一種穩(wěn)定的抗vegf抗體制劑及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定的抗VEGF抗體制劑及其用途，具體地，所述制劑包括(i)治療有效量的抗VEGF單克隆抗體；(ii)含100?200mM磷酸鹽緩沖體系；(iii)抗體保護(hù)劑；以及(iv)表面活性劑，其中，所述制劑的pH為5.4?5.65。本發(fā)明的制劑的穩(wěn)定性能夠得到顯著地提高，且制劑中聚合物的含量顯著降低，使得制劑的存放時(shí)間得到有效延長。此外，本發(fā)明還公開了一種穩(wěn)定抗體的方法以及該制劑的用途。
【專利說明】
-種穩(wěn)定的抗VEGF抗體制劑及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地設(shè)及一種穩(wěn)定的抗VEGF抗體制劑及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 治療用抗VEGF單克隆抗體藥物，能夠特異性結(jié)合VEGF-A并抑制VEGF-A與VEGF-R1 和VEGF-R2的結(jié)合，阻斷PI3K-Akt/P邸和Ras-Raf-MEK-E服等信號通路的傳導(dǎo)，抑制血管內(nèi) 皮細(xì)胞的生長、增殖和遷移W及血管新生，降低血管滲透性，阻斷腫瘤組織的血液供應(yīng)，抑 制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡，產(chǎn)生抗腫瘤作用。
[0003] 目前已知的多數(shù)抗VEGF抗體制劑的穩(wěn)定性不高，儲存中易發(fā)生物理變化(例如聚 集和片段化）、化學(xué)變化(例如脫酷胺、氧化），導(dǎo)致聚合物和電荷異構(gòu)體的增多，使得產(chǎn)品的 質(zhì)量一致性和安全性受到潛在影響。因此有必要開發(fā)一種新型抗VEG巧亢體制劑W提高抗體 的穩(wěn)定性，從而提高產(chǎn)品質(zhì)量的均一性和臨床使用安全性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種穩(wěn)定的抗VEGF抗體制劑及其用途。
[0005] 本發(fā)明第一方面提供了一種抗體液體制劑，所述制劑包括：
[0006] (i)治療有效量的抗VEGF單克隆抗體；
[0007] (ii)含100-200mM憐酸鹽緩沖體系；
[000引（iii)抗體保護(hù)劑；W及
[0009] (iv)表面活性劑，
[0010] 其中，所述制劑的抑為5.4-5.65。
[00川在另一優(yōu)選例中，所述抗VEGF單克隆抗體的重鏈區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO.: 1所 /J、- 0
[001^ 在另一優(yōu)選例中，所述抗VEGF單克隆抗體的輕鏈區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO.: 2所 /J、- 0
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述抗VEGF單克隆抗體為貝伐單抗(Bevacizumab)的抗體。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述抗VEGF抗體的濃度為20-30mg/ml，較佳地，22-28mg/ml。
[001引在另一優(yōu)選例中，所述憐酸鹽緩沖液的濃度為100-200mM，較佳地，130-195mM。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述憐酸鹽緩沖液包括憐酸氨二鋼和一水憐酸二氨鋼。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述抗體保護(hù)劑和所述表面活性劑的濃度比為50-300,較佳地， 60-270。
[001引在另一優(yōu)選例中，所述抗VEGF單克隆抗體與所述抗體保護(hù)劑的濃度比為1:1-1:3， 較佳地，1:1.5-1:2.8，更佳地，1:2-1:2.6。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述抗VEGF抗體為單克隆抗體。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述單克隆抗體為全長抗體。
[0021 ]在另一優(yōu)選例中，所述單克隆抗體為IgGl抗體。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述單克隆抗體為人源化抗體。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述單克隆抗體為包含抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述抗體片段為化b或F(ab/ )2片段。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述單克隆抗體結(jié)合VEGF。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述制劑的pH為5.4-5.6，較佳地，5.45-5.55。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述抗體保護(hù)劑選自下組:海藻糖、薦糖、或其組合。
[00%]在另一優(yōu)選例中，所述抗體保護(hù)劑的濃度為40-80mg/ml，較佳地，50-80mg/ml，更 佳地，60-80mg/ml。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述表面活性劑的濃度為0.1-1.5111旨/1111，較佳地，0.2-1111旨/1111， 更佳地，0.4-lmg/ml。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述制劑滲透壓為235-315m0smol/kg。
[0031 ]在另一優(yōu)選例中，所述表面活性劑包括非離子表面活性劑。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述非離子表面活性劑包括吐溫20(TWEEN-20)、吐溫80(TWEEN- 80)、或其組合。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述非離子型表面活性劑包括吐溫20(TWEEN-20)。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述制劑具有選自下組的一種或多種特征：
[0035] (a)所述制劑的多聚體含量< 1 %，較佳地，<0.8 %，更佳地，<0.5 % ;
[0036] (b)所述制劑在2-8°C下保存至少2年，且純度下降的百分比低于2%;
[0037] (C)所述制劑在25°C下保存一個(gè)月，純度下降的百分比低于0.03%，多聚體含量低 于0.5% ;
[003引（d)所述制劑在2-8°C下保存一個(gè)月，純度下降的百分比低于0.01%，多聚體含量 低于0.5%。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述制劑包括：
[0040] (a)20-30mg/ml 抗 VEGF 單克隆抗體；
[0041 ] (b)14-30mg/ml-水憐酸二氨鋼；
[0042] (c)1.4-5mg/ml 憐酸氨二鋼；
[0043] (d)4〇-8〇mg/ml 海藻糖；
[0044] (e)0.1-1.5mg/ml 吐溫 20，
[0045] 并且所述制劑的抑為5.4-5.65。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述制劑包括：
[0047] (a)22-28mg/ml 抗 VEGF 單克隆抗體；
[004引（b)16-28mg/ml-水憐酸二氨鋼；
[0049] (c)1.5-3mg/ml 憐酸氨二鋼；
[(K)加](d)50-80mg/ml 海藻糖；
[0051] (e)0.2-lmg/ml吐溫 20，
[0化2] 并且所述制劑的抑為5.4-5.6。
[0053]在另一優(yōu)選例中，所述制劑包括：
[0054] (a)22-28mg/ml 抗 VEGF 單克隆抗體；
[0055] (b)18-25mg/ml-水憐酸二氨鋼；
[0056] (cH.e-ang/ml 憐酸氨二鋼；
[0化7] (d)50-70mg/ml 海藻糖；
[0化引（e)0.2-lmg/ml吐溫 20，
[0059] 并且所述制劑的抑為5.45-5.55。
[0060]在另一優(yōu)選例中，所述制劑由W下組分構(gòu)成：
[0061 ] (a)20-30mg/ml 抗 VEGF 單克隆抗體；
[0062] (b)14-30mg/ml-水憐酸二氨鋼；
[0063] (c)1.4-5mg/ml 憐酸氨二鋼；
[0064] (d)50-80mg/ml 海藻糖；
[00化](e)0.1-1.5mg/ml 吐溫 20，
[0066] 并且所述制劑的抑為5.4-5.65。
[0067] 在另一優(yōu)選例中，所述制劑由W下組分構(gòu)成：
[0068] (a)22-28mg/ml 抗 VEGF 單克隆抗體；
[0069] (b)16-28mg/ml-水憐酸二氨鋼；
[0070] (c)1.5-3mg/ml 憐酸氨二鋼；
[0071] (d)5〇-7〇mg/ml 海藻糖；
[0072] (e)0.2-lmg/ml 吐溫 20，
[0073] 并且所述制劑的抑為5.4-5.6。
[0074] 在另一優(yōu)選例中，所述制劑由W下組分構(gòu)成：
[00 巧](a)22-28mg/ml 抗 VEGF 單克隆抗體；
[0076] (b)18-25mg/ml-水憐酸二氨鋼；
[0077] (c)1.6-2mg/ml 憐酸氨二鋼；
[007 引（d)60-70mg/ml 海藻糖；
[0079] (e)0.2-lmg/ml 吐溫 20，
[0080] 并且所述制劑的抑為5.45-5.55。
[0081] 本發(fā)明第二方面提供了本發(fā)明第一方面所述制劑的用途，用于制備治療VEGF相關(guān) 性疾病的藥物。
[0082] 在另一優(yōu)選例中，所述的VEGF相關(guān)性疾病指由于VEGF過表達(dá)造成的病理性狀態(tài)， 優(yōu)選地，包括結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和卵巢癌。
[0083] 本發(fā)明第Ξ方面提供了一種藥盒，所述的藥盒含有一容器W及位于所述容器內(nèi)的 本發(fā)明第一方面所述的制劑。
[0084] 在另一優(yōu)選例中，所述的容器的容積為3、5、10、20ml。
[0085] 本發(fā)明第Ξ方面提供了一種制備穩(wěn)定的抗VEGF抗體制劑的方法，包括步驟：
[0086] (a)將治療有效量的抗VEGF抗體、含100-200mM憐酸鹽緩沖體系、抗體保護(hù)劑W及 表面活性劑進(jìn)行混合；
[0087] (b)將混合后的混合物抑值調(diào)整至抑為5.4-5.65;
[008引從而獲得一種穩(wěn)定的抗VEGF抗體制劑。
[0089]在另一優(yōu)選例中，所述穩(wěn)定的抗VEGF抗體制劑具有有選自下組的一種或多種特 征：
[0090] (a)所述制劑的多聚體含量< 1 %，較佳地，<ο. 8 %，更佳地，<ο. 5 % ;
[0091] (b)所述制劑在2-8°C下保存至少2年，且純度下降的百分比低于2%;
[0092] (C)所述制劑在25°C下保存一個(gè)月，純度下降的百分比低于0.03%，多聚體含量低 于0.5% ;
[0093] (d)所述制劑在2-8°C下保存一個(gè)月，純度下降的百分比低于0.01%，多聚體含量 低于0.5%。
[0094] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可W互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【具體實(shí)施方式】
[00M]本發(fā)明人經(jīng)過廣泛深入的研究發(fā)現(xiàn)，抗VEG巧亢體與特定濃度的含一水憐酸二氨鋼 和憐酸二氨鋼的緩沖體系、抗體保護(hù)劑(如海藻糖）、W及表面活性劑(如吐溫20)組成的液 體制劑在抑為5.4-5.65的條件下，制劑的穩(wěn)定性能夠得到顯著提高，且制劑中聚合物的含 量顯著降低，使得制劑的存放時(shí)間得到有效延長。發(fā)明人在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0096] 如本文所用，所述"液體制劑"是指如下形式的制備物，使得容許活性組分的生物 學(xué)活性有效，且不含別的對會施用該制劑的受試者有不可接受的毒性的成分。受試者包括 哺乳動物，優(yōu)選為人。
[0097] 如本文所用，所述"抗體穩(wěn)定性"是指一種抗體在膽藏后基本上保留其物理穩(wěn)定性 和/或化學(xué)穩(wěn)定性和/或生物學(xué)活性。膽藏期一般基于制劑的預(yù)定貨架期來選擇。多種用于 測量抗體穩(wěn)定性的分析技術(shù)是本領(lǐng)域所公知的。
[0098] 可W在選定溫度下用選定時(shí)間測定穩(wěn)定性。優(yōu)選的是，所述制劑在25°C下能穩(wěn)定 至少1個(gè)月和/或在大約2-8°C下穩(wěn)定至少2年，且抗VEGF抗體純度的下降小于2%，多聚體含 量低于1%;
[0099] 如果在通過對顏色和/或透明度進(jìn)行肉眼檢查，或通過UV光散射或通過大小排阻 層析測定時(shí)基本沒有表現(xiàn)出明顯的聚集，沉淀和/或變性的跡象，則制劑中的抗體保持它的 物理穩(wěn)定性。
[0100] 如果在特定時(shí)間化學(xué)穩(wěn)定性使得抗體被認(rèn)為仍然保留了下面所定義的生物學(xué)活 性，則在制劑中，所述抗體保持它的化學(xué)穩(wěn)定性?？蒞通過檢測和定量所述抗體的化學(xué)改變 形式評估化學(xué)穩(wěn)定性。化學(xué)改變可能設(shè)及大小改變(例如，剪切），例如，可W通過采用大小 排阻層析，SDS-PAGE和/或矩陣輔助的激光解析離子化/飛行時(shí)間質(zhì)譜分析(MLDI/TOF MS) 進(jìn)行評估。其他類型的化學(xué)改變包括電荷改變(例如，因?yàn)槊摽岚穼?dǎo)致的改變），例如，可W 通過離子交換層析對它進(jìn)行評估。
[0101] 如果一種制劑中的抗體具有它預(yù)期用途的生物學(xué)活性，則所述抗體在制劑中保持 它的生物學(xué)活性。例如，如果所述制劑中的抗體的生物學(xué)活性為在制備所述制劑時(shí)所表現(xiàn) 出的生物學(xué)活性的大約70%-130%(在測定的誤差范圍內(nèi)）內(nèi)，就認(rèn)為保持了它的生物學(xué)活 性(例如，通過抗原結(jié)合測定確定）。
[0102] 如本文所用，所述"治療有效量"或"有效量"表示在藥理學(xué)含義上，在本發(fā)明的范 圍內(nèi)，在預(yù)防或治療疾病方面的有效量。對于所述疾病的治療來說，所述抗體是有效的。"治 療"表示治療性治療和預(yù)防性或防御性措施。需要治療的受試者包括業(yè)已患有有關(guān)病癥的 受試者，W及需要預(yù)防有關(guān)疾病的受試者。
[0103] 如本文所用，所述"VEGF"是指人血管內(nèi)皮生長因子，基因由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含 子組成，定位于染色體6P21.3,由于外顯子剪切的不同而形成不同的亞型，其中VEGF121、 VEGF165和VEGF189在人類表達(dá)。如Mattei MG，et.al.Genomics 32(1) :168-169所述。腫瘤 組織生長，必須依靠新生血管生成來提供足夠的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)來維持，運(yùn)被認(rèn)為是VEGF 臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)。
[0104] 如本文所用，所述"抗VEGF抗體"是指W足夠親和力和特異性結(jié)合VEGF的抗體。在 某些實(shí)施方案中，所選擇的抗體通常會具有足夠的對VEGF的結(jié)合親和力。抗體親和力可通 過例如基于表面等離振子共振的測定法;酶聯(lián)免疫吸附測定法化LISA)和競爭測定法(例如 RIA)來測定。
[0105] 抗體液體制劑
[0106] 本發(fā)明的抗體液體制劑，主要包括：
[0107] (i)治療有效量的抗VEGF單克隆抗體；
[010引（ii)含100-200mM憐酸鹽緩沖體系；
[0109] (iii)抗體保護(hù)劑；W及
[0110] (iv)表面活性劑。
[0111] 其中，可用于本發(fā)明制劑中的抗VEGF抗體包括單克隆抗體，重組抗體，單鏈抗體， 雜合抗體，嵌合抗體，人源化抗體，或它們的片段。還可W使用包括一個(gè)或兩個(gè)用于結(jié)合抗 原的結(jié)合位點(diǎn)和免疫球蛋白的化-部分的抗體分子。本發(fā)明優(yōu)選為單克隆抗體，本發(fā)明所述 的抗VEGF單克隆抗體可來源 W下文獻(xiàn):Presta.化 al. Cancer Res. 1997.57:4593-4599，CN 1191276C，CN 100480629C，通過本領(lǐng)域所公知的方法進(jìn)行制備，也可W選用其它基因工程 技術(shù)獲得的抗VEGF單克隆抗體。用于本發(fā)明制劑中的優(yōu)選抗體是人源化抗體，主要指鼠源 單克隆抗體W基因克隆及DNA重組技術(shù)改造，重新表達(dá)的抗體，其大部分氨基酸序列為人源 序列取代，基本保留親本鼠單克隆抗體的親和力和特異性，又降低了其異源性，特別優(yōu)選的 人源化抗體是針對抗原VEGF，包括人VEGF的抗體。
[0112] 存在于本發(fā)明制劑中的抗體的治療有效量是通過考慮需要的劑量體積和施用模 式?jīng)Q定的。在本發(fā)明中，抗體的濃度為20-30mg/ml，優(yōu)選22-28mg/ml。本發(fā)明包括使用上述 任意值的組合作為上限和/或下限的值的范圍。
[0113] 用于本發(fā)明制劑中的緩沖體系為包含憐酸氨二鋼和一水憐酸二氨鋼的緩沖體系。 抗體保護(hù)劑沒有特別限制，通常包括了海藻糖、薦糖。本發(fā)明的制劑優(yōu)選是等滲透的。在本 發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體保護(hù)劑為海藻糖，濃度為40-80mg/ml，優(yōu)選為50-80mg/ml，更 優(yōu)選60-80mg/ml。本發(fā)明包括使用上述任意值的組合作為上限和/或下限的值的范圍。
[0114] 本發(fā)明制劑中的表面活性劑優(yōu)選非離子表面活性劑，如吐溫20(TWEEN-20)、吐溫 80(TWEEN-80)。所添加的表面活性劑的量使其能減少制劑中的抗體的聚集和/或減少顆粒 在制劑中的形成和/或減少吸附。在本發(fā)明的優(yōu)選的表面活性劑為吐溫20。在一優(yōu)選的實(shí)施 方案中，吐溫20的濃度為0.1-1.5mg/ml，優(yōu)選為0.2-lmg/ml，更優(yōu)選0.4-lmg/ml。本發(fā)明包 括使用上述任意值的組合作為上限和/或下限的值的范圍。
[0115] 本發(fā)明通過緩沖體系來調(diào)節(jié)制劑的pH值，W控制pH在5.4-5.65的范圍內(nèi)，在某些 實(shí)施方案中，制劑的抑處于5.4至5.65、5.4至5.6、5.45-5.55之間，本發(fā)明包括使用上述任 意值的組合作為上限和/或下限的值的范圍。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，制劑抑為5.5。
[0116] 應(yīng)理解，本發(fā)明的緩沖體系除包括憐酸氨二鋼和一水憐酸二氨鋼W外，還可進(jìn)一 步包括一種或多種其他緩沖組分，通過與其他緩沖組分的組合將制劑的pH值控制在上述范 圍。適合的其他緩沖組分包括組氨酸鹽、巧樣酸鹽、憐酸鹽、班巧酸鹽(例如班巧酸鋼)等。
[0117] 本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，緩沖體系優(yōu)選憐酸氨二鋼和一水憐酸二氨鋼，其中憐 酸氨二鋼濃度為1.4-5mg/ml，優(yōu)選為1.5-3mg/ml，； 一水憐酸二氨鋼濃度為14-30mg/ml，優(yōu) 選為16-28mg/ml，。本發(fā)明包括使用上述任意值的組合作為上限和/或下限的值的范圍。在 另一種實(shí)施方案中，所述制劑的抑是用巧樣酸、乙酸或憐酸等無機(jī)酸調(diào)節(jié)的。
[0118] 此外，發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)的試驗(yàn)，對各類緩沖體系的組分及含量進(jìn)行了大量的篩選， 并最終從大量的緩沖體系中篩選得到了本發(fā)明的憐酸鹽緩沖體系，并且發(fā)現(xiàn)在該體系中， 抗體蛋白的穩(wěn)定性明顯提高。當(dāng)本發(fā)明制劑中憐酸氨二鋼和一水憐酸二氨鋼的濃度之比低 于0.06時(shí)，緩沖體系的緩沖能力將受到明顯的限制，當(dāng)憐酸鹽緩沖液的濃度高于200mM時(shí)， 對制劑穩(wěn)定性并無提高作用。
[0119] 本發(fā)明的制劑中可包括一種或多種其它藥學(xué)可接受載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，諸如 那些在Remington's PharmaceuticalSciences 16th edition,0sol,A.Ed. (1980)中記載 的，只要它們對制劑的期望特征沒有不利影響?？山邮茌d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑 量和濃度對接受者是無毒的，而且包括別的共溶劑;抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸； 整合劑，諸如EDTA;金屬復(fù)合物（例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物）；生物可降解聚合物，諸如聚醋； 和/或成鹽反荷離子。
[0120] 本發(fā)明的制劑可采用本領(lǐng)域公知的方法將各種組分按一定的濃度進(jìn)行組合制備。
[0121] -類優(yōu)選的方法主要包括W下步驟：
[0122] 用叫化acel-30K超濾離屯、管將抗VEGF單克隆抗體通過離屯、（4500rpm，4-10°C)濃 縮換液至不同制劑緩沖液中，用制劑緩沖液將蛋白濃度調(diào)整到所需濃度。采用〇.22μπι Millex針頭濾器將制劑過濾除菌。對所制備的制劑進(jìn)行包裝W方便使用，選用的包材可W 是玻璃瓶。
[0123] 本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺蒞任意組合。本案說明書所掲示 的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所掲示的各個(gè)特征，可W被任何提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所掲示的特征僅為均等或相似特 征的一般性例子。
[0124] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：
[0125] 1.本發(fā)明的制劑能夠顯著降低多聚體含量（多聚體含量低于1%，較佳地，低于 0.5% )，且能夠顯著提高抗體的穩(wěn)定性，降低潛在的安全性風(fēng)險(xiǎn)。
[01 %] 2.本發(fā)明的制劑在2-8°C或25 °C下放置至少1個(gè)月后的純度依舊高達(dá)97.7-98 %， 其多聚體含量極低，低于0.5%，因此可顯著延長產(chǎn)品的貨架期。
[0127] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，運(yùn)些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0128] 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中 所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0129] SEC-HPLC 測試方法
[0130] 1)蛋白含量測定
[0131 ]方法:紫外-可見分光光度法
[0132] 檢測波長:280nm
[0133] 計(jì)算方法:吸收系數(shù)法化=1.7)
[0134] 2)純度檢測
[01巧]方法:分子篩排阻色譜法(SEC-HPLC)
[0136] 色譜條件：
[0137] a.流動相配制：
[0138] 取憐酸二氨鐘13.6032旨（0.1111〇1幾），硫酸鋼21.3021旨（0.15111〇1幾），精氨酸 34.8467(0.2mol/L)g加純化水1000ml用憐酸調(diào)PH值至7.0搖勻過濾即得。
[0139] b.檢測波長:280nm，流速 0.8ml/min
[0140] C.檢測:直接取樣品進(jìn)樣30ul，記錄色譜圖
[0141] d.色譜柱：TSKgel TSKel G3000SWXL(5)7.8*300
[0142] 純度測定法:面積歸一化法。
[0143] 抗體制備
[0144] 用CD19真核重組蛋白抗原分別免疫雌性健康的BALB/c小鼠，挑選出血清化ISA， WB，F(xiàn)C檢測呈陽性的小鼠，對其提取脾臟細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞;將雜交 瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對高通量流式篩選呈陽性的單克隆細(xì)胞進(jìn)行化ISA復(fù)篩，獲得 陽性克隆30多株，再進(jìn)行WB復(fù)篩，獲得陽性克隆9株，對WB陽性細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，經(jīng)過2次亞 克隆，排除亞克隆過程中返陰細(xì)胞株，最終篩選出能夠穩(wěn)定分泌抗VEGF的單克隆抗體的單 克隆細(xì)胞3株;運(yùn)用亞型鑒定試劑盒，鑒定單克隆抗體的亞型。
[0145] 對上述獲得的單克隆抗體的編碼序列進(jìn)行測序。經(jīng)測定，一株抗VEGF單克隆抗體 的序列如下：
[0146] 重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.: 1所示：
[0152] 經(jīng)活性測定和分子量測定，結(jié)果表明，該抗VEGF單克隆抗體的特性與貝伐單抗相 同，故用于W下實(shí)施例1-5和對比例1-4。
[0153] 實(shí)施例1
[0154] 制劑中各組分與含量如表1所示：
[0155] 表1
[0156]
[0157] 實(shí)施例2
[0158] 制劑中各組分與含量如表2所示：
[0159] 表2
[0160]
[0161] ~實(shí)施例3
' '
[0162] 制劑中各組分與含量如表3所示：
[0163] 表3
[0164]
[01化]對比例1
[0166] 制劑中各組分與含量如表3a所不：
[0167] 表3a
[016 引
[0169]
[0170] 對比例2
[0171] 制劑中各組分與含量如表3b所示：
[0172] 表3b
[0173]
[0183]結(jié)果顯示，實(shí)施例1的制劑在長期2-8°C和加速25°C下存放一個(gè)月后，本發(fā)明制劑 中的抗體純度沒有損失或損失很少，多聚體含量極低，低于ο. 5%。
[0184] 并且，實(shí)施例2與3的制劑在長期2-8°C和加速25°C下存放一個(gè)月后，其抗體純度沒 有損失或損失很少，多聚體含量也極低，低于0.5%。
[0185] 結(jié)果表明，本發(fā)明的制劑具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。
[0186] 實(shí)施例5本發(fā)明的制劑與對比例制劑的穩(wěn)定性比較
[0187] 5.1對實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3和對比例1、對比例2、對比例3、對比例4的制劑分 別進(jìn)行SEC檢測，判斷制劑中多聚體含量的變化，測試結(jié)果如表4所示。
[0188] 表4多聚體含量的變化結(jié)果
[0189]
[0190] 結(jié)果顯示，本發(fā)明實(shí)施例1-3的多聚體含量顯著低于對比例1-4,且穩(wěn)定性較好。對 比例1(抑5.3)中多聚體含量的下降可能是由于緩沖體系的緩沖能力過弱從而使存放過程 中的pH發(fā)生改變而造成的。結(jié)果表明，本發(fā)明的制劑中的多聚體含量更低且更加穩(wěn)定。
[0191 ] 5.2對實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3和對比例1、對比例2的制劑分別進(jìn)行SEC檢測，判 斷制劑中抗體純度的變化，測試結(jié)果如表5所示。
[0192] 表5抗體純度的變化結(jié)果
[0193]
[0194] 結(jié)果顯示，本發(fā)明實(shí)施例1-3的抗體純度顯著高于對比例1-2。
[01M]本發(fā)明的制劑在放置1個(gè)月后，其抗體純度的下降程度明顯低于對比例1-2中抗體 純度的下降值。因此，本發(fā)明制劑具有更好的穩(wěn)定性。
[0196]在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 w對本發(fā)明作各種改動或修改，運(yùn)些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗體液體制劑，其特征在于，所述制劑包括： (i) 治療有效量的抗VEGF單克隆抗體； (ii) 含100-200mM磷酸鹽緩沖體系； (iii) 抗體保護(hù)劑；以及 (iv) 表面活性劑， 其中，所述制劑的pH為5.4-5.65。2. 如權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于，所述抗VEGF抗體的濃度為20-30mg/ml，較佳 地，22_28mg/ml。3. 如權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于，所述制劑的pH為5.4-5.6，較佳地，5.45-5.55。4. 如權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于，所述抗體保護(hù)劑選自下組:海藻糖、鹿糖、或 其組合。5. 如權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于，所述抗體保護(hù)劑的濃度為40-80mg/ml，較佳 地，50-80mg/ml，更佳地，60-80mg/ml。6. 如權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于，所述表面活性劑的濃度為O . 1-1.5mg/ml，較 佳地，O · 2-lmg/ml，更佳地，O · 4-lmg/ml。7. 如權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于，所述制劑具有選自下組的一種或多種特征： (a) 所述制劑的多聚體含量< 1 %，較佳地，<0.8 %，更佳地，<0.5 % ; (b) 所述制劑在2-8°C下保存至少2年，且純度下降的百分比低于2%; (c) 所述制劑在25°C下保存一個(gè)月，純度下降的百分比低于0.03%，多聚體含量低于 0.5% ； (d) 所述制劑在2-8°C下保存一個(gè)月，純度下降的百分比低于0.01%，多聚體含量低于 0.5%〇8. 如權(quán)利要求1所述制劑的用途，其特征在于，所述制劑用于制備治療VEGF相關(guān)性疾病 的藥物。9. 一種藥盒，其特征在于，所述的藥盒含有一容器以及位于所述容器內(nèi)的權(quán)利要求1所 述的制劑。10. -種制備穩(wěn)定的抗VEGF抗體制劑的方法，其特征在于，包括步驟： (a) 將治療有效量的抗VEGF抗體、含100-200mM磷酸鹽緩沖體系、抗體保護(hù)劑以及表面 活性劑進(jìn)行混合； (b) 將混合后的混合物pH值調(diào)整至pH為5.4-5.65; 從而獲得一種穩(wěn)定的抗VEGF抗體制劑。
【文檔編號】A61K39/395GK105920600SQ201610244018
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月19日
【發(fā)明人】付德麗, 李春澍, 付愛玲, 孫海勝, 邱永鋒, 楊君, 張磊, 鐘慧麗, 周雪
【申請人】上海景澤生物技術(shù)有限公司