專利名稱：一種利用基因工程手段制備細(xì)菌超抗原的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用基因工程手段制備細(xì)菌超抗原的方法，具體的說，涉及一種利用基因工程手段制備來源于葡萄球菌和鏈球菌的超抗原的方法。
背景技術(shù)：
超抗原(Superantigen，SAg)是一組細(xì)菌或病毒編碼的蛋白分子，可不需要抗原提呈細(xì)胞(APC)處理，以完整的蛋白質(zhì)分子形式直接與APC上的MHC-II類分子抗原結(jié)合槽外側(cè)結(jié)合，導(dǎo)致帶有特異性Vβ節(jié)段T細(xì)胞大量活化增殖，其活化的T細(xì)胞數(shù)是普通抗原的數(shù)千倍乃至數(shù)萬倍。目前研究的超抗原主要是金黃色葡萄球菌腸毒素(SE)，有多個(gè)血清型，分別是SEA、SEB、SEC1-3、SED、SEE、SEG、SEH和SEI。研究的另一比較透徹的超抗原是鏈球菌致熱外毒素(SPE)，分為A、B、C三個(gè)血清型。以上毒素之間有著較高的同源性，且有著類似的空間結(jié)構(gòu)，同屬超抗原家族。如SEB與鏈球菌致熱外毒素的在氨基酸序列上的同源性可以達(dá)到70％以上。
超抗原可以大量激活T細(xì)胞，促其分化成為殺傷力很強(qiáng)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(可殺傷MHC-II類的靶細(xì)胞)及分泌多種細(xì)胞因子，如IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α，這些細(xì)胞因子激活的NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞亦有殺傷作用，因此是潛在的腫瘤免疫治療制劑。
最早的獲得超抗原的方法是困難的。如獲得葡萄球菌腸毒素超抗原的方法是從金葡菌發(fā)酵液中提取，首先進(jìn)行產(chǎn)毒培養(yǎng)，然后進(jìn)行分離純化，但天然毒素產(chǎn)毒量低(多低于100微克/毫升)，因天然產(chǎn)物存在大量雜質(zhì)給后續(xù)的毒素純化帶來極大困難。已有人嘗試?yán)没蚬こ痰氖侄沃苽涑乖虺乖耐蛔凅w，如俞紅等采用原核表達(dá)載體pTrc99A對葡萄球菌B型腸毒素突變體進(jìn)行了基因表達(dá)，但未公布具體的表達(dá)水平(俞紅，錢利生，葡萄球菌B型腸毒素突變體基因表達(dá)和功能的初步研究，中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2001，21(2)200)。時(shí)成波等對葡萄球菌A型腸毒素基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，采用T7啟動(dòng)子載體對SEA進(jìn)行高效表達(dá)。表達(dá)量盡管有所提高，但也僅占全菌蛋白的15％左右(時(shí)成波，呂安國，吳文軍等，生物工程學(xué)報(bào)，2002，18(4)477)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決高活性超抗原獲得困難的問題，本發(fā)明提供了一種利用基因工程手段制備細(xì)菌超抗原的方法。該方法是通過國內(nèi)構(gòu)建的原核表達(dá)載體pBV220(張智清、侯云德、李玉英等，應(yīng)用PRPL串聯(lián)啟動(dòng)子和Cits857調(diào)控基因高效表達(dá)人γ-干擾素，病毒學(xué)報(bào)，1988，4(2)97)實(shí)現(xiàn)的。首先是細(xì)菌超抗原基因的制備，通過設(shè)計(jì)引物，取全菌作為模板，按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得超抗原基因DNA片段。然后是重組表達(dá)載體的構(gòu)建，獲得的超抗原基因經(jīng)酶切后與相同酶切處理的pBV220載體連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，按照常規(guī)方法進(jìn)行熱誘導(dǎo)表達(dá)。重懸菌體，超聲破碎，收集上清，上樣至預(yù)先平衡的弱陽離子交換層析柱，平衡后用線性梯度洗脫并收集相應(yīng)蛋白峰，透析后進(jìn)行蛋白電泳。獲得電泳純的純化產(chǎn)物，即為重組超抗原。
本發(fā)明所述的細(xì)菌超抗原是指來源于葡萄球菌和鏈球菌的超抗原。其中葡萄球菌的超抗原可以是A、B、C1、C2、C3、D、E、G、H或I型葡萄球菌腸毒素，鏈球菌的超抗原是A、B或C型鏈球菌致熱外毒素。
本發(fā)明所述的細(xì)菌超抗原也可以是上述超抗原的一點(diǎn)或多點(diǎn)突變體。
大腸桿菌可以是適合PRPL串聯(lián)啟動(dòng)子表達(dá)的任一種大腸桿菌，優(yōu)選大腸桿菌DH5α。
通過本方法獲得的超抗原表達(dá)量高，從以上列舉的超抗原種類中，我們隨機(jī)選取葡萄球菌A、B和C1型腸毒素，三種超抗原均獲得了高效表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度均占全菌蛋白的40％以上，原核表達(dá)載體pBV220是國內(nèi)構(gòu)建的PRPL串聯(lián)啟動(dòng)子表達(dá)載體，曾對多種人源細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素2、γ-干擾素)進(jìn)行了高效表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度多數(shù)占菌體蛋白的20-30％，但多形成不溶性的包涵體。利用該表達(dá)載體制備超抗原，不僅產(chǎn)量高，而且為可溶性表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物均以可溶性狀態(tài)存在，且具有很好的生物學(xué)活性，與天然提純的超抗原活性相當(dāng)。而且便于后續(xù)分離純化，通過一步弱陽離子交換層析即可獲得電泳純的純化產(chǎn)物。經(jīng)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，10皮克/毫升的重組超抗原即對人肝癌細(xì)胞的生長具有顯著抑制作用。


圖1葡萄球菌腸毒素SEA表達(dá)產(chǎn)物電泳圖譜。泳道1為純化的SEA產(chǎn)物，泳道2為蛋白質(zhì)marker，泳道3為表達(dá)上清，泳道4為表達(dá)沉淀。
圖2葡萄球菌腸毒素SEB表達(dá)產(chǎn)物電泳圖譜。泳道1為表達(dá)上清，泳道2為表達(dá)沉淀，泳道3為純化的SEA產(chǎn)物，泳道4為蛋白質(zhì)marker。
圖3葡萄球菌腸毒素SEC1表達(dá)產(chǎn)物電泳圖譜。泳道1為提純的天然SEC1，泳道2為SEC1的表達(dá)上清。
圖4不同濃度重組SEB的腫瘤細(xì)胞抑制率曲線圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1葡萄球菌腸毒素SEA的制備葡萄球菌腸毒素SEA基因序列的PCR擴(kuò)增以Staphylococcus aureusFRI 100全菌(購于美國ATCC)作為模板，按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下上游引物5’-CG GAA TTC ATG AGC GAG AAA AGC GAAGAA-3’，下游引物5’-CCG GGA TCC TTA ACT TGT ATA TAA ATA-3’。擴(kuò)增獲得720bp的DNA片段。
葡萄球菌腸毒素SEA的表達(dá)以產(chǎn)腸毒素SEA金黃色葡萄球菌為摸板PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)EcoR I/BamH I酶切后與相同酶切處理pBV220的載體連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pBV220-rSEA，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，按照常規(guī)方法進(jìn)行熱誘導(dǎo)表達(dá)。重組蛋白獲得高效表達(dá)，重組蛋白占菌體蛋白的30％以上，且表達(dá)產(chǎn)物主要以可溶狀態(tài)存在。結(jié)果見圖1。
表達(dá)產(chǎn)物的純化用5mM的PB(pH5.6)重懸菌體，超聲破碎后，收集上清，上樣至預(yù)先平衡的CM-Sepharose FF柱，流速5ml/min，平衡液洗至基線，用0.04M的PB(pH7.2)-0.SM NaCl線性梯度洗脫并收集相應(yīng)蛋白峰，透析后進(jìn)行蛋白電泳。獲得電泳純的純化產(chǎn)物，即使重組SEA上樣量達(dá)到50微克，仍然顯示單一條帶。結(jié)果見圖1。
實(shí)施例2葡萄球菌腸毒素SEB的制備葡萄球菌腸毒素SEB基因序列的PCR擴(kuò)增以產(chǎn)SEB的金黃色葡萄球菌S6全菌(購于美國ATCC)作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下上游引物5’-CG GAA TTC ATG GAG AGT CAA CCA GAT CC-3’，下游引物5’-AG GGA TCC TCA CTT TTT CTT TGT CG-3’。擴(kuò)增獲得730bp的DNA片段。
腸毒素SEB的表達(dá)產(chǎn)腸毒素SEB的金黃色葡萄球菌S6標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)毒株為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增約730bp的片段，經(jīng)EcoRI、BamHI酶切后，與相同酶切的pBV220重組，重組的pBV220-rSEB質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中進(jìn)行表達(dá)。重組蛋白獲得高效表達(dá)，重組蛋白占菌體蛋白的40％以上。且表達(dá)產(chǎn)物主要以可溶狀態(tài)存在。結(jié)果見圖2。
表達(dá)產(chǎn)物的純化用5mM的PB(pH5.6)重懸菌體，超聲破碎后，收集上清，上樣至預(yù)先平衡的CM-Sepharose FF柱，流速5ml/min，平衡液洗至基線，用0.04M的PB(pH7.2)-0.5M NaCl線性梯度洗脫并收集相應(yīng)蛋白峰，透析后進(jìn)行蛋白電泳。獲得電泳純的純化產(chǎn)物，即使重組SEB上樣量達(dá)到50微克，仍然顯示單一條帶。結(jié)果見圖2。
實(shí)施例3葡萄球菌腸毒素SEC1的制備葡萄球菌腸毒素SEC1基因序列的PCR擴(kuò)增以Staphylococcus aureus FRI137全菌(購于美國ATCC)作為摸板按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下上游引物5’-CCG GAA TTC ATG GAG AGA CAA CCA GAV CCT-3’，下游引物5’-CGC GGA TCC TTA TCC ATT CTT TGT TGT-3’。擴(kuò)增獲得730bp的DNA片段。
腸毒素SEC1的表達(dá)以產(chǎn)腸毒素SEC的金黃色葡萄球菌137為摸板PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)EcoR I/BamH I酶切后與相同酶切處理pBV220的載體連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pBV220-rSEC，然后轉(zhuǎn)化DH5α，進(jìn)行表達(dá)。重組蛋白獲得高效表達(dá)，重組蛋白占菌體蛋白的30％以上。且表達(dá)產(chǎn)物主要以可溶性狀態(tài)存在。結(jié)果見圖3。
實(shí)施例4重組SEB的超抗原活件測定以BALB/C小鼠的脾淋巴細(xì)胞為靶細(xì)胞，將其懸浮于RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml，接種于24孔板中，每孔1ml，陽性孔加入50ul 100ug/ml ConA，陰性孔加50ul 1640完全培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)孔加入系列濃度的毒素液50ul，37℃5％CO2孵箱培育72h，每孔小心取出0.7ml上清，加入0.7ml不含小牛血清的1640培養(yǎng)液，并每孔加入50μl噻唑藍(lán)(MTT)，繼續(xù)培育4h后，每孔加1ml酸性異丙醇，吹打均勻，于570nm測定吸光值。
結(jié)果表明重組SEB與天然SEB的活性相當(dāng)。
表1超抗原活性測定結(jié)果 實(shí)施例5重組SEB對肝癌細(xì)胞SMMC的生長抑制試驗(yàn)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)基采用含15％小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基。每孔加入5×103個(gè)腫瘤細(xì)胞，然后加入2×105個(gè)淋巴細(xì)胞和系列稀釋的重組SEB，總體積為200μl，在37℃ 5％CO2培養(yǎng)5天。然后采用細(xì)胞增值分析試劑盒分析腫瘤細(xì)胞數(shù)。具體步驟為首先用培養(yǎng)液沖洗三次去除效應(yīng)細(xì)胞，每孔加入1640完全培養(yǎng)基100μl，顯色試劑20μl，繼續(xù)37℃ 5％CO2培養(yǎng)4h，以僅含效應(yīng)細(xì)胞和培養(yǎng)基的孔的吸收值調(diào)零，490nm比色，同時(shí)設(shè)對照，每孔設(shè)復(fù)孔，取平均值。結(jié)果以腫瘤生長抑制率(TGI)表示。TGI(％)＝(1-Atest/Ac)×100。Atest指在效應(yīng)細(xì)胞和不同濃度藥液下生長的腫瘤細(xì)胞的吸收值，Ac指僅在培養(yǎng)液生長的腫瘤細(xì)胞的吸收值。結(jié)果表明效靶比為36∶1，單純效應(yīng)細(xì)胞可顯著抑制SMMC-7721的生長，腫瘤細(xì)胞生長抑制率為33％，在10pg/ml-100μg/ml的濃度范圍內(nèi)，重組SEB可顯著增強(qiáng)淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷效率，腫瘤細(xì)胞生長抑制率為53-90％，結(jié)果見圖4。不加效應(yīng)細(xì)胞，重組SEB即使?jié)舛雀哌_(dá)100μg/ml，也未發(fā)現(xiàn)對腫瘤的生長有抑制現(xiàn)象。
權(quán)利要求
1.一種利用基因工程手段制備細(xì)菌超抗原的方法，其步驟包括(1)細(xì)菌超抗原基因的制備；(2)超抗原基因與原核表達(dá)載體pBV220相連接；(3)含超抗原基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)；(4)表達(dá)后的超抗原的分離純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中細(xì)菌超抗原是指來源于葡萄球菌或鏈球菌的超抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其中葡萄球菌的超抗原是A、B、C1、C2、C3、D、E、G、H或I型葡萄球菌腸毒素。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其中鏈球菌的超抗原是A、B或C型鏈球菌致熱外毒素。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其中葡萄球菌的超抗原是A、B、C1、C2、C3、D、E、G、H或I型葡萄球菌腸毒素的一點(diǎn)或多點(diǎn)突變體，鏈球菌的超抗原是A、B或C型鏈球菌致熱外毒素的一點(diǎn)或多點(diǎn)突變體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于細(xì)菌超抗原基因是通過PCR擴(kuò)增獲得的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于所述大腸桿菌為適合PRPL串聯(lián)啟動(dòng)子表達(dá)的大腸桿菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于所述大腸桿菌為大腸桿菌DH5α。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中超抗原的分離純化采用的方法為弱陽離子交換層析方法。
10.根據(jù)權(quán)利要求9方法，其中的離子交換層析介質(zhì)為CM-Sepharose FF。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用基因工程的手段制備細(xì)菌超抗原的方法，包括以下步驟(1)細(xì)菌超抗原基因的制備；(2)與原核表達(dá)載體pBV220相連接；(3)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)。本發(fā)明所述細(xì)菌超抗原是來源于葡萄球菌和鏈球菌的超抗原。該方法克服了早期從金葡菌發(fā)酵液中提取超抗原產(chǎn)量很低的缺點(diǎn)，所制備的細(xì)菌超抗原與天然超抗原的超抗原活性和免疫學(xué)活性相似，低濃度即表現(xiàn)出良好的抗腫瘤作用。
文檔編號(hào)C07K14/195GK1523106SQ03104629
公開日2004年8月25日 申請日期2003年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月19日
發(fā)明者姜永強(qiáng), 鄭玉玲, 寧保安, 馬茹 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物