背景

本發(fā)明一般涉及治療由超增強子(superenhancer)調(diào)節(jié)的疾病的方法及針對其的組合物。

背景技術(shù)：

超增強子是大量轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域的dna，其驅(qū)動控制細(xì)胞同一性的基因的表達(dá)。超增強子在多種疾病狀態(tài)中變得失調(diào)，包括但不限于癌癥。超增強子募集轉(zhuǎn)錄因子，輔因子，染色質(zhì)調(diào)節(jié)劑，信號酶(例如激酶)和轉(zhuǎn)錄手段(例如，rna聚合酶ii)，其形成大的復(fù)合物，其調(diào)節(jié)多個基因的表達(dá)，同時其關(guān)于在dna的線性形式方面不一定非常接近(smith和shilatifard，2014，naturestructuralandmolecularbiology21(3)：210-219)。超增強子允許細(xì)胞具有調(diào)節(jié)基因組的效率，以協(xié)調(diào)一致地確定或維持細(xì)胞同一性。已經(jīng)證明癌細(xì)胞重編程超增強子復(fù)合物以改變癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，轉(zhuǎn)移和疾病進展。事實上，已經(jīng)假設(shè)許多疾病，甚至在癌癥之外，最終都是由超增強子復(fù)合物發(fā)生故障的結(jié)果(cell2013，nov7；155(4)：934-47)。

超增強子復(fù)合物的已知組分包括細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(例如cdk9)，溴和額外末端(bet)結(jié)構(gòu)域蛋白(例如brd4)，組蛋白脫乙酰酶(hdac)，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(例如p300)，組蛋白脫甲基酶(例如lsd1)，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(例如dot1l)等。這些成分通常參與典型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。然而，與通過典型增強子元素控制的基因相比，抑制超增強子功能的組分已被證明對超增強子控制的基因具有更深遠(yuǎn)的作用(lovén等，2013，.cell153(2)：320-334)。這種觀察的一個可能的原因是與典型的增強劑相比，在超增強子中富集轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)修飾蛋白。例如，中間體復(fù)合物(包括cdk8)和brd4都存在于超增強子和典型的增強子。然而，與典型的增強子相比，超增強子的調(diào)解劑的量已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)超過25倍(hnisz等人，2013，cell155：934-947)。類似地，超增強子的brd4的水平已經(jīng)顯示比典型的增強劑高約20倍(hnisz等，2013，cell155：934-947)。

已經(jīng)顯示超增強子表達(dá)的基因介導(dǎo)某些癌癥中的疾病進展。例如，在多發(fā)性骨髓瘤(mm)中，腫瘤細(xì)胞通常具有將超增強子元素置于myc基因附近的易位(hnisz等人，2013，cell155：934-947)。急性淋巴母細(xì)胞性白血病(t-all)，肺癌，胰腺癌，結(jié)直腸癌，乳腺癌，慢性骨髓性白血病(cml)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，淋巴母細(xì)胞樣癌，子宮頸癌和前列腺癌的患者中已發(fā)現(xiàn)類似的改變(hnisz等，2013，cell155：934-947)。

雖然已經(jīng)取得進展，但是本領(lǐng)域仍然需要改進超增強子的靶向和用于治療由超增強子介導(dǎo)的疾病的方法。本發(fā)明滿足了這一需要并提供了相關(guān)的優(yōu)點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

簡而言之，本發(fā)明的實施方案提供了治療涉及施用超增強子的兩種以上成分的抑制劑的疾病的方法。在一個實施方案中，本公開提供了治療有需要的哺乳動物中超增強子介導(dǎo)的疾病的方法，所述方法包括向哺乳動物施用有效量的以下治療劑中的至少兩種：

i)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑；

ii)溴結(jié)構(gòu)域(bromodomain)抑制劑；

iii)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑；

iv)組蛋白脫乙酰酶抑制劑；和

v)組蛋白脫甲基酶抑制劑。

還提供了包含至少兩種前述治療劑的藥物組合物。

參考下面的詳細(xì)描述，本發(fā)明的這些和其它方面將是顯而易見的。為此，本文闡述了更詳細(xì)地描述某些背景信息，程序，化合物和/或組合物的各種參考文獻(xiàn)，并且其各自通過引用整體并入本文。

附圖說明

在附圖中，相同的引用數(shù)字表示相似的元素。附圖中的元素的尺寸和相對位置不一定按比例繪制，并且這些元素中的一些元素被任意地放大和定位以改善附圖清晰度。此外，所繪出的元素的特定形狀不旨在傳達(dá)關(guān)于特定元素的實際形狀的任何信息，并且為了便于在圖中的識別而被單獨選擇。

圖1說明了brd4募集cdk9到轉(zhuǎn)錄起始位點的提出的機制。

圖2描述了cdk9和brd4抑制劑之間協(xié)同作用的證據(jù)。

圖3顯示用媒介物，阿伏西地，jq1或阿伏西地和jq1的組合處理的小鼠的體重增加。

圖4提供了cdk9和brd4抑制劑在超增強子(super-enhancer)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平上的協(xié)同作用的證據(jù)。

圖5a和5b是顯示mv4-11細(xì)胞中阿伏西地對myc(圖5a)和mcl-1(圖5b)表達(dá)的抑制的條形圖。

圖6顯示了使用單獨的和組合的阿伏西地或brd4抑制劑處理的mv4-11細(xì)胞的凋亡數(shù)據(jù)。

圖7a-c是表示阿伏西地，jq1(7a)，otx(7b)和ibet762(7c)作為單一藥劑和組合存在的myc表達(dá)的圖。

圖8a-c是阿伏西地，jq1(8a)，otx(8b)和ibet762(8c)作為單一藥劑和組合存在的myc表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡。

圖9a-c是顯示圖8a-c的蛋白質(zhì)印跡的定量的條形圖。jq1的數(shù)據(jù)提供在圖8a中，otx015數(shù)據(jù)在提供在圖8b中和ibet762的數(shù)據(jù)如圖9c所示。

圖10a是用阿伏西地處理的mv4-11細(xì)胞的代表性的蛋白質(zhì)印跡。圖10b提供了圖10a的蛋白質(zhì)印跡的定量。

圖11a是用阿伏西地處理的mv4-11細(xì)胞中的劑量遞增實驗的代表性的蛋白質(zhì)印跡。圖11b提供了圖11a的蛋白質(zhì)印跡的定量。

圖12a是用不同劑量用阿伏西地處理2小時的mv4-11細(xì)胞的代表性的蛋白質(zhì)印跡。圖12b提供了圖12a的蛋白質(zhì)印跡的定量。。

圖13a是用阿伏西地處理的a549細(xì)胞中的劑量遞增實驗的代表性的蛋白質(zhì)印跡。圖13b是用阿伏西地處理特定時間段的a549細(xì)胞的代表性的蛋白質(zhì)印跡。

圖14a是用阿伏西地處理的a549細(xì)胞的時間依賴性實驗的代表性的蛋白質(zhì)印跡。圖14b對于sk-n-as細(xì)胞顯示與前述相同的。

圖15提供了mv4-11細(xì)胞中mrna抑制的定量，同時以阿伏西地以時間依賴的方式處理。

圖16a-c是表示阿伏西地，jq-1(16a)，otx(16b)和ibet762(16c)作為單一藥劑和組合存在的mcl-1表達(dá)的圖。

圖17是顯示存在阿伏西地和jq-1作為單一藥劑和組合存在在給藥濃度范圍內(nèi)的mcl-1表達(dá)的圖。

圖18是在阿伏西地和jq-1作為單一藥劑和組合存在下在a549細(xì)胞中顯示c-myc表達(dá)的代表性的蛋白質(zhì)印跡

圖19呈現(xiàn)在單獨的和組合的阿伏西地或jq-1抑制劑存在下a549細(xì)胞的凋亡數(shù)據(jù)。

圖20呈現(xiàn)單獨的和組合的dinaciclib或jq-1抑制劑存在下的a549細(xì)胞的凋亡數(shù)據(jù)。

圖21a和圖21b是顯示在給藥濃度范圍內(nèi)存在阿伏西地的a549細(xì)胞中myc和mcl-1表達(dá)的圖。

圖22a是代表性的蛋白質(zhì)印跡，其顯示未處理的，用非靶向sirna處理的，和用cdk9特異性sirna處理的cdk9水平。圖22b顯示用bet抑制劑和非靶向或cdk9特異性sirna處理時a549細(xì)胞的凋亡數(shù)據(jù)。

詳細(xì)說明

在下面的描述中，闡述了某些具體細(xì)節(jié)以提供對本發(fā)明的各種實施例的透徹理解。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以在沒有這些細(xì)節(jié)的情況下實踐本發(fā)明。

除非上下文另有要求，否則在本說明書和權(quán)利要求書中，詞語“包括”及其變體，例如“包括”和“包含”應(yīng)以開放的、包容的意義來解釋，也就是說，應(yīng)該解釋為“包括，但不限于”。

在本說明書中對“一個實施方案”或“實施方案”的提及意味著結(jié)合實施方案描述的特定特征，結(jié)構(gòu)或特性包括在本發(fā)明的至少一個實施方案中。因此，貫穿本說明書的各個部分的短語“在一個實施方案中”或“在實施方案中”的出現(xiàn)不一定都指代相同的實施方案。此外，特定特征或特征可以以任何合適的方式組合在一個或多個實施方案中。

“哺乳動物”包括人類和家養(yǎng)動物如實驗室動物和家庭寵物(例如貓，狗，豬，牛，綿羊，山羊，馬，兔)和非家養(yǎng)動物如野生動物等。

“藥物組合物”是指本發(fā)明的化合物和本領(lǐng)域通常接受的用于將生物活性化合物遞送到哺乳動物例如人的介質(zhì)的制劑。這種介質(zhì)包括所有可藥用載體，稀釋劑或賦形劑。

“有效量”或“治療有效量”是指當(dāng)向哺乳動物、優(yōu)選人施用時，本發(fā)明化合物足以實現(xiàn)治療如下定義的哺乳動物、優(yōu)選人類的超增強子相關(guān)狀況或疾病的量。構(gòu)成“治療有效量”的本發(fā)明化合物的量將根據(jù)化合物、狀況及其嚴(yán)重程度、施用方式和待治療的哺乳動物的年齡而變化，但可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員考慮到他自己的知識和本公開來確定。

本文所用的“處理”或“醫(yī)治”涵蓋具有關(guān)注的疾病或狀況的哺乳動物、優(yōu)選人的關(guān)注的疾病或狀況的治療，并且包括：

(i)防止在哺乳動物中發(fā)生疾病或狀況，特別是當(dāng)這種哺乳動物易于患所述疾病或狀況，但尚未被診斷為具有疾病或狀況時；

(ii)抑制疾病或狀況，即阻止其發(fā)展；

(iii)減輕疾病或狀況，即導(dǎo)致疾病或狀況消退；或

(iv)減輕由疾病或狀況引起的癥狀，即緩解疼痛而不解決潛在的疾病或狀況。如本文所用，術(shù)語“疾病”和“狀況”可以互換使用或可以不同，因為特定的疾病或狀況可能不具有已知的致病因子(因此病因尚未得到解決)，因此它是尚未被認(rèn)定為疾病，但僅作為不良狀況或綜合征，其中臨床醫(yī)生已鑒定出或多或少具體的癥狀。

i.方法

在某些實施方案中，所述方法可用于破壞超增強子功能和/或用于預(yù)防，治療或改善與涉及超增強功能的疾病，障礙或病理狀況相關(guān)的癥狀，優(yōu)選一種影響人的疾病。當(dāng)一起施用或依次施用時抑制兩種或更多種超增強子成分的活性的化合物可用于預(yù)防，治療，改善或減少癌癥、例如急性骨髓性白血病(aml)和肺癌的癥狀或進展。本發(fā)明提供了抑制超增強子的方法，其包括將治療有效量的本文所述的超增強子組分的兩種或更多種抑制劑施用于有需要的受試者。受試者可以是人，非人靈長類，嚙齒動物，犬(犬科)，貓(貓科)，有蹄類，牛，馬或其他物種。

因此，在一個實施方案中，本公開提供了治療有需要的哺乳動物中超增強子介導(dǎo)的疾病的方法，所述方法包括向哺乳動物施用有效量的以下治療劑中的至少兩種：

i)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑；

ii)溴結(jié)構(gòu)域(bromodomain)抑制劑；

iii)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑；

iv)組蛋白脫乙酰酶抑制劑；和

v)組蛋白脫甲基酶抑制劑。

在一些實施方案中，所述方法包括施用細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑和溴結(jié)構(gòu)域(bromodomain)(bet)抑制劑。

兩種或更多種治療劑可以共同施用或依次施用。例如，可以施用第一治療劑，并且在足夠的時間段之后施用第二治療劑。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以基于常見的技術(shù)和知識獲得適當(dāng)?shù)氖┯梅桨浮?/p>

在某些實施方案中，至少一種治療劑將抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cdk)蛋白，例如cdk4，cdk6，cdk7，cdk8，cdk9，cdk10和/或cdk11。在一些實施方案中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑抑制cdk7，cdk9或兩者。在一些實施方案中，治療劑是dinaciclib(acsmed.chem.lett.2010may17；1(5)：204-8；mol.cancerther.2010aug；9(8)：2344-53；merck，sharp和dohme)，at7519(j.med.chem.2008aug28；51(16)：4986-99；astexpharmaceutical)，palbociclib(j.med.chem.2005apr7；48(7)：2388-406；輝瑞(pfizer))或阿伏西地(int.j.oncol.1996dec9(6)：1143-68)，例如阿伏西地。在一些實施方案中，至少一種治療劑是cdk9特異性sirna，阿伏西地或dinaciclib。在一些實施方案中，所述治療劑中的至少一種是阿伏西地。

在其它實施方案中，至少一種治療劑將抑制溴結(jié)構(gòu)域(bromodomain)蛋白如brd2，brd3，brd4和/或brdt，例如brd4。在這些實施方案的一些實施方案中，治療劑是jq-1(nature2010dec23；468(7327)：1067-73)，bi2536(acschem.biol。2014年5月16日；9(5)：1160-71；boehringeringelheim)，tg101209(acschem.biol.2014年5月16日；9(5)：1160-71)，otx015(mol.cancerther.november201312；c244；oncoethix)，ibet762(jmedchem.2013年10月10日；56(19)：7498-500；glaxosmithkline)，ibet151(bioorg.med.chem.lett.2012apr15；22(8)：2968-72；glaxosmithkline)，pfi-1(j.med.chem.2012年11月26日；55(22)：9831-7；cancerres.2013jun1；73(11)：3336-46；structuralgenomicsconsortium)ofcpi-0610(constellationpharmaceuticals)。在另外的實施方案中，至少一種治療劑將抑制組蛋白脫乙酰酶(hdac)蛋白。hdac蛋白質(zhì)基于與酵母hdac蛋白質(zhì)的同源性可以分組成類別，其中由hdac1，hdac2，hdac3和hdac8組成的i類；由hdac4，hdac5，hdac7和hdac9組成的iia類；由hdac6和hdac10組成的iib類；和由hdac11組成的iv類。在這些實施方案的一些實施方案中，治療劑是曲古抑菌素a，伏力諾他(vorinostat)(proc.natl.acad.sci.usa1998年3月17日；95(6)：3003-7)，吉維司他，abexinostat(mol.cancerther.2006may；5(5)：1309-17)，貝林司他(mol.cancerther.2003aug；2(8)：721-8)，帕比司他(clin.cancerres.2006年8月1日；12(15)：4628-35)，resminostat(clin.cancerres.2013oct1；19(19)：5494-504)，quisinostat(clin.cancerres.2013aug1；19(15)：4262-72)，縮酚酸肽(depsipeptide)(blood.2001nov1；98(9)：2865-8)，恩替司他(proc.natl.acad.sci.usa1999年4月13日；96(8)：4592-7)，莫西司他(bioorg.med.chem.lett.2008feb1；18(3)：1067-71)或丙戊酸(emboj.2001dec17；20(24)：6969-78)。例如，在一些實施方案中，治療劑是帕比司他。在其它實施方案中，所述至少一種治療劑是帕比司他或saha。

在另外的實施方案中，至少一種治療劑將抑制組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白，例如dot1樣組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(dot1l)。在這些實施方案的一些實施方案中，治療劑是epz004777，epz-5676(blood.di2013年8月8日；122(6)：1017-25)或sgc0946(nat.commun.2002；3：1288)，例如epz-5676。

在一些實施方案中，所選擇的治療劑之一將抑制組蛋白脫甲基酶，例如賴氨酸特異性脫甲基酶，例如賴氨酸特異性脫甲基酶1a(lsd1)。在這些實施方案的一些實施方案中，治療劑是hci-2509(bmccancer.2014oct9；14：752)，反苯環(huán)丙胺或ory-1001(j.clin.oncol31，2013(suppl；abstre13543)。在一些實施方案中，治療劑為hci-2509。

在一些其它實施方案中，所述方法包括向哺乳動物施用有效量的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑和溴結(jié)構(gòu)域(bromodomain)抑制劑。例如，在一些實施方案中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑是cdk9特異性sirna或阿伏西地。在一些其它實施方案中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑是阿伏西地。在上述不同的實施方案中，溴結(jié)構(gòu)域(bromodomain)抑制劑是jq1。在上述其它不同的實施方案中，溴結(jié)構(gòu)域(bromodomain)抑制劑是ibet762。在上述的更多實施方案中，溴結(jié)構(gòu)域(bromodomain)抑制劑是otx015。

因此，在一些實施方案中，該方法包括向哺乳動物施用有效量的阿伏西地和有效量的jq1。在其它實施方案中，該方法包括向哺乳動物施用有效量的阿伏西地和有效量的ibet762。在更多實施方案中，所述方法包括向哺乳動物施用有效量的阿伏西地和有效量的otx015。

在其它具體實施方案中，該方法包括向哺乳動物施用有效量的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑和組蛋白脫乙酰酶抑制劑。在這些實施方案的一些中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑是阿伏西地。在上述的其他實施方案中，組蛋白脫乙酰酶抑制劑是帕比司他。

在其它具體實施方案中，該方法包括向哺乳動物施用有效量的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。在這些實施方案的一些中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑是阿伏西地。

在其它具體實施方案中，該方法包括向哺乳動物施用有效量的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑和組蛋白脫甲基酶抑制劑。在這些實施方案的一些中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑是阿伏西地。

各種各樣的癌癥，包括實體瘤和白血病(例如急性骨髓性白血病)都適用于本文公開的方法?？梢栽诟鞣N實施方案中治療的癌癥的類型包括但不限于：乳，前列腺和結(jié)腸的腺癌；所有形式的肺支氣管原癌；骨髓；黑色素瘤；肝瘤；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；乳頭狀瘤；胺前體攝取脫羧細(xì)胞瘤(apudoma)；迷芽瘤；鰓原瘤；惡性類癌綜合征；類癌心臟?。缓桶?例如walker，基底細(xì)胞，基底鱗狀，brown-pearce，導(dǎo)管，ehrlich腫瘤，krebs2，merkel細(xì)胞，粘液性，非小細(xì)胞肺，燕麥細(xì)胞，乳頭狀，硬性，細(xì)支氣管，支氣管原，鱗狀細(xì)胞和移行細(xì)胞)?？梢灾委煹钠渌愋偷陌┌Y包括：組織細(xì)胞障礙；白血?。粣盒缘慕M織細(xì)胞增多癥；霍奇金病；免疫增生的小；非霍奇金淋巴瘤；漿細(xì)胞瘤；網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖；黑色素瘤；軟骨母細(xì)胞瘤；軟骨瘤；軟骨肉瘤；纖維瘤；纖維肉瘤；巨細(xì)胞瘤；組織細(xì)胞瘤；脂肪瘤；脂肪肉瘤；間皮瘤；粘液瘤；粘液肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；脊索瘤；顱咽管瘤；無性細(xì)胞瘤；錯構(gòu)瘤；間葉瘤；中腎瘤；肌肉瘤；成釉細(xì)胞瘤；牙骨質(zhì)瘤；牙瘤；畸胎瘤；胸腺瘤；滋養(yǎng)細(xì)胞瘤。此外，以下類型的癌癥也被認(rèn)為適于治療：腺瘤；膽管瘤；膽脂瘤；圓柱瘤(cyclindroma)；囊腺癌；囊腺瘤；粒層細(xì)胞瘤；兩性胚細(xì)胞瘤；肝細(xì)胞瘤；汗腺腺瘤；胰島細(xì)胞瘤；睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤；乳頭狀瘤；睪丸支持細(xì)胞瘤；泡膜細(xì)胞瘤；平滑肌瘤(leimyoma)；平滑肌肉瘤；成肌細(xì)胞瘤；肌瘤(myomma)；肌肉瘤(myosarcoma)；橫紋肌瘤(rhabdomyoma)；橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)；室管膜(細(xì)胞)瘤(ependymoma)；神經(jīng)節(jié)瘤；膠質(zhì)瘤；髓母細(xì)胞瘤；腦膜瘤；神經(jīng)鞘瘤；神經(jīng)細(xì)胞瘤；神經(jīng)上皮瘤；神經(jīng)纖維瘤；神經(jīng)瘤；副神經(jīng)節(jié)瘤；非嗜鉻的副神經(jīng)節(jié)瘤?？梢灾委煹陌┌Y的類型還包括但不限于，血管角化瘤；伴有嗜酸粒細(xì)胞增多的血管淋巴樣增生；硬化性血管瘤；血管瘤??；血管球瘤；血管內(nèi)皮瘤；血管瘤(hemangioma)；血管外皮細(xì)胞瘤；血管肉瘤；淋巴管瘤；淋巴管肌瘤；淋巴管肉瘤；松果體瘤；癌肉瘤；軟骨肉瘤；葉狀囊性肉瘤；纖維肉瘤；血管肉瘤；平滑肌肉瘤；白血病性肉瘤；脂肪肉瘤；淋巴管肉瘤；肌肉瘤；粘液肉瘤；卵巢癌；橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)；肉瘤；腫瘤；神經(jīng)纖維瘤??；和宮頸發(fā)育不良。

ii.藥物組合物

其它實施方案涉及藥物組合物。藥物組合物包含任何兩種(或多種)前述抑制劑和藥學(xué)上可接受的載體。例如，在一些實施方案中，藥物組合物包含藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑和以下治療劑中的至少兩種：

i)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑；

ii)溴結(jié)構(gòu)域(bromodomain)抑制劑；

iii)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑；

iv)組蛋白脫乙酰酶抑制劑；

v)組蛋白脫甲基酶抑制劑。

治療劑可以是本文所述或本領(lǐng)域已知的任何一種。在一些實施方案中，組合物包含細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，例如阿伏西地或dinaciclib。

在其它具體實施方案中，藥物組合物包含細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑和溴結(jié)構(gòu)域(bromodomain)抑制劑。例如，在這些實施方案的一些中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑是阿伏西地。在上述實施方案的其它實施方案中，溴結(jié)構(gòu)域(bromodomain)抑制劑是jq1。在上述其它不同的實施方案中，溴結(jié)構(gòu)域(bromodomain)抑制劑是ibet762。在上述的更多實施方案中，溴結(jié)構(gòu)域(bromodomain)抑制劑是otx015。

因此，在一些實施方案中，藥物組合物包含藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，阿伏西地和jq1。在其它實施方案中，藥物組合物包含藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，阿伏西地和ibet762。在更多實施方案中，藥物組合物包含藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，阿伏西地和otx015。

在不同的實施方案中，藥物組合物包含細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑和組蛋白脫乙酰酶抑制劑。在這些實施方案的一些中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑是阿伏西地。在上述實施方案的其它實施方案中，組蛋白脫乙酰酶抑制劑是帕比司他。

在不同的實施方案中，藥物組合物包含細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。在這些實施方案的一些中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑是阿伏西地。

在不同的實施方案中，藥物組合物包含細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑和組蛋白脫甲基酶抑制劑。在這些實施方案的一些中，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑是阿伏西地

在一些實施方案中，將藥物組合物配制成用于口服施用。在其它實施方案中，將藥物組合物配制成用于注射。

合適的施用途徑包括但不限于口服，靜脈內(nèi)，直腸，氣霧劑，胃腸外，眼科，肺，經(jīng)粘膜，透皮，陰道，耳，鼻和局部施用。此外，僅作為示例，胃腸外遞送包括肌肉內(nèi)，皮下，靜脈內(nèi)，髓內(nèi)注射，以及鞘內(nèi)，直接腦室內(nèi)，腹膜內(nèi)，淋巴內(nèi)和鼻內(nèi)注射。

在某些實施方案中，如本文所述的化合物以局部而非全身方式施用，例如通過將化合物直接注射入器官，通常在貯庫制劑或持續(xù)釋放制劑中。在具體實施方案中，長效制劑通過植入(例如皮下或肌肉內(nèi))或通過肌內(nèi)注射施用。此外，在其它實施方案中，藥物在靶向藥物遞送系統(tǒng)中遞送，例如在涂有器官特異性抗體的脂質(zhì)體中。在這樣的實施方案中，脂質(zhì)體被器官選擇性地靶向和攝取。在其它實施方案中，本文所述的化合物以快速釋放制劑的形式、以延緩釋放制劑的形式，或以中間體(intermediate)釋放制劑的形式提供。在其它實施方案中，本文所述的化合物局部施用。

根據(jù)本發(fā)明的化合物在寬劑量范圍內(nèi)是有效的。例如，在成年人的治療中，0.01至1000mg，0.5至100mg，1至50mg/天和5至40mg/天的劑量是在一些實施方案中使用的劑量的實例。示例性劑量為每天10至30mg。確切的劑量將取決于施用途徑，施用化合物的形式，待治療的受試者，待治療受試者的體重以及主治醫(yī)師的偏好和經(jīng)驗。

在一些實施方案中，以單一劑量施用本發(fā)明的化合物。通常，這種施用將通過注射，例如靜脈內(nèi)注射，以便快速引入該藥劑。但是，根據(jù)需要使用其他途徑。單劑量的本發(fā)明化合物也可用于處理急性狀況。

在一些實施方案中，以多個劑量施用本發(fā)明的化合物。在一些實施方案中，施用是每天約一次，兩次，三次，四次，五次，六次或六次以上。在其他實施方案中，施用大約每月一次，每兩周一次，每周一次，或每隔一天一次。在另一個實施方案中，本發(fā)明的化合物和另一種藥劑每天一次約一次至每天約6次一同施用。在另一個實施方案中，施用本發(fā)明化合物和藥劑持續(xù)不到約7天。在另一個實施方案中，該施用持續(xù)超過約6、10、14、28天，兩個月，六個月或一年。在某些情況下，只要有必要，連續(xù)施用被實現(xiàn)和維持。

本發(fā)明化合物的施用可以在需要的情況下持續(xù)。在一些實施方案中，施用本發(fā)明化合物超過1、2、3、4、5、6、7、14或28天。在一些實施方案中，施用本發(fā)明的化合物少于28、14、7、6、5、4、3、2或1天。在一些實施方案中，本發(fā)明的化合物在持續(xù)的基礎(chǔ)上長期施用，例如用于長期效果的治療。

在一些實施方案中，本發(fā)明的化合物以多個劑量施用。由于復(fù)合藥代動力學(xué)中的主體間變異性，在某些實施方案中提供了施用方案的個體化。本發(fā)明化合物的施用可以通過本公開的常規(guī)實驗來發(fā)現(xiàn)和/或可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員得出。

在一些實施方案中，將本文所述的化合物配制成藥物組合物。在具體實施方案中，藥物組合物以常規(guī)方式配制，使用一種或多種生理學(xué)上可接受的載體，其包含促進活性化合物加工成可以藥學(xué)上使用的制劑的賦形劑和助劑。適當(dāng)?shù)闹苿┤Q于所選擇的施用途徑。使用適于配制本文所述的藥物組合物的任何藥學(xué)上可接受的技術(shù)，載體和賦形劑：remington：thescienceandpracticeofpharmacy，第十九版(easton，pa.：mackpublishingcompany，1995)；hoover，johne.，remington'spharmaceuticalsciences，mackpublishingco.，easton，pennsylvania1975；liberman，ha和lachman，l.，eds.，pharmaceuticaldosageforms，marceldecker，newyork，n.y.，1980；和pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems，seventhed.(lippincottwilliams&wilkins1999)。

本文提供的藥物組合物包含靶向選自以下的至少兩種超增強子組分的抑制劑：i)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cdk)；ii)溴結(jié)構(gòu)域(bromodomain)蛋白質(zhì)的溴結(jié)構(gòu)域(bromodomain)和外端(extraterminal)(bet)亞家族；iii)dot1樣組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(dot1l)；iv)i，ii和iv類組蛋白脫乙酰酶(hdac)；和v)賴氨酸特異性脫甲基酶1a(lsd1)和藥學(xué)上可接受的稀釋劑，賦形劑或載體。本文所涵蓋的是在下文和整個本公開的組合療法部分中闡述的活性物質(zhì)的組合。

如本文所用的藥物組合物是指靶向至少兩種超增強子組分的抑制劑與其它化學(xué)組分的混合物，所述其它化學(xué)組分例如載體，穩(wěn)定劑，稀釋劑，分散劑，懸浮劑，增稠劑和/或賦形劑。在某些實施方案中，藥物組合物便于將化合物施用于生物體。在一些實施方案中，實施本文提供的治療的方法或用途，本文提供的治療有效量的兩種或更多種靶向至少兩種超增強子組分的抑制劑在藥物組合物中施用至具有待被處理的疾病、障礙或醫(yī)學(xué)狀況的哺乳動物。在具體實施方案中，哺乳動物是人。在某些實施方案中，治療有效量根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度，受試者的年齡和相對健康，所用化合物的效力和其它因素而變化。本文所述的化合物單獨使用或與一種或多種治療劑作為組分混合物而組合使用。

在一個實施方案中，靶向至少兩種超增強子組分的抑制劑配制在含水(水性)溶液中。在具體實施方案中，含水(水性)溶液僅作為實例選自生理上相容的緩沖液，例如漢克氏溶液，林格氏溶液或生理鹽水緩沖液。在其它實施方案中，靶向至少兩種超增強子組分的抑制劑被配制用于經(jīng)粘膜施用。在具體實施方案中，經(jīng)粘膜制劑包括適于被滲透屏障的滲透劑。在其中將本文所述化合物配制用于其它腸胃外注射的其它實施方案中，合適的制劑包括水性或非水性溶液。在具體實施方案中，這樣的溶液包括生理上相容的緩沖液和/或賦形劑。

在另一個實施方案中，將本文所述的化合物配制用于口服施用。本文所述的化合物通過將活性化合物與例如藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑組合來配制。在各種實施方案中，本文所述的化合物配制成口服劑型，其僅通過舉例，包括片劑，粉劑，丸劑，糖錠劑，膠囊，液體，凝膠，糖漿，酏劑，漿液，懸浮液等。

在某些實施方案中，用于口服使用的藥物制劑通過以下獲得：將一種或多種固體賦形劑與一種或多種本文所述的化合物混合，任選地研磨所得混合物，以及如果需要，在加入合適的助劑之后加工顆?；旌衔?，如果需要，以獲得片劑或糖錠劑芯。合適的賦形劑特別是填充劑例如糖，包括乳糖，蔗糖，甘露糖醇或山梨糖醇；纖維素制劑，例如玉米淀粉，小麥淀粉，大米淀粉，馬鈴薯淀粉，明膠，黃蓍膠，甲基纖維素，微晶纖維素，羥丙基甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉；或其它如：聚乙烯吡咯烷酮(pvp或聚維酮)或磷酸鈣。在具體實施方案中，任選地加入崩解劑。崩解劑僅舉例來說包括交聯(lián)的交聯(lián)羧甲基纖維素鈉，聚乙烯吡咯烷酮，瓊脂或海藻酸或其鹽如海藻酸鈉。

在一個實施方案中，提供劑型，例如糖錠劑芯和片劑，其具有一種或多種合適的包衣。在具體實施方案中，使用濃縮糖溶液來涂覆劑型。糖溶液任選地含有另外的組分，例如僅舉例來說，阿拉伯膠，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，卡波姆(carbopol)凝膠，聚乙二醇和/或二氧化鈦，漆溶液和合適的有機溶劑或溶劑混合物。也任選將染料和/或顏料加入到涂層中用于鑒定目的。此外，任選地使用染料和/或顏料來表征活性化合物劑量的不同組合。

在某些實施方案中，靶向本文所述的至少兩種超增強子組分的治療有效量的抑制劑配制成其它口服劑型?？诜┬桶ㄓ擅髂z制成的推入契合(push-fit)膠囊，以及由明膠和增塑劑如甘油或山梨糖醇制成的軟的密封膠囊。在具體實施方案中，推入契合膠囊含有與一種或多種填充劑混合的活性成分。填充劑僅通過舉例包括乳糖，粘合劑如淀粉和/或潤滑劑如滑石或硬脂酸鎂，以及任選的穩(wěn)定劑。在其它實施方案中，軟膠囊含有溶解或懸浮在合適液體中的一種或多種活性化合物。合適的液體僅通過舉例包括一種或多種脂肪油，液體石蠟或液體聚乙二醇。此外，任選地加入穩(wěn)定劑。

在其它實施方案中，本文所述的靶向至少兩種超增強子組分的治療有效量的抑制劑被配制用于口腔或舌下施用。適用于口腔或舌下施用的制劑僅通過舉例包括片劑，錠劑或凝膠劑。在其它實施方案中，將本文所述的化合物配制用于腸胃外注射，包括適于推注或連續(xù)輸注的制劑。在具體實施方案中，用于注射的制劑以單位劑量形式(例如，安瓿)或多劑量容器呈現(xiàn)。任選地，將防腐劑加入到注射制劑中。在另外的其它實施方案中，藥物組合物配制成適合腸胃外注射的形式，作為油性或水性載體中的無菌懸浮液，溶液或乳液。腸胃外注射制劑任選地含有配制試劑，例如懸浮劑，穩(wěn)定劑和/或分散劑。在具體實施方案中，用于腸胃外施用的藥物制劑包括水溶性形式的活性化合物的含水(水性)溶液。在另外的實施方案中，制備活性化合物(例如結(jié)構(gòu)(i)的化合物)的懸浮液作為適當(dāng)?shù)挠托宰⑸鋺腋∫骸Ｓ糜诒疚乃鏊幬锝M合物的合適的親脂性溶劑或載體僅通過舉例包括脂肪油如芝麻油或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酸酯，或脂質(zhì)體。在某些具體實施方案中，水性注射懸浮液含有增加懸浮液粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉，山梨糖醇或葡聚糖。任選地，懸浮液包含合適的穩(wěn)定劑或增加化合物溶解度的試劑，以允許制備高度濃縮的溶液。或者，在其它實施方案中，活性成分是粉末形式，其用于在使用之前用合適的載體(例如無菌無熱原的水)構(gòu)建。

在其它實施方案中，局部施用靶向至少兩種超增強子組分的抑制劑。將本文所述的化合物配制成各種可局部施用的組合物，例如溶液，懸浮液，洗劑，凝膠，糊劑，藥物棒，香膏，霜劑或軟膏。這種藥物組合物任選含有增溶劑，穩(wěn)定劑，張力增強劑，緩沖劑和防腐劑。

在其它實施方案中，將靶向至少兩種超增強子組分的抑制劑配制用于透皮施用。在具體實施方案中，透皮制劑使用透皮遞送裝置和透皮遞送貼片，并且可以是溶解和/或分散在聚合物或粘合劑中的親脂性乳劑或緩沖的含水(水性)溶液。在各種實施方案中，這樣的貼劑構(gòu)建用于藥劑的連續(xù)，脈動或按需遞送。在另外的實施方案中，靶向至少兩種超增強子組分的抑制劑的透皮遞送通過離子電滲貼片等實現(xiàn)。在某些實施方案中，透皮貼劑提供靶向至少兩種超增強子組分的抑制劑的受控遞送。在具體實施方案中，通過使用速率控制膜或通過將化合物捕獲在聚合物基質(zhì)或凝膠內(nèi)來減緩吸收速率。在替代實施方式中，吸收增強劑用于增加吸收。吸收增強劑或載體包括有助于通過皮膚的可吸收的藥學(xué)上可接受的溶劑。例如，在一個實施方案中，透皮裝置是繃帶的形式，包括背襯構(gòu)件，包含化合物的儲存器，任選地具有載體，任選地的速率控制屏障，以將化合物以受控和預(yù)定的速率在延長使用時間內(nèi)遞送到主體的皮膚，和將裝置固定在皮膚上的手段(工具)。

在其它實施方案中，靶向至少兩種超增強子組分的抑制劑被配制用于通過吸入施用。適于通過吸入施用的各種形式包括但不限于氣溶膠，霧或粉末。使用合適的推進劑(例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其他適合氣體)，以加壓包裝或噴霧器的氣溶膠噴霧形式方便地遞送靶向至少兩種超增強子組分的抑制劑的藥物組合物。在具體實施方案中，加壓氣霧劑的劑量單位是通過提供一個閥來來確定的，以傳遞計量的量。在某些實施方案中，將僅通過舉例的明膠的用于吸入器或吹入器的膠囊和藥筒配制成含有化合物和合適的粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉的粉末混合物。

在其它實施方案中，靶向至少兩種超增強子組分的抑制劑配制在直腸組合物中，例如灌腸劑，直腸凝膠，直腸泡沫，直腸氣溶膠，栓劑，凍膠栓劑或保留灌腸劑，其含有常規(guī)的栓劑基質(zhì)如可可脂或可可脂其它甘油酯，以及合成聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，peg等。在組合物的栓劑形式中，首先熔化低熔點蠟，例如但不限于脂肪酸甘油酯，任選與可可脂組合的混合物。

在某些實施方案中，藥物組合物以任何常規(guī)方式配制，使用一種或多種生理學(xué)上可接受的載體，其包含有助于將活性化合物加工成藥學(xué)上可使用的制劑的賦形劑和助劑。適當(dāng)?shù)闹苿┤Q于所選擇的施用途徑。任選使用任何藥學(xué)上可接受的技術(shù)，載體和賦形劑。包括靶向至少兩種超增強子組分的抑制劑的藥物組合物以常規(guī)方式制造，例如僅通過舉例通過常規(guī)混合，溶解，制粒，糖錠劑制造，研磨，乳化，包封，包埋或壓縮過程。

藥物組合物包含至少一種藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑或賦形劑和本文所述的靶向至少兩種超增強子組分的作為活性成分的抑制劑?；钚猿煞质怯坞x酸或游離堿形式，或以藥學(xué)上可接受的鹽形式。此外，本文所述的方法和藥物組合物包括使用n-氧化物，結(jié)晶形式(也稱為多晶型物)以及具有相同類型活性的這些化合物的活性代謝物。本文所述化合物的所有互變異構(gòu)體都包括在本文給出的化合物的范圍內(nèi)。此外，本文所述的化合物包括非溶劑化以及溶劑化形式與藥學(xué)上可接受的溶劑如水，乙醇等。本文給出的靶向至少兩種超增強子組分的抑制劑的溶劑化形式也被認(rèn)為在本文中公開。此外，藥物組合物任選地包括其它藥物或藥劑，載體，佐劑，例如防腐劑，穩(wěn)定劑，潤濕劑或乳化劑，溶液促進劑，用于調(diào)節(jié)滲透壓的鹽，緩沖劑和/或其它有治療價值的物質(zhì)。

用于制備包含本文所述的靶向至少兩種超增強子組分的抑制劑的組合物的方法包括用一種或多種惰性的藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體配制化合物以形成固體，半固體或液體。固體組合物包括但不限于粉劑，片劑，可分散顆粒劑，膠囊劑，扁囊劑和栓劑。液體組合物包括其中溶解化合物的溶液，包含化合物的乳液，或含有包含本文公開的化合物的脂質(zhì)體、膠束或納米顆粒的溶液。半固體組合物包括但不限于凝膠，懸浮液和霜劑。本文所述的藥物組合物的形式包括液體溶液或懸浮液，在使用前適合于在液體中溶液或懸浮的固體形式，或作為乳劑。這些組合物還任選地含有少量無毒輔助物質(zhì)，例如潤濕劑或乳化劑，ph緩沖劑等。

在一些實施方案中，包含靶向至少兩種超增強子組分的抑制劑的藥物組合物示例性地采取液體的形式，其中藥劑存在于溶液，懸浮液或兩者中。通常當(dāng)組合物作為溶液或懸浮液施用時，藥劑的第一部分存在于溶液中，并且藥劑的第二部分以顆粒形式存在于懸浮液中在液體基質(zhì)中。在一些實施方案中，液體組合物包括凝膠制劑。在其它實施方案中，液體組合物是含水的(水性的)。

在某些實施方案中，有用的含水的(水性的)懸浮液含有一種或多種作為懸浮劑的聚合物。有用的聚合物包括水溶性聚合物，例如纖維素聚合物，例如羥丙基甲基纖維素，和水不溶性聚合物，例如交聯(lián)的含羧基聚合物。本文所述的某些藥物組合物包含選自例如羧甲基纖維素，卡波姆(丙烯酸聚合物)，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚丙烯酰胺，聚卡波非，丙烯酸/丙烯酸丁酯共聚物，藻酸鈉和葡聚糖的粘膜粘附聚合物。

有用的藥物組合物還可任選地包括增溶劑以幫助靶向至少兩種超增強子組分的抑制劑的溶解度。術(shù)語“增溶劑”通常包括導(dǎo)致形成藥劑的膠束溶液或真正溶液的試劑。某些可接受的非離子表面活性劑，例如聚山梨酸酯80，可用作增溶劑，如眼科可接受的二醇，聚二醇如聚乙二醇400和二醇醚。

此外，有用的藥物組合物任選地包括一種或多種ph調(diào)節(jié)劑或緩沖劑，包括酸如乙酸，硼酸，檸檬酸，乳酸，磷酸和鹽酸；堿如氫氧化鈉，磷酸鈉，硼酸鈉，檸檬酸鈉，乙酸鈉，乳酸鈉和三羥甲基氨基甲烷；以及緩沖劑如檸檬酸鹽/右旋糖，碳酸氫鈉和氯化銨。這些酸，堿和緩沖劑以將組合物的ph保持在可接受的范圍內(nèi)所需的量包括在內(nèi)。

另外，有用的組合物還可以任選地包括使組合物的重量克分子滲透濃度達(dá)到可接受范圍所需量的一種或多種鹽。這些鹽包括具有以下的鹽：鈉，鉀或銨陽離子和氯離子，檸檬酸根，抗壞血酸根，硼酸根，磷酸根，碳酸氫根，硫酸根，硫代硫酸根或亞硫酸氫根陰離子；合適的鹽包括氯化鈉，氯化鉀，硫代硫酸鈉，亞硫酸氫鈉和硫酸銨。

其它有用的藥物組合物任選地包括一種或多種抑制微生物活性的防腐劑。合適的防腐劑包括含汞物質(zhì)，如硼酸苯汞和硫柳汞；穩(wěn)定的二氧化氯；以及季銨化合物如苯扎氯銨，十六烷基三甲基溴化銨和氯化十六烷基吡啶鎓。

其它有用的組合物包括一種或多種用于增強物理穩(wěn)定性或用于其它目的的表面活性劑。合適的非離子表面活性劑包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如聚氧乙烯(60)氫化蓖麻油；和聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如辛苯昔醇10，辛苯昔醇40。

還有其它有用的組合物包括一種或多種抗氧化劑以在需要時提高化學(xué)穩(wěn)定性。合適的抗氧化劑僅通過舉例包括抗壞血酸和焦亞硫酸鈉。

在某些實施方案中，將含水(水性)懸浮液組合物包裝在單劑量不可再封閉的容器中。或者，使用多劑量可再封閉容器，在這種情況下，通常在組合物中包含防腐劑。

在替代實施方案中，使用用于疏水性藥物化合物的其它遞送系統(tǒng)。脂質(zhì)體和乳劑是可用于本文的遞送載體或載體的實例。在某些實施方案中，也使用有機溶劑如n-甲基吡咯烷酮。在另外的實施方案中，本文所述的化合物使用持續(xù)釋放系統(tǒng)遞送，例如含有治療劑的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)。各種持續(xù)釋放材料在本文中是有用的。在一些實施方案中，緩釋膠囊將化合物釋放數(shù)周至多達(dá)100天以上。根據(jù)化學(xué)性質(zhì)和治療藥劑的生物穩(wěn)定性，采用其他蛋白質(zhì)穩(wěn)定化策略。

在某些實施方案中，本文所述的制劑包含一種或多種抗氧化劑，金屬螯合劑，含硫醇化合物和/或其它一般穩(wěn)定劑。這種穩(wěn)定劑的實例包括但不限于：(a)約0.5％至約2％w/v甘油，(b)約0.1％至約1％w/v甲硫氨酸，(c)約0.1％至約2％w/v一硫代甘油，(d)約1mm至約10mmedta，(e)約0.01％至約2％w/v抗壞血酸，(f)0.003％至約0.02％w/v聚山梨醇酯80，(g)0.001％至約0.05％w/v.聚山梨酯20，(h)精氨酸，(i)肝素，(j)硫酸葡聚糖，(k)環(huán)糊精，(l)多硫酸戊聚糖和其他類肝素，(m)二價陽離子如鎂和鋅；或(n)前述物質(zhì)的組合。

在一些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物中提供的一種或多種抑制劑的濃度小于100％，90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，19％，18％，17％，16％，15％，14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.4％，0.3％，0.2％，0.1％，0.09％，0.08％，0.07％，0.06％，0.05％，0.04％，0.03％，0.02％，0.01％，0.009％，0.008％，0.007％，0.006％，0.005％，0.004％，0.003％，0.002％，0.001％，0.0009％，0.0008％，0.0007％，0.0006％，0.0005％，0.0004％，0.0003％，0.0002％，或0.0001％w/w，w/v或v/v。

在一些實施方案中，本發(fā)明的一種或多種抑制劑的濃度大于90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，19.75％，19.50％，19.25％19％，18.75％，18.50％，18.25％18％，17.75％，17.50％，17.25％17％，16.75％，16.50％，16.25％16％，15.75％，15.50％，15.25％15％，14.75％，14.50％，14.25％14％，13.75％，13.50％，13.25％13％，12.75％，12.50％，12.25％12％，11.75％，11.50％，11.25％11％，10.75％，10.50％，10.25％10％，9.75％，9.50％，9.25％9％，8.75％，8.50％，8.25％8％，7.75％，7.50％，7.25％7％，6.75％，6.50％，6.25％6％，5.75％，5.50％，5.25％5％，4.75％，4.50％，4.25％，4％，3.75％，3.50％，3.25％，3％，2.75％，2.50％，2.25％，2％，1.75％，1.50％，125％，1％，0.5％，0.4％，0.3％，0.2％，0.1％，0.09％，0.08％，0.07％，0.06％，0.05％，0.04％，0.03％，0.02％，0.01％，0.009％，0.008％，0.007％，0.006％，0.005％，0.004％，0.003％，0.002％，0.001％，0.0009％，0.0008％，0.0007％，0.0006％，0.0005％，0.0004％，0.0003％，0.0002％，或0.0001％w/w，w/v，或v/v。

在一些實施方案中，本發(fā)明的一種或多種抑制劑的濃度在以下范圍內(nèi)：大約0.0001％至大約50％，大約0.001％至大約40％，大約0.01％至大約30％，大約0.02％至大約29％，大約0.03％至大約28％，大約0.04％至大約27％，大約0.05％至大約26％，大約0.06％至大約25％，大約0.07％至大約24％，大約0.08％至大約23％，大約0.09％至大約22％，大約0.1％至大約21％，大約0.2％至大約20％，大約0.3％至大約19％，大約0.4％至大約18％，大約0.5％至大約17％，大約0.6％至大約16％，大約0.7％至大約15％，大約0.8％至大約14％，大約0.9％至大約12％，大約1％至大約10％w/w，w/v或v/v。

在一些實施方案中，本發(fā)明的一種或多種抑制劑的濃度范圍為：大約0.001％至大約10％，大約0.01％至大約5％，大約0.02％至大約4.5％，大約0.03％至大約4％，大約0.04％至大約3.5％，大約0.05％至大約3％，大約0.06％至大約2.5％，大約0.07％至大約2％，大約0.08％至大約1.5％，大約0.09％至大約1％，大約0.1％至大約0.9％w/w，w/v或v/v。

在一些實施方案中，本發(fā)明的一種或多種抑制劑的量等于或小于10g，9.5g，9.0g，8.5g，8.0g，7.5g，7.0g，6.5g，6.0g，5.5g，5.0g，4.5g，4.0g，3.5g，3.0g，2.5g，2.0g，1.5g，1.0g，0.95g，0.9g，0.85g，0.8g，0.75g，0.7g，0.65g，0.6g，0.55g，0.5g，0.45g，0.4g，0.35g，0.3g，0.25g，0.2g，0.15g，0.1g，0.09g，0.08g，0.07g，0.06g，0.05g，0.04g，0.03g，0.02g，0.01g，0.009g，0.008g，0.007g，0.006g，0.005g，0.004g，0.003g，0.002g，0.001g，0.0009g，0.0008g，0.0007g，0.0006g，0.0005g，0.0004g，0.0003g，0.0002g，或0.0001g.

在一些實施方案中，本發(fā)明的一種或多種抑制劑的量大于0.0001g，0.0002g，0.0003g，0.0004g，0.0005g，0.0006g，0.0007g，0.0008g，0.0009g，0.001g，0.0015g，0.002g，0.0025g，0.003g，0.0035g，0.004g，0.0045g，0.005g，0.0055g，0.006g，0.0065g，0.007g，0.0075g，0.008g，0.0085g，0.009g，0.0095g，0.01g，0.015g，0.02g，0.025g，0.03g，0.035g，0.04g，0.045g，0.05g，0.055g，0.06g，0.065g，0.07g，0.075g，0.08g，0.085g，0.09g，0.095g，0.1g，，0.15g，0.2g，，0.25g，0.3g，，0.35g，0.4g，，0.45g，0.5g，0.55g，0.6g，，0.65g，0.7g，0.75g，0.8g，0.85g，0.9g，0.95g，1g，1.5g，2g，2.5，3g，3.5，4g，4.5g，5g，5.5g，6g，6.5g，7g，7.5g，8g，8.5g，9g，9.5g，或10g。

在一些實施方案中，本發(fā)明的一種或多種抑制劑的量在以下范圍內(nèi)：0.0001-10g，0.0005-9g，0.001-8g，0.005-7g，0.01-6g，0.05-5g，0.1-4g，0.5-4g，或1-3g。

實施例

實施例1

組合治療對腫瘤體積的影響

aml細(xì)胞系，mv4-11是mll融合和flt3-itd陽性。mll融合使得該細(xì)胞系特別依賴于用于驅(qū)動腫瘤發(fā)生的超增強子功能。將mv4-11細(xì)胞皮下植入無胸腺nu/nu小鼠，并允許建立直到腫瘤達(dá)到100-200mm³。單獨和組合使用jq-1，bet蛋白抑制劑和阿伏西地，cdk抑制劑，以確定藥物對腫瘤體積的影響。將動物分成4組，并施用四種處理之一：媒介物，25mg/kgjq-1，2.5mg/kg阿伏西地，或兩種藥物在這些劑量的組合。藥物腹膜內(nèi)施用，每日一次，持續(xù)5天，共3周。通過卡尺測量每周測量兩次腫瘤體積。結(jié)果如圖2所示。25mg/kgjq-1顯示無可測量的活性，因為它與媒介物對照密切相關(guān)。阿伏西地2.5mg/kg顯示中度活性，其腫瘤在整個研究中為媒介物的大小的大約50％。令人驚訝的是，這些劑量水平的這兩種藥物的組合在第8天完全停止了這些小鼠的腫瘤生長。在組合組中研究完成時，沒有任何小鼠(n＝8)檢測到腫瘤。所有動物的體重在整個研究中是相當(dāng)?shù)?。媒介物和單獨藥物治療小鼠的體重增加可歸因于腫瘤生長。施用組合治療的小鼠的體重增加可歸因于小鼠的整體健康和食物攝取。

這些結(jié)果是阿伏西地與jq-1之間協(xié)同作用的有力證據(jù)，也是靶向兩點或更多點的超增強子復(fù)合物的概念的有力證據(jù)。

實施例2

組合治療對c-myc表達(dá)的影響

c-myc基因是眾所周知的由aml細(xì)胞中的超增強子復(fù)合物調(diào)節(jié)。單獨和組合使用jq-1，bet蛋白抑制劑和阿伏西地，cdk抑制劑，以確定藥物對c-myc表達(dá)的影響。用不同濃度的阿伏西地和/或jq-1處理mv4-11細(xì)胞2小時。還包括dmso處理的對照。通過裂解細(xì)胞并分離rna進行rt-qpcr分析來終止處理。確定c-myc的表達(dá)并將其針對持家基因hprt1和dmso處理的對照進行歸一化。結(jié)果如圖3所示。阿伏西地和jq-1單獨使用時下調(diào)了c-myc的表達(dá)；但是，當(dāng)兩種藥劑組合使用時，c-myc的下調(diào)更加嚴(yán)重。再次，這些數(shù)據(jù)表明這兩種藥劑之間的強大協(xié)同作用，并為通過多種機制靶向超增強子復(fù)合物的方法提供了良好的理由。

實施例3

組合治療對ic50的影響

molm13和mv4-11是mll融合和flt3-itd陽性的aml細(xì)胞系。將兩種細(xì)胞系用以下處理：用20nm的阿伏西地(cdk抑制劑)持續(xù)48小時或dmso對照，然后加入不同濃度的bet蛋白抑制劑jq-1，或然后加入不同濃度的hdac抑制劑帕比司他，持續(xù)額外的48小時。完成后，通過細(xì)胞滴定度(celltiter)glo試劑測量細(xì)胞活力。測定jq-1和帕比司他在有或沒有低劑量阿伏西地的情況下的ic50值。結(jié)果示于下表1中。加入20nm阿伏西地增加了jq-1的效力，如通過ic50值低2倍所示。加入20nm阿伏西地增加帕比司他(hdac抑制劑)的效力，如通過ic50值低3至6倍低所證明的。這些數(shù)據(jù)表明，相對于各個單個抑制劑，組合的cdk和bet蛋白抑制劑和cdk和hdac抑制劑的活性增加。

表1

阿伏西地降低了jq-1和帕比司他的ic50

實施例4

阿伏西地對myc和mcl-1表達(dá)的抑制

為了測定阿伏西地的myc和mcl-1抑制活性，用阿伏西地處理mv4-11細(xì)胞2小時，測定myc和mcl-1相對于hprt的表達(dá)。數(shù)據(jù)顯示，阿伏西地作為單一藥物完全消除mv4-11細(xì)胞中myc表達(dá)(圖5a)，并將mcl-1表達(dá)降低60％(圖5b)。

實施例5

與brd4抑制劑組合的阿伏西地增加mv4-11細(xì)胞凋亡

將mv4-11細(xì)胞以每孔1000個細(xì)胞接種在384孔板中。將brd4抑制劑(ibet762，otx015或jq1)以單劑量加入細(xì)胞持續(xù)24小時。阿伏西地以劑量稀釋在24小時加入。加入細(xì)胞滴定度(celltiter)glo和半胱天冬酶glo，并在48小時測量發(fā)光。單劑量的brd4抑制劑與系列稀釋的阿伏西地組合，顯示了半胱天冬酶活性的協(xié)同增加，表明與伏伏西地或單獨的brd4抑制劑相比，與brd4抑制劑組合的阿伏西地協(xié)同地增加mv4-11細(xì)胞凋亡，(圖6)。

實施例6

與brd4抑制劑組合的阿伏西地比單獨處理更好地減少mv4-11細(xì)胞中的myc和mcl-1表達(dá)

將mv4-11細(xì)胞接種(100萬個細(xì)胞)6孔板，并用單獨的阿伏西地或brd4抑制劑(ibet762，otx015或jq1)處理或用阿伏西地和bdr4抑制劑(ibet762，otx015或jq1)的組合進行處理。處理療后，通過rt-pcr分析細(xì)胞。阿伏西地和brd4抑制劑的組合比單獨處理更好地降低myc表達(dá)(圖7a-c)。阿伏西地和brd4抑制劑的組合也比單獨處理更好地降低mcl-1表達(dá)(圖16a-c)。

在相關(guān)實驗中，將mv4-11細(xì)胞接種在t75燒瓶中(300萬個細(xì)胞)，并用單獨的阿伏西地或brd4抑制劑(ibet762，otx015或jq1)處理或用阿伏西地和bdr4抑制劑(ibet762，otx015或jq1)的組合進行處理，持續(xù)3小時。通過蛋白質(zhì)印跡分析細(xì)胞，其顯示所有處理的樣品的myc表達(dá)降低(圖8a-c)。蛋白質(zhì)印跡的定量表明，阿伏西地(0.1mm)和brd4抑制劑(0.1mm)的組合比單獨處理更好地降低myc表達(dá)(圖9a-c)。

實施例7

阿伏西地以時間和劑量依賴方式增加cdk9和hexim1蛋白質(zhì)的相關(guān)性

將mv4-11細(xì)胞接種并用相同濃度和劑量的阿伏西地處理。在給定時間收集細(xì)胞，并使細(xì)胞進行高鹽裂解緩沖液和免疫沉淀，隨后進行蛋白質(zhì)印跡。數(shù)據(jù)顯示，1mm阿伏西地以時間依賴的方式增加了cdk9和hexim1的關(guān)聯(lián)。圖10a中提供了代表性的蛋白質(zhì)印跡，圖10b中顯示了蛋白質(zhì)印跡的定量。圖11a和11b提供了根據(jù)上述一般程序進行的劑量遞增研究的結(jié)果。數(shù)據(jù)顯示，不同劑量的阿伏西地在半小時時間點改變cdk9和hexim1關(guān)聯(lián)。500nm劑量的阿伏西地表現(xiàn)出增加的cdk9/hexim1關(guān)聯(lián)。圖11a中提供了代表性的蛋白質(zhì)印跡，伴有圖11b中的蛋白質(zhì)印跡的定量。

類似的實驗表明，使用不同劑量的阿伏西地的2小時處理表現(xiàn)出cdk9/hexim1關(guān)聯(lián)的劑量依賴性增加。在圖12a中提供了代表性的蛋白質(zhì)印跡，定量了圖12b中的蛋白質(zhì)印跡。

實施例8

阿伏西地以時間和劑量依賴方式抑制超增強子復(fù)合物調(diào)節(jié)的基因

a549細(xì)胞是用作ii型肺上皮模型(實體瘤)的腺癌人肺泡基底上皮細(xì)胞。將這些細(xì)胞接種并用相同濃度和劑量的阿伏西地處理。通過裂解細(xì)胞并分離rna進行rt-qpcr分析來終止處理。數(shù)據(jù)顯示，阿伏西地以時間依賴的方式抑制實體瘤細(xì)胞中的超增強子復(fù)合物調(diào)控的基因。圖13a中提供了代表性的蛋白質(zhì)印跡。確定mrna的表達(dá)并將其針對β-肌動蛋白和對照進行歸一化。阿伏西地在24和48小時的時間點完全下調(diào)mrna的表達(dá)。

圖13b提供根據(jù)本實施例提供的程序進行的劑量遞增研究的結(jié)果，細(xì)胞裂解在用阿伏西地處理后2小時進行。使用施用范圍顯示mrna表達(dá)，并消退以a549細(xì)胞的劑量依賴性方式對應(yīng)于阿伏西地。數(shù)據(jù)顯示，不同劑量的阿伏西地在2小時時間點改變mrna表達(dá)，0.1μm劑量的阿伏西地顯著抑制mrna表達(dá)。在相對于β-肌動蛋白和媒介物對照，在1μm至8μm的劑量下，在測定中觀察到完全抑制。

實施例9

阿伏西地以時間依賴方式抑制在固體腫瘤和神經(jīng)細(xì)胞瘤中蛋白表達(dá)

接種a549細(xì)胞和sk-n-as細(xì)胞(人腎上腺神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系)，分別用濃度為100nm和300nm的阿伏西地處理。在給定的時間收集細(xì)胞，并提取總蛋白并用蛋白質(zhì)印記檢測。數(shù)據(jù)顯示，阿伏西地通過抑制cdk9以時間依賴的方式抑制mcl-1和c-myc/n-myc的蛋白表達(dá)。圖14a和14b中提供了代表性的蛋白質(zhì)印跡。

實施例10

阿伏西地以時間依賴方式抑制在mv4-11細(xì)胞中的mrna表達(dá)

接種mv4-11細(xì)胞并用濃度為100nm的阿伏西地處理。處理后0.5，1，3，4，8和16小時收集細(xì)胞。收獲細(xì)胞，使用rt-qpcr分析以前述實施例中描述的方式進行mrna的檢測。將mcl-1的表達(dá)與對照和未處理細(xì)胞的表達(dá)進行比較。圖15顯示阿伏西地以時間依賴的方式抑制mcl-1mrna表達(dá)。mcl-1的表達(dá)在30分鐘時間點被抑制，在施用后1小時達(dá)到最大抑制，并且在2小時時間點降低抑制。截止3小時的時間點似乎沒有抑制表達(dá)。

實施例11

與jq-1組合的阿伏西地比單獨處理更好減少a549細(xì)胞mcl-1和c-myc表達(dá)

將a549細(xì)胞接種并用濃度范圍為0nm至100nm的阿伏西地與濃度范圍為0nm至50nm的jq-1的組合進行處理。首先用jq-1處理細(xì)胞1小時，然后用阿伏西地處理2小時。在固體腫瘤細(xì)胞的處理后，收獲細(xì)胞，并以前述實施例中描述的方式使用rt-qpcr檢測mrna。圖17顯示阿伏西地通過抑制cdk9以時間依賴性方式抑制mcl-1mrna表達(dá)。

圖18顯示，當(dāng)阿伏西地與jq-1組合時，a549細(xì)胞中c-myc的蛋白表達(dá)被抑制。以與本實施例相同的方式制備細(xì)胞，然后用100nm阿伏西地和100nmjq-1處理2小時，如圖18所示。處理后，收獲細(xì)胞，使用標(biāo)準(zhǔn)的免疫印跡技術(shù)進行蛋白質(zhì)檢測。

實施例12

與jq-1組合的阿伏西地以劑量依賴方式增加a549細(xì)胞性中的凋亡

用濃度為的jq-1處理a549細(xì)胞24小時(圖19)。在jq-1處理24小時后，以100nm的濃度加入阿伏西地。加入細(xì)胞滴定度(celltiter)glo和半胱天冬酶glo，并在施用后48小時測量發(fā)光。逐漸增加劑量的jq-1與不變劑量的阿伏西地組合，顯示出半胱天冬酶活性的協(xié)同增加。當(dāng)1μmjq-1的劑量與100nm阿伏西地的劑量組合時，觀察到凋亡反應(yīng)增加大于3倍。與單獨的阿伏西地或jq-1相比，與jq-1組合的阿伏西地增加a549癌細(xì)胞凋亡(圖19)。

實施例13

與jq-1組合的dinaciclib以劑量依賴方式增加a549細(xì)胞中的凋亡

a549細(xì)胞用濃度為的jq-1處理24小時(圖20)。在jq-1處理24小時后，以3nm的濃度加入dinaciclib。加入細(xì)胞滴定度(celltiter)glo和半胱天冬酶glo，并在施用后48小時測量發(fā)光。逐漸增加劑量的jq-1與不變量的dinaciclib組合，顯示出半胱天冬酶活性的協(xié)同增加。當(dāng)1μmjq-1的劑量與3nmdinaciclib的劑量組合時，觀察到凋亡反應(yīng)增加大于4倍。與單獨的dinaciclib或jq-1相比，這種增加表明與jq-1組合的dinaciclib可以增加a549癌細(xì)胞的凋亡(圖20)。

實施例14

阿伏西地減少a549細(xì)胞中的mcl-1和c-myc表達(dá)

接種a549細(xì)胞并用濃度為0μm-8μm的阿伏西地處理2小時。在固體腫瘤細(xì)胞的處理后，收獲細(xì)胞，并以前述實施例中描述的方式使用rt-qpcr檢測mrna。圖21a顯示阿伏西地相對于hprt1以劑量依賴的方式抑制mycmrna表達(dá)。圖21b顯示阿伏西地以相對于hprt1的劑量依賴性方式抑制mcl-1mrna表達(dá)。

實施例15

cdk9特異性sirna與bet抑制劑協(xié)同地減少a549細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)和增加細(xì)胞凋亡

接種a549細(xì)胞并用非靶向sirna或cdk9特異性sirna處理48小時。測量相對于對照的未處理的、非靶向sirna和cdk9特異性sirna的蛋白質(zhì)表達(dá)。圖22a顯示了cdk9中相對于未處理的和非靶向sirna的確定降低，而β-肌動蛋白保持恒定。

為了評估凋亡誘導(dǎo)，進行上述程序，然后用濃度為0.03μm的bet抑制劑(ibet762，jq-1或otx015)處理48小時。用bet抑制劑處理48小時后，加入細(xì)胞滴定度(celltiter)glo和半胱天冬酶glo，并測量發(fā)光以評估細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡。圖22b顯示了，當(dāng)使用與非靶向sirna組合的bet抑制劑處理細(xì)胞時，與使用cdk9特異性sirna的bet抑制劑相比較，活性增加約2-3倍。

本說明書中提及的所有美國專利，美國專利申請公開，美國專利申請，外國專利，外國專利申請和非專利出版物的全部內(nèi)容通過引用并入本文中，其程度與本說明書不一致。

從上述可以理解，雖然為了說明的目的在本文中描述了本發(fā)明的具體實施方式，但是可以在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下進行各種修改。因此，除了所附權(quán)利要求之外，本發(fā)明不受限制。