leu Asp Gly Leu Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>85
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>85
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asn Ile Gly Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>86
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>86
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>87
<211>232
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>87
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
225 230
<210>88
<211>119
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>88
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Gly Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Tyr Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Phe Val Met Ser Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>89
<211>117
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>89
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Gly Ser
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Lys Pro Ala Gly Pro Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
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<211>119
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>90
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Gly Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Thr Pro Ala Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Phe Pro Phe His Tyr Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>91
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Ser Ser
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Thr Pro Ala Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Lys Gly Phe His Trp Tyr Arg Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115120
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>92
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Gly Ser
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Lys Pro Ala Gly Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210>93
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>93
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Thr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Gly Ile Ser Pro Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Lys Val Val Ser Ser His Val Thr Asn Lys Tyr Val Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>94
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Gly Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asn Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ser Arg Arg Pro Trp Leu Trp Gly Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>95
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221>MOD_RES
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<223>未確定的氨基酸
<400>95
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Trp Ile Ser Pro Xaa Xaa Gly Asn Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<220>
<221>MOD_RES
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<220>
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<220>
<221>MOD_RES
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<220>
<221>MOD_RES
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<223>未確定的氨基酸
<400>96
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Xaa Ile Ser Pro Xaa Xaa Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Ary Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ala Leu Cys Ala Pro Xaa Xaa Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210>97
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>97
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Ile Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
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<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>98
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>99
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>99
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser 6ly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Ser Thr Ser Pro Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210>100
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成多肽
<400>100
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Asn Leu Gly Val Cys Ala Gly Ala Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>101
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>101
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
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<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>102
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asp Arg Ala Arg Val Cys Ala Gly Ala Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>103
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>103
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ala Ser Pro Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210>104
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>104
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Arg Arg
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Ser Ser Val Arg Gly Cys Ala Gly Ala Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>105
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>105
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Ile Ser Pro Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210>106
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>106
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Val Thr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>107
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>107
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Trp Ile Thr Pro Gly His Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>108
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>108
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Asn Thr Pro Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210>109
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<23>人工序列的描述合成多肽
<400>109
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe ser Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Trp Ile Thr Pro Thr His Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
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Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>110
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>110
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Ala Arg Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Trp Ile Leu Pro Ser Ala Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>111
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>111
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Leu Ile Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210>112
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>112
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Arg Ser Ile
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>113
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>工序列的描述合成多肽
<400>113
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210>114
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>114
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn His Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>115
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>115
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210>116
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>116
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Ser Asn His
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Val Thr Pro Ser Tyr Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>117
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>117
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Leu Met Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210>118
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>118
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Val Thr Pro Gly Val Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>119
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>119
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Ile Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210>120
<211>L25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>120
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Ser Arg Arg
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Thr Pro Leu Tyr Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>121
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>121
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gly Ile Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210>122
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>122
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Arg Asn Asn
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Val Leu Pro Ser Asn Gly Val Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>123
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>123
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210>124
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>124
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asn Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
3S 40 45
Ala Trp Val Leu Pro ser val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp ser Val
50 5560
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met ASn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>125
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 510 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ala Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
6S 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>126
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>126
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Gln Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>127
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>127
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 5560
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Va1 Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>128
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>128
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>129
<211>232
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>129
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
225 230
<210>130
<211>454
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>130
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325 330 335
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu lyr Ser
405 410 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450
<210>131
<211>454
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(442)..(442)
<223>Ala，Trp，His，Tyr or Phe
<400>131
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Tle Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325 330 335
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Xaa His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450
<210>132
<211>330
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>132
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210>133
<211>218
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>133
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210>134
<211>217
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(204)..(204)
<223> Ala，Trp， His，Tyr or Phe
<400>134
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu Xaa Asn His Tyr Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215
<210>135
<211>218
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>135
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
115 120 125
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210215
<210>136
<211>217
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>136
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210>137
<211>218
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>137
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
180 185 190
Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210>138
<211>218
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>138
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp GlX Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215
<210>139
<211>215
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>139
Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
1 5 10 15
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
20 25 30
Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp
35 40 45
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe
50 55 60
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp
65 70 75 80
Cys Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe
85 90 95
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
100 105 110
Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys
115 120125
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp
130 135 140
Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys
145 150 155 160
Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
165 170175
Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
180 185 190
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
195 200 205
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
210 215
<210>140
<211>218
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>140
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
35 40 45
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
50 55 60
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
85 90 95
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
100 105 110
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
130 135 140
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
165 170 175
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
210 215
<210>141
<211>218
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>141
Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
1 5 10 15
Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
35 40 45
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
50 55 60
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser His Leu Pro Ile Gln
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
85 90 95
Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
100 105 110
Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln
115 120 125
Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn
130 135 140
Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
165 170 175
Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp
180 185 190
Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu
195 200 205
Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
210 215
<210>142
<211>217
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>142
Pro Pro Gly Asn Ile Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Ala Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val His Val Ser Trp
35 40 45
Phe Val Asp Asn Lys Glu Val His Thr Ala Trp Thr Gln Pro Arg Glu
50 55 60
Ala Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Met Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
100 105 110
Arg Ala Gln Thr Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Arg Glu Gln
115 120 125
Met Ser Lys Lys Lys Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Thr Asn Phe Phe
130 135 140
ser Glu Ala Ile Ser Val Glu Trp Glu Arg Asn Gly Glu Leu Glu Gln
145 150 155 160
Asp Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Ile Leu Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Thr Asp Ser Trp Leu Gln Gly Glu
180 185 190
Ile Phe Thr Cys Ser Val Val His Glu Ala Leu His Asn His His Thr
195 200 205
Gln Lys Asn Leu Ser Arg Ser Pro Gly
210 215
<210>143
<211>285
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>143
Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu
1 5 10 15
Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro
20 25 30
Arg Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu
35 40 45
Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val
50 55 60
Ser Phe Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg
65 70 75 80
Ala Glu Leu Gln Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly
85 90 95
Ala Pro Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu
100 105 110
Lys Ile Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn
115 120 125
Ser Arg Asn Lys Arg Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln
130 135 140
Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys
145 150 155 160
Gly Ser Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser
165 170 175
Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr
180 185 190
Phe Phe Ile Tyr Gly Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met
195 200 205
Gly His Leu Ile Gln Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu
210 215 220
Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu
225 230 235 240
Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly
245 250 255
Asp Glu Leu Gln Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu
260 265 270
Asp Gly Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu
275 280 285
<210>144
<211>309
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>144
Met Asp Glu Ser Ala Lys Thr Leu Pro Pro Pro Cys Leu Cys Phe Cys
1 5 10 15
Ser Glu Lys Gly Glu Asp Met Lys Val Gly Tyr Asp Pro Ile Thr Pro
20 25 30
Gln Lys Glu Glu Gly Ala Trp Phe Gly Ile Cys Arg Asp Gly Arg Leu
35 40 45
Leu Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Ser Ser Phe Thr Ala
50 55 60
Met Ser Leu Tyr Gln Leu Ala Ala Leu Gln Ala Asp Leu Met Asn Leu
65 70 75 80
Arg Met Glu Leu Gln Ser Tyr Arg Gly Ser Ala Thr Pro Ala Ala Ala
85 90 95
Gly Ala Pro Glu Leu Thr Ala Gly Val Lys Leu Leu Thr Pro Ala Ala
100 105 110
Pro Arg Pro His Asn Ser Ser Arg Gly His Arg Asn Arg Arg Ala Phe
115 120 125
Gln Gly Pro Glu Glu Thr Glu Gln Asp Val Asp Leu Ser Ala Pro Pro
130 135 140
Ala Pro Cys Leu Pro Gly Cys Arg His Ser Gln His Asp Asp Asn Gly
145 150 155 160
Met Asn Leu Arg Asn Ile Ile Gln Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp
165 170 175
Ser Asp Thr Pro Thr Ile Arg Lys Gly Thr Tyr Thr Phe Val Pro Trp
180 185 190
Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Asn Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys
195 200 205
Ile Val Val Arg Gln Thr Gly Tyr Phe Phe Ile Tyr Ser Gln Val Leu
210 215 220
Tyr Thr Asp Pro Ile Phe Ala Met Gly His Val Ile Gln Arg Lys Lys
225 230 235 240
Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys
245 250 255
Ile Gln Asn Met Pro Lys Thr Leu Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala
260 265 270
Gly Ile Ala Arg Leu Glu Glu Gly Asp Glu Ile Gln Leu Ala Ile Pro
275 280 285
Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Arg Asn Gly Asp Asp Thr Phe Phe Gly
290 295 300
Ala Leu Lys Leu Leu
305
<210>145
<211>184
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>145
Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro
1 510 15
Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys
20 25 30
Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala
35 40 45
Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly
50 55 60
Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro Gly Leu Leu Phe Gly
65 70 75 80
Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Val Leu Val
85 90 95
Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gln Arg Arg Leu Arg Gly Ala Ser
100 105 110
Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys Asp Ala Pro Glu Pro Leu Asp
115 120 125
Lys Val Ile Ile Leu Ser Pro Gly Ile Ser Asp Ala Thr Ala Pro Ala
130 135 140
Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His Ser
145 150 155 160
Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr Thr
165 170 175
Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gln Gln
180
<210>146
<211>185
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>146
Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys
20 25 30
Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala
35 40 45
Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val
50 55 60
Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro Gly Leu Leu Phe
65 70 75 80
Gly Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Val Leu
85 90 95
Val Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gln Arg Arg Leu Ar1 Gly Ala
100 105 110
Ser Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys Asp Ala Pro Glu Pro Leu
115 120 125
Asp Lys Val Ile Ile Leu Ser Pro Gly Ile Sar Asp Ala Thr Ala Pro
130 135 140
Ala Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr
165 170 175
Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gln Gln
180 185
<210>147
<211>175
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>147
Met Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gln Arg Ser Arg Asp Ser
1 5 10 15
Ser Val Pro Thr Gln Cys Asn Gln Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val
20 25 30
Arg Asn Cys Val Ser Cys Glu Leu Phe His Thr Pro Asp Thr Gly His
35 40 45
Thr Ser Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Gly Ser
50 55 60
Ala Leu Arg Pro Asp Val Ala Leu Leu Val Gly Ala Pro Ala Leu Leu
65 70 75 80
Gly Leu Ile Leu Ala Leu Thr Leu Val Gly Leu Val Ser Leu Val Ser
85 90 95
Trp Arg Trp Arg Gln Gln Leu Arg Thr Ala Ser Pro Asp Thr Ser Glu
100 105 110
Gly Val Gln Gln Glu Ser Leu Glu Asn Val Phe Val Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Thr Pro His Ala Ser Ala Pro Thr Trp Pro Pro Leu Lys Glu Asp Ala
130 135 140
Asp Ser Ala Leu Pro Arg His Ser Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu
145 150 155 160
Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gln
165 170 175
<210>148
<211>175
<212>PRT
<213>Rattus norvegicus
<400>148
Met Gly Val Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Arg Arg Ser Arg Asp Ser
1 5 10 15
Pro Val Ser Thr Gln Cys Asn Gln Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val
20 25 30
Arg Asn Cys Val Ser Cys Glu Leu Phe Tyr Thr Pro Glu Thr Arg His
35 40 45
Ala Ser Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Gly Ser
50 55 60
Gly Leu Arg Pro Asp Val Ala Leu Leu Phe Gly Ala Pro Ala Leu Leu
65 70 75 80
Gly Leu Val Leu Ala Leu Thr Leu Val Gly Leu Val Ser Leu Val Gly
85 90 95
Trp Arg Trp Arg Gln Gln Arg Arg Thr Ala Ser Leu Asp Thr Ser Glu
100 105 110
Gly Val Gln Gln Glu Ser Leu Glu Asn Val Phe Val Pro Pro Ser Glu
115 120 125
Thr Leu His Ala Ser Ala Pro Asn Trp Pro Pro Phe Lys Glu Asp Ala
130 135 140
Asp ASn Ile Leu Ser Cys His Ser Ile Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu
145 150 155160
Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gln
165 170 175
<210>149
<211>183
<212>PRT
<213>Macaca mulatta
<400>149
Met Lys Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro
1 510 15
Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys
20 25 30
Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Ala Pro
35 40 45
Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val
50 55 60
Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Ser Leu Pro Gly Leu Leu Phe
65 70 75 80
Gly Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Val Leu
85 90 95
Val Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gln Arg Arg Leu Arg Gly Ala
100 105 110
Ser Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys Asp Lys Asp Glu Pro Leu
115 120 125
Asp Lys Val Ile Ile Leu Ser Pro Gly Ile Ser Asp Ala Ala Ala Pro
130 135 140
Ala Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr
165 170 175
Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu
180
<210>150
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>150
Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys
1 5 10 15
Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg
20
<210>151
<211>61
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>151
Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys
20 25 30
Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala
35 40 45
Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu
50 55 60
<210>152
<211>64
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>152
Met Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gln Arg Ser Arg Asp Ser
1 5 10 15
Ser Val Pro Thr Gln Cys Asn Gln Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val
20 25 30
Arg Asn Cys Val Ser Cys Glu Leu Phe His Thr Pro Asp Thr Gly His
35 40 45
Thr Ser Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Gly Ser
50 55 60
<210>153
<211>314
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>153
Met Ser Ala Leu Leu Ile Leu Ala Leu Val Gly Ala Ala Val Ala Ser
1 5 10 15
Thr Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gln Arg Ser Arg Asp Ser
20 25 30
Ser Val Pro Thr Gln Cys Asn Gln Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val
35 40 45
Arg Asn Cys Val Ser Cys Glu Leu Phe His Thr Pro Asp Thr Gly His
50 55 60
Thr Ser Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Gly Gln
65 70 75 80
Val Thr Gly Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro
85 90 95
Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
100 105 110
Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys
115 120 125
Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp
130 135 140
Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu
145 150 155 160
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met
165 170 175
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser
180 185 190
Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
195 200 205
Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln
210 215 220
Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe
225 230 235 240
Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu
245 250 255
Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr phe
260 265 270
Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn
275 280 285
Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
290 295 300
Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
305 310
<210>154
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>154
tcttgtgaca aaactcacag tggcggtggc tctggt 36
<210>155
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>155
tattactgtc agcaacatta ataaaggcct taacctccca cgttcgga 48
<210>156
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修飾的堿基
<222>(29)..(29)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>156
acctgccgtg ccagtcagrd trktrvwanw thtgtagcct ggtatcaaca gaaac 55
<210>157
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修飾的堿基
<222>(29)..(29)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>157
acctgccgtg ccagtcagrd trktrvwanw thtctggcct ggtatcaaca gaaac 55
<210>158
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>158
ccgaagcctc tgatttackb ggcatccavc ctctactctg gagtccct 48
<210>159
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>159
ccgaagcttc tgatttackb ggcatccavc ctcgmatctg gagtcccttc tcgc 54
<210>160
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<212>DNA
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<220>
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<220>
<221>修飾的堿基
<222>(31)..(31)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>160
gcaacttatt actgtcagca atmtdmcrvt nhtcctykga cgttcggaca gggtacc57
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<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
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gcaacttatt actgtcagca atmtdmcrvt nhtccttwta cgttcggaca gggtacc57
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<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修飾的堿基
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gcaacttatt actgtcagca asrtdmcrvt nhtcctykga cgttcggaca gggtacc57
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<213>人工序列
<220>
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<220>
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gcaacttatt actgtcagca asrtdmcrvt nhtccttwta cgttcggaca gggtacc57
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<213>人工序列
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gcaacttatt actgtcagca annnnnnnnn nnnccgnnna cgttcggaca gggtacc 57
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
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tgtgcagctt ctggcttcwc cnttnnnnnn nnnnnnnnnn nntgggtgcg tcaggcc57
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<212>DNA
<213>人工序列
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<221>修飾的堿基
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aagggcctgg aatgggttgs tnnnatcnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ntatgccgat 60
agcgtcaag 69
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<212>DNA
<213>人工序列
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<220>
<221>修飾的堿基
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gccgtctatt attgtgctcg tnnnnnntgc nnnnnnnnnn nnnnnnnntg cnnnnnnnnn 60
atggactact ggggtcaag 79
<210>168
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<213>人工序列
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<221>修飾的堿基
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<223>a，t，c or g
<400>168
gccgtctatt attgtgctcg tnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
atggactact ggggtcaag 79
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<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
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<220>
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<223>a，t，c or g
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gccgtctatt attgtgctnn nnnnnnntgc nnnnnnnnnn nnnnnggctg cgcgggggca 60
atg 63
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<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
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<221>修飾的堿基
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<223>a，t，c or g
<400>170
gctcgtcggg tctgctacnn nnnnnnnnnn nnntgcnnnn nnnnnatgga ctactggggt 60
caa 63
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<213>人工序列
<220>
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<400>171
gctcggttgc cgccgggcgt tttttatg 28
<210>172
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<220>
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<220>
<221>修飾的堿基
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<223>a，t，c or g
<400>172
acttattact gtcagcaann nnnnnnnnnn ccgnnnacgt tcggacaggg t 51
<210>173
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修飾的堿基
<222>(19)..(33)
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<220>
<221>修飾的堿基
<222>(37)..(39)
<223>a，t，c or g
<400>173
acttattact gtcagcaann nnnnnnnnnn nnnccgnnna cgttcggaca gggt 54
<210>174
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
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<220>
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<221>修飾的堿基
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<223>a，t，c or g
<400>174
acttattact gtcagcaann knnknnkccg cccacgttcg gacagggt 48
<210>175
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修飾的堿基
<222>(22)..(33)
<223>a，t，c or g
<400>175
gcagcttctg gcttcwccat tnnnnnnnnn nnnatacact gggtgcgtc 49
<210>176
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
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<220>
<221>修飾的堿基
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<223>a，t，c or g
<400>176
ctggaatggg ttgcttggrt tnnncctnnn nnnggtnnna ctnnntatgc cgatagcgtc 60
aag 63
<210>177
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修飾的堿基
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<220>
<221>修飾的堿基
<222>(28)..(45)
<223>a，tt，c or g
<400>177
gtctattattt gtgctcgtnn nnnntgcnnn nnnnnnnnnn nnnnntgcgc tggtgggatg 60
<210>178
<211>75
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修飾的堿基
<222>(19)..(24)
<223>a，t，c or g
<220>
<221>修飾的堿基
<222>(28)..(36)
<223>a，t，c or g
<220>
<221>修飾的堿基
<222>(49)..(57)
<223>a，t，c or g
<400>178
gtctattatt gtgctcgtnn nnnntgcnnn nnnnnncttg gtgtttgcnn nnnnnnnatg 60
gactactggg gtcaa 75
<210>179
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<221>修飾的堿基
<222>(19)..(24)
<223>a，t，c or g
<220>
<221>修飾的堿基
<222>(28)..(45)
<223>a，t，c or g
<400>179
gtctattatt gtgctcgtnn nnnnrstnnn nnnnnnnnnn nnnnnrstgs tgstgsgatg 60
gactactggg gt 72
<210>180
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<220>
<22修飾的堿基
<222>(19)..(21)
<223>a，t，c or g
<220>
<221>修飾的堿基
<222>(25)..(42)
<223>a，t，c or g
<220>
<221>修飾的堿基
<222>(46)..(54)
<223>a，t，c or g
<400>180
tattattgtg ctcgtcggnn nrstnnnnnn nnnnnnnnnn nnrstnnnnn nnnnatggac 60
tactggggtc70
<210>181
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>181
acctgccgtg ccagtsaaga mrttkccasc kctgtagcct ggtatcaaca gaaac 55
<210>182
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>182
ccgaagcttc tgatttwckc cgcatcctwc ctctwctctg gagtcccttc tcgc 54
<210>183
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>183
gcaacttatt actgtcagca skccsaartt kccccgscaa cgttcggaca gggtacc57
<210>184
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>184
gcagcttctg gcttcaccat tkcckcckcc kccatacact gggtgcgtca g 51
<210>185
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>185
gcagcttctg gcttcaccat tagtkccagc kccatacact gggtgcgtca g 51
<210>186
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>186
gcagcttctg gcttcaccat tkccagckcc tctatacact gggtgcgtca g 51
<210>187
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>187
aagggcctgg aatgggttgc atkgrttmtc scakccrttg sttwcascga mtatgccgat 60
agcgtcaagg gc 72
<210>188
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>188
aagggcctgg aatgggttgc ttggrttctt scatctrttg gttwcactga mtatgccgat 60
agcgtcaagg gc 72
<210>189
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>189
aagggcctgg aatgggttgc ttkggttmtc cctkccgtgg sttttascga ctatgccgat 60
agcgtcaagg gc 72
<210>190
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>190
actgccgtct attattgtgc aaraarartt tgctwcraca ramtcgstrt ttgckctgst 60
gstatggact actggggtca a 81
<210>191
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>191
actgccgtct attattgtgc tcgtaragtc tgctwcaaca racttgstgt ttgckctggt 60
gstatggact actggggtca a 81
<210>192
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成核苷酸序列
<400>192
actgccgtct attattgtgc taracggrtt tgctacracc gcmtcggtrt ttgcgctgst 60
ggtatggact actggggtca a 81
<210>193
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>193
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ala Ser Ser
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>194
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>194
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ala Thr Ser
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>195
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>195
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ser Ala Ser Phe Leu Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Glu Val Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>196
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>196
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>197
<21L>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>197
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Tyr Leu Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Val Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>198
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>198
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>199
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>199
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Glu Ile Ala Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Tyr Leu Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Val Ala Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>200
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>200
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Glu Ile Ala Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Glu Val Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>201
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>201
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ala Thr Ser
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Tyr Leu Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Val Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>202
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>202
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Glu Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Glu Val Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>203
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>203
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ser Ala Ser Phe Leu Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Val Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>204
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>204
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ala Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>205
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>205
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Glu Ile Ala Thr Ser
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Val Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>206
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>206
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>207
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成多肽
<400>207
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Val Ser Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Tyr Leu Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Gln Val Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>208
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>208
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
1 5
<210>209
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>209
Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala
1 5
<210>210
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>210
Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe
1 5
<210>211
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>211
Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu
1 5
<210>212
<211>8
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>212
Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr
1 5
<210>213
<211>20
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>213
Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
1 5 10 15
Ser Val Lys Gly
20
<210>214
<211>10
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>214
Gly Phe Thr Val Thr Ala Tyr Tyr Met Ser
1 5 10
<210>215
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(3)
<223>Gln or Ser
<220>
<221>MOD_RES
<222>(4)
<223>His，Ile or Thr
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)
<223>Leu or Arg
<220>
<221>MOD_RES
<222>(6)
<223>Asp or Glu
<400>215
Trp Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Ser
1 5
<210>216
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>Gly，Asp，Ser，Ala，Val， Glu or Thr
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)
<223> Leu，Ser，Trp，Pro，Phe，Ala，Val，Ile，Arg，
Tyr or Asp
<220>
<221>MOD_RES
<222>(3)
<223>Pro，Thr，Ala，Asn，Ser，Ile，Lys，Leu或
Gln
<220>
<221>MOD_RES
<222>(4)
<223>Met，Arg，Val，Tyr，Gly，Glu，Ala，Thr，Leu
Trp or Asp
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)
<223>Ala，Ser，Thr，Gly，Ile，Arg，Pro，Asn，Asp
Tyr or His
<220>
<221>MOD_RES
<222>(6)
<223>Gly，Ala，Ser，Pro or Thr
<220>
<221>MOD_RES
<222>(7)
<223>Phe，His，Tyr，Arg，Ser，Val or Asn
<220>
<221>MOD_RES
<222>(9)
<223>Thr，Ile，Met，Phe，Trp or Val
<220>
<221>MOD_RES
<222>(10)
<223>Thr，Gly，Ser or Ala
<400>216
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa
1 5 10
<210>217
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>Thr，Asn or Arg
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)
<223>Thr，Ser，Leu，Asn or Pro
<220>
<221>MOD_RES
<222>(3)
<223>Leu，Asn or His
<220>
<221>MOD_RES
<222>(4)
<223>Pro，Phe，Tyr，Leu or Asn
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)
<223>Asp or Tyr
<400>217
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210>218
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>Asn，Thr or Arg
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)
<223>Ala，Ser，Thr，Leu，Asn or Pro
<220>
<221>MOD_RES
<222>(3)
<223>Asn，His or Leu
<220>
<221>MOD_RES
<222>(4)
<223> Pro，Tyr，Phe，Asn，Thr or Leu
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)
<223>Tyr，Thr or Asp
<220>
<221>MOD_RES
<222>(7)
<223>Ala or Glu
<400>218
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Met Asp Tyr
1 5 10
<210>219
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>219
Asn Ser Asn Phe Tyr Gly Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210>220
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(6)
<223>Arg or His
<400>220
Arg Val Cys Tyr Asn Xaa Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210>221
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>221
Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210>222
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>222
Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn Ser Ile His
1 5 10
<210>223
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>223
Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asp Gly Asn Thr Asp
1 5 10
<210>224
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>224
Gly Phe Thr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His
1 5 10
<210>225
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>225
Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp
1 5 10
<210>226
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(4)
<223>Gln or Glu
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)
<223>Asp or Glu
<220>
<221>MOD_RES
<222>(6)
<223>Ile or Glu
<220>
<221>MOD_RES
<222>(7)
<223>Ser or Ala
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)
<223>Ser or Thr
<220>
<221>MOD_RES
<222>(9)
<223>Ala or Ser
<400>226
Arg Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Ala
1 5 10
<210>227
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>Tyr or Phe
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)
<223>Ser，Ala or Gly
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)
<223>Asn，Phe or Tyr
<220>
<221>MOD_RES
<222>(7)
<223>Phe or Tyr
<400>227
Xaa Xaa Ala Ser Xaa Leu Xaa Ser
1 5
<210>228
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)
<223>Gln or His
<220>
<221>MOD_RES
<222>(4)
<223>Gly，Leu，Arg，His，Tyr，Gln or Glu
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)
<223>Asn，Thr，Met，Ser，Ala，Ile or Val
<220>
<221>MOD_RES
<222>(6)
<223>Thr or Ser
<400>228
Gln Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Pro Pro Thr
1 5
<210>229
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>229
Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ser Thr Ala Val Ala
1期 5 10
<210>230
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>230
Tyr Ala Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210>231
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>人工序列的描述合成肽
<400>231
Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro Thr
1 5
<210>232
<211>17
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>232
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Asn Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210>233
<211>7
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>233
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210>234
<211>9
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>234
Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210>235
<211>10
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>235
Thr Pro His Thr Tyr Gly Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210>236
<211>17
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>236
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Asn Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
權(quán)利要求
1.抗體或多肽，其結(jié)合人BR3胞外區(qū)序列且在人效應(yīng)細(xì)胞存在下具有抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)或者與包含人野生型IgG Fc的抗體相比，在人效應(yīng)細(xì)胞存在下，其具有增加的ADCC。
2.抗體或多肽，其結(jié)合人BR3胞外區(qū)序列且與包含人野生型IgG Fc的抗體相比，在人效應(yīng)細(xì)胞存在下，其具有降低的抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)。
3.抗體或多肽，其結(jié)合人BR3胞外區(qū)并在體內(nèi)殺傷或去除B細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求3所述的抗體或多肽，其中與基線水平或未用所述抗體或多肽處理的陰性對(duì)照相比，所述抗體或多肽體內(nèi)殺傷或去除至少20％的B細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4所述的抗體或多肽，其中與基線水平或未用所述抗體或多肽處理的陰性對(duì)照相比，所述抗體或多肽體內(nèi)殺傷或去除血液中至少25％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多的B細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求4或5所述的抗體或多肽，其中所述抗體能夠去除至少一種靈長類動(dòng)物B細(xì)胞，所述靈長類動(dòng)物B細(xì)胞選自人、短尾猴和恒河猴B細(xì)胞。
7.抗體或多肽，其結(jié)合人BR3胞外區(qū)序列且與具有野生型或天然序列IgG Fc的抗體相比，其在體內(nèi)具有增加的半衰期。
8.如權(quán)利要求3所述的抗體或多肽，其中所述抗體或多肽與血清白蛋白、血清白蛋白結(jié)合多肽或非蛋白聚合物偶聯(lián)。
9.如權(quán)利要求1-7中任一權(quán)利要求所述的抗體或多肽，其中所述抗體或多肽包含與野生型IgG Fc區(qū)相比較改變的Fc區(qū)。
10.如權(quán)利要求7所述的抗體或多肽，其中所述抗體或多肽包含改變的Fc區(qū)，其與包含野生型IgG Fc區(qū)的抗體相比，在pH 6.0時(shí)對(duì)人Fc新生受體(FcRn)具有更高的親和性。
11.人源化抗體或人抗體，其具有在人BR3上的包含殘基L38和R39的功能性表位。
12.人源化抗體或人抗體，其具有在人BR3上的包含殘基G36的功能性表位。
13.抗體，其具有在人BR3上的包含殘基L28和V29的功能性表位。
14.抗體，其具有在人BR3上的包含殘基P21和A22的功能性表位。
15.人源化抗體或人抗體，其具有在人BR3上的包含殘基F25、V33、A34并還任選地包含殘基R30的功能性表位。
16.抗體或多肽，其以如下的表觀Kd值結(jié)合人BR3胞外區(qū)序列并結(jié)合小鼠BR3胞外區(qū)序列500nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低。
17.如權(quán)利要求1-14中任一權(quán)利要求所述的抗體或多肽，其在25℃下在BIAcore分析中作為Fab以如下表觀Kd值結(jié)合人BR3胞外區(qū)序列100μM或更低、1μM或更低、500nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低。
18.抗體或多肽，其來源于表2中的任一種抗體并在25℃下在BIAcore分析中作為Fab以如下表觀Kd值結(jié)合人BR3胞外區(qū)序列100μM或更低、1μM或更低、500nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低。
19.人源化抗體或人抗體，其結(jié)合人胞外BR3序列并具有H1、H2和H3區(qū)，所述H1、H2和H3區(qū)分別與表2中的任一種抗體的H1、H2和H3區(qū)具有至少70％同源性。
20.人源化抗體或人抗體，其結(jié)合人BR3胞外區(qū)序列并具有L1、L2和L3區(qū)，所述L1、L2和L3區(qū)分別與表2中的任一種抗體的L1、L2和L3區(qū)具有至少70％同源性。
21.人抗體或人源化抗體，其結(jié)合人BR3胞外區(qū)序列并與表2中的任一種抗體的VH結(jié)構(gòu)域具有至少70％同源性。
22.結(jié)合人BR3胞外區(qū)序列的人抗體或人源化抗體，所述抗體包含任一SEQ ID NOs.4-13，15，16-18，20，22，24，26，28-73，75-76，78，80-85，87-96，98，100，102，104，106，107，109-110，112，116，118，120，122，124-127和129-131中的H3序列。
23.如權(quán)利要求22所述的抗體，其還包含來自表2中公開的任一種抗體的H1、H2和H3序列。
24.如權(quán)利要求23所述的抗體，還包含來自表2中公開的任一種抗體的L1、L2和L3序列。
25.抗-BR3抗體，其包含(1)含有QVRRALDY(SEQ ID NO212)的H3高變區(qū)(HVR3)；和(2)含有RDTSKNTF(SEQ ID NO210)的重鏈框架3區(qū)(HC-FR3)。
26.如權(quán)利要求25所述的抗-BR3抗體，其還包含在H1高變區(qū)(HVR1)中的殘基GFTVTAYYMS(SEQ ID NO214)和在H2高變區(qū)(HVR2)中的殘基GFIRDKANGYTTEYNPSVKG(SEQ ID NO213)。
27.如權(quán)利要求25所述的抗-BR3抗體，其還包含HVR1和HVR2，所述HVR1含有任一SEQ ID NOS6-9，16-18，35-36，75-76和81-85的抗體序列的編號(hào)為26-35(Kabat編號(hào))的殘基，以及所述HVR2含有任一SEQ ID NOs6-9，16-18，35-36，75-76和81-85的抗體序列的編號(hào)為49-65(Kabat編號(hào))的殘基。
28.抗-BR3抗體，其包含(1)含有QVRRALDY(SEQ ID NO212)的H3高變區(qū)(HVR3)；和(2)含有RDTSKNTL(SEQ ID NO211)的重鏈框架3區(qū)(HC-FR3)。
29.如權(quán)利要求28所述的抗-BR3抗體，其還包含SEQ ID NOs5、11-13和37-73中任一抗體序列的編號(hào)為26-35和49-65(Kabat編號(hào))的殘基。
30.抗-BR3抗體，其包含(1)含有QVRRALDY(SEQ ID NO212)的H3高變區(qū)(HVR3)；和(2)含有W-A-X3-X4-X5.X6-S(SEQ ID NO215)的L1高變區(qū)(LVR1)，其中X3為Q或S，X4為H或I，X5為L或R以及X6為D或E。
31.抗-BR3抗體，其包含(1)含有QVRRALDY(SEQ ID NO212)的H3高變區(qū)(HVR3)；和(2)含有X1-X2-P-X4-X5-G-X7-Y-X9-S(SEQID NO216)的H1高變區(qū)(HVR1)，其中X1為G或D，X2為L或S，X4為M、R或V，X5為A或S，X7為F、H或Y以及X9為T或I。
32.抗-BR3抗體，其包含(1)含有QVRRALDY(SEQ ID NO212)的H3高變區(qū)(HVR3)；(2)含有SEQ ID NO215的序列的LVR1，和(3)含有SEQ ID NO216的序列的HVR1。
33.抗-BR3抗體，其包含(1)含有序列X1-X2-X3-X4-X5-G-A-M-D-Y(SEQ ID NO217)的HVR3，其中X1為T、N或R，X2為T、S、L、N或P，X3為L或N，X4為P、F、L、Y或N以及X5為D或Y和(2)含有RDTSKNTF(SEQ ID NO210)的重鏈框架3區(qū)(HC-FR3)。
34.如權(quán)利要求33所述的抗-BR3抗體，其中所述HVR3包含任一SEQ ID NOs6-9和16-18的抗體的編號(hào)為94-102(Kabat編號(hào))的殘基。
35.抗-BR3抗體，包含(1)含有序列 X1-X2-X3-X4-X5-G-X7-M-D-Y(SEQ ID NO218)的HVR3，其中X1為T或N，X2為A、T或S，X3為N、H或L，X4為P、F、Y或N，X5為T或Y以及X7為A或E，和(2)含有RDTSKNTL(SEQ ID NO211)的重鏈框架3區(qū)(HC-FR3)。
36.如權(quán)利要求35所述的抗-BR3抗體，其中所述HVR3包含任一SEQ ID NOs5和10-13的抗體的編號(hào)為94-102(Kabat編號(hào))的殘基。
37.包含HVR3的BR3結(jié)合抗體，所述HVR3含有任一SEQ IDNOs7-13和16-18的抗體序列的編號(hào)為94-102(Kabat編號(hào))的殘基。
38.抗-BR3抗體，其包含(1)含有任一SEQ ID NOs81-83的抗體序列的殘基94-102(Kabat編號(hào))的HVR3和(2)含有RDTSKNTF(SEQID NO210)的重鏈框架3區(qū)(HC-FR3)。
39.包含HVR3的抗-BR3抗體，所述HVR3含有RVCYN-X6-LGVCAGGMDY(SEQ ID NO220)，其中X6為R或H。
40.如權(quán)利要求39所述的抗-BR3抗體，其還包含LVR1、LVR2和LVR3，所述LVR1、LVR2和LVR3分別含有任一SEQ ID NOs86，97，99，101，103，105，108，111，113，115，117，119，121，123和194-207的抗體序列的殘基24-34、49-55和89-97(Kabat編號(hào))。
41.包含H1、H2和H3的抗-BR3抗體，所述H1、H2和H3分別含有任一SEQ ID NOs7-13，16-18，24，26-73，75-76，78，80-85，87-96，98，100，102，104，106，107，109-110，112，114，116，118，120，122，124-127，129和193的抗體序列的編號(hào)為26-35、49-65和94-102(Kabat編號(hào))的殘基。
42.人源化抗-BR3抗體，其包含含有殘基QVRRALDY(SEQ IDNO212)的H3；含有殘基GFTVTAYYMS(SEQ ID NO214)的H1，含有殘基GFIRDKANGYTTEYNPSVKG(SEQ ID NO213)的H2。
43.抗-BR3抗體，其包含含有殘基RVCYNRLGVCAGGMDY(SEQ ID NO221)的H3；含有殘基SGFTISSNSIH(SEQ ID NO222)的H1和含有殘基AWITPSDGNTD(SEQ ID NO223)的H2。
44.抗-BR3抗體，其包含含有殘基RVCYNRLGVCAGGMDY(SEQ ID NO221)的H3；含有殘基SGFTISSSSIH(SEQ ID NO224)的H1和含有殘基AWVLPSVGFTD(SEQ ID NO223)的H2。
45.BR3結(jié)合抗體，其能夠競爭性抑制由保藏為3.1(ATCC保藏號(hào)PTA-6622)或12B12.1(ATCC保藏號(hào)PTA-6624)的雜交瘤產(chǎn)生的抗體與人BR3的胞外區(qū)結(jié)合。
46.如權(quán)利要求45所述的抗-BR3抗體，其中所述抗體包含由保藏為3.1(ATCC保藏號(hào)PTA-6622)或12B12.1(ATCC保藏號(hào)PTA-6624)的所述雜交瘤產(chǎn)生的所述抗體的可變區(qū)序列。
47.如權(quán)利要求45所述的抗-BR3抗體，其中所述抗體包含由保藏為3.1(ATCC保藏號(hào)PTA-6622)或12B12.1(ATCC保藏號(hào)PTA-6624)的所述雜交瘤產(chǎn)生的所述抗體的高變區(qū)序列。
48.如權(quán)利要求45所述的抗-BR3抗體，其中所述抗體為由保藏為3.1(ATCC保藏號(hào)PTA-6622)或12B12.1(ATCC保藏號(hào)PTA-6624)的所述雜交瘤產(chǎn)生的所述抗體的人源化形式。
49.抗體，其包含任一SEQ ID NOs 13，15，16-18，22，24，26，28-73，75-76，78，80-85，87-96，98，100，102，104，106，107，109-110，112，116，118，120，122，124-127和129-131的VH序列。
50.抗體，其包含任一SEQ ID NOs.3，14，21，23，25，27，74，77，79，86，97，99，101，103，105，108，11，113，115，117，119，121，123和128的VL序列。
51.如權(quán)利要求19-27中任一權(quán)利要求所述的抗體，其中所述抗體在25℃下在BIAcore分析中作為Fab以如下表觀Kd值結(jié)合人BR3胞外區(qū)序列500nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、10nM或更低、5nM或更低或1nM或更低。
52.如權(quán)利要求1-27中任一權(quán)利要求所述的抗體，其中所述抗體在25℃下在BIAcore分析中作為Fab以500nM-0.001pM之間的表觀Kd值結(jié)合人BR3胞外區(qū)序列。
53.如權(quán)利要求1-52中任一權(quán)利要求所述的抗體或多肽，其中所述抗體或多肽包含人IgG的Fc區(qū)。
54.如權(quán)利要求1和3-52中任一權(quán)利要求所述的抗體或免疫粘附素，其中所述抗體或多肽包含人IgG1或人IgG3的Fc區(qū)。
55.如權(quán)利要求2-27中任一權(quán)利要求所述的抗體或多肽，其中所述抗體或多肽包含人IgG4的Fc區(qū)。
56.如權(quán)利要求1、3-21、25-44和49-52中任一權(quán)利要求所述的抗體或多肽，其中所述抗體或多肽抑制BAFF與細(xì)胞表面上的天然BR3多肽結(jié)合。
57.如權(quán)利要求1、3-21和25-52中任一權(quán)利要求所述的抗體或多肽，其中所述抗體或多肽抑制B細(xì)胞增殖和B細(xì)胞存活。
58.如權(quán)利要求1、7-21和25-52中任一權(quán)利要求所述的抗體或多肽，其中所述抗體或多肽在體內(nèi)殺傷或去除B細(xì)胞。
59.如權(quán)利要求3-21和25-52中任一權(quán)利要求所述的抗體或多肽，其中所述抗體或多肽在人效應(yīng)細(xì)胞存在下具有抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)或者與包含人野生型IgG1 Fc的抗-BR3抗體比較，在人效應(yīng)細(xì)胞存在下，其具有增加的ADCC。
60.如權(quán)利要求3-21和25-52中任一權(quán)利要求所述的抗體或多肽，其中所述抗體或多肽與包含人野生型IgG1 Fc的抗-BR3抗體比較，在人效應(yīng)細(xì)胞存在下，其具有降低的抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)。
61.刺激B細(xì)胞增殖和B細(xì)胞存活的BR3結(jié)合抗體或多肽。
62.如權(quán)利要求61所述的BR3結(jié)合抗體或多肽，其中所述多肽不具有ADCC效應(yīng)功能。
63.如權(quán)利要求61所述的BR3結(jié)合抗體或多肽，其中所述多肽包含人IgG的Fc區(qū)。
64.如權(quán)利要求63所述的BR3結(jié)合抗體或多肽，其中所述Fc區(qū)具有D265A和N297A突變(EU編號(hào)系統(tǒng))。
65.如權(quán)利要求2所述的BR3結(jié)合抗體或多肽，其中所述Fc區(qū)具有D265A和N297A突變(EU編號(hào)系統(tǒng))。
66.如權(quán)利要求1-65中任一權(quán)利要求所述的抗體或多肽，其中所述抗體或多肽包含F(xiàn)c區(qū)，所述Fc區(qū)通過在如下位置的任一位置或其任意組合處替代氨基酸被改變，從而與野生型IgG Fc序列相比改變了所述抗體或多肽的ADCC、CDC和/或藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性，所述位置選自所述Fc區(qū)的238，239，246，248，249，250，252，254，255，256，258，265，267，268，269，270，272，276，278，280，283，285，286，289，290，292，293，294，295，296，297，298，301，303，305，307，309，312，314，315，320，322，324，326，327，329，330，331，332，333，334，335，337，338，340，360，373，376，378，382，388，389，398，414，416，419，428，430，434，435，437，438和439，其中所述Fc區(qū)中的殘基編號(hào)是根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)。
67.如權(quán)利要求66所述的抗體或多肽，其中所述替代選自N434A、N434Y、N343F、N434H。
68.如權(quán)利要求66所述的抗體或多肽，其中所述Fc區(qū)為SEQ IDNO134，且其中X為選自A、W、H、Y和F的任意氨基酸。
69.如權(quán)利要求1和3-52中任一權(quán)利要求所述的抗體或多肽，其中抗體或免疫粘附素包含人IgG的Fc區(qū)，所述人IgG的Fc區(qū)包含如下替代的至少任意一種或其任意組合K246H、H268D、E283L、S324G、S239D和I332E。
70.如權(quán)利要求1和3-52中任一權(quán)利要求所述的抗體或多肽，其中抗體或免疫粘附素包含人IgG的Fc區(qū)，所述人IgG的Fc區(qū)包含如下替代的至少任意一種或其任意組合S298A、K326A、E333A和K334A。
71.與細(xì)胞毒劑或化學(xué)治療劑偶聯(lián)的前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的抗體或多肽。
72.如權(quán)利要求71所述的抗體或多肽，其中所述細(xì)胞毒劑為放射性同位素或毒素。
73.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的抗體或多肽，所述抗體是在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的。
74.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的抗體或多肽，其中所述抗體是單克隆抗體。
75.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的抗體或多肽，其中所述抗體是人源化抗體。
76.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的抗體或多肽，其中所述抗體是人抗體。
77.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的抗體或多肽，所述抗體選自Fab、Fab’、F(ab)’2、單鏈Fv(scFv)、Fv片段；雙抗體和線性抗體。
78.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的抗體或多肽，其中所述抗體是多特異性抗體。
79.編碼前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的抗體或多肽的分離的核酸分子。
80.編碼前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的抗體或多肽的表達(dá)載體。
81.含有權(quán)利要求79所述的核酸分子或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體含有所述核酸分子。
82.如權(quán)利要求81所述的宿主細(xì)胞，其產(chǎn)生前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的抗體或多肽。
83.如權(quán)利要求82所述的宿主細(xì)胞，其為CHO細(xì)胞。
84.產(chǎn)生前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的抗體或多肽的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求81所述的細(xì)胞并從所述細(xì)胞培養(yǎng)中回收所述抗體或多肽。
85.包含前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的BR3結(jié)合抗體或多肽以及載體的組合物。
86.如權(quán)利要求85所述的組合物，其還包含至少一種另外的治療劑，所述治療劑選自細(xì)胞毒劑、化學(xué)治療劑、生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑、免疫抑制劑和抗-CD20抗體。
87.制造的物品，其包含容器和其中所含的組合物，其中所述組合物包含前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的抗體。
88.如權(quán)利要求87所述的制造的物品，其還包含表示所述組合物能夠用于治療疾病的包裝說明書。
89.如權(quán)利要求88所述的制造的物品，其中所述疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、干燥綜合征、多發(fā)性硬化癥、非何杰金氏淋巴瘤、ALL、CLL、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤。
90.治療BR3陽性癌的方法，其包括將治療有效劑量的本發(fā)明的BR3結(jié)合抗體或多肽給予患有所述癌癥的患者。
91.如權(quán)利要求90所述的方法，其中所述BR3結(jié)合抗體或多肽為至少一種選自如下的BR3結(jié)合抗體或多肽權(quán)利要求1-1 8、22-52、66-78中任一權(quán)利要求所述的抗體和多肽，權(quán)利要求19-24中任一權(quán)利要求所述的任一拮抗性BR3結(jié)合抗體或表2中的拮抗性BR3結(jié)合抗體。
92.治療B細(xì)胞瘤的方法，包括將治療有效劑量的本發(fā)明的BR3結(jié)合抗體或多肽給予患有所述瘤的患者。
93.如權(quán)利要求92所述的方法，其中所述BR3結(jié)合抗體或多肽為至少一種選自如下的BR3結(jié)合抗體或多肽權(quán)利要求1-18、25-52和66-78中任一權(quán)利要求所述的抗體和多肽，權(quán)利要求19-24中任一權(quán)利要求所述的任一拮抗性BR3結(jié)合抗體或表2中的拮抗性BR3結(jié)合抗體。
94.治療自身免疫性疾病的方法，包括將治療有效劑量的本發(fā)明的BR3結(jié)合抗體給予患有所述自身免疫性疾病的患者。
95.如權(quán)利要求68所述的方法，其中所述BR3結(jié)合抗體或多肽為至少一種選自如下的BR3結(jié)合抗體或多肽權(quán)利要求1-18、25-52和66-78中任一權(quán)利要求所述的抗體和多肽，權(quán)利要求19-24中任一權(quán)利要求所述的任一拮抗性BR3結(jié)合抗體或表2中的拮抗性BR3結(jié)合抗體。
96.治療癌癥的方法，包括將治療有效劑量的本發(fā)明的BR3結(jié)合抗體給予患有所述癌癥的患者。
97.如權(quán)利要求96所述的方法，其中所述BR3結(jié)合抗體或多肽為至少一種選自如下的BR3結(jié)合抗體或免疫粘附素權(quán)利要求1-18、25-52和66-78中任一權(quán)利要求所述的抗體和免疫粘附素，權(quán)利要求19-24中任一權(quán)利要求所述的任一拮抗性BR3結(jié)合抗體或表2中的拮抗性BR3結(jié)合抗體。
98.將B細(xì)胞從混合的細(xì)胞群中去除的方法，其包括將所述混合的細(xì)胞群與減少B細(xì)胞數(shù)目的有效量的前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的BR3-結(jié)合抗體或多肽接觸。
99.如權(quán)利要求72所述的方法，其中所述BR3結(jié)合抗體或多肽為至少一種選自如下的BR3結(jié)合抗體或多肽權(quán)利要求1-18、25-52和66-78中任一權(quán)利要求所述的抗體和多肽，權(quán)利要求19-24中任一權(quán)利要求所述的任一拮抗性BR3結(jié)合抗體或表2中的拮抗性BR3結(jié)合抗體。
100.從混合的細(xì)胞群中去除B細(xì)胞的方法，包括將所述混合的細(xì)胞群與減少B細(xì)胞數(shù)目的有效量的前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的BR3-結(jié)合抗體或多肽接觸，所述BR3結(jié)合抗體或多肽在人效應(yīng)細(xì)胞存在下具有ADCC效應(yīng)功能或具有增加的ADCC效應(yīng)功能。
101.從混合的細(xì)胞群中去除B細(xì)胞的方法，包括將所述混合的細(xì)胞群與減少B細(xì)胞數(shù)目的有效量的前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的BR3-結(jié)合抗體或多肽接觸，所述BR3結(jié)合抗體或多肽在人效應(yīng)細(xì)胞存在下具有ADCC效應(yīng)功能或具有增加的效應(yīng)功能并阻斷BAFF與細(xì)胞表面上的BR3結(jié)合。
102.如權(quán)利要求90-97中任一權(quán)利要求所述的方法，其還包括將治療有效劑量的抗-CD20抗體順序地或同時(shí)地與所述BR3結(jié)合抗體或多肽進(jìn)行給藥的步驟。
103.如權(quán)利要求98-101中任一權(quán)利要求所述的方法，還包括將所述混合的細(xì)胞群與抗-CD20抗體順序地或同時(shí)地與所述BR3結(jié)合抗體或多肽接觸的步驟。
104.如權(quán)利要求90-97中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述BR3結(jié)合抗體或多肽具有改變的ADCC效應(yīng)功能。
105.如權(quán)利要求101-102中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述BR3抗體阻斷BAFF與細(xì)胞表面上的BR3結(jié)合。
106.如權(quán)利要求101和102所述的方法，其中所述CD20結(jié)合抗體為Rituxan_抗體。
107.如權(quán)利要求90-97中任一權(quán)利要求所述的治療方法，還包括將治療有效劑量的至少一種如下試劑順序或同時(shí)給藥BAFF拮抗劑、生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑、B細(xì)胞去除劑、細(xì)胞毒劑、化學(xué)治療劑和免疫抑制劑。
108.如權(quán)利要求98-101中任一權(quán)利要求所述的方法，還包括將治療有效劑量的至少一種如下試劑順序或同時(shí)給藥BAFF拮抗劑、生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑、B細(xì)胞去除劑、細(xì)胞毒劑、化學(xué)治療劑和免疫抑制劑。
109.如權(quán)利要求107或108所述的方法，其中所述BAFF拮抗劑選自BR3-Fc、TACI-Fc、BCMA-Fc、抗-BAFF肽體(peptibody)、抗-BAFF抗體和抗-BR3抗體。
110.如權(quán)利要求90或92中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述癌癥選自非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、淋巴細(xì)胞為主的何杰金氏病(LPHD)、濾泡性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、ALL、CLL和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤。
111.如權(quán)利要求90-101中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述抗體來源于9.1抗體或V3-1抗體。
112.如權(quán)利要求90-101中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述抗體包含9.1RF的重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO35)。
113.如權(quán)利要求90-101中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述抗體包含V3-46s RF的重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO127)。
114.如權(quán)利要求92所述的方法，其中所述癌癥為非何杰金氏淋巴瘤(NHL)以及所述化學(xué)治療劑選自多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松龍。
115.如權(quán)利要求94所述的方法，其中所述自身免疫性疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、Wegener′s病、炎癥性腸病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板減少癥、多發(fā)性硬化癥、銀屑病、IgA腎病、IgM多發(fā)性神經(jīng)病、重癥肌無力、血管炎、糖尿病、雷諾氏綜合征、干燥綜合征和腎小球腎炎。
116.如權(quán)利要求115所述的方法，其中所述自身免疫性疾病為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
117.如權(quán)利要求108所述的方法，其中所述免疫抑制劑為氨甲喋呤。
118.如權(quán)利要求90-115中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述抗體或多肽與細(xì)胞毒劑或化學(xué)治療劑偶聯(lián)。
119.如權(quán)利要求119所述的方法，其中所述細(xì)胞毒劑為放射性同位素或毒素。
120.如權(quán)利要求90-115中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述BR3結(jié)合抗體與具有野生型IgG Fc的抗體相比，對(duì)人FcRn具有增加的親和性。
121.治療免疫缺陷病的方法，包括將治療有效劑量的激動(dòng)性BR3結(jié)合抗體或多肽給予患有所述免疫缺陷病的患者。
122.如權(quán)利要求90-101和121中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述抗體或多肽來源于2.1抗體。
123.如權(quán)利要求121所述的方法，其中所述抗體包含2.1-46的重鏈可變區(qū)。
124.如權(quán)利要求121所述的方法，其中所述BR3結(jié)合抗體或多肽包含任一SEQ ID NOs 133和135-142的IgG Fc區(qū)。
125.如權(quán)利要求121所述的方法，其中所述BR3結(jié)合抗體或多肽包含具有至少一個(gè)在434處(EU編號(hào)系統(tǒng))替代的人IgG1 Fc區(qū)，所述替代選自N434A、N434F、N4343Y和N434H。
126.如權(quán)利要求125所述的方法，其中所述人IgG1 Fc區(qū)為SEQID NO134，其中X為A、W、F、Y或H。
127.如權(quán)利要求121所述的方法，其中所述激動(dòng)性BR3結(jié)合抗體或多肽與天然的人IgG野生型Fc相比，具有降低的ADCC活性。
128.如權(quán)利要求121所述的方法，其中所述抗體或多肽含有具有D265A/N297A替代(EU編號(hào)系統(tǒng))的人IgG1 Fc序列。
129.如權(quán)利要求121所述的方法，其中所述激動(dòng)性BR3結(jié)合抗體為Hu2.1-46或Hu2.1-46.DANA。
130.如權(quán)利要求90至129中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述BR3結(jié)合抗體為單克隆抗體
131.如權(quán)利要求90至129中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述BR3結(jié)合抗體為人源化抗體。
132.如權(quán)利要求90至129中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述BR3結(jié)合抗體為人抗體。
133.如權(quán)利要求90至129中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述BR3結(jié)合抗體選自Fab、Fab’、F(ab)’2、單鏈Fv(scFv)、Fv片段；雙抗體和線性抗體。
134.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述抗體是多特異性抗體。
135.如權(quán)利要求90至129中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述BR3結(jié)合抗體還包含血清白蛋白結(jié)合肽。
136.分離BR3的方法，其包括將前述權(quán)利要求所述的抗體與BR3接觸并回收所述抗體。
137.液體制劑，其包含在組氨酸緩沖液中的前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的BR3抗體。
138.如權(quán)利要求137所述的液體制劑，其中所述緩沖液是組氨酸醋酸鹽緩沖液。
139.篩選所述B細(xì)胞增殖抑制劑的方法，包括如下步驟
(a)用前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的BR3激動(dòng)性抗體刺激所述B細(xì)胞，
(b)將候選化合物給藥；以及
(c)檢測細(xì)胞增殖。
140.鑒定并監(jiān)測BR3途徑中的下游標(biāo)志物的方法，包括如下步驟
(a)用前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的BR3激動(dòng)性抗體刺激所述B細(xì)胞，以及
(b)檢測所述細(xì)胞中基因表達(dá)的變化。
141.診斷自身免疫性疾病或癌癥的方法，其包括
(a)將來自測試個(gè)體的生物樣品與本發(fā)明的BR3結(jié)合抗體或多肽接觸；
(b)分析所述生物樣品中的BR3多肽水平；以及
(c)將所述生物樣品中的BR3多肽水平與BR3蛋白的標(biāo)準(zhǔn)水平比較；從而與BR3蛋白的標(biāo)準(zhǔn)水平相比，BR3蛋白的存在或BR3蛋白水平的增加預(yù)示著存在待用BR3結(jié)合療法治療的自身免疫性疾病或癌癥。
142.檢測BR3多肽的方法，包括如下步驟在測試樣品或個(gè)體中結(jié)合本發(fā)明所述的抗-BR3抗體或多肽，并將結(jié)合的所述抗體或多肽與對(duì)照抗體或多肽進(jìn)行比較。
143.如權(quán)利要求142所述的方法，其中將所述抗體或多肽用于選自如下的分析中FACS分析、免疫組織化學(xué)分析(IHC)和ELISA分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的BR3結(jié)合抗體和多肽，包括拮抗和激動(dòng)性多肽。本發(fā)明還涉及BR3結(jié)合抗體和多肽的用途，例如在治療方法、篩選方法、診斷方法、測定和蛋白純化方法中的用途。
文檔編號(hào)C07K16/28GK101120021SQ200580044339
公開日2008年2月6日 申請(qǐng)日期2005年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月31日
發(fā)明者柯里斯蒂娜·M·安布魯瓦茲, 梅塞德茲·巴拉日, 勞拉·德福爾熱, 馬克·S·丹尼斯, 熱爾梅娜·富, 斯蒂芬·D·赫斯特, 重偉·V·李, 亨利·B·洛曼, 弗萊維厄斯·馬丁, 杰拉爾德·R·納卡穆拉, 達(dá)亞·塞莎賽義迪, 梅麗莎·斯塔羅瓦斯尼克, 杰弗里·S·湯普森 申請(qǐng)人:基因技術(shù)公司, 拜奧根Idec馬薩諸塞公司