姜黃素對DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎PPAR-γ和COX-2影響的模型建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及潰瘍性結(jié)腸炎干預(yù)模型建立方法，特別設(shè)及姜黃素對DSS誘導(dǎo)的小鼠 潰瘍性結(jié)腸炎PPAR- 丫和C0X-2影響的模型建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種病因尚不十分清楚的直腸和結(jié)腸 慢性非特異性炎癥性疾病，病變主要局限于大腸粘膜與粘膜下層，病變成連續(xù)性彌漫分布， 范圍多自肛端直腸開始，逆行向近段發(fā)展，甚至累及全結(jié)腸及末端回腸，屬于炎癥性腸病 (inflammatory boweldisease, IBD)之一。本病呈慢性過程，且大部分患者反復(fù)發(fā)作，近年 來由于治療水平提高，病死率已明顯下降，但是慢性持續(xù)性活動或反復(fù)發(fā)作頻繁，預(yù)后較 差，且病程漫長者癌變危險(xiǎn)性增加。
[000引過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome pro Iif erator-activated receptor，PPAR)是一組具有復(fù)雜功能的核受體超家族成員，有PPARa、PPARfVS、PPAR 丫 3種 亞型，分別由不同的基因編碼，PPAR是配體調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，PPAR 丫由配體激活，主要參與 炎癥、免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，有減輕潰瘍性結(jié)腸炎患者及結(jié)腸炎動物模型的炎癥反應(yīng)作用。
[0004] 環(huán)氧合酶-2 (eye looxygenase-2, C0X-2)是啟動子含NF-KB結(jié)合位點(diǎn)的一種誘生型 酶，在正常情況下不表達(dá)，而在有炎癥時(shí)高度表達(dá)，在UC的發(fā)病中起重要作用，C0X-2作為促 炎癥介質(zhì)和促細(xì)胞分裂刺激早的反應(yīng)表達(dá)，在慢性結(jié)腸炎增加的前列腺素產(chǎn)物依賴于COX-2的活性，C0X-2是催化花生四締酸生成前列腺素 E2(prostaglandin E2，PGE2)的關(guān)鍵酶， PGE2具有擴(kuò)血管、增加腸黏膜通透性和刺激腸上皮細(xì)胞分泌的作用，可能與UC腹痛、腹瀉的 發(fā)生有關(guān)。
[0005] STAT是一個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，STAT蛋白質(zhì)是一個(gè)含有STAT1/2/3/4/ 5a/化/6的蛋白質(zhì)家族，在沒有特殊受體刺激時(shí)STAT在細(xì)胞質(zhì)中保持無活性形式，與多個(gè)炎 癥因子的表達(dá)相關(guān)，它在UC的發(fā)病機(jī)制中有重要作用。在不同的刺激如細(xì)胞因子、生長因 子、激素類等，STAT蛋白質(zhì)迅速通過酪氨酸憐酸化而被激活。在UC的作用機(jī)制中，STAT的家 族成員之一 STAT3在UC發(fā)病機(jī)制中的重要作用已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究中得到證實(shí)。
[0006] 姜黃素是從姜科植物姜黃中提取的一種色素，為澄黃色結(jié)晶粉末，味稍苦，酸性多 酪類物質(zhì)，主鏈為不飽和脂族及芳香族基團(tuán)，大量研究證明它具有抗氧化、抗炎、抗凝、降 月旨、抗動脈粥樣硬化、抗衰老消除自由基及抑制腫瘤生長等作用。
[0007] 潰瘍性結(jié)腸炎主要藥物治療有氨基水楊酸制劑，但此類藥物不良反應(yīng)多，且臨床 療效不甚令人滿意，而5-ASA新型制劑不良反應(yīng)明顯減少，缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴，因此需要研發(fā) 新的藥物，此藥既能更好的對潰瘍性結(jié)腸炎起良好療效，同時(shí)副作用少且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。姜黃素 對潰瘍性結(jié)腸炎的研究近年來有所進(jìn)步。由于葡聚糖硫酸鋼(DSS)誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎 化C)小鼠與人UC的組織學(xué)與臨床表現(xiàn)類似，為目前較好的研究人UC的動物模型，DSS誘導(dǎo)模 型之所W在I抓研究中受歡迎是由于它的迅速、簡單、再現(xiàn)性、可控制性。本課題通過對正常 小鼠、DSS模型小鼠各組治療前后的生物行為、病理學(xué)、免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)研究，巧U 定PPAR 丫、C0X-2、STAT3的表達(dá)，觀察姜黃素對潰瘍性結(jié)腸炎的干預(yù)作用，探討姜黃素治療 潰瘍性結(jié)腸炎的可能機(jī)制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供姜黃素對DSS誘導(dǎo)的小 鼠潰瘍性結(jié)腸炎PPAR-丫和C0X-2影響的模型建立方法。通過觀察姜黃素對DSS誘導(dǎo)小鼠潰 瘍性結(jié)腸炎的療效;觀察小鼠的體重、糞便性狀和隱血情況、臨床癥狀、結(jié)腸組織學(xué)損傷、宏 觀表現(xiàn);測定結(jié)腸黏膜層PPAR 丫、C0X-2表達(dá)情況，及STAT3mRNA和憐酸化STAT3，探討姜黃素 影響潰瘍性結(jié)腸炎的可能機(jī)制。
[0009] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0010]姜黃素對DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎PPAR- 丫和C0X-2影響的模型建立方法，包 括如下步驟：
[0011] 步驟一、實(shí)驗(yàn)分組與模型制造；
[0012] 選雌性BALB/c小鼠數(shù)十只、體重16-20g，小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，隨機(jī)數(shù)字表分為A、 B、C、D、E、F六組，每組數(shù)目相同；
[0013] A組:正常對照組，每日自由進(jìn)飲用水及飼料，每日腹腔注射Iml生理鹽水，共7d;
[0014] B組:模型組，每日自由飲用5%DSS溶液，替代飲用水，自由進(jìn)食飼料，每日腹腔注 射Iml的2.5%乙醇溶液，共7d;
[0015] C組:地塞米松治療組，每日飲用5%DSS溶液替代飲用水，自由進(jìn)食飼料，每日腹腔 注射1次地塞米松針劑，劑量為1.5mg/kg. d，溶于Iml生理鹽水，共7d。
[0016] L組:姜黃素低劑量組，飲用5%DSS溶液替代飲用水，自由進(jìn)食飼料，每日腹腔注射 姜黃素懸液1次，姜黃素按每日25mg/kg. d的劑量溶于Iml 2.5%乙醇溶液，共7d。
[0017] M組:姜黃素中劑量組，飲用5 %DSS溶液替代飲用水，自由進(jìn)食飼料，每日腹腔注射 姜黃素懸液1次，姜黃素按每日50mg/kg. d的劑量溶于Iml 2.5%乙醇溶液，共7d。
[0018] H組:姜黃素高劑量組，飲用5%DSS溶液替代飲用水，自由進(jìn)食飼料，每日腹腔注射 姜黃素懸液1次，姜黃素按每日lOOmg/kg.d的劑量溶于Iml 2.5%乙醇溶液，共7d。
[0019] 步驟二、結(jié)腸組織取樣；
[0020] 第8天，頸椎脫白處死小鼠，剪開腹腔，游離結(jié)腸及遠(yuǎn)端回腸，取出肛口至盲腸末端 的整個(gè)腸段，沿腸系膜縱軸剖開，用冰冷PBS反復(fù)沖洗干凈，再用清潔濾紙吸干水分。宏觀檢 查并進(jìn)行評分后，剪取潰瘍最嚴(yán)重處結(jié)腸組織1cm，置于4%甲醒溶液固定，常規(guī)石蠟包埋， 切片，留作免疫組化染色。另取兩段結(jié)腸組織放入低溫冰箱-80°C存放，做RT-PCR和化ISA。
[0021] 步驟=、觀察指標(biāo)；
[0022] 觀察造模期間每日重點(diǎn)觀察小鼠的體重、糞便性狀和隱血情況，并進(jìn)行DAI積分， 糞便/潛血臨床癥狀評分;宏觀檢查評分;組織損傷評分；
[0023] 步驟四、生化指標(biāo)測定；
[0024] 根據(jù)上述積分和評分對檢測結(jié)果進(jìn)行定性分析，同時(shí)，
[002引進(jìn)一步的，所述步驟一中所選小鼠為60只，每組10只。
[0026]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：
[0027] 本發(fā)明提供了姜黃素對DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎PPAR- 丫和COX-2影響的模型 建立方法。通過觀察姜黃素對DSS誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的療效;觀察小鼠的體重、糞便性 狀和隱血情況、臨床癥狀、結(jié)腸組織學(xué)損傷、宏觀表現(xiàn);測定結(jié)腸黏膜層PPAR 丫、C0X-2表達(dá) 情況，及STAT3mRNA和憐酸化STAT3，探討姜黃素影響潰瘍性結(jié)腸炎的可能機(jī)制。
【附圖說明】
[0028] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的結(jié)腸組織P-STAT3蛋白的表達(dá)情況示意圖；
[0029] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的結(jié)腸組織STAT3表達(dá)情況(RT-PCR)的示意圖；
[0030] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的結(jié)腸組織光鏡下觀察化EX200)的示意圖；
[0031] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的結(jié)腸組織PPAR 丫的表達(dá)情況(SPX400)的示意圖；
[0032] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的結(jié)腸組織STAT3的表達(dá)情況(SPX400)的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)描述：
[0034] 試驗(yàn)例：
[003引一、實(shí)驗(yàn)材料
[0036] 1.實(shí)驗(yàn)動物:雌性BALB/c小鼠60只、清潔級、鼠齡6-7巧4，體重16-20邑。
[0037] 2.主要實(shí)驗(yàn)試劑
[0038] 葡聚糖硫酸鋼、姜黃素、地塞米松、PPAR 丫兔抗鼠多克隆抗體、STAT3兔抗鼠多克隆 抗體、C0X-2化ISA檢測試劑盒、SP免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、4 %多聚甲醒固定 液、Trizo 1試劑盒、CDNA合成試劑盒、STAT3上下游基因引物、TraiZO1總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn) 錄試劑盒、憐酸化STAT3多克隆抗體。
[0039] 二.實(shí)驗(yàn)方法
[0040] 1實(shí)驗(yàn)分組與模型制造
[0041 ] 選雌性BALB/c小鼠60只、體重16-20g。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，隨機(jī)數(shù)字表分為A、B、 C、D、E、F六組，每組10只。
[0042] A組:正常對照組，每日自由進(jìn)飲用水及飼料，每日腹腔注射Iml生理鹽水，共7d;
[0043] B組:模型組，每日自由飲用5 %DSS溶液，替代飲用水，自由進(jìn)食飼料，每日腹腔注 射Iml的2.5%乙醇溶液，共7d;
[0044] C組:地塞米松治療組，每日飲用5 %DSS溶液替代飲用水，自由進(jìn)食飼料，每日腹 腔注射1次地塞米松針劑(劑量為1.5mg/kg.d，溶于Iml生理鹽水），共7d。
[004引L組:姜黃素低劑量組，飲用5%DSS溶液替代飲用水，自由進(jìn)食飼料，每日腹腔注射 姜黃素懸液1次(姜黃素按每日25mg/kg.d的劑量溶于Iml 2.5%乙醇溶液[2]，共7(1。
[0046] M組:姜黃素中劑量組，飲用5 %DSS溶液替代飲用水，自由進(jìn)食飼料，每日腹腔注射 姜黃素懸液1次(姜黃素按每日50mg/kg.d的劑量溶于Iml 2.5%乙醇溶液[2，3])，共7d。
[0047] H組:姜黃素高劑量組，飲用5%DSS溶液替代飲用水，自由進(jìn)食飼料，每日腹腔注射 姜黃素懸液1次(姜黃素按每日lOOmg/kg.d的劑量溶于Iml 2.5%乙醇溶液[2])，共7(1。
[004引 2.結(jié)腸組織取樣
[0049]第8天，頸椎脫白處死小鼠，剪開腹腔，游離結(jié)腸及遠(yuǎn)端回腸，取出肛口至盲腸末端 的整個(gè)腸段，沿腸系膜縱軸剖開，用冰