生物相容性高分子多孔體的制造方法、生物相容性高分子多孔體、生物相容性高分子塊體 ...的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種生物相容性高分子多孔體的制造方法、生物相容性高分子多孔 體、生物相容性高分子塊體及細(xì)胞構(gòu)建體。詳細(xì)而言，本發(fā)明設(shè)及一種能夠制造顯示較高的 細(xì)胞數(shù)量及較高的血管數(shù)量的細(xì)胞構(gòu)建體的生物相容性高分子多孔體及其制造方法、W及 由所述生物相容性高分子多孔體得到的生物相容性高分子塊體及細(xì)胞構(gòu)建體。
【背景技術(shù)】
[0002] 幫助陷入功能障礙和功能不全的生物組織、器官再生的再生醫(yī)療的實際應(yīng)用目前 正在進行中。再生醫(yī)療是新的醫(yī)療技術(shù)，其使用細(xì)胞、支架及生長因子運=種因子來使生物 組織恢復(fù)與原組織相同的形式和功能，所述生物組織無法僅通過活體所具有的自然治愈能 力來恢復(fù)。近年來，已經(jīng)逐漸實現(xiàn)使用細(xì)胞的治療。例如，可W舉出使用自體細(xì)胞的培養(yǎng)表 皮、使用自體軟骨細(xì)胞的軟骨治療、使用間充質(zhì)干細(xì)胞的骨再生治療、使用成肌細(xì)胞的屯、肌 細(xì)胞片治療、使用角膜上皮片的角膜再生治療、W及神經(jīng)再生治療等。運些新的治療與現(xiàn)有 的使用人造材料的代替醫(yī)療(例如，人工骨修補劑、透明質(zhì)酸注射等)不同，是幫助生物組織 的修復(fù)與再生的技術(shù)，可得到較高的治療效果。實際上，使用自體細(xì)胞的培養(yǎng)表皮、培養(yǎng)軟 骨等產(chǎn)品已有銷售。
[0003] 例如，在使用細(xì)胞片的屯、肌再生中，為了使有厚度的組織再生，認(rèn)為需要細(xì)胞片的 多層構(gòu)建體。
[0004] 另外，專利文獻1及專利文獻2中記載有通過W鑲嵌狀=維配置具有生物相容性的 高分子塊體和細(xì)胞來制造的細(xì)胞=維構(gòu)建體。在該細(xì)胞=維構(gòu)建體中，能夠從外部向細(xì)胞 =維構(gòu)建體的內(nèi)部遞送營養(yǎng)，具有充分的厚度，并且細(xì)胞在構(gòu)建體中均勻地存在。并且，專 利文獻1的實施例中，使用由重組明膠或天然明膠材料構(gòu)成的高分子塊體證實了較高的細(xì) 胞生存活性，專利文獻2中公開有移植細(xì)胞=維構(gòu)建體之后能夠在移植部位形成血管。
[000引 W往技術(shù)文獻
[0006] 專利文獻
[0007] 專利文獻1:國際公開W02011/108517號公報
[0008] 專利文獻2:美國專利申請公開第2013/071441號說明書
[0009] 發(fā)明的概要
[0010] 發(fā)明要解決的技術(shù)課題
[0011] 專利文獻1及2中所公開的細(xì)胞=維構(gòu)建體顯示較高的細(xì)胞生存活性及血管形成 能力，但期待顯示更高的細(xì)胞生存活性及血管形成能力的生物相容性高分子塊體及細(xì)胞構(gòu) 建體。
[0012] 因此，本發(fā)明所要解決的課題在于提供一種可W提供顯示較高的細(xì)胞數(shù)量及較高 的血管數(shù)量的細(xì)胞構(gòu)建體的生物相容性高分子多孔體及其制造方法。另外，本發(fā)明的課題 在于提供一種由所述生物相容性高分子多孔體得到的生物相容性高分子塊體及細(xì)胞構(gòu)建 體。
[0013] 用于解決技術(shù)課題的手段
[0014] 本發(fā)明人等為了解決上述課題而進行了深入研究，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過W下工序制造 的生物相容性高分子多孔體中，多孔氣孔的大小偏差較小，即多孔體的結(jié)構(gòu)均勻性較高： (a)將生物相容性高分子的溶液冷卻成未冷凍狀態(tài)的工序，其中，溶液中液溫最高的部分的 溫度與溶液中液溫最低的部分的溫度之差為2.5°C W下，且溶液中液溫最高的部分的溫度 為溶劑的烙點W下；（b)對工序(a)中所得到的生物相容性高分子的溶液進行冷凍的工序； 及(C)對工序(b)中所得到的冷凍的生物相容性高分子進行冷凍干燥的工序。并且，本發(fā)明 人等發(fā)現(xiàn)使用如此得到的生物相容性高分子多孔體來制造的細(xì)胞構(gòu)建體顯示較高的細(xì)胞 數(shù)量及較高的血管數(shù)量。本發(fā)明是基于運些見解而完成的。
[0015] 目P，根據(jù)本發(fā)明，提供一種生物相容性高分子多孔體的制造方法，所述制造方法包 含：
[0016] (a)將生物相容性高分子的溶液冷卻成未冷凍狀態(tài)的工序，其中，溶液中液溫最高 的部分的溫度與溶液中液溫最低的部分的溫度之差為2.5°C W下，且溶液中液溫最高的部 分的溫度為溶劑的烙點W下；
[0017] (b)對工序(a)中所得到的生物相容性高分子的溶液進行冷凍的工序;及
[0018] (C)對工序(b)中所得到的冷凍的生物相容性高分子進行冷凍干燥的工序。
[0019] 優(yōu)選在工序(a)中，即將產(chǎn)生凝固熱之前的溶液中液溫最高的部分的溫度與溶液 中液溫最低的部分的溫度之差為2.5 °C W下。
[0020] 優(yōu)選在工序(a)中，溶液中液溫最低的部分的溫度為溶劑烙點-5°C W下。
[0021 ]根據(jù)本發(fā)明，還提供一種通過本發(fā)明的生物相容性高分子多孔體的制造方法來制 造的生物相容性高分子多孔體。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明，還提供一種生物相容性高分子多孔體，其中，對于通過對生物相容性 高分子多孔體的剖面結(jié)構(gòu)的圖像的1.5mm見方視場實施二維傅立葉變換而得到的二維傅立 葉變換圖像制作譜線輪廓時，在譜線輪廓上的X的最大值的一半的位置不存在峰值，所述譜 線輪廓是從二維傅立葉變換圖像的y軸下端開始，對于圖像像素尺寸的10分之1像素寬度， 將X軸坐標(biāo)周邊的亮度值進行平均并繪制在y軸上而得到的。該生物相容性高分子多孔體優(yōu) 選通過本發(fā)明的生物相容性高分子多孔體的制造方法來進行制造。
[0023] 優(yōu)選將譜線輪廓的基本偏差值設(shè)為O時，將在譜線輪廓上的X的最大值的一半的位 置檢測不到2. Oo W上的峰值的情況視為不存在峰值。
[0024] 優(yōu)選生物相容性高分子為明膠、膠原、彈性蛋白、纖連蛋白、Pronectin、層粘連蛋 白、腫生蛋白、纖維蛋白、絲蛋白、巢蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、Retro化ctin、聚乳酸、聚乙醇 酸、乳酸-乙醇酸共聚物、透明質(zhì)酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、軟骨素、纖維素、瓊脂糖、簇甲基纖 維素、甲殼素、或殼聚糖。
[002引優(yōu)選生物相容性高分子為重組明膠。
[0026] 優(yōu)選重組明膠由下式表示。
[0027] 式:A-[(Gly-X-Y)n]m-B
[0028] (式中，A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列，n個X分 別獨立地表示氨基酸中的任意一種，n個Y分別獨立地表示氨基酸中的任意一種，n表示3~ 100的整數(shù)，m表示2~10的整數(shù)。另外，n個Gly-X-Y可W分別相同也可W不同。）。
[0029 ]優(yōu)選重組明膠為W下中的任意一種：
[0030] (a)具有序列號1所記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
[0031] (b)具有在序列號1所記載的氨基酸序列中缺失、取代或附加了一個或多個氨基酸 的氨基酸序列且具有生物相容性的蛋白質(zhì);或
[0032] (C)具有與序列號1所記載的氨基酸序列具有80% W上的同源性的氨基酸序列且 具有生物相容性的蛋白質(zhì)。
[0033] 優(yōu)選重組明膠為具有與序列號1所記載的氨基酸序列具有90% W上的同源性的氨 基酸序列且具有生物相容性的蛋白質(zhì)。
[0034] 優(yōu)選重組明膠為具有與序列號1所記載的氨基酸序列具有95% W上的同源性的氨 基酸序列且具有生物相容性的蛋白質(zhì)。
[0035] 優(yōu)選多孔體中的生物相容性高分子通過熱、紫外線或酶進行交聯(lián)。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明，還提供一種生物相容性高分子塊體，其通過粉碎本發(fā)明的生物相容 性高分子多孔體來得到。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明，還提供一種細(xì)胞構(gòu)建體，其含有:本發(fā)明的生物相容性高分子塊體； 及至少一種細(xì)胞，并且在多個細(xì)胞間的間隙中配置有多個生物相容性高分子塊體。
[0038] 優(yōu)選一個生物相容性高分子塊體的大小為20皿W上且200皿W下。
[0039] 優(yōu)選一個生物相容性高分子塊體的大小為50皿W上且120皿W下。
[0040] 優(yōu)選本發(fā)明的細(xì)胞構(gòu)建體的厚度或直徑為400mW上且3cmW下。
[0041 ]優(yōu)選本發(fā)明的細(xì)胞構(gòu)建體中，相對于一個細(xì)胞，包含0.000000Iyg W上且化gW下 的生物相容性高分子塊體。
[0042] 優(yōu)選本發(fā)明的細(xì)胞構(gòu)建體含有血管生成因子。
[0043] 優(yōu)選細(xì)胞為選自多能細(xì)胞、體干細(xì)胞、前體細(xì)胞及成熟細(xì)胞中的細(xì)胞。
[0044] 優(yōu)選細(xì)胞僅為非血管系細(xì)胞。
[004引優(yōu)選細(xì)胞包含非血管系細(xì)胞及血管系細(xì)胞運兩者。
[0046] 優(yōu)選在細(xì)胞構(gòu)建體中具有中屯、部的血管系細(xì)胞的面積大于周邊部的血管系細(xì)胞 的面積的區(qū)域。
[0047] 優(yōu)選具有中屯、部的血管系細(xì)胞的比例相對于血管系細(xì)胞的總面積為60%~100% 的區(qū)域。
[0048] 優(yōu)選具有細(xì)胞構(gòu)建體的中屯、部的血管系細(xì)胞密度為1.0 X ICT4CelIs/皿3 W上的區(qū) 域。
[0049] 優(yōu)選在細(xì)胞構(gòu)建體的內(nèi)部形成有血管。
[0050] 發(fā)明效果
[0051] 通過使用生物相容性高分子多孔體來制造的細(xì)胞構(gòu)建體在細(xì)胞構(gòu)建體中能夠顯 示較高的細(xì)胞數(shù)量及較高的血管數(shù)量，所述生物相容性高分子多孔體通過本發(fā)明的生物相 容性高分子多孔體的制造方法來進行制造。根據(jù)由本發(fā)明提供的細(xì)胞構(gòu)建體，能夠進行更 有效的細(xì)胞移植治療。
【附圖說明】
[0052] 圖I表示"A"中所記載的實驗的液溫輪廓。
[0053] 圖2表示"B"中所記載的實驗的液溫輪廓。
[0054] 圖2表示"護中所記載的實驗的液溫輪廓。
[0055] 圖4表示"護中所記載的實驗的液溫輪廓。
[0056] 圖5表示"護中所記載的實驗的液溫輪廓。
[0057] 圖6表示"F"中所記載的實驗的液溫輪廓。
[0058] 圖7表示"AA"中所記載的實驗的液溫輪廓。
[0059] 圖8表示"BB"中所記載的實驗的液溫輪廓。
[0060] 圖9表示"A"及"B"中所得到的CBE3多孔體的均勻性評價仁維傅立葉變換與軸向 功率譜）。
[0061] 圖10表示"C"及"護中所得到的CBE3多孔體的均勻性評價仁維傅立葉變換與軸向 功率譜）。
[00叫圖11表示"護及"F"中所得到的CBE3多孔體的均勻性評價仁維傅立葉變換與軸向 功率譜）。
[00間圖12表示"AA"及"BB"中所得到的CBE3多孔體的均勻性評價(二維傅立葉變換與軸 向功率譜）。
[0064] 圖13表示使用差溫大塊體A及B的hMSC鑲嵌細(xì)胞塊中的細(xì)胞數(shù)量和血管的評價。
[0065] 圖14表示使用差溫大塊體C的hMSC鑲嵌細(xì)胞塊中的細(xì)胞數(shù)量和血管的評價。
[0066] 圖15表示使用差溫小塊體E及F的hMSC鑲嵌細(xì)胞塊中的細(xì)胞數(shù)量和血管的評價。
[0067] 圖16表示使用差溫大塊體A及B的hMSC+hECFC鑲嵌細(xì)胞塊中的細(xì)胞數(shù)量和血管的 評價。
[0068] 圖17表示使用差溫小塊體E及F的hMSC+hECFC鑲嵌細(xì)胞塊中的細(xì)胞數(shù)量和血管的 評價。
【具體實施方式】
[0069] W下，對本發(fā)明的實施方式進行詳細(xì)說明。
[0070] (1)生物相容性高分子多孔體的制造方法
[0071] 本發(fā)明的生物相容性高分子多孔體的制造方法包含：
[0072] (a)將生物相容性高分子的溶液冷卻成未冷凍狀態(tài)的工序，其中，溶液中液溫最高 的部分的溫度與溶液中液溫最低的部分的溫度之差為2.5°C W下，且溶液中液溫最高的部 分的溫度為溶劑的烙點W下；
[0073] (b)對工序(a)中所得到的生物相容性高分子的溶液進行冷凍的工序;及
[0074] (C)對工序(b)中所得到的冷凍的生物相容性高分子進行冷凍干燥的工序。
[0075] 本發(fā)明的方法中，當(dāng)將生物相容性高分子的溶液冷卻成未冷凍狀態(tài)時，通過將液 溫最高的部分的溫度與溶液中液溫最低的部分的溫度之差為2.5°C W下(優(yōu)選2.3°C W下， 更優(yōu)選2. TC W下）即溫度差設(shè)為較小，能夠減少所得到的多孔氣孔的大小偏差。另外，液溫 最高的部分的溫度與溶液中液溫最低的部分的溫度之差的下限并沒有特別限定，只要是0 °(：^上即可，例如可^是0.1°(：^上、0.5°(：^上、0.8°(：^上、或0.9°(：^上。由此，使用利用 通過本發(fā)明的方法來制造的多孔體制造的生物相容性高分子塊體的細(xì)胞構(gòu)建體可W實現(xiàn) 顯示較高的細(xì)胞數(shù)量及較高的血管數(shù)量的效果。
[0076]工序(a)的冷卻例如優(yōu)選經(jīng)由導(dǎo)熱系數(shù)低于水的材料(優(yōu)選特氣龍(注冊商標(biāo)））進 行冷卻，溶液中液溫最高的部分可視為最遠(yuǎn)離冷卻側(cè)的部分，溶液中液溫最低的部分可視 為冷卻面的液溫。
[OOW]在工序(a)中，即將產(chǎn)生凝固熱之前的溶液中液溫最高的部分的溫度與溶液中液 溫最低的部分的溫度之差優(yōu)選為2.5°C W下，更優(yōu)選為2.3°C W下，進一步優(yōu)選為2. TC W 下。在此，"即將產(chǎn)生凝固熱之前的溫度差"是指產(chǎn)生凝固熱時的1秒前~10秒前期間溫度差 最大時的溫度差。
[0078] 在工序(a)中，溶液中液溫最低的部分的溫度優(yōu)選為溶劑烙點-5 °C W下，更優(yōu)選為 溶劑烙點-5 °C W下且溶劑烙點-20°C W上，進一步優(yōu)選為溶劑烙點-6 °C W下且溶劑烙點-16 "CU上。另外，溶劑烙點的溶劑是指生物相容性高分子溶液的溶劑。
[0079] 在工序(b)中，對工序(a)中所得到的生物相容性高分子的溶液進行冷凍。在工序 (b)中用于冷凍的冷卻溫度并沒有特別限制，雖然也與冷卻設(shè)備有關(guān)，但優(yōu)選比溶液中液溫 最低的部分的溫度低3°C至30°C的溫度，更優(yōu)選為低5°C至25°C的溫度，進一步優(yōu)選為低10 °(：至20°(：的溫度。
[0080] 在工序(C)中，對工序(b)中所得到的冷凍的生物相容性高分子進行冷凍干燥。冷 凍干燥能夠通過常規(guī)方法來進行，例如能夠通過在低于溶劑的烙點的溫度下進行真空干 燥，進而在室溫(20°C)下進行真空干燥來進行冷凍干燥。
[0081 ] (2)生物相容性高分子多孔體
[0082] 根據(jù)本發(fā)明，提供一種通過上述生物相容性高分子多孔體的制造方法來制造的生 物相容性高分子多孔體。
[0083] 根據(jù)本發(fā)明，還提供一種生物相容性高分子多孔體，其中，對于通過對生物相容性 高分子多孔體的剖面結(jié)構(gòu)的圖像的1.5mm見方視場實施二維傅立葉變換而得到的二維傅立 葉變換圖像制作譜線輪廓時，在譜線輪廓的X為最大值的一半的位置不存在峰值，所述譜線 輪廓是從二維傅立葉變換圖像的y軸下端開始，對于圖像像素尺寸的10分之1像素寬度，將X 軸坐標(biāo)周邊的亮度值進行平均并繪制在y軸上而得到的。
[0084] 在此，"在譜線輪廓的X為最大值的一半的位置不存在峰值"優(yōu)選是指將譜線輪廓 的基本偏差值設(shè)為O時在譜線輪廓的X為最大值的一半的位置檢測不到2.OoW上的峰值的 情況。
[0085] 生物相容性高分子多孔體的剖面結(jié)構(gòu)的圖像的獲得方法并沒有特別限定，例如能 夠通過制作冷凍切片并制作皿化ematoxylin-eosin)染色標(biāo)本來獲得。通過對所得到的標(biāo) 本圖像中的1.5mm見方視場實施二維傅立葉變換來獲得二維傅立葉變換圖像。二維傅立葉 變換例如能夠使用圖像分析軟件Image J來進行。
[0086] 在所得到的二維傅立葉變換圖像中，生物相容性高分子多孔體中確認(rèn)到不均勻的 方向性時，尤其在軸向上觀測到較強的功率譜。關(guān)于軸向有無功率譜，能夠通過在二維傅立 葉變換圖像的y軸下端取譜線輪廓來規(guī)定。具體而言，從y軸下端開始，對于圖像像素尺寸的 10分之1像素寬度，將X軸坐標(biāo)周邊的亮度值進行平均并繪制在y軸上，由此能夠制作譜線輪 廓。譜線輪廓的制作例如能夠使用軟件"Gwyddion2.31"來進行。如上所述，在圖像橫向上從 圖像的一端至另一端獲得亮度值并進行數(shù)值化(線譜），由此能夠規(guī)定有無功率譜。另外，就 譜線輪廓的X坐標(biāo)而言，將二維傅立葉變換圖像中的左端設(shè)為零，將向右前進I像素的位置 設(shè)為0.000001。即，在二維傅立葉變換圖像中從左端前進512像素的位置在譜線輪廓上的X 坐標(biāo)為0