諾如病毒滅活劑及其制造方法、諾如病毒滅活方法、諾如病毒滅活用溶菌酶類的制造方法 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種諾如病毒滅活劑，含有選自溶菌酶和/或其鹽以及它們的改性物中的至少1種的溶菌酶類。
【專利說明】
諾如病毒滅活劑及其制造方法、諾如病毒滅活方法、諾如病毒 滅活用溶菌酶類的制造方法、諾如病毒感染的預防藥或治療 藥從及諾如病毒滅活用皮膚外用劑
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及一種含有溶菌酶和/或其鹽W及它們的改性物中的至少1種的諾如病 毒滅活劑及其制造方法、諾如病毒滅活方法、諾如病毒滅活用溶菌酶類的制造方法、諾如病 毒感染的預防藥或治療藥W及諾如病毒滅活用皮膚外用劑。
【背景技術】
[0002] 諾如病毒對人的感染高，引起食物中毒、病毒性急性胃腸炎(感染癥）。目前，諾如 病毒沒有疫苗，也沒有有效的抗病毒劑，因此，若一旦發(fā)病，則治療僅限于輸液等對癥療法， 但對于老年人等，也有重癥化的情況。
[0003] 諾如病毒的感染途徑主要為經(jīng)口感染。因此，為了預防食物中毒、感染癥的發(fā)生和 防止發(fā)生后的擴大，將環(huán)境中存在的諾如病毒滅活極其重要。
[0004] W往，W醇制劑為代表的許多消毒藥對于諾如病毒的滅活無效，為了滅活，推薦85 °C1分鐘W上的加熱或利用次氯酸鋼進行處理。然而，次氯酸鋼具有對金屬的腐蝕作用、對 皮膚的刺激作用、對衣物等的漂白作用，因此，實際上的使用受到限制。因此，期望開發(fā)一種 滅活劑代替次氯酸鋼。
[0005] 對此，作為諾如病毒滅活劑的有效成分，提出了柿子提取物（柿單寧）（專利文獻 1)、葡萄的種子等中含有的原花青素(專利文獻2)等。
[0006] 即，在專利文獻1中記載了應用2分鐘柿子提取物的病毒基因組RNA數(shù)的抑制率為 86~99 %，另外，在專利文獻2中記載了原花青素對于通過50 %培養(yǎng)細胞感染濃度法得到的 對照的感染效價(logTCIDso/mL)在作用時間1分鐘時為3。然而，均沒有達到將諾如病毒充分 滅活，基于諾如病毒的強感染力，期望開發(fā)一種具有更強的滅活效果的新的滅活劑。
[0007] 現(xiàn)有技術文獻 [000引專利文獻
[0009] 專利文獻1:專利5092145號
[0010] 專利文獻2:日本特開2013-47196號公報

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的課題在于提供一種將諾如病毒有效地滅活的技術。
[0012] 本發(fā)明人還意外地發(fā)現(xiàn)溶菌酶和/或其鹽W及它們的改性物中的至少1種對諾如 病毒具有優(yōu)異的滅活作用，想到了本發(fā)明。
[0013] 1.本發(fā)明的一個形態(tài)的諾如病毒滅活劑含有選自溶菌酶和/或其鹽W及它們的改 性物中的至少1種的溶菌酶類。
[0014] 2.根據(jù)上述1所述的諾如病毒滅活劑，其中，所述溶菌酶類的含量可W為0.05質(zhì) 量％^上。
[0015] 3.根據(jù)上述1或2所述的諾如病毒滅活劑，其中，所述溶菌酶類的由下述定義規(guī)定 的巧光強度為4000 W上。
[0016] 巧光強度:在W所述溶菌酶類的濃度W固體成分換算計為0.05質(zhì)量％、且憐酸鹽 的濃度為0.2M的方式用憐酸緩沖液(PH7.0)稀釋而得到的稀釋液5mL中添加8mM的1，8 -苯 胺基糞橫酸的甲醇溶液2扣L，使得到的液體在室溫下反應30分鐘后，在激發(fā)波長390nm(激 發(fā)帶寬lOnm)和巧光波長470nm(巧光帶寬lOnm)的條件下對該液體進行測定而得到的巧光 強度
[0017] 4.根據(jù)上述1~3中任一項所述的諾如病毒滅活劑，其中，所述溶菌酶類的下述所 規(guī)定的抗諾如病毒活性為2.0W上。
[0018] 抗諾如病毒活性:將等量混合諾如病毒液和所述溶菌酶類的2質(zhì)量％水溶液而得 到的諾如病毒混合液在室溫下放置1分鐘時，從放置前的感染效價的對數(shù)減去放置后的感 染效價的對數(shù)而得的值
[0019] 5.根據(jù)上述1~4中任一項所述的諾如病毒滅活劑，其可W為液劑。
[0020] 6.本發(fā)明的一個形態(tài)的諾如病毒的滅活方法可W包含使用選自溶菌酶和/或其鹽 W及它們的改性物中的至少1種的溶菌酶類將諾如病毒滅活的工序。
[0021] 7.本發(fā)明的一個形態(tài)的諾如病毒滅活用溶菌酶類的制造方法是上述1~5中任一 項所述的諾如病毒滅活劑中含有的諾如病毒滅活用溶菌酶類的制造方法，包含將溶菌酶 和/或其鹽加熱改性的工序。
[0022] 8.本發(fā)明的一個形態(tài)的諾如病毒滅活劑的制造方法包含含有選自溶菌酶和/或其 鹽W及它們的改性物中的至少1種的溶菌酶類的工序。
[0023] 9.本發(fā)明的一個形態(tài)的諾如病毒滅活劑的制造方法是上述8所述的諾如病毒滅活 劑的制造方法，包含將溶菌酶和/或其鹽加熱改性而得到加熱改性物的工序和得到含有該 加熱改性物的諾如病毒滅活劑的工序。
[0024] 10.根據(jù)上述9所述的諾如病毒滅活劑的制造方法，其中，所述得到加熱改性物的 工序可W包含:第1加熱工序，對波長66化m的光的透射率超過70%、pH為5.0~7.0、且溶菌 酶和/或其鹽的濃度W固體成分換算計為0.5質(zhì)量％~7質(zhì)量％的溶菌酶和/或其鹽的水溶 液進行加熱直到該水溶液的波長660nm的光的透射率成為70%;第巧日熱工序，在所述第1加 熱工序之后，將該水溶液加熱至所述水溶液的波長660nm的光的透射率小于70 %的極小值 后，對該水溶液進行加熱直到該水溶液的波長660nm的光的透射率成為70% ; W及第3加熱 工序，在所述第2加熱工序之后，在所述水溶液的波長66化m的光的透射率超過70 %的狀態(tài) 下進一步對該水溶液加熱。
[0025] 11.根據(jù)上述10所述的諾如病毒滅活劑的制造方法，其中，所述第3加熱工序的加 熱條件可W為在將該第3加熱工序中得到的水溶液用0.45μπι的膜過濾器過濾而得到的物質(zhì) 和乙醇W質(zhì)量比1:1的比例混合時進行加熱直到波長66化m的光的透射率成為85% W上的 條件。
[0026] 12.根據(jù)上述10或11所述的諾如病毒滅活劑的制造方法，其中，在所述第巧日熱工 序之后，進一步包含使所述水溶液噴霧干燥或冷凍干燥而得到粉末狀的所述改性物的工 序。
[0027] 13.本發(fā)明的一個形態(tài)的諾如病毒感染的預防藥或治療藥包含選自溶菌酶和/或 其鹽W及它們的改性物中的至少1種的溶菌酶類。
[00%] 14.本發(fā)明的一個形態(tài)的諾如病毒滅活用皮膚外用劑包含選自溶菌酶和/或其鹽 W及它們的改性物中的至少1種的溶菌酶類。
[0029] 15.本發(fā)明的一個形態(tài)的溶菌酶類是用于諾如病毒的滅活的選自溶菌酶和/或其 鹽W及它們的改性物中的至少1種。
[0030] 本發(fā)明的諾如病毒滅活劑中含有的選自溶菌酶和/或其鹽W及它們的改性物中的 至少巧巾的溶菌酶類對諾如病毒具有優(yōu)異的滅活作用，特別是加熱改性物能夠在1分鐘W內(nèi) 運樣的極短的作用時間內(nèi)使諾如病毒滅活。另外，溶菌酶一直W來就作為提高食品的耐存 性的食品添加劑使用，氯化溶菌酶作為消炎劑使用，因此，本發(fā)明的諾如病毒滅活劑能夠安 全地使用。因此，本發(fā)明的諾如病毒滅活劑、本發(fā)明的諾如病毒的滅活方法、本發(fā)明的諾如 病毒感染的預防劑或治療藥、本發(fā)明的諾如病毒滅活用皮膚外用劑對于抑制諾如病毒的繁 殖、殺滅、預防諾如病毒感染、防止感染的擴大W及治療感染有用。
[0031] 特別是根據(jù)將溶菌酶或其鹽或者它們的改性物與低級醇、多元醇等含醇液體混合 而得到的諾如病毒滅活劑，發(fā)揮醇的除菌效果和所述溶菌酶類的諾如病毒滅活效果運兩 者，因此，能夠日常進行住所環(huán)境的殺菌和諾如病毒的滅活。
[0032] 另外，根據(jù)本發(fā)明的諾如病毒滅活劑的制造方法，能夠簡便地制造諾如病毒滅活 劑，根據(jù)諾如病毒滅活用溶菌酶類的制造方法，能夠制造諾如病毒滅活效果極高的溶菌酶 類。
【附圖說明】
[0033] 圖1是示意性地表示在本發(fā)明的諾如病毒滅活劑的制造方法中，在得到溶菌酶的 加熱改性物的工序中，第1加熱工序、第2加熱工序W及第3加熱工序中的加熱時間與透射率 的關系的圖。
[0034] 圖2是表示本發(fā)明的一個實施例中得到的溶菌酶類(溶菌酶和/或其鹽的改性物） 的電泳(S D S - P AG E)結(jié)果的照片。
[0035] 圖3中，圖3(a)是諾如病毒的電子顯微鏡照片，圖3(b)是溶菌酶類(在80°C下通過 180分鐘的加熱而得到的溶菌酶改性物）的電子顯微鏡照片，圖3(c)是從接觸開始1分鐘的 時刻的諾如病毒和溶菌酶類(溶菌酶改性物)的電子顯微鏡照片。
[0036] 圖4中，圖4(a)是從接觸開始1小時的時刻的諾如病毒和溶菌酶類(通過80°CX 180 分鐘的加熱而得到的溶菌酶改性物)的電子顯微鏡照片，圖4(b)是從接觸開始1分鐘的時刻 的諾如病毒和溶菌酶類(非加熱溶菌酶)的電子顯微鏡照片。
[0037] 圖5是使人諾如病毒和本發(fā)明的溶菌酶類（100ΓΧ40分鐘)接觸1小時后，通過實 時PCR法對人諾如病毒基因劑量進行分析的結(jié)果。
【具體實施方式】
[0038] W下，對本發(fā)明詳細地進行說明。應予說明，在本發(fā)明中，只要沒有特別說明，貝U "份'是指"質(zhì)量份是指"質(zhì)量％"。
[0039] <
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0040] 本發(fā)明的諾如病毒滅活劑含有選自溶菌酶和/或其鹽W及它們的改性物中的至少 1種（W下，有時也簡記為"溶菌酶類"）。溶菌酶類用于諾如病毒的滅活。即，本發(fā)明的諾如病 毒滅活劑可W含有溶菌酶和/或其鹽W及它們的改性物下，有時也將溶菌酶和/或其鹽 的改性物簡記為"溶菌酶改性物"）中的1種或巧巾W上。
[0041] 例如，本發(fā)明的諾如病毒滅活劑可溶菌酶類(例如，溶菌酶或其鹽或者它們的 改性物)作為有效成分。該諾如病毒滅活劑可W作為諾如病毒的消毒劑、諾如病毒感染的預 防藥或治療藥等使用。另外，根據(jù)使用形態(tài)，也可W作為外用劑或口服劑使用。
[0042] 在本發(fā)明中，"諾如病毒的滅活(deactivate)"是指使通過感染小腸的上皮細胞并 繁殖而引起嘔吐、腹瀉等癥狀的諾如病毒的活性降低，不僅包含將諾如病毒殺滅而降低活 性，還包含在諾如病毒生存的狀態(tài)下僅使活性降低。
[0043] <溶菌酶和/或其鹽>
[0044] 在本發(fā)明中，"溶菌酶"是指具有將N-乙酷葡萄糖胺和N-乙酷胞壁酸的β-1，4鍵 水解的性質(zhì)的蛋白質(zhì)。
[0045] 可W在本發(fā)明的諾如病毒滅活劑中含有的溶菌酶廣泛存在于蛋、動物的組織、體 液、植物等生物界，根據(jù)底物特異性和結(jié)構，大致分類為W下的5種類型。另外，可W將溶菌 酶和/或其鹽作為溶菌酶改性物的原料使用。
[0046] 1.溶菌酶(細菌型）
[0047] 2.溶菌酶(雞型）
[004引 3.溶菌酶(碟型）
[0049] 4.溶菌酶(隧菌體型;V型）
[(Κ)加]5.溶菌酶(CH型）
[0051] 在本發(fā)明中，5種類型均可W使用。運些溶菌酶中，作為本發(fā)明中使用的溶菌酶類、 W及作為溶菌酶改性物的原料，從作為食品添加劑等廣泛使用的觀點考慮，優(yōu)選蛋清溶菌 酶、人溶菌酶等溶菌酶(雞型），進而，從低成本且獲得容易的方面考慮，特別優(yōu)選為蛋清溶 菌酶和/或其改性物。
[0052] 另外，作為溶菌酶的鹽，可W舉出作為食品添加劑可容許或藥學上可容許的鹽，例 如可W舉出：鹽酸、碳酸、憐酸、棚酸、六偏憐酸、硝酸、硫酸等無機酸的鹽、巧樣酸、酒石酸、 班巧酸、蘋果、乙酸、谷氨酸、甘油憐酸、葡糖酸等有機酸的鹽。溶菌酶的鹽中，優(yōu)選無機酸的 鹽，從作為消炎劑被廣泛使用、確立了安全性的方面考慮，優(yōu)選氯化溶菌酶等鹽酸鹽。
[0053] 作為溶菌酶和/或其鹽的改性方法，可W舉出加熱處理、酸處理、堿處理、酶處理、 有機溶劑處理、表面活性劑處理、氧化處理、還原處理、高壓力處理等。運些改性處理可W單 獨進行或者并用進行。應予說明，溶菌酶改性物中也含有將溶菌酶和/或其鹽進行分解處理 而得的來自溶菌酶的膚。
[0054] 溶菌酶類中，從諾如病毒的滅活效果的方面考慮，優(yōu)選將溶菌酶和/或其鹽進行加 熱改性而得的物質(zhì)下，也簡稱為"加熱改性物"）。加熱改性物與非加熱的溶菌酶和/或其 鹽相比能夠在短時間內(nèi)使諾如病毒滅活。因此，本發(fā)明也包含將溶菌酶和/或其鹽加熱改性 的方法作為諾如病毒滅活用溶菌酶的制造方法。
[0055] 加熱改性只要能適度地進行溶菌酶和/或其鹽的改性，就不特別限定加熱條件，但 優(yōu)選將溶菌酶和/或其鹽在50°C~130°C、優(yōu)選60°CW上、更優(yōu)選70°CW上進行加熱。
[0056] 作為加熱改性的方法，可W使溶菌酶和/或其鹽溶解于溶劑并加熱，也可W在粉末 的狀態(tài)下直接加熱，使溶菌酶和/或其鹽溶解并加熱時，加熱時間可w根據(jù)溶菌酶加熱溫度 來決定，可W為1分鐘~720分鐘。在粉末的狀態(tài)下加熱時，加熱時間優(yōu)選為1天W上且小于 30天。應予說明，上述溶劑只要為能夠溶解溶菌酶和/或其鹽的溶劑就沒有限定，例如可W 為水、含有水的有機溶劑。
[0化7] <得到加熱改性物的工序>
[005引得到上述加熱改性物的工序包含:第1加熱工序下，也簡稱為"第1加熱工序"）， 對波長660nm的光的透射率超過70 % (優(yōu)選為80 % W上，更優(yōu)選為90 % W上，通常為100 % W 下）、抑為5.0~7.0、且溶菌酶和/或其鹽的濃度W固體成分換算計為0.5質(zhì)量％~7質(zhì)量％ 的溶菌酶的水溶液進行加熱直到該水溶液的波長660nm的光的透射率成為70%;第2加熱工 序下，也簡稱為"第2加熱工序"），在上述第1加熱工序之后，將該水溶液加熱至該水溶液 的波長660nm的光的透射率小于70%的極小值后，對該水溶液進行加熱直到該水溶液的波 長660nm的光的透射率成為70%; W及第3加熱工序下，也簡稱為"第3加熱工序"），在上 述第巧日熱工序之后，在上述水溶液的波長660nm的光的透射率超過70 %的狀態(tài)下進一步對 該水溶液加熱。通過上述第1加熱工序、第巧日熱工序W及第3加熱工序，可W得到溶菌酶改 性物。
[0059] 通過上述第1加熱工序、第巧日熱工序W及第巧日熱工序，可W得到由上述定義規(guī)定 的巧光強度為4000 W上的溶菌酶改性物。
[0060] [加熱的機理]
[0061] 圖1是示意性地表示在本實施方式的溶菌酶改性物的制造方法中，第1加熱工序、 第巧日熱工序W及第巧日熱工序中的加熱時間與透射率的關系的圖。本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)在對含 有溶菌酶的水溶液進行加熱時，波長660nm的光的透射率根據(jù)加熱時間如圖1所示那樣發(fā)生 變化。推測該透射率的變化由得到的溶菌酶改性物的表面疏水性的變化(主要是表面疏水 性的增加)和水溶性的變化(水溶性的降低和隨后的水溶性的增加）引起。
[006^ [第1加熱工序]
[0063] 如圖1所示，通過第1加熱工序，波長660nm的光的透射率超過70%的水溶液中的該 光的透射率降低而成為70%是指該水溶液的透射率降低，例如，通過目視能夠確認該水溶 液的白濁。
[0064] 目P，推測在第1加熱工序中，上述水溶液中的溶菌酶的立體結(jié)構和/或溶菌酶的表 面的表面疏水性上升，疏水性部分互相吸引而凝聚，上述水溶液中的溶菌酶的溶解性降低， 結(jié)果該水溶液的波長660nm的光的透射率從超過70%降低至70%。
[00例（原料）
[0066] 在第1加熱工序中在水溶液中使用的作為原料的溶菌酶和/或其鹽可W使用在上 述的 <溶菌酶和/或其鹽 >一欄中例示的溶菌酶和/或其鹽。從低成本且獲得容易的方面考 慮，作為原料的溶菌酶和/或其鹽優(yōu)選為蛋清溶菌酶。
[0067] (原料的濃度）
[006引從能夠可靠地改變?nèi)芫傅牧Ⅲw結(jié)構、且能夠防止溶菌酶的凝聚而提高諾如病毒 的滅活作用的方面考慮，優(yōu)選在第1加熱工序中水溶液中的溶菌酶的濃度為1質(zhì)量％ W上， 另一方面，優(yōu)選為5質(zhì)量％ W下。
[0069](溶菌酶和/或其鹽的水溶液）
[0070] 構成溶菌酶和/或其鹽的水溶液的溶劑為水，但也可W在不影響溶菌酶和/或其鹽 在水中的溶解性的范圍使用與水混合的有機溶劑。構成溶菌酶和/或其鹽的水溶液的溶劑 中的水的比例通常為80質(zhì)量％~100質(zhì)量％。另外，構成溶菌酶和/或其鹽的水溶液的溶劑 含有與水混合的有機溶劑時，構成溶菌酶和/或其鹽的水溶液的溶劑中的該有機溶劑的比 例通常為1質(zhì)量％~20質(zhì)量％。
[0071] 作為上述有機溶劑，只要為與水混合的有機溶劑即可，例如可W舉出甲醇、乙醇、 1-丙醇、2-丙醇、乙二醇、丙二醇、甘油等醇系溶劑、丙酬、甲基乙基酬等酬系溶劑、乙臘、 四氨巧喃、1，4一二0惡燒等，它們可W單獨使用或組合使用巧巾W上。
[0072] (pH)
[0073] 從能夠防止溶菌酶的凝聚、且能夠提高得到的溶菌酶改性物的表面疏水性的方面 考慮，在第1加熱工序、第巧日熱工序W及第3加熱工序中，上述水溶液的pH更優(yōu)選為5.5 W 上，另一方面，更優(yōu)選為6.5W下。
[0074] 另外，可W根據(jù)需要使用酸（例如，鹽酸、硫酸、硝酸等無機酸、巧樣酸、乙酸、憐酸 等有機酸）、堿(例如，氨氧化鋼、氨氧化鐘等無機堿)或緩沖液(例如，乙酸緩沖液)將上述水 溶液調(diào)整到上述范圍的抑。
[0075] 例如，溶菌酶為溶菌酶的鹽(例如氯化溶菌酶)時，優(yōu)選在使用酸、堿或緩沖液將水 溶液的抑調(diào)整到上述范圍的抑的基礎上進行第1加熱工序。
[0076] [第巧日熱工序]
[0077] 在第2加熱工序中，通過在加熱至第1加熱工序中得到的水溶液的波長660nm的光 的透射率從70%到小于70% (優(yōu)選小于60%，更優(yōu)選小于50%，通常為0%W上）的極小值后 進行加熱直到第1加熱工序中得到的水溶液的波長660nm的光的透射率成為70%，第1加熱 工序中得到的水溶液的光的透射率進一步降低(其結(jié)果，通過目視能夠確認水溶液的白濁 和/或沉淀），然后，該透射率變?yōu)樵黾?，能夠確認該白濁和/或沉淀逐漸消失(其結(jié)果，通過 目視能夠確認逐漸變得透明）。
[007引目P，推測在第2加熱工序中，隨著上述水溶液中的溶菌酶的立體結(jié)構進一步發(fā)生變 化、溶菌酶的表面疏水性進一步升高，溶菌酶的水溶性在暫時降低后升高，結(jié)果水溶液的波 長660nm的光的透射率成為70%。
[0079] 在第巧日熱工序中，隨著溶菌酶的表面疏水性進一步升高，溶菌酶的水溶性在暫時 降低后升高的機理尚未明確，但推測是因為通過第巧日熱工序，在第1加熱工序中凝聚的溶 菌酶彼此結(jié)合而變成線狀的凝聚體，該凝聚體在上述水溶液溶解，因此，上述水溶液中的溶 菌酶的溶解性上升。
[0080] 第2加熱工序可W在第1加熱工序之后接著進行。即，第2加熱工序可W與第1加熱 工序連續(xù)地進行。
[0081] [第：3加熱工序]
[0082] 推測在第3加熱工序中，上述水溶液中的溶菌酶的立體結(jié)構進一步發(fā)生變化，在維 持溶菌酶的水溶性的狀態(tài)下，溶菌酶的表面疏水性進一步升高，結(jié)果，能夠維持水溶液的波 長660nm的光的透射率超過70%的值。
[0083] 更具體而言，在第巧日熱工序中，優(yōu)選在該水溶液中不產(chǎn)生白濁和/或沉淀(維持該 水溶液的透射率(透明性））。
[0084] 從能夠更可靠地改變上述水溶液中的溶菌酶的立體結(jié)構的方面考慮，第巧日熱工 序更優(yōu)選進行加熱直到該水溶液的波長660nm的光的透射率成為75% W上，更優(yōu)選進行加 熱直到該水溶液的波長660nm的光的透射率成為80% W上(通常為100% W下）。
[0085] 進而，第3加熱工序優(yōu)選在將第3加熱工序中得到的水溶液用0.45皿的膜過濾器過 濾而得到的物質(zhì)和乙醇W質(zhì)量比1:1的比例混合時進行加熱直到波長66化m的光的透射率 成為85 % W上，更優(yōu)選進行加熱直到波長660nm的光的透射率成為90 % W上(通常為100 % W下)。
[0086] 將第3加熱工序中得到的水溶液用0.45WI1的膜過濾器過濾而得到的物質(zhì)和乙醇W 質(zhì)量比1:1的比例混合時波長660皿的光的透射率成為85% W上可W設為得到由上述定義 定義的巧光強度為4000W上的溶菌酶改性物的指標。
[0087] 第3加熱工序可W在第2加熱工序之后接著進行。即，第3加熱工序可W與第1加熱 工序和第2加熱工序連續(xù)地進行。
[0088] 在第3加熱工序中，在上述透射率超過70%的狀態(tài)下加熱過的（透明化了的）水溶 液即使返回到室溫(例如25Γ)也能夠維持該透射率(能夠維持透明性）。作為其原因，推測 是因為即使在室溫下也維持該水溶液中含有的溶菌酶等的形態(tài)(立體結(jié)構）。
[0089] (加熱溫度和加熱時間）
[0090] 在本實施方式的諾如病毒滅活劑的制造方法(溶菌酶改性物的制造）中，從能夠?qū)?現(xiàn)高收率、且能夠?qū)⒃撍芤赫{(diào)整為第1加熱工序、第巧日熱工序W及第3加熱工序中各自規(guī) 定的透射率的方面考慮，優(yōu)選W使第1加熱工序、第巧日熱工序W及第巧日熱工序中的該水溶 液的中屯、品溫為70°C W上的方式進行加熱，從因加熱時間短而能夠縮短制造時間的方面考 慮，更優(yōu)選80°C W上，進一步優(yōu)選90°C W上（可W為130°C W下，也可W為約100°C W下）。應 予說明，第1加熱工序、第2加熱工序W及第3加熱工序中的加熱時間可W根據(jù)加熱溫度和處 理量W滿足各工序中規(guī)定的透射率的方式適當決定。
[0091] 在相同加熱溫度下連續(xù)地進行第1加熱工序、第巧日熱工序W及第巧日熱工序時，第 1加熱工序中的加熱時間、第2加熱工序中的加熱時間W及第3加熱工序中的加熱時間優(yōu)選 W合計計在中屯、品溫為70 °C~75 °C時為125分鐘~720分鐘，在中屯、品溫超過75 °C且為80°C W下時為80分鐘~435分鐘，在中屯、品溫超過80°C且為85°C W下時為70分鐘~305分鐘，在 中屯、品溫超過85°C且為90°C W下時為50分鐘~240分鐘，在中屯、品溫超過90°C且為95°C W 下時為40分鐘~185分鐘，在中屯、品溫超過95°C且為100°CW下時為25分鐘~120分鐘，在中 屯、品溫超過100 °C時為10分鐘~120分鐘。
[0092] (噴霧干燥/冷凍干燥）
[0093] 應予說明，在本發(fā)明的溶菌酶改性物的制造方法中，可W在上述第3加熱工序之 后，進一步包含使上述水溶液噴霧干燥或冷凍干燥而得到粉末狀的溶菌酶改性物的工序。
[0094] ]噴霧干燥和冷凍干燥根據(jù)常規(guī)方法進行即可。
[00M] <諾如病毒滅活作用>
[0096] 在本發(fā)明中，諾如病毒滅活作用可W通過使用后述的實施例中所記載的方法（即， 感染了諾如病毒的小鼠細胞)的系統(tǒng)進行評價。
[0097] (巧光強度）
[0098] 對本發(fā)明的溶菌酶類而言，從表面疏水性更高、諾如病毒的滅活作用更優(yōu)異的方 面考慮，由下述定義規(guī)定的溶菌酶類(溶菌酶和/或其鹽的改性物（w下，有時也記為"溶菌 酶改性物"）、更具體而言為溶菌酶改性物的巧光強度優(yōu)選為4000W上，更優(yōu)選為5000W上， 通常為10000W下。應予說明，在本發(fā)明中，"室溫"是指20°C~25°C。
[0099] 巧光強度:在W上述溶菌酶類的濃度W固體成分換算計為0.05質(zhì)量％、且憐酸鹽 的濃度為0.2M的方式用憐酸緩沖液(PH7.0)稀釋而得到的稀釋液5mL中添加8mM的1，8 -苯 胺基糞橫酸的甲醇溶液2扣L，使得到的液體在室溫下反應30分鐘后，在激發(fā)波長390nm(激 發(fā)帶寬lOnm)和巧光波長470nm(巧光帶寬lOnm)的條件下對該液體進行測定而得到的巧光 強度。
[0100] 本發(fā)明中規(guī)定的溶菌酶類的巧光強度是溶菌酶類的表面疏水性的指標。即，可W 說本發(fā)明中規(guī)定的溶菌酶類的巧光強度越高，溶菌酶類的表面疏水性越高。另外，有溶菌酶 類的表面疏水性越高，諾如病毒的滅活效果(抗諾如病毒活性)越優(yōu)異的趨勢。
[0101] 本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)有溶菌酶類的表面疏水性越高，諾如病毒的滅活作用越高的趨 勢。其中，作為溶菌酶加工品和/或其鹽的本發(fā)明的溶菌酶改性物具有諾如病毒的滅活作用 更優(yōu)異運樣的特征。應予說明，在本發(fā)明中，"溶菌酶加工品"是溶菌酶改性物，具有與溶菌 酶和/或其鹽不同的立體結(jié)構。
[0102] 本發(fā)明的溶菌酶加工品和/或其鹽具有優(yōu)異的諾如病毒的滅活作用的原因尚未明 確，但推測如下:第1，具有表面疏水性的溶菌酶加工品和/或其鹽容易與諾如病毒的疏水性 部位結(jié)合;第2，溶菌酶加工品和/或其鹽為溶菌酶改性物，通過改性，溶菌酶加工品含有溶 菌酶所具有的S-S鍵的至少一部分斷開而得到的硫醇基（一SH)，該硫醇基與存在于諾如病 毒的表面的S-S鍵鍵合;第3,溶菌酶加工品和/或其鹽具有容易與諾如病毒結(jié)合的立體結(jié) 構。
[0103] 應予說明，W溶菌酶類的濃度W固體成分換算計為0.05質(zhì)量％、憐酸鹽的濃度為 0.2M的方式用憐酸緩沖液稀釋，具體而言是指例如在測定含有W固體成分換算計為1質(zhì) 量％的溶菌酶類的水溶液的巧光強度時，將上述水溶液5g和0.25M的憐酸緩沖液80mL放入 lOOmL的容量瓶中后，用純化水定容至lOOmL而進行調(diào)整。
[0104] 在本發(fā)明中，溶菌酶類的巧光強度為通過Canadian Institute of Food Science and Technology 1985Vol.l8No.4p.290-295中記載的方法測得的值。應予說明，本發(fā)明中 的溶菌酶類的巧光強度的測定中使用的憐酸緩沖液是用憐酸二氨鋼和憐酸氨二鋼制備而 成的。另外，本發(fā)明中的溶菌酶類的巧光強度為另外測定0.2M憐酸緩沖液(PH7.0、含有憐酸 二氨鋼和憐酸氨二鋼作為憐酸鹽)的巧光強度作為空白值并減去該空白值而得的值。
[0105] 更具體而言，溶菌酶類的巧光強度為使用日本分光株式會社制的型號FP-8500巧 光光譜光度計在激發(fā)波長390nm、激發(fā)帶寬lOnm、巧光波長470nm、巧光帶寬lOnm、響應 0.5sec、靈敏度Low(約270±10V)(電源頻率（50/60HZ))、使用化ristaltic Sipper SHP- 820型的條件下測定時的值。應予說明，也可W使用其它巧光光譜光度計(例如，株式會社日 立制作所制，型號F-2000巧光光譜光度計)進行測定，但此時需要使靈敏度等測定條件符 合本申請中規(guī)定的條件。
[0106] (抗諾如病毒活性）
[0107] 上述溶菌酶類優(yōu)選下述所規(guī)定的抗諾如病毒活性為2.0W上。
[0108] 抗諾如病毒活性:將等量混合諾如病毒液和所述溶菌酶類的2質(zhì)量％水溶液而得 到的諾如病毒混合液在室溫下放置1分鐘時，從放置前的感染效價的對數(shù)減去放置后的感 染效價的對數(shù)而得的值
[0109] (二聚體和Ξ聚體）
[0110] 上述溶菌酶類(溶菌酶改性物，更具體而言，溶菌酶加工品和/或其鹽)可W含有約 29邸a化化=10化曰）的蛋白質(zhì)和/或約36.5KDa的蛋白質(zhì)。即，本發(fā)明的諾如病毒滅活劑可W 含有約29KDa的蛋白質(zhì)和/或約36.5KDa的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的諾如病毒滅活劑W及上述溶 菌酶類中含有約29KDa的蛋白質(zhì)和/或約36.5KDa的蛋白質(zhì)可W通過后述的實施例所示的電 泳來確認。應予說明，電泳可W使用市售的電泳試劑盒進行。
[0111 ]推測約29KDa的蛋白質(zhì)為溶菌酶改性物的二聚體，推測約36.5KDa的蛋白質(zhì)為溶菌 酶改性物的Ξ聚體。
[0112] 在本發(fā)明的諾如病毒滅活劑中，通過含有約29KDa的蛋白質(zhì)和/或約36.5KDa的蛋 白質(zhì)，可提高抗諾如病毒活性。
[0113] <溶菌酶和/或其鹽的含量>
[0114] 在本發(fā)明的諾如病毒滅活劑中，溶菌酶類的優(yōu)選的含量（固體成分換算)取決于該 諾如病毒滅活劑中使用的溶菌酶的種類、諾如病毒滅活劑的劑型、使用形態(tài)等，可W為諾如 病毒滅活劑的0.05質(zhì)量％ ^上，進一步可W為0.1質(zhì)量％ ^上，特別是可W為0.25質(zhì)量％ W 上(例如，0.05質(zhì)量％~100質(zhì)量％)。在此，本發(fā)明的諾如病毒滅活劑含有溶菌酶類中的巧中 W上時，溶菌酶類的含量(固體成分換算)是指溶菌酶類的合計的含量。
[011引 < 配合材料>
[0116] 在本發(fā)明的諾如病毒滅活劑中，與溶菌酶類一起配合的配合材料可W根據(jù)諾如病 毒滅活劑的劑型等適當選擇，例如可W適當組合使用水；乙醇、異丙醇等碳原子數(shù)5W下的 低級醇;甘油、聚乙二醇、下二醇、丙二醇、二丙二醇、山梨醇等多元醇;甘氨酸、有機酸、甘油 脂肪酸醋、薦糖脂肪酸醋、苯甲酸鋼、山梨酸鋼、丙酸鋼、脫氨乙酸鋼、對徑基苯甲酸醋、亞硫 酸鋼、EDTA、苯扎氯錠、節(jié)索氯錠、葡萄糖酸氯己定、鹽酸烷基二氨基乙基甘氨酸、艦町、艦 伏、嫁蠟基憐酸節(jié)燒錠、Ξ氯生、氯二甲苯酪、異丙基甲基苯酪、ε-聚賴氨酸、乳鐵蛋白、乳酸 鏈球菌素、細菌素、食用±當歸提取物、野萊莉提取物、茵陳葛提取物、酶解慧巧提取物、魚 精蛋白提取物、芋側(cè)素、果膠分解物等抑菌劑。
[0117] 其中，通過使用水、低級醇和多元醇中的至少1種、特別是使用含有低級醇和多元 醇中的至少巧巾的醇制劑，能夠兼具醇的殺菌效果和溶菌酶類的諾如病毒滅活效果，作為消 毒劑的便利性升高。
[011引此外，本發(fā)明的諾如病毒滅活劑中也可W根據(jù)需要添加巧樣酸、巧樣酸鋼、氨氧化 鋼、Ξ乙醇胺等抑調(diào)節(jié)劑、生育酪乙酸醋等抗氧化劑、簇基乙締基聚合物、徑乙基纖維素等 增稠劑等添加劑。
[0119] < 劑型 >
[0120] 本發(fā)明的諾如病毒滅活劑可W根據(jù)需要采用各種劑型，例如可W制成液劑，也可 W制成粉末、片劑、膠囊等固形劑。
[0121] 制成液劑時，其粘度可W根據(jù)使用方法適當確定。例如，通過制成可噴霧的粘度的 液劑并填充于手扣式噴霧器、擠壓容器、氣霧劑容器等噴霧容器中，對手指、食品、烹調(diào)器 具、住所環(huán)境、嘔吐物、排泄物等噴霧含有該諾如病毒滅活劑的液滴，由此，可W方便地進行 諾如病毒的滅活，也可w通過將滅活的對象物(例如，手指、食品、醫(yī)療設備、醫(yī)療器具、烹調(diào) 器具、住所環(huán)境)浸在含有諾如病毒滅活劑的液劑中，方便地進行諾如病毒的滅活。另外，可 濕潤了含有諾如病毒滅活劑的液劑的片（sheet)的形式使用。進而，可W通過制成洗 劑、乳膏等而作為皮膚外用劑使用，由此，諾如病毒即使附著于手指也會立即滅活，可W作 為防止諾如病毒經(jīng)口感染的感染預防藥使用。
[0122] 另一方面，制成固形劑時，例如通過預先口服，即使諾如病毒進入口中，也可W作 為將其滅活而預防感染的感染預防藥使用，另外，在因諾如病毒而導致感染癥發(fā)病時，也可 W作為將體內(nèi)的諾如病毒滅活的治療藥使用。作為本發(fā)明的諾如病毒滅活劑的攝取方法， 例如可W舉出：口服、栓劑、輸液、靜脈注射等。
[0123] <諾如病毒的滅活方法>
[0124] 本發(fā)明包含使用溶菌酶類在住所、食品廠、公共設施、醫(yī)院等各種環(huán)境或狀況中將 諾如病毒滅活的方法。其中，不包括作為醫(yī)療實踐的將諾如病毒滅活的情況。
[0125] 溶菌酶W往作為食品添加劑使用，其溶菌酶的鹽也作為抗菌劑使用。特別是氯化 溶菌酶作為消炎劑被廣泛使用，確立了安全性。因此，溶菌酶或其鹽或者它們的改性物只要 不會損害將諾如病毒滅活運樣的本發(fā)明的有效成分的特異性，對使用方法就沒有特別限 制。
[0126] 目P，可W采用根據(jù)上述的諾如病毒滅活劑的劑型將諾如病毒滅活劑噴霧或涂布于 將諾如病毒滅活的對象區(qū)域或者與將諾如病毒滅活的對象物混合而進行攝取等方法。
[0127] <諾如病毒滅活劑的制造方法>
[0128] 本發(fā)明包含使作為將諾如病毒滅活的有效成分的溶菌酶類含有在各種固體或液 體的載體中而制造諾如病毒滅活劑的方法。特別是，包含使溶菌酶類與含有低級醇和多元 醇中的至少巧中的液體混合而制造諾如病毒滅活劑的方法，其中，包含與醇制劑混合而制造 諾如病毒滅活劑的方法。此時，含有溶菌酶類的對象只要不損害將諾如病毒滅活運樣的本 發(fā)明的有效成分的特異性就沒有特別限制，例如只要將溶菌酶類和上述的配合材料混合， 制備成期望的劑型即可。
[01巧] < 關于作用效果>
[0130] 本發(fā)明的諾如病毒滅活劑的作為有效成分的溶菌酶類與W往作為諾如病毒滅活 劑的有效成分已知的柿子提取物(柿單寧)和葡萄的種子等中含有的原花青素相比，對諾如 病毒具有優(yōu)異的滅活作用，特別是加熱改性物能夠在1分鐘W內(nèi)運樣的極短的作用時間內(nèi) 使諾如病毒滅活。另外，溶菌酶一直W來就作為提高食品的耐存性的食品添加劑使用，氯化 溶菌酶作為消炎劑使用，因此，本發(fā)明的諾如病毒滅活劑能夠安全地使用。進而，柿子提取 物(柿單寧)和葡萄的種子等中含有的原花青素均為多酪系?色素系的物質(zhì)，在噴霧時存在 餐具、器具著色等問題，但本發(fā)明的諾如病毒滅活劑為白色，不會使餐具、器具著色，因此， 能夠廣泛使用。
[0131] 實施例
[0132] W下，通過試驗例對本發(fā)明具體地進行說明。
[0133] [試驗例1]
[0134] [1]溶菌酶溶液的制備
[0135] 作為諾如病毒滅活劑，如下制備:準備將蛋清(雞蛋蛋清)溶菌酶化ewpie株式會社 審Ij)溶解于蒸饋水，制成規(guī)定濃度后，在表1所示的條件下進行加熱處理并空氣冷卻(試驗編 號2~14)。另外，將同樣的蛋清溶菌酶(非加熱溶菌酶)溶解于水并進行過濾滅菌，由此制備 濃度10質(zhì)量％的溶菌酶溶液(試驗編號1)。將測定各溶液的諾如病毒活性，將得到的結(jié)果示 于表1。
[0136] 應予說明，各試驗編號中的反應液(水溶液）的波長660nm的光的透射率利用吸光 光度計(型號"UV-2450"、株式會社島津制作所制)測定。
[0137] 在試驗編號8、9、11、13和14中，確認到作為上述第1加熱工序、第巧日熱工序^及第 3加熱工序記載的反應液的透射率的變化。應予說明，在本試驗例中，連續(xù)地進行第1加熱工 序、第巧日熱工序W及第巧日熱工序，表1的加熱時間為第1、第2W及第巧日熱工序中的加熱時 間的合計。
[0138] 更具體而言，在制備試驗編號8、9、11、13和14的溶菌酶改性物時的加熱工序中，確 認到第1加熱工序前的反應液的波長66化m的光的透射率超過70% (99%~100%)，但通過 第1加熱工序，該透射率降低，成為70%，接著，通過第巧日熱工序，該透射率進一步降低，該 第2加熱工序中的反應液的透射率的極小值小于70 % (20 %~30 % )后，該透射率再次上升， 成為70 %后，通過接下來的第3加熱工序，該透射率進一步上升，最終該第3加熱工序結(jié)束后 的反應液的透射率超過70%。
[0139]
[0140] [2]感染效價的評價
[0141 ]通過空斑測定法如下評價各試驗編號的感染效價。
[0142] (1)在6孔板中，將小鼠巨隧細胞株(RAW264.7細胞)培養(yǎng)至60~80%融合。
[01創(chuàng) （2)另一方面，如下制備諾如病毒的感染效價(P即/1^)為106~10郵U/血左右的病 毒液。
[0144] 首先，將小鼠巨隧細胞株(RAW264.7細胞)培養(yǎng)至融合，對融合的細胞接種ImL的諾 如病毒液，在2天、37°C、5%C02條件下進行培養(yǎng)。此時，作為諾如病毒液，使用Murine norovirus strain 1(MNV-1)(Effect of Food Residues on Norovirus Survival on Stainless Steel Surfaces)。
[0145] 培養(yǎng)后，通過目視確認細胞剝離，重復4次凍融將細胞破壞，釋放細胞中的病毒。然 后，分注于50mL離屯、管中，進行離屯、分離(8,000g、20分鐘），得到感染效價(P即/mU為106~ 107PFU/mL左右的諾如病毒液。該諾如病毒液在一80°C下保存，解凍使用。
[0146] (3)在試驗編號1~14的溶菌酶溶液中加入等量的（2)中得到的諾如病毒液，將其 作為試驗編號1~14的評價用樣品。
[0147] 將各評價用樣品在室溫下放置規(guī)定的反應時間（0分鐘、1分鐘或60分鐘），由此使 各評價用樣品中的溶菌酶與諾如病毒反應。
[0148] 反應后，將各評價用樣品稀釋l〇x倍，作為稀釋樣品。在此，X為整數(shù)，在后述的（8) 中，設為能夠通過目視數(shù)出空斑數(shù)的數(shù)。即，在(8)中，W空斑數(shù)為10~100左右的方式調(diào)整 稀釋倍率。
[0149] (4)在（1)的板中除去總量的培養(yǎng)液，將放置規(guī)定時間后稀釋的稀釋樣品Κ5(Κ)μLν we 11各2個孔地進行接種。
[0150] (5)-邊W小鼠巨隧細胞株(RAW264.7細胞)不會干燥的方式振蕩一邊在室溫下培 養(yǎng)1小時，使小鼠巨隧細胞株感染諾如病毒。
[0151] (6)將板上的500yL/well的接種液總量除去，按2ml/well重疊1.5%Sea Plaque Agarose-DMEM(37°C)，其凝固后，在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)2天。
[0152] (7)在培養(yǎng)2天后的板上按2mL/well重疊作為染色液的0.03%中性紅溶液，在37 °C、5%C02條件下下培養(yǎng)1小時。
[0153] (8)在(7)的培養(yǎng)后除去總量的0.03%中性紅溶液，通過目視數(shù)出空斑數(shù)。由得到 的空斑數(shù)和稀釋倍率算出感染效價(PFU/mL)。
[0154] (9)另外，基于表1所示的結(jié)果，由W下的式子算出試驗編號3~14的抗諾如病毒活 性。其結(jié)果，在巧光強度為4000W上的試驗編號8、9、11、13^及14的任一情況下均確認到由 W下的式子所規(guī)定的抗諾如病毒活性為2W上。
[0155] 抗諾如病毒活性= Logio(放置1分鐘前的諾如病毒混合液的感染效價）一Logio(放 置1分鐘后的諾如病毒混合液的感染效價）
[0156] 其結(jié)果，試驗編號8、9、11、13^及14的溶菌酶改性物均能夠通過與諾如病毒的接 觸而使諾如病毒的感染效價降低至l/l〇2W下，確認到具有諾如病毒滅活效果。
[0157] 另外，溶菌酶改性物(試驗編號6)和非加熱的溶菌酶(試驗編號1)顯示與試驗編號 2的溶菌酶改性物同等的諾如病毒的滅活效果，溶菌酶改性物(試驗編號5)顯示比試驗編號 2的溶菌酶改性物稍強的諾如病毒的滅活效果。
[015引[試驗例2]
[0159] 在試驗例1中，變更溶菌酶的加熱時間和溶菌酶水溶液的濃度，得到具有表2所示 的巧光強度的溶菌酶改性物。
[0160] 表2
[0161]
[0162] [試驗例3]
[0163] 在本試驗例中，對溶菌酶改性物進行電泳。在本試驗例中，改變試驗例1中的加熱 條件(加熱溫度、加熱時間和蛋清溶菌酶的濃度)來制備溶菌酶改性物。
[0164] 更具體而言，在加熱溫度80°C下在加熱時間0分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘、90分 鐘W及120分鐘的時刻采取蛋清溶菌酶的2質(zhì)量％水溶液，在該水溶液SOiiL中加入樣品緩沖 液95化L，在100°C下加熱10分鐘后，冰冷，將10化(W溶菌酶改性物計為1 Oyg)填充于電泳凝 膠。應予說明，作為樣品緩沖液，使用未加入2-琉基乙醇的樣品緩沖液(非還原）。電泳的凝 膠使用SDS-PAG血ini(Tefco株式會社制，凝膠濃度4-10%，凝膠厚lmm)，W20mA的恒定電 流進行泳動。染色液使用coomassie blue-R250。
[0165] 圖2是表示電泳的結(jié)果的照片。如圖2所示，在加熱時間60分鐘、90分鐘W及120分 鐘的時刻明顯檢測出表示約29KDa的蛋白質(zhì)（推測為二聚體)和/或約36.5KDa的蛋白質(zhì)（推 測為Ξ聚體)的條帶。另外，確認到加熱時間越長，表示運些蛋白質(zhì)的條帶變得越深(生成的 上述蛋白質(zhì)的量增加）。另外，推測在同一加熱溫度下，加熱時間越長，該蛋白質(zhì)的表面疏水 性越增加，可得到諾如病毒滅活作用高的蛋白質(zhì)。
[0166] [試驗例4]
[0167] 在本試驗例中，使用電子顯微鏡拍攝諾如病毒與溶菌酶類的接觸。
[0168] 諾如病毒:作為諾如病毒，使用MNV-1 (由華盛頓大學(Washington化iversity)的 化rbert提供）。另外，制作除去了培養(yǎng)基成分的諾如病毒液。諾如病毒液的 制作方法如下。
[0169] 試驗樣品：使用將蛋清溶菌酶2質(zhì)量％水溶液分別在80°C下加熱180分鐘(試驗編 號9)而得到的溶菌酶改性物。加熱使用恒溫水槽。
[0170] 諾如病毒與溶菌酶改性物的接觸時間分別為1分鐘和1小時。
[0171] 試驗方法（自然染色法(Native Seining Method)):
[0172] 1)將試驗樣品滴加在石蠟膜上，使其在碳支承膜上接觸2分鐘。
[0173] 2)使1)中得到的試驗樣品在2質(zhì)量％乙酸軸上接觸2分鐘。
[0174] 3)用濾紙從2)中得到的試驗樣品中吸取多余的液體，使該試驗樣品干燥。
[0175] 4)用電子顯微鏡(JE0L JEM1200EX似80kV拍攝電子顯微鏡照片。
[0176] 考察；
[0177] 在文獻中，諾如病毒的大小(直徑）為30~40nm。在圖3(a)、圖4(a) W及圖4(b)中， "NV"是指諾如病毒，用圈圍住的地方為諾如病毒。
[0178] 如圖3(a)所示，在本試驗例中，可W觀察到直徑為30~40nm、與文獻中所記載的諾 如病毒的大小大致相同大小的球形的物體。根據(jù)大小進行判斷，推定該球形的物體為諾如 病毒。
[0179] 另外，如圖3(b)所示，可W觀察到非球形的楠圓的物體。已知溶菌酶(非加熱)是大 小(直徑)為3~4nm的粒子。因此，推定運些物體是溶菌酶通過加熱而改性，形狀發(fā)生變化的 溶菌酶改性物。
[0180] 如圖3(c)所示，在與諾如病毒的接觸開始1分鐘的時刻，觀察到推定是諾如病毒膨 脹的諾如病毒的球體。
[0181] 另外，如圖4(a)所示，在與諾如病毒的接觸開始1小時的時刻，也觀察到在與諾如 病毒的接觸開始1分鐘的時刻（圖3(c))所觀察到的推測是諾如病毒膨脹的諾如病毒的球 體。另外，在該時刻，和與諾如病毒的接觸開始1分鐘的時刻相比，觀察到諾如病毒數(shù)整體減 少。運與如上所述利用通過在80°C下180分鐘的加熱而得到的溶菌酶改性物，諾如病毒的生 存數(shù)減少至1000分之下的情況一致。
[0182] 另一方面，如圖4(b)所示，在諾如病毒與溶菌酶(非加熱）的接觸開始1分鐘的時 亥IJ，未觀察到諾如病毒的變化。
[0183] 另外，與溶菌酶(或溶菌酶改性物)的溶液接觸時的諾如病毒的直徑如下。
[0184] 諾如病毒：35.5±1.70nm
[0185] 非加熱溶菌酶：37.3±1.77nm
[0186] 溶菌酶改性物(80°C X 180分鐘加熱:49.1 ±2.12nm)
[0187] 根據(jù)本試驗例，確認到通過與溶菌酶改性物的接觸，諾如病毒膨脹。因此，推測通 過與溶菌酶改性物的接觸，諾如病毒膨脹，結(jié)果諾如病毒被滅活。
[018引[試驗例引
[0189] 在本試驗例中，使用實時PCR法研究溶菌酶改性物對人諾如病毒的效果。應予說 明，本試驗中使用的人諾如病毒液如下制備:將從患者的糞便中采取并在一80°C下冷凍保 存的人諾如病毒原液在冰上解凍，將其用憐緩沖生理鹽水稀釋成10倍后，W 100(K)rpm離屯、 分離20分鐘，除去沉淀物。
[0190] 試驗方法(實時PCR法）：
[0191] 將人諾如病毒液與試驗編號13的溶菌酶溶液或蒸饋水等量混合，放置1小時。接 著，利用使用了Takara qPCR Norovirus(GI/GII)Typing kit的實時PCR法測定人諾如病毒 基因劑量。
[0192] 其結(jié)果，確認到殘留在與試驗編號13的溶菌酶溶液的混合液中的人諾如病毒基因 劑量（圖5右側(cè)）比殘留在與蒸饋水的混合液中的人諾如病毒基因劑量（圖5左偵0少 1.51ogi日particles/mL。運表示溶菌酶改性物將人諾如病毒殺滅（圖5)。
[0193] [配合例1]
[0194] 使用試驗例1的溶菌酶改性物(試驗編號9)制造內(nèi)容物為下述配合的軟膠囊。
[0195] <配合比例> 落菌酶改性物（試猶論考9) 20%
[0196] 推攬減 50% 蜂蠟 10%
[0197]
[019引[配合例2]
[0199] 使用試驗例1的溶菌酶改性物(試驗編號11)制造內(nèi)容物為下述配合的下述配合的 粉劑(顆粒劑）。
[0200] <配合比例>
[0201]
[0202] [配合例3]
[0203] 使用試驗例1的溶菌酶改性物(試驗編號13)制造內(nèi)容物為下述配合的下述配合的 片劑。
[0204] <配合比例>
[0205]
[0206]
[0207] 產(chǎn)業(yè)上的可利用性
[0208] 本發(fā)明在將諾如病毒滅活的各種場合是有效的，例如作為進行手指、身軀、醫(yī)療器 具、學校、醫(yī)院、福利設施等設施、工廠、住所等的消毒的消毒劑、食品添加劑、諾如病毒的除 去劑、感染預防或治療藥是有用的。
[0209] W上是本發(fā)明的實施方式的說明。本發(fā)明包含與實施方式中說明的構成實質(zhì)上相 同的構成(例如，功能、方法和結(jié)果相同的構成、或目的和效果相同的構成）。另外，本發(fā)明包 含將實施方式中說明的構成的非本質(zhì)的部分置換的構成。另外，本發(fā)明包含與實施方式中 說明的構成產(chǎn)生相同的作用效果的構成或能夠?qū)崿F(xiàn)相同目的的構成。另外，本發(fā)明包含在 實施方式中說明的構成中附加了公知技術的構成。
【主權項】
1. 一種諾如病毒滅活劑，含有選自溶菌酶和/或其鹽以及它們的改性物中的至少1種的 溶菌酶類。2. 根據(jù)權利要求1所述的諾如病毒滅活劑，其中，所述溶菌酶類的含量為0.05質(zhì)量％以 上。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的諾如病毒滅活劑，其中，所述溶菌酶類的由下述定義規(guī)定 的熒光強度為4000以上， 所述熒光強度是如下測定的熒光強度，即，在以所述溶菌酶類的濃度以固體成分換算 計為0.05質(zhì)量％、且磷酸鹽的濃度為0.2M的方式用pH7.0的磷酸緩沖液稀釋而得到的稀釋 液5mL中添加8mM的1，8-苯胺基萘磺酸的甲醇溶液25yL，使得到的液體在室溫下反應30分 鐘后，在激發(fā)波長390nm、激發(fā)帶寬10nm和熒光波長470nm、熒光帶寬10nm的條件下對該液體 進行測定。4. 根據(jù)權利要求1~3中任一項所述的諾如病毒滅活劑，其中，所述溶菌酶類的下述所 規(guī)定的抗諾如病毒活性為2.0以上， 所述抗諾如病毒活性是將等量混合諾如病毒液和所述溶菌酶類的2質(zhì)量％水溶液而得 到的諾如病毒混合液在室溫下放置1分鐘時，從放置前的感染效價的對數(shù)減去放置后的感 染效價的對數(shù)而得的值。5. 根據(jù)權利要求1~4中任一項所述的諾如病毒滅活劑，其為液劑。6. -種諾如病毒的滅活方法，包含使用選自溶菌酶和/或其鹽以及它們的改性物中的 至少1種的溶菌酶類將諾如病毒滅活的工序。7. -種諾如病毒滅活用溶菌酶類的制造方法，是權利要求1~5中任一項所述的諾如病 毒滅活劑中含有的諾如病毒滅活用溶菌酶類的制造方法，包含將溶菌酶和/或其鹽加熱改 性的工序。8. -種諾如病毒滅活劑的制造方法，包含含有選自溶菌酶和/或其鹽以及它們的改性 物中的至少1種的溶菌酶類的工序。9. 根據(jù)權利要求8所述的諾如病毒滅活劑的制造方法，其中，包含將溶菌酶和/或其鹽 加熱改性而得到加熱改性物的工序和得到含有該加熱改性物的諾如病毒滅活劑的工序。10. 根據(jù)權利要求9所述的諾如病毒滅活劑的制造方法，其中，所述得到加熱改性物的 工序包含： 第1加熱工序，對波長660nm的光的透射率超過70%、pH為5.0~7.0、且溶菌酶和/或其 鹽的濃度以固體成分換算計為0.5質(zhì)量％~7質(zhì)量％的溶菌酶和/或其鹽的水溶液進行加熱 直到該水溶液的波長660nm的光的透射率成為70% ; 第2加熱工序，在所述第1加熱工序之后，將該水溶液加熱至所述水溶液的波長660nm的 光的透射率小于70%的極小值后，對該水溶液進行加熱直到該水溶液的波長660nm的光的 透射率成為70 %;以及 第3加熱工序，在所述第2加熱工序之后，在所述水溶液的波長660nm的光的透射率超過 70%的狀態(tài)下進一步對該水溶液進行加熱。11. 根據(jù)權利要求1 〇所述的諾如病毒滅活劑的制造方法，其中，所述第3加熱工序的加 熱條件為在將該第3加熱工序中得到的水溶液用0.45μπι的膜過濾器過濾而得到的物質(zhì)和乙 醇以質(zhì)量比1:1的比例混合時進行加熱直到波長660nm的光的透射率成為85%以上的條件。12. 根據(jù)權利要求10或11所述的諾如病毒滅活劑的制造方法，其中，在所述第3加熱工 序之后，進一步包含使所述水溶液噴霧干燥或冷凍干燥而得到粉末狀的所述改性物的工 序。13. -種諾如病毒感染的預防藥或治療藥，包含選自溶菌酶和/或其鹽以及它們的改性 物中的至少1種的溶菌酶類。14. 一種諾如病毒滅活用皮膚外用劑，包含選自溶菌酶和/或其鹽以及它們的改性物中 的至少1種的溶菌酶類。15. -種溶菌酶類，是用于諾如病毒的滅活的選自溶菌酶和/或其鹽以及它們的改性物 中的至少1種。
【文檔編號】A61P31/14GK106029089SQ201580009328
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2015年2月23日
【發(fā)明人】高橋肇, 佐藤美紀, 宮下隆, 笹原亮
【申請人】丘比株式會社