鴨疫里默氏桿菌、大腸埃希氏桿菌二聯(lián)滅活疫苗的制備方法及其制品的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，更具體是涉及一種鴨疫里默氏桿菌、大腸埃希氏桿菌二聯(lián)滅活疫苗的制備方法及其制品。
【背景技術(shù)】
[0002]鴨傳染性楽膜炎是由鴨疫里氏桿菌(Riemerellaanatipestifer，RA)引起的急性或慢性接觸性、敗血性傳染病。鴨大腸埃希氏菌病(Escherchia coli)是由致病性大腸桿菌引起的出血性、滲出性和敗血性的傳染病。不同品種、天齡及性別的鴨群均可感染發(fā)病，而且這兩種病通?；旌喜l(fā)感染。鴨發(fā)生傳染性漿膜炎后，往往繼發(fā)鴨大腸埃希氏菌病，導(dǎo)致鴨群大批死亡，給養(yǎng)殖場(chǎng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]鴨傳染性漿膜炎又稱為鴨疫里默氏桿菌病是目前造成養(yǎng)鴨業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的最主要傳染病之一，在全球范圍內(nèi)大多數(shù)有集約化養(yǎng)鴨生產(chǎn)的國(guó)家和地區(qū)均有本病發(fā)生，在我國(guó)幾乎所有養(yǎng)鴨區(qū)都有發(fā)生。本病的發(fā)病率在5%-100%，死亡率通常為5%-70%或更高，鴨的易感天齡為10-30天。使用疫苗進(jìn)行免疫接種是控制該病的有效措施。
[0004]鴨大腸桿菌病是由鴨埃希氏大腸桿菌引起的各種天齡鴨的急性敗血性細(xì)菌病，以心包炎、氣囊炎、肝周炎、腹膜炎為主要特征，在鴨群中常與鴨疫里默氏桿菌病伴發(fā)。鴨埃希氏大腸桿菌有08、015、019、073、078等多個(gè)血清型普遍存在。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種鴨疫里默氏桿菌、大腸埃希氏桿菌的二聯(lián)滅活疫苗的制備方法及其制品。
[0006]為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明提供一種鴨疫里默氏桿菌、大腸埃希氏桿菌二聯(lián)滅活疫苗的制備方法，包括如下步驟:
(I)種子液的制備，將鴨疫里默氏桿菌、大腸埃希氏菌基礎(chǔ)種子分別接種于相應(yīng)的血清含量為3wt%~5wt %的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到種子液；
(2 )制苗用菌液的制備，在相應(yīng)的血清含量為2wt%~3wt%的培養(yǎng)基中接入步驟(I)得到的種子液進(jìn)行培養(yǎng)得到；
(3)滅活，將步驟(2)得到的制苗用菌液進(jìn)行滅活；
(4)疫苗的制備，在步驟(3)得到的滅活菌液中加入4wt%的吐溫-80并與礦物油佐劑混合、乳化、分裝，得到油乳劑滅活疫苗成品。
[0007]優(yōu)選地，其中所述鴨疫里默氏桿菌疫苗株為I型和II型，且所述鴨疫里默氏桿菌I和II型菌的培養(yǎng)條件為:發(fā)酵罐37°C培養(yǎng)10-12h，培養(yǎng)菌液的OD值達(dá)到30-40。
[0008]優(yōu)選地，其中所述大腸埃希氏菌為078型，且所述大腸埃希氏菌的培養(yǎng)條件為:發(fā)酵罐37°C培養(yǎng)6-8h，培養(yǎng)菌液的OD值達(dá)到30以上。
[0009]優(yōu)選地，其中所述鴨疫里默氏桿菌的培養(yǎng)基為特制胰酶大豆培養(yǎng)基。特制胰酶大豆培養(yǎng)基的制備方法如下:胰蛋白胨，1g ;大豆蛋白胨，1g ;酵母浸出干粉，5g ;葡萄糖，2g ;NaCl，5g ;調(diào)節(jié)pH值為7.4±0.2，補(bǔ)足水分至lOOOmL，分裝后于121 °C高壓滅菌20min，置4°C冰箱備用，使用前加入適量的無(wú)菌鴨胚浸出液。制備TSA固體培養(yǎng)基時(shí)，在其中另外加入瓊脂粉15 g，同樣高壓滅菌，冷卻至適宜溫度，加入適量的預(yù)先溫育的無(wú)菌鴨胚浸出液。無(wú)菌操作倒入滅菌平皿中，制成平板，室溫凝固后，倒置4°C冰箱備用。
[0010]優(yōu)選地，所述大腸埃希氏菌的培養(yǎng)基為改良馬丁肉湯培養(yǎng)基。改良馬丁肉湯培養(yǎng)基的制備方法如下:改良馬丁湯(pH 7.4±0.2)，牛肉湯500ml，豬胃消化液500ml，NaCl
2.5g。上述成分混合后，以NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.4 ± 0.2，煮沸20 — 40分鐘，補(bǔ)足水分至1000ml，冷卻沉淀，抽取上清液，經(jīng)濾紙過濾，濾液應(yīng)為澄清，淡黃色。按需要量分裝后，于116°C高壓滅菌30 min，置4°C保存?zhèn)溆?，用前加?.03-0.06wt%的無(wú)菌輔酶。制備改良馬丁固體培養(yǎng)基時(shí)，在其中另外加入瓊脂粉15 g，加熱熔化后，分裝到小試管中，高壓滅菌?；蚍盅b到三角瓶中高壓滅菌后，冷卻到適宜溫度加入0.03-0.06wt%的無(wú)菌輔酶并混勻后制備平皿，室溫凝固并無(wú)菌檢驗(yàn)合格后，置4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0011]為了更完善本發(fā)明的鴨疫里默氏桿菌、大腸埃希氏桿菌的二聯(lián)滅活疫苗的制備方法，在步驟(I)得到種子液后和步驟(2)得到制苗用菌液后都還包括檢驗(yàn)提純的步驟(活菌計(jì)數(shù)、滅活及滅活檢驗(yàn)等(方法按獸藥典2010版進(jìn)行))。
[0012]優(yōu)選地，其中步驟(4)所述礦物油佐劑與滅活菌液的油水比是2:1，且礦物油佐劑為Marc-52白油佐劑。
[0013]優(yōu)選地，其中步驟(3)中所述的滅活為:鴨疫里默氏桿菌中加入0.3wt%~0.4wt%的甲醛溶液，經(jīng)37°C滅活18-24小時(shí)；大腸埃希氏菌中加入0.3wt%~0.4wt%的甲醛溶液，經(jīng)37°C滅活48-54小時(shí)。
[0014]本發(fā)明還提供一種用上述制備方法制備而來(lái)的鴨疫里默氏桿菌、大腸埃希氏桿菌二聯(lián)滅活疫苗。
[0015]本發(fā)明的鴨疫里默氏桿菌、大腸埃希氏桿菌二聯(lián)滅活疫苗采用的種子菌是經(jīng)過血清學(xué)調(diào)查，嚴(yán)格篩選出來(lái)的。能有效預(yù)防鴨疫里默氏桿菌、大腸埃希氏桿菌。本發(fā)明的疫苗制備方法簡(jiǎn)單，產(chǎn)品效果穩(wěn)定。而且鴨疫里默氏桿菌、大腸埃希氏桿菌二聯(lián)滅活疫苗單次注射，可以有效預(yù)防鴨傳染性漿膜炎和鴨大腸桿菌病兩種疾病的目的，省時(shí)省事，預(yù)防效率尚O
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1A為鴨疫里默氏桿菌I型菌株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定圖之一；
圖1B為鴨疫里默氏桿菌I型菌株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定圖之二 ；
圖1C為鴨疫里默氏桿菌I型菌株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定圖之三；
圖2A為鴨疫里默氏桿菌II型菌株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定圖之一；
圖2B為鴨疫里默氏桿菌II型菌株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定圖之二 ；
圖2C為鴨疫里默氏桿菌II型菌株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定圖之三；
圖3A為大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線測(cè)定圖之一；
圖3B為大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線測(cè)定圖之二 ；
圖3C為大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線測(cè)定圖之三。
【具體實(shí)施方式】
[0017]為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不是用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。本發(fā)明所采用的生物材料鴨疫里默氏桿菌I型和II型，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)。本發(fā)明所采用的生物材料大腸埃希氏菌為078型，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCOo
[0018]應(yīng)該指出，以下具體說(shuō)明都是例示性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的發(fā)明。除非另有說(shuō)明，本文使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義。
[0019]本發(fā)明的鴨疫里默氏桿菌、大腸埃希氏桿菌二聯(lián)滅活疫苗是用免疫原性良好的鴨疫里默氏桿菌I型、II型及大腸埃希氏菌078型作為種子菌接種于適宜培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)甲醛溶液滅活后，與油佐劑乳化制成。用于預(yù)防鴨的傳染性漿膜炎和大腸埃希氏菌病。
[0020]一、制備實(shí)施例:
I培養(yǎng)基
1.1鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)基
鴨疫里默氏桿菌采用特制胰酶大豆液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0021]1.2大腸埃希氏菌培養(yǎng)基
大腸埃希氏菌采用改良馬丁肉湯培養(yǎng)。
[0022]2半成品的制備
2.1鴨疫里默氏桿菌、大腸埃希氏菌
2.1.1生產(chǎn)種子的制備
取出鴨疫里默氏桿菌、大腸埃希氏菌基礎(chǔ)種子各I瓶。鴨疫里默氏桿菌菌種用特制胰酶大豆液體培養(yǎng)基回溶至凍干前的體積，劃線接種于特制胰酶大豆固體培養(yǎng)基平皿上，含5% 0)2的環(huán)境下37°C培養(yǎng)24小時(shí)，選取典型菌落接種特制胰酶大豆固體培養(yǎng)基斜面上，置37°C培養(yǎng)24小時(shí)，保存于2-8°C冰箱，經(jīng)檢驗(yàn)純粹后作為一級(jí)種子。一級(jí)種子接種于適量的特制胰酶大豆液體培養(yǎng)基(含3wt%~5wt%新生牛血清)中，37°C振蕩培養(yǎng)20-22h，