一種生物膜角膜貼片及其制備方法和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及的是再生醫(yī)學和組織工程領(lǐng)域，涉及一種生物膜角膜貼片及其制備方 法和應用，具體的說，涉及一種由人骨髓間充質(zhì)干細胞與蠶絲蛋白生物膜構(gòu)建形成的角膜 貼片及其制備方法，用于治療角膜損傷的等疾病。
【背景技術(shù)】
[0002] 角膜是眼球最前部的突出部分，直接與外界環(huán)境相接，因而容易遭受外界的損傷。 人眼角膜共分5層，角膜上皮層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層和內(nèi)皮層。最外層的角膜上皮 具有屏障功能，是保持良好視力的關(guān)鍵。角膜位于眼球最前面，由于經(jīng)常暴露于空氣中，容 易感染細菌，其發(fā)生機械性及化學性損傷的概率較高，從而導致角膜炎癥甚至角膜潰瘍。角 膜潰瘍是眼科致盲的常見眼表疾病，潰瘍波及深部者愈合時間長，反復發(fā)作造成角膜細胞 的嚴重破壞形成角膜潰瘍甚至穿孔，治療棘手。且該疾病具有診斷不明，病程易反復、迀延 的特點。對于藥物難以控制的角膜潰瘍，常行角膜移植。
[0003]目前，臨床上傳統(tǒng)治療角膜潰瘍等疾病的方法一般有以下幾種：（一）傳統(tǒng)的角膜 移植，術(shù)后短期角膜透明，其主要缺點為僅中央〇7mm光學透明區(qū)移植，對干細胞缺失無 效，因排斥反應明顯，需要長期使用免疫抑制劑配合治療；（二）自體角膜緣移植，雖然無免 疫排斥反應，但材料來源受限，主要缺點為增加健眼患病的危險性，不能360度環(huán)裝移植， 效果受限；（三）異體角膜緣移植，供體材料極為有限，治療機會非常少，并且免疫排斥反應 明顯，需要長期用藥，費用很高。以上移植方法，費用昂貴，不能及時得到角膜材料，以及術(shù) 后可能發(fā)生排斥反應而限制了其在治療角膜潰瘍中的應用。
[0004] 近年來，組織工程化人工角膜技術(shù)日趨成熟，為臨床上治療角膜疾病提供了一個 新的思路。它是以可降解材料為支架，在體外進行細胞培養(yǎng)，讓細胞在材料表面及內(nèi)部進行 三維生長、分化為多層細胞，最后得到類似于供體角膜的"人工供體角膜"，主要由種子細胞 和支架材料構(gòu)成。
[0005] 理想的構(gòu)建組織工程角膜種子細胞應該具備以下條件：容易分離培養(yǎng)，有較強的 增殖能力且能長期保持其特有的生物活性和特性，無免疫原性，無異源污染等。骨髓間充質(zhì) 干細胞（Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)獲取方便，體外增殖能力強，有多向分化潛 能，能向骨、脂肪、軟骨、神經(jīng)等各個胚層的組織分化，因此被廣泛地應用于再生醫(yī)學。同時， BMSCs有旁分泌功能，參與免疫調(diào)節(jié)；不表達MHC-II或共刺激分子，無免疫原性；對CD4+/ CD8+ T細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞等都有抑制作用。在角膜堿燒傷的治療方面，研宄 報道BMSCs有減輕炎癥的作用，從而促進角膜的損傷修復。BMSCs的這種治療作用，為調(diào)節(jié) 炎癥反應和減少移植物排斥提出了一種新思路。
[0006] 用于組織工程構(gòu)建活性人工角膜的支架材料，其生物相容性要好，種子細胞能夠 在其內(nèi)正常生長且形成近似體內(nèi)器官的正常結(jié)構(gòu)，并具備角膜特有的透明、屈光、透氧等特 性。目前較常用的支架材料有脫上皮的角膜基質(zhì)、羊膜、膠原、天然珊瑚、纖維蛋白等材料。 現(xiàn)有的幾種生物支架材料存在一定的缺點：天然高分子材料雖生物相容性好，但力學性能 欠佳，降解過快，不利于細胞營養(yǎng)物質(zhì)向材料內(nèi)擴散。由于倫理道德的影響，羊膜自身亦存 在供體來源缺乏的問題，且羊膜存在傳播肝炎、人類免疫缺陷病毒（HIV)等感染性病毒的風 險，加上羊膜的透明性低，植入體內(nèi)難以完全恢復角膜的透明性，影響了患者視覺功能的恢 復，這些問題都極大地限制了羊膜在臨床中的進一步推廣和應用。
[0007] 蠶絲蛋白是一種可降解的生物大分子，因其力學性能良好、可調(diào)范圍大，骨再生能 力好，在組織工程領(lǐng)域，常被作為植入材料用于研宄其成骨作用。蠶絲蛋白具有水溶性，在 制備過程中可避免有毒溶劑的使用，生物安全性好，可在體內(nèi)降解。另外，蠶絲蛋白本身是 天然蛋白質(zhì)多肽，生物相容性好，不易激發(fā)免疫反應。蠶絲蛋白在體內(nèi)和體外均可降解，降 解時間穩(wěn)定，最終降解產(chǎn)物是氨基酸或寡肽，對機體沒有毒害作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，結(jié)合再生醫(yī)學和組織工程技術(shù)，本發(fā)明利用骨髓間充質(zhì)干 細胞作為種子細胞；構(gòu)建蠶絲蛋白生物膜作為載體，制備形成角膜貼片。針對角膜潰瘍、角 膜缺損、角膜混濁等一系列的角膜損傷疾病的治療，本發(fā)明種子細胞與支架的緊密附和，既 可提供充足營養(yǎng)又能有效阻止新生血管，對眼表修復和重建具有顯著效果，有良好的應用 前景。
[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種全新的由骨髓間充質(zhì)干細胞構(gòu)建生物膜角膜貼片，該貼 片應用于角膜潰瘍等角膜損傷疾病的治療。
[0010] 本發(fā)明的另一個目的是提供上述生物膜角膜貼片的制備方法。
[0011] 為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，達到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)： 一種生物膜角膜貼片是由接種于支架材料上的種子細胞和形成三維空間的生物膜支 架構(gòu)建組成，其中所述的種子細胞是骨髓間充質(zhì)干細胞，所述的生物膜支架是蠶絲蛋白生 物膜。
[0012] 進一步的，所述的骨髓間充質(zhì)干細胞的接種密度為（1~10)xio6/cm2,優(yōu)選 7X106/cm2〇
[0013] 進一步的，所述的蠶絲蛋白生物膜的質(zhì)量含量為1%~10%，優(yōu)選2% ;膜干燥溫度條 件為10°C~60°C，優(yōu)選25°C ;膜干燥的濕度條件為25%~60%，優(yōu)選50%。本支架材料既能 維持種子細胞的位置、形態(tài)，也能參與細胞分化狀態(tài)的調(diào)控。
[0014] 進一步的，所述的骨髓間充質(zhì)干細胞來源于同種異體。
[0015] 一種生物膜角膜貼片的制備方法，由下述步驟組成：（1)蠶絲蛋白生物膜支架的 制備；（2)骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定；（3)骨髓間充質(zhì)干細胞的接種；（4)生物 膜角膜貼片的制備；（5)生物膜角膜貼片的移植。
[0016] 所述的步驟（1)的具體操作方法是：稱取適量桑蠶絲置于0. 5%的無水碳酸鈉溶 液中，浴比1 :50,于90°C~100°C處理30min，重復3次(最后一次用去離子水)。脫膠后洗 凈，60°C烘箱干燥后得到精煉蠶絲。將脫膠完的生絲溶解在9. 5mol/L的溴化鋰溶液中，然 后將溶液在去離子水中透析3d。透析完的絲蛋白溶液離心去除極少量絮狀沉淀物后，用重 量法標定絲蛋白溶液的濃度，然后加入適量的去離子水將溶液稀釋至絲蛋白的質(zhì)量分數(shù)為 1%~10%。將lml再生蠶絲蛋白溶液移入3cmX3cm的塑料盒中，在10°C~60°C溫度，25%~ 60%相對濕度下，放置過夜，使其自然干燥成膜(約需24h)。所得的再生蠶絲蛋白膜膜厚約 為5 y m，蒸餾水浸泡48小時，每隔8h時更換蒸餾水。取出材料薄膜，干燥后分別用PBS及 培養(yǎng)基各浸泡ld，備用。
[0017] 本發(fā)明的支架材料，其中蠶絲蛋白的質(zhì)量分數(shù)為1%~10%，經(jīng)動物體內(nèi)回植實驗 驗證，該支架材料具有較好的生物相容性及適宜的體內(nèi)降解速度，且降解產(chǎn)物無毒。
[0018] 進一步的，所述的步驟（2)的具體操作方法是：BMSCs分離及傳代培養(yǎng)：取人骨髓 5~10ml，肝素抗凝，用等量的PBS稀釋，按2 : 1比例加在Ficoll淋巴細胞分離液上，400g 離心30 min，取中間白膜層，用PBS洗滌3遍，用含10%FBS的a-MEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為 1 X 106個/ml接種于9cm培養(yǎng)皿中。運用差速貼壁法37°C，5%C0 2條件下培養(yǎng)48小時后半 量換液，4d全量換液棄去未貼壁的細胞。倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長，待細胞長到 85%融合時，用0. 25% trypsin-EDTA進行消化，按1 : 2的比例進行傳代，之后約48小時換 液一次，3~4日傳代一次。取傳代4~6代后的細胞用于流式細胞檢測及細胞的增殖和形 態(tài)學實驗，各組細胞以2 X 105/孔，接種于鋪有各組材料的24孔板中，37°C，5%0)2條件下培 養(yǎng)，每48~72小時換液。
[0019] BMSCs的鑒定：將體外培養(yǎng)4~6代的BMSCs用PBS多次洗漆后；加入熒光標記的 抗體；4°C、孵育30min ;PBS洗去未結(jié)合的抗體，1%多聚甲醛固定；應用FACScan流式細胞儀 檢測細胞表面抗原表達。
[0020] 進一步的，所述的步驟（3)的具體操作方法是：BMSCs傳代擴增到第三代后接種 于支架材料上制得細胞材料復合物；于培養(yǎng)箱