一種微生物復(fù)合肥及其制備
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微生物復(fù)合肥，重量份數(shù)組成為：植物乳桿菌混合菌劑8?20份,混合曲霉培養(yǎng)物10?20份，枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物8?15。本產(chǎn)品使用方法簡單，每畝地使用量0.2?0.5公斤，成本僅為80?100元/畝，拌種或生長期灌水前地表噴灑。CGMCC No.940520140702CGMCC NO.1176320151130
【專利說明】
-種微生物復(fù)合肥及其制備
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種復(fù)合肥，屬于農(nóng)用肥料技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 微生物肥的功效發(fā)揮主要是通過對傳統(tǒng)化肥、有機肥的增效作用，對±壤的改良 活化作用，W及微生物的生理作用等方式來實現(xiàn)的。因此，微生物肥料就有了化肥、有機肥、 有益生物菌的多種肥力和功效，是活化肥料養(yǎng)分、提高肥料效果、改良作物品質(zhì)、促進農(nóng)業(yè) 增產(chǎn)增效的理想肥料。微生物肥料是活體肥料，它的作用主要靠它含有的大量有益微生物 的生命活動來完成。只有當運些有益微生物的生命活動來完成。只有當運些有益微生物處 于旺盛的繁殖和新陳代謝的情況下，物質(zhì)轉(zhuǎn)化和有益代謝產(chǎn)物才能不斷形成。因此，微生物 肥料中有益微生物的種類、生命活動是否旺盛是其有效性的基礎(chǔ)，而不像其它肥料是W氮、 憐、鐘等主要元素的形式和多少為基礎(chǔ)。正因為微生物肥料是活制劑，所W其肥效與活菌數(shù) 量、強度及周圍環(huán)境條件密切相關(guān)，包括溫度、水分、酸堿度、營養(yǎng)條件及原生活在±壤中± 著微生物排斥作用都有一定影響。
[0003] 一株產(chǎn)耐高溫a-淀粉酶的枯草芽抱桿菌，申請?zhí)?201310566374.5.本發(fā)明公開了 一株產(chǎn)耐高溫Q-淀粉酶的枯草芽抱桿菌，所述枯草芽抱桿菌(Baci Ilussubti Iis )Li-2013- 02于2013年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、(CGMCC)，保藏 號為CGMCCNo. 7926。該菌株產(chǎn)耐高溫a-淀粉酶的枯草芽抱桿菌Li-2010經(jīng)紫外線-氯化裡- 硫酸二乙醋復(fù)合誘變篩選獲得，該菌株具有強耐酸、耐熱性，產(chǎn)酶活力高的特點，應(yīng)用前景 非常廣闊。一株高產(chǎn)纖維素酶的黑曲霉.申請?zhí)枺?01310571925.7.本發(fā)明公開了一株高產(chǎn) 纖維素酶的黑曲霉，本發(fā)明屬于黑曲霉領(lǐng)域，特別設(shè)及高產(chǎn)纖維素酶的黑曲霉菌株。本發(fā)明 所提供的黑曲霉(Aspergi Ilusniger )，該菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中屯、，保藏編號為CGMCCNo. 7927。發(fā)酵罐實驗跟蹤的各項性能指標表明，該菌株 代謝正常，產(chǎn)纖維素酶能力強，是一株優(yōu)良的纖維素酶高產(chǎn)菌株。
[0004] 由于我國長期在微生物肥料方面研究缺乏投入，使得我國的微生物肥料產(chǎn)業(yè)依然 存在整體水平不高、技術(shù)創(chuàng)新不足、產(chǎn)品質(zhì)量與應(yīng)用效果表現(xiàn)欠穩(wěn)定的問題。在農(nóng)業(yè)可持續(xù) 發(fā)展已成為人類共識的今天，運些問題成了微生物肥行業(yè)函待打通的"瓶頸"。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種微生物復(fù)合肥：
[0006] 重量份數(shù)組成為:植物乳桿菌混合菌劑8-20份，混合曲霉培養(yǎng)物10-20份，枯草芽 抱桿菌培養(yǎng)物8-15;
[0007] 所述混合曲霉培養(yǎng)物的組成及重量份數(shù)如下：黑曲霉培養(yǎng)物5-9份，泡盛曲霉培養(yǎng) 物1-3份；
[000引所述黑曲霉(Aspergillus niger)為CGMCC NO.7927。
[0009]植物乳桿菌混合菌劑組成及重量份數(shù)如下:植物乳桿菌CGMCC 9405菌粉1-2份，植 物乳桿菌CGMCC 11763菌粉5-8份；
[0010] 所述枯草芽抱桿菌培養(yǎng)物制備:從斜面轉(zhuǎn)接培養(yǎng)枯草芽抱桿菌，逐級擴培后的種 子液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)過板框過濾、干燥后獲得枯草芽抱桿菌培養(yǎng)物。
[0011] 植物乳桿菌劑的制備方法:從斜面轉(zhuǎn)接培養(yǎng)植物乳桿菌，逐級擴培后的種子液轉(zhuǎn) 接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)低溫負壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液。添加 載體：向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻;濃縮液與載體的重量比為0.5-0.6:1，載體 組成為:化C〇3 20-30份，糊精10-15份。流化床干燥，干燥溫度50°C。
[0012] 泡盛曲霉培養(yǎng)物制備:菌種培養(yǎng)，固體發(fā)酵培養(yǎng):抱子液接種到米曲霉固態(tài)發(fā)酵培 養(yǎng)料中，26-33 °C培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)料，低溫流化床干燥，粉碎干燥物。
[0013] 黑曲霉培養(yǎng)物制備:菌種培養(yǎng)，采用常見固體發(fā)酵培養(yǎng)方法制備:抱子液接種到固 態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)料中，26-33 °C培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)料，干燥，粉碎干燥物。
[0014] 有益效果
[0015] 本發(fā)明的肥料能夠增強作物的抗旱能力。本發(fā)明的肥料由復(fù)合微生物發(fā)酵而成， 能夠改善±壤的微生態(tài)環(huán)境，為農(nóng)作物的生長提供有益條件。本發(fā)明的肥料能夠改良±壤。 肥料中有益微生物能產(chǎn)生糖類物質(zhì)，占±壤有機質(zhì)的0.1%，與植物粘液，礦物胚體和有機 膠體結(jié)合在一起，可W改善±壤團粒結(jié)構(gòu)，增強±壤的物理性能和減少±壤顆粒的損失，在 一定的條件下，還能參與腐殖質(zhì)形成。所W施用微生物肥料能改善±壤物理性狀，有利于提 高±壤肥力。
[0016] 本產(chǎn)品使用方法簡單，每畝地使用量0.2-0.5公斤，成本僅為80-100元/畝，拌種或 生長期灌水前地表噴灑。
【具體實施方式】
[0017] 下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段 均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的 范圍，本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本 發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，對運些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也 屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0018] 本發(fā)明中植物乳桿菌CGMCC 9405菌株特點如下：在顯微鏡下觀察，該菌株為短桿 狀，革蘭氏染色呈陽性，無鞭毛，不產(chǎn)芽抱;在固體培養(yǎng)基上，該菌菌落為白色，表面光滑，致 密，形態(tài)為圓形，邊緣較整齊。
[0019] 理化特征為:過氧化氨酶(-)，明膠液化(-)，嗎I噪實驗( + )，運動性(-)，發(fā)酵產(chǎn)氣 (-)，亞硝酸鹽還原(-)，發(fā)酵產(chǎn)氣(-)，產(chǎn)硫化氨氣體(-),PH4.0MRS培養(yǎng)基中生長(+ )。
[0020] 本發(fā)明植物乳桿菌采用下述流程進行選育：
[0021] 原始出發(fā)菌種^試管活化^硫酸二乙醋(DES)誘變^亞硝基脈(NTG)誘變^等離 子體誘變^平板初篩^搖瓶復(fù)篩^傳代穩(wěn)定性試驗。
[0022] 本發(fā)明所采用的出發(fā)菌株在MRS葡萄糖培養(yǎng)基中，其乳酸的生產(chǎn)速率為1.5g/L/d, 當培養(yǎng)基pH為3.5時幾乎停止生長，對亞硝酸鋼的分解速率為0.34mg/h/kg白菜。出發(fā)菌株 為李政采集于寧夏鹽池縣育肥羊場的青儲飼料，采集時間2013年9月15日。
[0023] 為了提高其乳酸生產(chǎn)速率、耐酸能力和亞硝酸鹽的分解速率，依次采用DES和NTG 技術(shù)對該菌種進行誘變，誘變后菌株采用MRS碳酸巧平板進行初篩，然后采用500mL搖瓶發(fā) 酵，生物傳感器分析儀對高產(chǎn)菌進行復(fù)篩，選育優(yōu)良的植物乳桿菌菌株，然后做傳代實驗， 評價其遺傳穩(wěn)定性。
[0024] 植物乳桿菌tlj-2014遺傳穩(wěn)定性結(jié)果表明：經(jīng)過連續(xù)傳代十次，各項性能指標都 比較穩(wěn)定，遺傳性較好，性狀沒有回復(fù)，因此把植物乳桿菌tlj-2014作為選育得到的目的菌 株。
[0025] 經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn):該誘變菌株的乳酸生產(chǎn)速率可W達到35g/L/d，該菌株經(jīng)過71小時發(fā) 酵后乳酸濃度達到95g/l;能夠在pH為1.80的條件下存活。降解亞硝酸鹽速度快，分解能力 達到9.8mg/h/kg(自然發(fā)酵過程亞硝酸鹽積累的速率大約為1. Img/h/kg)，能夠耐1%膽鹽。
[0026] 因此采用該菌種生產(chǎn)泡菜，整個發(fā)酵過程中亞硝酸鹽濃度在5mg/kgW下，遠低于 國家標準GB2714-2003中規(guī)定的含量(20mg/kg)。
[0027] 植物乳桿菌(Xactobaci Ilus plantarum) tlj-2014,該菌株已于2014年7月2 日保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、（簡稱CGMCC，地址為：中國北京市朝 陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編：100101),保藏號為CGMCC NO.9405。
[0028] 1. DES誘變選育
[0029] 1)在超凈臺上取試管斜面上的植物乳桿菌L 一環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS(無瓊 月旨，葡萄糖20g/L)培養(yǎng)基的250血S角瓶中，200巧m，37°C培養(yǎng)1化左右，使菌體處于對數(shù)生 長前期。
[0030] 2)取5mL菌液，500化pm離屯、IOmin收集菌體，用生理鹽水洗涂2次。
[0031] 3)用PH7.0憐酸緩沖液稀釋成IO7個/mL菌懸液。
[0032] 4)取32血PH7.0的憐酸鐘緩沖液、SmL菌懸液、0.4mL DES在預(yù)先放入轉(zhuǎn)子的150mL S角瓶中充分混合，使DES最終濃度為1 % (v/v)。
[0033] 5)在37°C搖床中150rpm反應(yīng)30min，取ImL混合液，加入0.5mL 25%化2S2O3溶液中 止反應(yīng)。
[0034] 6)適當稀釋，取最后稀釋度的菌液0.2mL，涂布于碳酸巧篩選培養(yǎng)基(含lOOg/L葡 萄糖的碳酸巧MRS培養(yǎng)基)平皿中。在37°C培養(yǎng)2~3天后，采用影印法將該篩選平板的菌株 轉(zhuǎn)印到抑為1.5、1.8和2.0的LPHMRS培養(yǎng)基(低抑值改性MRS培養(yǎng)基)上和亞硝酸鋼篩選培養(yǎng) 基(單一氮源為2g/L亞硝酸鋼的改性MRS篩選培養(yǎng)基)上。
[0035] 7)在37 °C培養(yǎng)2~3天后，挑選菌落較大，分別能在LPHMRS培養(yǎng)基、亞硝酸鋼篩選培 養(yǎng)基上生長并且在碳酸巧篩選培養(yǎng)基上。經(jīng)初步篩選，挑取出的菌落命名為植物乳桿菌L1。
[0036] 2.亞硝基脈誘變
[0037] 1)在超凈臺上取試管斜面上的植物乳桿菌Ll 一環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS(無瓊 月旨)培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為60g/L)的250血S角瓶中，200巧m，37°C培養(yǎng)1化左右，使菌體處于 對數(shù)生長前期。
[0038] 2)取5mL菌液5000巧m離屯、IOmin收集菌體，用生理鹽水洗涂2次。
[0039] 3)用抑6.0憐酸緩沖液稀釋成IO7個/血菌懸液。
[0040] 4)取10血菌懸液轉(zhuǎn)移至IOOmL^角瓶中，加入IOmg的NTG，配制成終濃度為lOmg/mL 的NTG溶液，并加入4-5滴丙酬，W利于NTG溶解。
[0041 ] 5)在37°C下200rpm振蕩反應(yīng)30min，5000rpm離屯、IOmin收集菌體，用無菌生理鹽水 洗涂數(shù)次，中止反應(yīng)。
[0042] 6)適當稀釋，取最后稀釋度的菌液0.2mL，涂布于碳酸巧篩選培養(yǎng)基(含lOOg/L葡 萄糖的碳酸巧MRS培養(yǎng)基)平皿中。在37°C培養(yǎng)2~3天后，采用影印法將該篩選平板的菌株 轉(zhuǎn)印到抑為1.5、1.8和2.0的LPHMRS培養(yǎng)基(低抑值改性MRS培養(yǎng)基)上和亞硝酸鋼篩選培養(yǎng) 基(單一氮源為2g/L亞硝酸鋼的改性MRS篩選培養(yǎng)基)上。
[0043] 7)挑選菌株方法:挑選菌落較大，分別能在LPHMRS培養(yǎng)基、亞硝酸鋼篩選培養(yǎng)基上 生長并且在碳酸巧篩選培養(yǎng)基上。經(jīng)初步篩選，挑取100支符合W上條件的菌落。
[0044] 3.搖瓶復(fù)篩
[0045] 1)在超凈臺上分別取各試管斜面上的植物乳桿菌一環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS (無瓊脂)培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為lOOg/L)的250mLS角瓶中，200rpm，37°C培養(yǎng)1加左右，使菌 體處于對數(shù)生長中期。
[0046] 2)分別取5mL菌液，接入裝有50mL碳酸巧篩選液體培養(yǎng)基(含250g/L葡萄糖的碳酸 巧MRS培養(yǎng)基)平皿中、抑為1.5、1.8和2.0的LPHMRS液體培養(yǎng)基(低抑值改性MRS培養(yǎng)基）和 亞硝酸鋼液體篩選培養(yǎng)基（單一氮源為2g/L亞硝酸鋼的改性MRS篩選培養(yǎng)基）上（注:采用 250mLS角瓶）。20化pm，37°C培養(yǎng)3-4天，每天分別檢測碳酸巧篩選液體培養(yǎng)基中k乳酸產(chǎn) 生速率、LP麗RS液體培養(yǎng)基中的生物量和亞硝酸鋼液體篩選培養(yǎng)基中亞硝酸鹽的消耗速 率。發(fā)酵結(jié)束后，比較100株菌種的碳酸巧篩選液體培養(yǎng)基中心乳酸產(chǎn)生速率、LP歷RS液體 培養(yǎng)基中的生物量和亞硝酸鋼液體篩選培養(yǎng)基中亞硝酸鹽的消耗速率。
[0047] 3)選擇兼具高k乳酸產(chǎn)生速率、耐受低抑(該菌種僅能在最低為抑1.8的培養(yǎng)基中 生長)和亞硝酸鹽的消耗速率高的菌株，將其命名為L2菌。
[004引 4.遺傳穩(wěn)定性試驗
[0049]將L2菌在斜面上連續(xù)十次傳代，并用搖瓶復(fù)篩的方法檢測每次傳代后的發(fā)酵情 況。實驗發(fā)現(xiàn)，在斜面上連續(xù)十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項性能指標都正常，說 明該菌種的遺傳穩(wěn)定性較強。菌株命名為植物乳桿菌化actobacillus plantarumHlj- 2014。
[(K)加]5.化發(fā)酵罐試驗
[0051] 1)取斜面上的植物乳桿菌L2-環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS(無瓊脂）（葡萄糖濃度 為150g/L)培養(yǎng)基的250mLS角瓶中，200巧m，37°C培養(yǎng)1化左右，使菌體處于對數(shù)生長中期。
[0052] 2)將對數(shù)期的菌種接入裝有化MRS液體培養(yǎng)基(初始葡萄糖為150g/L)的化發(fā)酵 罐中。接種量為10%，37°C下10化pm培養(yǎng)8小時，對數(shù)前期溶氧控制10% (通氣0.化/min)，后 期厭氧培養(yǎng)63小時。發(fā)酵結(jié)束后，植物乳桿菌L2的乳酸產(chǎn)量達到95g/L。運樣的產(chǎn)乳酸速率 利于泡菜的快速發(fā)酵。
[0053] 3)將對數(shù)期的菌種接入裝有化pH為1.8的LPHMRS液體培養(yǎng)基(初始葡萄糖為50g/ L)的化發(fā)酵罐中。接種量為10%，37°C下10化pm培養(yǎng)8小時，對數(shù)前期溶氧控制10 % (通氣 0.化/min)，后期厭氧，整個過程用0.5mol/L的氨氧化鋼將發(fā)酵液抑控制在1.8，總培養(yǎng)時間 為48小時。發(fā)酵結(jié)束后，檢測植物乳桿菌L2的生物量為2.5g/L，說明植物乳桿菌L2能夠在 P化.8的環(huán)境中生存。
[0054] 4)將對數(shù)期的菌種接入裝有化亞硝酸鋼液體篩選培養(yǎng)基(單一氮源為2g/L亞硝酸 鋼的改性MRS篩選培養(yǎng)基）的化發(fā)酵罐中。接種量為10 %，37 °C下10化pm培養(yǎng)8小時，對數(shù)前 期溶氧控制10 % (通氣O.化/min)，后期厭氧，發(fā)酵過程根據(jù)亞硝酸鹽的消耗速率流加20g/L 的亞硝酸鋼溶液，培養(yǎng)2-3天。發(fā)酵結(jié)束后，計算發(fā)酵過程植物乳桿菌L2對亞硝酸鋼的降解 速率。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在該條件下，L2對亞硝酸鋼的降解速率可W達到563mg/h/L。
[0055] 5)將對數(shù)期的菌種IOmL接入裝有化g預(yù)處理過的白菜中，按照傳統(tǒng)泡菜方法進行 加工，每12小時測定泡菜中的亞硝酸鹽含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在整個發(fā)酵過程中，L2菌對亞硝酸 鋼的分解速率為9.8mg/h/kg白菜。泡菜中的亞硝酸鋼含量始終低于5mg/kg，遠低于國家標 準GB2714-2003中規(guī)定的含量(20mg/kg)。
[0化6] 發(fā)明所述植物乳桿菌（LactobaciIlus plantarunOXH于2015年11月30日保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC NO. 11763,保 藏地址為：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101。 [0化7] 植物乳桿菌益生特性如下：
[005引本發(fā)明所提供的植物乳桿菌CGMCC NO. 11763經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)能夠在抑為1.50的條件 下存活，在1 %膽鹽培養(yǎng)4小時后仍處于存活狀態(tài);植物乳桿菌CGMCC NO. 11763降解亞硝酸 鹽速度快，分解能力達到10.9mg/h/kg，該菌種在生產(chǎn)泡菜時，整個發(fā)酵過程中亞硝酸鹽濃 度在4.8mg/kgW下；CGMCC NO. 11763在發(fā)酵60h小時后，對膽固醇降解率可達到64.76%。 CGMCC NO. 11763黏附能力測定的自凝集率為95.71 %。
[0化9] CGMCC NO. 11763對膽固醇降解能力研究和測定：
[0060] 取Iml CGMCC NO. 11763母液接種于IOmL的MRS膽固醇液體培養(yǎng)基（膽固醇含量 O.lmg/ml，抑6.2)中，37°C的恒溫靜置分別培養(yǎng)20h、40h、60h備用，W接入1血無菌水的MRS 膽固醇培養(yǎng)基為對照，取W上培養(yǎng)不同時間的菌液樣品及對照液各lml，9000r/min，4°C下 離屯、lOmin，得到發(fā)酵上清液，鄰苯二甲醒法測定上清液中膽固醇含量(具體為:取各上清液 0 . Iml于相應(yīng)的試管中，加冰醋酸0.3ml，Img/ml的鄰苯二甲醒0.15ml，緩緩加入濃硫酸 1.Oml，混合均勻。室溫靜置IOmin，于550nm下測吸光值）。每一處理3個重復(fù)，W同樣方法制 作膽固醇標準曲線，計算上清液中膽固醇含量及降解率，結(jié)果見表1。可知，CGMCC NO. 11763 對膽固醇有很好的降解作用，在發(fā)酵60h小時后，降解率可達到64.76%。
[0061 ]表1對膽固醇的降解情況
[0062]
[0063] CGMCC NO. 11763菌株的耐膽鹽試驗：
[0064] 取CGMCCN0.11763菌液ImL接種菌種于含有不同膽鹽（含量梯度為0.0%、0.2%、 0.4%、0.6%、0.8%、l%)的10血MRS液體培養(yǎng)基(PH=6.4)，置于37°C下分別培養(yǎng)0、2、4h， 每個處理3個重復(fù)。各取Iml樣品菌液于9ml生理鹽水中混勻，制備稀釋度溶液，取0.1ml稀釋 液于MRS中涂布，于37°C生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48小時(每個稀釋度做3個平行)記錄計算平 板上的菌數(shù)個數(shù)。結(jié)果見表2?？芍摼谀扄}濃度為1 %處理4h后菌的生長量依然達到 0.59±0.92 X 107(cfu/ml)，有很好的耐膽鹽能力。
[0065] 表2耐膽鹽能力檢測[(±s) X 107cfu/ml]
[0066]
[0067] CGMCC NO. 11763菌株的耐酸試驗
[0068] 取CGMCC NO. 11763母液按Iml接種菌種于不同抑值(抑梯度為1.5、2.0、2.5、3.0、 3.5、4.0)的10血MRS液體培養(yǎng)基，置于37°C下分別培養(yǎng)0、2、4h，每一處理3個重復(fù)。各取Iml 樣品菌液于9ml生理鹽水中混勻，制備稀釋溶液，取0.1 ml稀釋液于MRS中涂布，于37 °C生化 培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48小時(每個稀釋度做3個平行)記錄平板上的菌落個數(shù)。結(jié)果見表3。說 明該菌具有很強的耐酸能力。
[0069] 表3耐酸能力檢測[(±s) X 107cfu/ml]
[00701
[0071] CGMCC NO. 11763菌株的黏附能力測定
[0072] 培養(yǎng)CGMCC NO. 11763(MRS液體培養(yǎng)基）、大腸桿菌D冊a(LB液體培養(yǎng)基)24h得發(fā)酵 液，分別置于3000r/min、4°C下離屯、IOmin，收集菌泥，分別用抑=7.0的無菌憐酸鹽緩沖液 (PBS)洗涂菌泥2次（即在菌落中加入PBS，震蕩混合均勻后，置于3000r/min、4°C下離屯、 IOmin，收集菌體）。自凝集率（％ ):用無菌的PBS將菌泥CGMCC NO. 11763制成在波長600皿處 的吸光值為〇.4±0. UA 0)的懸浮菌液及菌懸液，靜置24h后測定吸光值A(chǔ) 24,自凝集率 (%)公式為(4 0-4 24)心0。；他凝集率（％):將〔610：^).11763和大腸桿菌0冊〇的懸菌 液調(diào)節(jié)成在波長600皿處的吸光值為0.6±0.1 (A 0)的混合懸浮菌液。靜置24H后測定吸光 值A(chǔ) 24,他凝集率（％ )公式為(A 0 -A 24VA 0。測定結(jié)果見表4,可知CGMCC NO. 11763的 自凝集率為95.71 %，有很強的黏附能力。
[0073] 表4黏附能力表
[0074]
[00巧]菌株生理特性
[0076] 所述植物乳桿菌(Xactobaci Ilus plantarunOXH于2015年11月30日保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC NO. 11763,保藏地 址為：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101。
[0077] 該菌株特點如下:在顯微鏡下觀察，該菌株為短桿狀，革蘭氏染色呈陽性，無鞭毛， 不產(chǎn)芽抱;在固體培養(yǎng)基上，該菌菌落為白色，表面光滑，致密，形態(tài)為圓形，邊緣較整齊。
[0078] 理化特征為:過氧化氨酶(-)，明膠液化(-)，嗎I噪實驗( + )，運動性(-)，發(fā)酵產(chǎn)氣 (-)，亞硝酸鹽還原(-)，發(fā)酵產(chǎn)氣(-)，產(chǎn)硫化氨氣體(-)，pH4.0MRS培養(yǎng)基中生長(+ )。經(jīng)過 生理生化鑒定為為植物乳桿菌化actobaci Ilus PIantarum)，命名為植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)XH。
[0079] 菌株能夠在57°C下生長良好，葡萄糖耐受能力為275g/L。
[0080] 本發(fā)明植物乳桿菌由采集人李建樹，從新疆維吾爾族老鄉(xiāng)家中酸奶中分離得到， 采集時間2015年6月2日。
[0081 ] 化發(fā)酵罐試驗
[0082] (1)取斜面上的植物乳桿菌CGMCC NO. 11763-環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS(無瓊 脂）（葡萄糖濃度為150g/L)培養(yǎng)基的250mLS角瓶中，200巧m，37°C培養(yǎng)12h左右，使菌體處 于對數(shù)生長中期。
[0083] (2)將對數(shù)期的菌種接入裝有化MRS液體培養(yǎng)基(初始葡萄糖為150g/L)的化發(fā)酵 罐中。接種量為10%，37°C下10化pm培養(yǎng)8小時，對數(shù)前期溶氧控制10% (通氣0.化/min)，后 期厭氧培養(yǎng)63小時。發(fā)酵結(jié)束后，植物乳桿菌CGMCC NO. 11763的乳酸產(chǎn)量達到llOg/L。運樣 的產(chǎn)乳酸速率利于泡菜的快速發(fā)酵。
[0084] (4)將對數(shù)期的菌種接入裝有化亞硝酸鋼液體篩選培養(yǎng)基（單一氮源為2g/L亞硝 酸鋼的改性MRS篩選培養(yǎng)基）的化發(fā)酵罐中。接種量為10%，37°C下10化pm培養(yǎng)8小時，對數(shù) 前期溶氧控制10% (通氣0.化/min),后期厭氧，發(fā)酵過程根據(jù)亞硝酸鹽的消耗速率流加 20g/L的亞硝酸鋼溶液，培養(yǎng)2-3天。發(fā)酵結(jié)束后，計算發(fā)酵過程植物乳桿菌CGMCC NO. 11763 對亞硝酸鋼的降解速率。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在該條件下，XH對亞硝酸鋼的降解速率可W達到653mg/ h/L。
[0085] (5)將對數(shù)期的菌種IOmL接入裝有化g預(yù)處理過的白菜中，按照傳統(tǒng)泡菜方法進行 加工，每12小時測定泡菜中的亞硝酸鹽含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在整個發(fā)酵過程中，XH菌對亞硝酸 鋼的分解速率為l〇.9mg/h/kg白菜。泡菜中的亞硝酸鋼含量始終低于4.8mg/kg，遠低于國家 標準GB2714-2003中規(guī)定的含量(20mg/kg)。
[0086] 本發(fā)明提供的黑曲霉菌株(Aspergillus nige;r)Li-2013-03是由實驗室保藏的一 株產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)的黑曲霉(Aspergillus niger化i-2010經(jīng)多輪亞硝基脈誘變，然后對突變 株逐級篩選淘汰，最后對優(yōu)良菌株經(jīng)發(fā)酵性能測試篩選得到產(chǎn)高活力纖維素酶的黑曲霉菌 株(Aspergillus nigei〇Li-2013-〇3。
[0087] 本發(fā)明提供的產(chǎn)高活力纖維素酶的菌株具體為黑曲霉(Aspergillus nigeiOLi- 2013-03。該菌株已于2013年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 屯、（簡稱CGMCC，地址為：中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編100101)，保藏號為 CGMCC NO.7927O
[0088] 產(chǎn)高活力纖維素酶菌株的篩選方法，包括W下步驟：
[0089] 1)斜面培養(yǎng):將原始黑曲霉菌株(Aspergillus niger化i-2010劃線接種斜面培養(yǎng) 基，3(TC培養(yǎng)2~3d，直至菌絲體成熟、產(chǎn)大量黑色抱子。所述斜面培養(yǎng)基組成如下 麥芽汁1000 mUpH值自然，121°C滅菌20min;
[0090] 2)抱子懸液制備（W下步驟均在無菌條件下操作）：向試管斜面加入15mL無菌水， 把抱子刮下，用濾紙過濾，將濾過液倒入已滅菌、并加有5-10粒無菌玻璃珠的ISOmLS角瓶 中，將立角瓶放入搖床振蕩10-15min，使抱子分散。
[00川 3)亞硝基脈(NTG)誘變
[0092] A.用無菌水將抱子懸浮液調(diào)節(jié)為稀釋成IO6-IO7個/mL。
[0093] B.取10血菌懸液轉(zhuǎn)移至IOOmLS角瓶中，加入IOmg的NTG，配制成終濃度為lOmg/mL 的NTG溶液，并加入4-5滴丙酬，W利于NTG溶解。
[0094] C.在30 °C下200rpm振蕩反應(yīng)30min，SOOOrpm離屯、IOmin收集菌體，用無菌生理鹽水 洗涂數(shù)次，中止反應(yīng)。
[00M] D.適當稀釋將抱子濃度調(diào)節(jié)為IO3個/mL,取最后稀釋度的菌液0.2mL，稀釋涂布于 纖維素-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基上。在30°C培養(yǎng)2~3天后挑取透明圈/菌落直徑較大的菌株 200支。（所述纖維素-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基組成如下:纖維素粉lOg、剛果紅0.2g、硫酸錠 5邑、硫酸儀0.25g、憐酸二氨鐘Ig、氯化鋼O.lg、明膠2g、瓊脂20g、自來水定容1000mL，pH值5- 6，12^C滅菌20min)。
[0096] E.復(fù)篩:將獲得的200株菌分別用無菌牙簽接種于斜面培養(yǎng)基，3(TC培養(yǎng)至抱子鋪 滿斜面。分別將抱子W無菌水洗下接種于裝有50mL復(fù)篩培養(yǎng)基的250mLS角瓶中進行發(fā)酵， 接種量10%(v/v)，3(rC、100r/min培養(yǎng)96h，分別測定各菌株的纖維素酶活性。（所述復(fù)篩培 養(yǎng)基組成如下：纖維素粉50g、硫酸錠5g、硫酸儀0.25g、憐酸二氨鐘Ig、氯化鋼0.1 g、自來水 定容1000 mL, pH值5-6,121°C滅菌20min)。選取纖維素酶酶活力最高的菌株進行放大實驗。
[0097] 4)遺傳穩(wěn)定性試驗
[0098] 將Li-2013-03菌株在斜面上連續(xù)十次傳代，并用搖瓶復(fù)篩的方法檢測每次傳代后 的發(fā)酵情況。實驗發(fā)現(xiàn)，在斜面上連續(xù)十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項性能指標 都正常，說明該菌種的遺傳穩(wěn)定性較強。
[0099] 5)放大試驗
[0100] ①種子培養(yǎng):將纖維素酶酶活力最高的菌株Aspergillus niger Li-2013-03接入 SOOmLS角瓶中，種子培養(yǎng)基裝量100毫升，30°C、150巧m搖床培養(yǎng)72-9化。
[0101] ③種子罐培養(yǎng):將種子液WlO % (v/v)接種量接入裝有7.化發(fā)酵液的IOL發(fā)酵罐 中，控制抑值恒定為6.0 ± 0.2，培養(yǎng)溫度30 ± 0. rC，攬拌速度300巧m，通風量(v/v) 1:0.8- 1.2,培養(yǎng)時間96h，溶解氧20-30%。所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:纖維素粉lOOg、硫酸錠5g、硫酸 儀0.25g、憐酸二氨鐘Ig、氯化鋼O.lg、自來水定容100〇111^9巧直5-6，121°(：滅菌2〇111111。
[0102] 發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵上清液(粗酶液)進行酶活力檢測經(jīng)測定，菌株Aspergillus niger Li-2013-03的外切(6-葡聚糖酶、內(nèi)切(6-葡聚糖酶、(6-葡萄糖巧酶和濾紙酶活力分別 達到620U/mL、1289U/血、45抓/mL和732U/血，分別比出發(fā)菌株Aspergillus nigerLi-2010 提高了9.21倍、7.43倍、8.15倍和10.31倍。
[0103] 本發(fā)明提供的枯草芽抱桿菌(Baci Ilus subtil is化i-2013-02。該菌株已于2013 年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、(簡稱CGMCC，地址為：中 國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號），保藏號為CGMCC No.7926。
[0104] 所述菌株特點如下：
[0105] 所述菌株在固體平板上菌落顏色為乳白色，表面干燥不透明，邊緣整齊，為具有運 動性的好氧菌。鏡檢為長桿狀，革蘭氏染色呈陽性。該菌可利用巧樣酸鹽，硝酸還原、V-P實 驗成陽性。
[0106] 所述枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)Li-2013-02由一株保藏于本實驗室的產(chǎn) 耐高溫Q-淀粉酶的枯草芽抱桿菌Li-2013經(jīng)紫外線-氯化裡-硫酸二乙醋復(fù)合誘變篩選獲 得，具體篩選步驟如下：
[0107] (1)菌懸液的制備
[0108] 將在平板劃線分離后長出的Li-2013單菌落接入種子培養(yǎng)基中，100r/min，40°C培 養(yǎng)1化后，取ImL培養(yǎng)液離屯、后用生理鹽水洗涂兩次，并重懸與9mL生理鹽水中。
[0109] (2)紫外線-氯化裡-硫酸二乙醋復(fù)合誘變
[0110] 將菌懸液置于無菌平板中，在距離為30cm，功率15w的紫外燈下攬拌照射100s。將 經(jīng)過照射的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化裡平板，并W未經(jīng)紫外照射的菌液稀釋涂平板做 對照。將上述涂布均勻的平板，用黑色的布或報紙包好，置4(TC培養(yǎng)4她，在長出菌落的平板 上篩選出水解圈與菌落直徑比值最大者挑至斜面保存，純化后配制成菌懸液，經(jīng)梯度稀釋 后與硫酸二乙醋原液充分混合，并于40°C震蕩處理40min，將處理過的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂 布于氯化裡平板。
[0111] (3)高產(chǎn)菌種的初篩
[0112] 將上述涂布均勻的平板，置4(TC培養(yǎng)4她，在長出菌落的平板上初篩出水解圈與菌 落直徑比值較大者挑至斜面保存，純化后獲得=株菌Li-2013-01，Li-2013-02，Li-2013-03
[0113] (4)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩
[0114] 將獲得的S株菌^-2013-01，^-2013-02，^-2013-03在含有301111^發(fā)酵培養(yǎng)基的 250mL搖瓶中進行搖瓶發(fā)酵，種子接種量10% (V/V)，40°C、lOOr/min培養(yǎng)72h，離屯、取發(fā)酵上 清液制得粗酶液。
[011引（5)酶活測定
[0116]酶活單位的定義：ImL粗酶液，于105°C、pH 4.2條件下，Imin液化Img可溶性淀粉， 即為1個酶活力單位，WlVmL表示。
[0117] 經(jīng)測定，菌株Li-2013-02,為穩(wěn)定的最高產(chǎn)菌株，且酶活達到30000U/mL，比原始菌 株酶活提高1.6倍。
[0118] 所述氯化裡平板：淀粉1 %，蛋白腺1 %，（NH)2S040.4%瓜冊〇4〇. 8%，CaCl2〇. 2%， 氯化裡0.9%，瓊脂2%。
[0119] 所述的種子培養(yǎng)基:酵母粉0.5%，蛋白腺1%，可溶性淀粉1% ,NaCl 1%。
[0120] 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉5%~15%，豆餅粉4%~10%，（NH)2S040.4%， K2HP040.8%，CaC120.2%。
[0121] 所述的搖瓶培養(yǎng)條件：該菌在含有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，接種量10% (V/V)，100r/min、40°C發(fā)酵培養(yǎng)72h。
[0122] 由菌株Li-2013-02發(fā)酵獲得了一種耐高溫的a-淀粉酶，其酶學性質(zhì)如下：
[0123] (1)該酶溫度適應(yīng)范圍較寬，最適作用溫度在1〇5-115°(：之間，且在110°(：^下保存 的溫度穩(wěn)定性較好，而115°C W上保存長時間溫度穩(wěn)定性較差。
[0124] (2)該酶最適反應(yīng)pH值為4.2。在pH值3.0-7.0之間均有較高酶活力，在抑值為3.0 時酶活完全穩(wěn)定。
[0125] (3)酶活性：由本發(fā)明所提供的突變株Li-2013-02,制備的耐高溫a-淀粉酶酶活力 為30000-35000U/ml。
[0126] 1、本發(fā)明使用紫外線-氯化裡-硫酸二乙醋復(fù)合誘變的方法獲得了一株高產(chǎn)耐高 溫曰-淀粉酶的枯草芽抱桿菌Li-2013-02,該菌株具有強耐酸、耐熱性，產(chǎn)酶活力高的特點。
[0127] 2、有該菌株生產(chǎn)所得的耐高溫a-淀粉酶酶活力高達30000-35000u/ml，；適用溫度 范圍為25-115°C，最適反應(yīng)溫度110°C，在110°C酶活完全穩(wěn)定;適用反應(yīng)pH值范圍為3.0- 7.0，在pH值為3.0時酶活完全穩(wěn)定，最適反應(yīng)pH值為4.2，比現(xiàn)有的耐高溫a-淀粉酶酶活力 高，酶作用最適抑值范圍寬泛，耐溫度高，特別適合反應(yīng)溫度高、液化工藝與糖化工藝并存 的工業(yè)化需求。
[012引實施例1
[0129] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種微生物復(fù)合肥：
[0130] 重量份數(shù)組成為:植物乳桿菌混合菌劑16份，混合曲霉培養(yǎng)物18份，枯草芽抱桿菌 培養(yǎng)物10;
[0131] 所述混合曲霉培養(yǎng)物的組成及重量份數(shù)如下：黑曲霉培養(yǎng)物9份，泡盛曲霉培養(yǎng)物 1份；
[0132] 所述黑曲霉(Aspergillus niger)為CGMCC NO.7927。
[0133] 植物乳桿菌混合菌劑組成及重量份數(shù)如下:植物乳桿菌CGMCC 9405菌粉2份，植物 乳桿菌CGMCC 11763菌粉7份；
[0134] 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis subsp)CGMCC7926
[0135] 泡盛曲霉（Aspergillus awamori)CGMCC3.6484
[0136] 泡盛曲霉菌劑的制備方法：
[0137] 技術(shù)方案如下：
[0138] 斜面菌種活化培養(yǎng):將泡盛曲霉斜面菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，27 °C培養(yǎng)3天。
[0139] 固體一級種子培養(yǎng):挑取泡盛曲霉斜面菌種接入裝有100克培養(yǎng)基的500毫升S角 瓶中進行種子培養(yǎng)，30°C培養(yǎng)3天即可。
[0140] 固體二級種子培養(yǎng):將上述培養(yǎng)好的固體一級種子攬拌為碎塊后加入裝有1000克 培養(yǎng)基的5000毫升=角瓶中進行種子培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:3(TC培養(yǎng)3天即可。
[0141] 固體發(fā)酵培養(yǎng):將二級搖瓶種子粉碎，加入裝有滅菌培養(yǎng)基的發(fā)酵池或托盤中混 合均勻后培養(yǎng)，曲料培養(yǎng)溫度控制在26-35°C，濕度80-90%，每隔10小時翻料一次，培養(yǎng)時 間5-7天；固體曲料的培養(yǎng)采用常用曲料培養(yǎng)技術(shù);待培養(yǎng)料長滿菌絲即可結(jié)束培養(yǎng)，培養(yǎng) 基預(yù)先經(jīng)高溫蒸煮滅菌處理，滅菌條件控制溫度i2rc，時間1小時。
[0142] 干燥粉碎:發(fā)酵結(jié)束培養(yǎng)料在流化床或其他干燥設(shè)備上進行干燥，干燥溫度控制 在60°C，干燥到水分含量在10% W下，然后將固體培養(yǎng)料進行粉碎，物料粉碎孔徑在60目W 上。
[0143] 培養(yǎng)基組成：固體原料:教皮80 %，豆餅粉10 %，玉米淀粉10 %，添加等量自來水； 初始抑自然。
[0144] 枯草芽抱桿菌培養(yǎng)物的制備方法：
[0145] 1.發(fā)酵液的獲得:采用斜面菌種逐級擴培獲得枯草芽抱桿菌發(fā)酵液；
[0146] (1)-級種子培養(yǎng):將枯草芽抱桿菌斜面菌種接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100 毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間24小時；
[0147] (2)二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中， 培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0148] (3)=級種子培養(yǎng):將二級種子W10%接種量接入5000毫升=級種子搖瓶中，培養(yǎng) 基裝量1000毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床100轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間24小時；
[0149] (4)-級種子罐培養(yǎng):將S級種子W10%接種量接入總?cè)莘e為15化的一級種子罐， 發(fā)酵培養(yǎng)基裝量IOOL，培養(yǎng)溫度28°C，攬拌速度100轉(zhuǎn)/分，通風量（V/V) 1: 0.5，罐壓 0.05Mpa，培養(yǎng)時間24小時；
[0150] (5)發(fā)酵培養(yǎng):將一級種子罐菌種W10%接種量接入總?cè)莘e為1.5噸二級種子罐， 發(fā)酵培養(yǎng)基裝量1噸，培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度28°C，攬拌速度100轉(zhuǎn)/分，通風量(V/V) 1:0.5，罐壓 0.05Mpa，培養(yǎng)時間24小時。
[0151] 培養(yǎng)基組成:葡萄糖6%，酵母提取物1 %，蛋白腺0.2%，化C031 %，P冊.8。
[0152] 植物乳桿菌劑的制備方法：
[0153] (1)-級種子培養(yǎng):將植物乳桿菌菌種接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升， 培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間24小時；
[0154] (2)二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中， 培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0K5] (3)=級種子培養(yǎng):將二級種子W10%接種量接入5000毫升=級種子搖瓶中，培養(yǎng) 基裝量1000毫升，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間24小時；
[0156] (4)-級種子罐培養(yǎng):將S級種子W5%接種量接入總?cè)莘e為15化的一級種子罐， 發(fā)酵培養(yǎng)基裝量10化，培養(yǎng)溫度30°C，罐壓0.05Mpa，培養(yǎng)時間18小時；
[0157] (5)發(fā)酵罐培養(yǎng):將一級種子罐菌種W5%接種量接入總?cè)莘e為3噸二級種子罐，發(fā) 酵培養(yǎng)基裝量2噸，培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度30°C，罐壓0.05Mpa，培養(yǎng)時間22小時。發(fā)酵完畢發(fā)酵 液經(jīng)低溫負壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液。添加載體：向濃縮液中添加混合好 的載體，混合均勻;濃縮液與載體的重量比為0.5:1，載體組成為:CaO)3 25份，糊精12份。流 化床干燥，干燥溫度50°C。
[0158] 培養(yǎng)基組成為:酪蛋白腺1%，牛肉提取物1%，酵母提取物0.5%，葡萄糖0.5%，乙 酸鋼0.5%，巧樣酸二胺0.2%，1'"6611 80 0.1%，1(2冊04 0.2%，]\1邑504.7肥0 0.02%， MnS04.肥0 0.005%,CaCOS 2%,瓊脂 1.5%,P冊.8。
[0159] 實施例2
[0160] 基本同實施例1
[0161] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種微生物復(fù)合肥：
[0162] 重量份數(shù)組成為:植物乳桿菌混合菌劑20份，混合曲霉培養(yǎng)物10份，枯草芽抱桿菌 培養(yǎng)物8;
[0163] 所述混合曲霉培養(yǎng)物的組成及重量份數(shù)如下：黑曲霉培養(yǎng)物6份，泡盛曲霉培養(yǎng)物 2份；
[0164] 所述黑曲霉(Aspergillus niger)為CGMCC NO.7927。
[0165] 植物乳桿菌混合菌劑組成及重量份數(shù)如下:植物乳桿菌CGMCC 9405菌粉2份，植物 乳桿菌CGMCC 11763菌粉5份；
[0166] 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis subsp)CGMCC7926
[0167] 泡盛曲霉（Aspergillus awamori)CGMCC3.6484
[0168] 產(chǎn)品效果實驗
[0169] 試驗地的選擇與試驗設(shè)計:試驗于2015年在寧夏鹽池縣進行。
[0170] 試驗田旱地田種植玉米10畝，分別在種植時使用本發(fā)明產(chǎn)品每畝0.3公斤，出苗1 個月左右通過働地松±方式使用發(fā)明產(chǎn)品0.2公斤，對照組使用市售微生物肥料。
[0171] 發(fā)明產(chǎn)品使用玉米地玉米產(chǎn)量達到290公斤，對照組達到110公斤。
【主權(quán)項】
1. 一種微生物復(fù)合肥，重量份數(shù)組成為:植物乳桿菌混合菌劑8-20份，混合曲霉培養(yǎng)物 10-20份，枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物8-15。2. 如權(quán)利要求1所述一種微生物復(fù)合肥，其特征在于，所述混合曲霉培養(yǎng)物的組成及重 量份數(shù)如下:黑曲霉培養(yǎng)物5-9份，泡盛曲霉培養(yǎng)物1 -3份。3. 如權(quán)利要求2所述一種微生物復(fù)合肥，其特征在于，所述黑曲霉（Aspergi Ilus niger)為CGMCC N0.7927。4. 如權(quán)利要求1所述一種微生物復(fù)合肥，其特征在于，植物乳桿菌混合菌劑組成及重量 份數(shù)如下:植物乳桿菌CGMCC 9405菌粉1-2份，植物乳桿菌CGMCC 11763菌粉5-8份。5. 如權(quán)利要求1-4任一所述一種微生物復(fù)合肥，一種微生物復(fù)合肥:重量份數(shù)組成為： 植物乳桿菌混合菌劑16份，混合曲霉培養(yǎng)物18份，枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物10份。6. 如權(quán)利要求5所述一種微生物復(fù)合肥，其特征在于，所述混合曲霉培養(yǎng)物的組成及重 量份數(shù)如下：黑曲霉培養(yǎng)物9份，泡盛曲霉培養(yǎng)物1份;所述黑曲霉(Aspergi Ilusniger)為 CGMCC NO.7927〇7. 如權(quán)利要求5所述一種微生物復(fù)合肥，其特征在于，植物乳桿菌混合菌劑組成及重量 份數(shù)如下:植物乳桿菌CGMCC 9405菌粉2份，植物乳桿菌CGMCC 11763菌粉7份。8. 如權(quán)利要求5所述一種微生物復(fù)合肥，其特征在于，枯草芽孢桿菌（Baci Ilus subtilis subsp)CGMCC7926,泡盛曲霉（Aspergillus awamori)CGMCC3.6484〇
【文檔編號】C12R1/125GK105924238SQ201610248607
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月20日
【發(fā)明人】李秉京
【申請人】義烏市錦鈺信息科技有限公司