逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的基因組合物h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的基因組合物-h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
惡性腫瘤是常見且嚴(yán)重威脅人類健康和生命的重大疾病之一，正在成為世界“頭號(hào)殺手”。隨著抗腫瘤新藥的不斷研發(fā)，化療方案的不斷改進(jìn)，化療在腫瘤綜合治療中的作用和地位日益重要。但是，抗腫瘤化學(xué)藥物的選擇性低、對(duì)正常組織毒副作用大，這些因素很大程度上影響臨床化療的效果。除此之外，腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的產(chǎn)生也成為目前腫瘤化療失敗的一個(gè)主要原因，據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)估計(jì)，90％以上腫瘤患者死于不同程度的耐藥。因此，如何成功逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥也已成為目前腫瘤治療領(lǐng)域中亟待解決的重要問題[vanVlerkenetal.,2008]。多藥耐藥(multidrugresistance，MDR)是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)耐藥性的同時(shí)，對(duì)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的多種抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥性，從而大大降低了抗腫瘤藥物的療效。MDR形成機(jī)制復(fù)雜，腫瘤細(xì)胞可以通過不同途徑導(dǎo)致MDR的產(chǎn)生。隨著腫瘤細(xì)胞MDR分子機(jī)制研究的不斷深入，克服MDR的方法研究也取得了較大進(jìn)展，目前研究較多的是化學(xué)合成抑制劑和基因治療?；瘜W(xué)合成的抑制劑能夠增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，但這些藥物在臨床應(yīng)用中特異性不高、毒副作用嚴(yán)重，難以達(dá)到逆轉(zhuǎn)MDR的有效血漿濃度，并且腫瘤細(xì)胞也可以對(duì)這些藥物產(chǎn)生耐藥性，其臨床應(yīng)用受到限制。目前逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的基因治療方法主要集中在：1)抑制P-gp藥泵功能(Linetal,2003)；2)干擾MDR相關(guān)基因的表達(dá)，如MDR1基因的反義寡聚脫氧核糖核酸(AOD)，MDR1和MRP基因的反義RNA聯(lián)合抑制，切割MDR1mRNA的核酶(Stuartetal2000；Wangetal,2003；Hueskeretal,2002)；3)針對(duì)MDR1基因調(diào)節(jié)的基因治療(Efferthetal,2001)；4)mdr1/siRNA的RNA干擾(Hannonetal,2002；Yagueetal,2004)。與反義寡核苷酸、反義RNA和人工轉(zhuǎn)錄因子相比，siRNA的應(yīng)用前景最好，其它均存在體內(nèi)特異性不強(qiáng)、轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定表達(dá)不足等問題。盡管siRNA相比于反義寡核苷酸、反義RNA等具有較好的應(yīng)用前景，但具有核酸和小分子化合物的雙重特性的siRNA，其本身的親水性和陰離子特性使其很難通過細(xì)胞膜，而且由于易被核酸酶(RNase)降解導(dǎo)致其具有穩(wěn)定性差、半衰期短、轉(zhuǎn)染效率低等特點(diǎn)。因此應(yīng)用siRNA分子的關(guān)鍵是如何使其有效地穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中的RNAi通路。而且將siRNA分子導(dǎo)入生物體內(nèi)治療疾病更為復(fù)雜，除了細(xì)胞膜障礙外，還要克服靶細(xì)胞的選擇性、體內(nèi)siRNA分子的穩(wěn)定性、動(dòng)態(tài)平衡的機(jī)制以及對(duì)非靶細(xì)胞的毒性等問題。因此，siRNA是否能夠有效遞送是其能否應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵，設(shè)計(jì)和合成安全、高效、靶向的siRNA遞送載體已經(jīng)成為目前siRNA藥物研究的重要方向。新型樹枝狀高分子聚酰胺-胺(PAMAM)，以其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)，成為了治療性基因載體研究的熱點(diǎn)。以末端為胺基的PAMAM樹枝狀大分子為例，它在生理pH條件下具有很好的溶解性，其正電性的特征可以實(shí)現(xiàn)更多數(shù)量基因的運(yùn)載，而且體系穩(wěn)定，能夠保護(hù)目的基因不受體內(nèi)血漿或組織細(xì)胞中各種酶的破壞，因而可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)的有效轉(zhuǎn)染[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:4897-4902]。但PAMAM作為基因遞送載體在體內(nèi)應(yīng)用尚存在以下幾個(gè)問題需要解決：1)轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較低；2)在體內(nèi)環(huán)境下，PAMAM可以非特異性的結(jié)合大量的負(fù)電大分子和紅細(xì)胞，影響轉(zhuǎn)染效率并且發(fā)生溶血現(xiàn)象；3)如何實(shí)現(xiàn)PAMAM納米基因遞送系統(tǒng)的靶向性。為了解決上述問題，目前研究多直接在PAMAM分子上進(jìn)行修飾，如在PAMAM表面修飾鳥氨酸等殘基[IntJPharm,2010,392:294–303]，增強(qiáng)PAMAM分子表面正電性以增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率，但此方法在增強(qiáng)過多正電性的同時(shí)，也提高了細(xì)胞毒性；另一方面，對(duì)PAMAM表面修飾PEG[Nanotechnology,2009,20:105-103]，以提高生物相容性，減少非特異性的結(jié)合血漿中的負(fù)電大分子和紅細(xì)胞，另外，在PEG末端修飾特定蛋白如乳鐵蛋白[Biomaterials,2008,29(2):238-246]，以實(shí)現(xiàn)組織靶向性，但PEG的修飾增加了PAMAM分子和DNA分子結(jié)合的空間位阻，降低了轉(zhuǎn)染效率。表皮生長(zhǎng)因子受體(EpidermalGrowthFactorReceptor，EGFR)是一種具有酪氨酸激酶活性的生長(zhǎng)因子受體，在正常細(xì)胞表達(dá)率低，而在多種腫瘤如肺癌、大腸癌、腎癌和頭頸部鱗癌等多種腫瘤細(xì)胞中存在過度表達(dá)。EGFR信號(hào)通路在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，EGFR的異常表達(dá)常與惡性腫瘤的特征如細(xì)胞增殖、免疫逃避、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、腫瘤血管形成以及化療抗拒、不良預(yù)后等相關(guān)，為以EGFR為靶點(diǎn)的腫瘤治療和針對(duì)EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)干預(yù)治療提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目前以EGFR為靶點(diǎn)的腫瘤治療方式中單克隆抗體為常見治療方法，EGFR單克隆抗體與內(nèi)源性配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EGFR，通過抑制酪氨酸激酶的激活、促進(jìn)EGFR內(nèi)化等作用產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)，也可與抗癌藥物或毒素相偶聯(lián)，從而達(dá)到特異性抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。例如，尼妥珠單克隆抗體(Nimotuzumab，h-R3)為抗人EGFR人源化單克隆抗體(mAb)，具有人源性、高選擇性和半衰期長(zhǎng)的特點(diǎn)，能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制內(nèi)源性配體與EGFR的結(jié)合，抑制EGFR的酪氨酸激酶活性，阻斷由EGFR介導(dǎo)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。體內(nèi)外研究表明，h-R3有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤血管生成以增加放化療敏感性的作用[ExpertRevAnticancerTher,2003,3(3):367-380；LungCancer,2013,79(3)270-275]。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于抗腫瘤多藥耐藥的組合物。本發(fā)明提供的組合物，由末端帶有氨基的聚酰胺-胺樹枝狀聚合物、尼妥珠單抗h-R3和MDR1siRNA復(fù)合制成。上述的組合物中，所述聚酰胺-胺樹枝狀聚合物的數(shù)均分子量為28824.81。上述的組合物中，所述MDR1siRNA為由序列比表中序列1所示的單鏈正義鏈和序列表中序列2所示的單鏈反義鏈組成。上述的組合物中，所述聚酰胺-胺樹枝狀聚合物與所述MDR1siRNA的氮/磷比為1:1-40:1。上述的組合物中，所述聚酰胺-胺樹枝狀聚合物與所述MDR1siRNA的氮/磷比為20:1。上述的組合物中，所述尼妥珠單抗h-R3與所述MDR1siRNA的質(zhì)量比為0.05:1-5:1。上述的組合物中，所述尼妥珠單抗h-R3與所述MDR1siRNA的質(zhì)量比為0.05:1、0.1:1或0.5:1。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備上述的抗腫瘤多藥耐藥組合物的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：將末端為氨基的聚酰胺-胺樹枝狀聚合物的水溶液與MDR1siRNA混合后，孵育條件下自組裝形成聚酰胺-胺樹枝狀聚合物與MDR1siRNA的組合物；再將所述聚酰胺-胺樹枝狀聚合物與MDR1siRNA的組合物中加入到尼妥珠單抗h-R3中，孵育條件下自組裝形成聚酰胺-胺樹枝狀聚合物、尼妥珠單抗h-R3和MDR1siRNA的組合物，即得到所述的抗腫瘤多藥耐藥基因組合物。上述的組合物在在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥產(chǎn)品中的應(yīng)用或在制備抗腫瘤細(xì)胞多藥耐藥產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述應(yīng)用中，所述腫瘤細(xì)胞為多藥耐藥腫瘤細(xì)胞，所述多藥耐藥腫瘤細(xì)胞具體為MCF-7/ADR；所述產(chǎn)品為藥物。上述的組合物在靶向運(yùn)輸核酸或制備靶向運(yùn)輸核酸產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，在本發(fā)明中的核酸為MDR1siRNA。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)以EGFR為靶點(diǎn)，通過自組裝的方法形成尼妥珠單抗h-R3修飾的PAMAM載體作為基因遞送載體，利用h-R3與腫瘤細(xì)胞EGFR介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，提高PAMAM載體對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性，從而將針對(duì)MDR1基因的小干擾RNA成功遞送到細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)目的基因MDR1siRNA的沉默，進(jìn)一步增加化療藥物的敏感性；2)通過單克隆抗體h-R3對(duì)PAMAM的修飾，可降低PAMAM載體過強(qiáng)的正電荷強(qiáng)度，有利于降低細(xì)胞毒性和溶血現(xiàn)象的發(fā)生；3)采用自組裝方法制備h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA組合物，與化學(xué)合成相比，分子自組裝方法可更方便、靈活的對(duì)體系進(jìn)行修飾，并且保持配體的生物活性。附圖說明圖1為WesternBlot法檢測(cè)敏感細(xì)胞MCF-7與耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR中GCS蛋白的表達(dá)。圖2為PCR檢測(cè)敏感細(xì)胞MCF-7與耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR中GCS蛋白的表達(dá)。圖3為不同氮/磷比(N/P比)的PAMAMG5/MDR1siRNA的凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖4為h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖5為h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物Zeta電位檢測(cè)結(jié)果。圖6為h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物粒度檢測(cè)結(jié)果。圖7為h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA轉(zhuǎn)染24h后的平均熒光強(qiáng)度。圖8為h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA(h-R3-dendriplex,N/P20:1,h-R3/siRNA0.1:1)在HepG2轉(zhuǎn)染24后的激光共聚焦圖。圖9為MCF-7/ADR轉(zhuǎn)染h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA后沉默多藥耐藥基因MDR-1的效果。圖10為激光共聚焦考察h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA在MCF-7/ADR細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后加入阿霉素(ADM)的攝取情況。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。聚酰胺-胺樹枝狀聚合物(PAMAM)：末端帶有氨基，以乙二胺為核，5.0代，(購(gòu)自Sigma-Aldrich，貨號(hào)：536709，規(guī)格5g，數(shù)均分子量為28824.81)；采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽真空，去掉甲醇溶劑，獲得PAMAMG5，再用PBS緩沖液(pH7.4)溶解，制備成10mg/mL儲(chǔ)存液于4℃?zhèn)溆谩Ｄ嵬字閱慰?Nimotuzumab，h-R3)：購(gòu)自百泰生物藥業(yè)有限公司。多藥耐藥基因(MDR1)小干擾RNA(MDR1siRNA)：購(gòu)自蘇州瑞博生物技術(shù)公司，其由序列表中序列1所示的單鏈正義鏈和序列表中序列2所示的單鏈反義鏈組成的雙鏈RNA。正義鏈CAGAAAGCUUAGUACCAAAdTdT(序列1)反義鏈UUUGGUACUAAGCUUUCUGdTdC(序列2)耐藥細(xì)胞株(MCF-7/ADR)：購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心，其細(xì)胞中MDR1的表達(dá)量檢測(cè)如下：首先采用蛋白質(zhì)印跡法(WesternBlot，WB)檢測(cè)耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR中MDR1的表達(dá)，并與敏感細(xì)胞MCF-7進(jìn)行比較。結(jié)果如圖1所示，1為MCF-7細(xì)胞、2為MCF-7/ADR細(xì)胞；由結(jié)果可知MDR1在耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR中的表達(dá)明顯高于在敏感細(xì)胞株MCF-7中的表達(dá)。進(jìn)一步采用PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄水平上敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞中MDR1表達(dá)的差異，結(jié)果如圖2所示，1：Marker；2：MCF-7中的MDR1；3：MCF-7/ADR中的MDR1；4：MCF-7中的MDR1；5：MCF-7/ADR中的MDR1；6：MCF-7中的GAPDH；7：MCF-7/ADR中的GAPDH；表明在MCF-7和MCF-7/Adr細(xì)胞株中，不僅MDR1的表達(dá)存在差異，多藥耐藥蛋白MDR1的表達(dá)也存在差異。實(shí)施例1、制備h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物及其表征一、PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物首先將上述制成的PAMAMG5(數(shù)均分子量為28824.81)10mg/mL儲(chǔ)存液溶解于消毒蒸餾水中，振蕩混勻，配制成1mg/mL的工作溶液，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。轉(zhuǎn)染前取1.0μgMDR1siRNA置于EP管中，分別加入0.7μL、1.4μL、3.5μL、7μL、14μL、21μL、28μL濃度為1mg/mL的PAMAMG5工作溶液，再加入opti-MEM培養(yǎng)基(購(gòu)自invitrogen，產(chǎn)品目錄號(hào)為11058-021)500uL，混勻后置室溫孵育30min形成PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物。形成的PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物中，PAMAM與MDR1siRNA的氮/磷比分別為1:1、2:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1。將上述制備的PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物采用瓊脂糖凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)證明PAMAM與MDR1siRNA的復(fù)合情況以及穩(wěn)定性。所檢測(cè)的PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物中，PAMAM與MDR1siRNA的氮/磷比分別為1:1、2:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1。具體方法如下：稱取適量瓊脂糖，加入1×TAE溶液，加熱溶解，配制1％瓊脂糖凝膠溶液，室溫冷卻至約50℃，加入1μL溴化乙錠溶液(500μg/ml)插入DNA染色，灌膠，加樣，120V電泳30min左右，紫外透射儀觀察并拍照。新鮮配制所需轉(zhuǎn)染復(fù)合物，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定包封效果。結(jié)果如圖3所示，泳道1為裸MDR1siRNA；泳道2-8為氮/磷比分別為1，2，5，10，20，30，40；泳道9為RNAMarker，結(jié)果顯示siRNA在沒有與PAMAM完全結(jié)合時(shí)(泳道2-5)，能夠出現(xiàn)正常電泳條帶；當(dāng)N/P比為20(泳道6)時(shí)，PAMAM-siRNA能夠完全阻滯其包裹的siRNA的電泳，使其滯留在點(diǎn)樣孔附近，無法電泳出正常電泳條帶，表明N/P達(dá)到20時(shí)，能夠形成穩(wěn)定的PAMAM-siRNA。二、h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物及其表征1、h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物將尼妥珠單抗(Nimotuzumab，h-R3)用PBS緩沖液(pH7.4，NaCl8.0g,KCl0.2g,NaH2PO4·H2O1.56g,KH2PO40.20g，蒸餾水定容至1000ml)，配制成濃度為1mg/mL的單抗溶液，向100μL氮/磷比20的PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物加入不同體積的濃度為1mg/mL的單抗溶液，混勻后置室溫孵育30min形成h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物。形成h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物中，h-R3與MDR1siRNA的質(zhì)量比分別為0.05:1、0.1:1、0.5:1、1:1、2:1、5:1，PAMAMG5與MDR1siRNA的氮/磷比為20:1。2、表征1)瓊脂糖凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)將上述制備的h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物采用瓊脂糖凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)證明PAMAM與MDR1siRNA的復(fù)合情況以及穩(wěn)定性，所檢測(cè)的h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物中，PAMAM與MDR1siRNA的氮/磷比為20:1；h-R3與MDR1siRNA的質(zhì)量比分別為0.05，0.1，0.5，1，2，5。方法同上。h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA三元復(fù)合物的瓊脂糖凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，泳道1為裸MDR1siRNA；泳道2-7為PAMAMG5與MDR1siRNA氮/磷比為20:1、且h-R3與MDR1siRNA的質(zhì)量比分別為0.05，0.1，0.5，1，2，5的h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物；泳道8為Marker，從圖中可見，當(dāng)h-R3與MDR1siRNA的質(zhì)量比為0.05、0.1、0.5時(shí)，無裸siRNA條帶，此時(shí)形成的h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物是穩(wěn)定的，可以有效包裹MDR1siRNA。因此，結(jié)合上述結(jié)論，h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物，PAMAM與DNA的氮/磷比為20:1，且h-R3與MDR1siRNA的質(zhì)量比為0.05、0.1、0.5，為最佳反應(yīng)組合物。2)、h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物的Zeta電位采用激光粒度及Zeta電位測(cè)定儀(英國(guó)Malvern公司，型號(hào)ZetasizerNanoZS90)對(duì)1制備的h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物(PAMAM與MDR1siRNA的氮/磷比為20:1；h-R3與MDR1siRNA的質(zhì)量比分別為0.05，0.1，0.5，1，2，5)的Zeta電位進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖5所示，h-R3與MDR1siRNA的質(zhì)量比從0.05提高到0.5時(shí)，mAb/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物的電位無明顯降低趨勢(shì)，而當(dāng)h-R3與MDR1siRNA的質(zhì)量比大于1時(shí)，復(fù)合物的Zeta電位明顯下降。3)、h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物的粒徑采用激光粒度及Zeta電位測(cè)定儀(英國(guó)Malvern公司，型號(hào)ZetasizerNanoZS90)對(duì)制備的h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物(PAMAM與MDR1siRNA的氮/磷比為20:1；h-R3與MDR1siRNA的質(zhì)量比分別為0.05，0.1，0.5，1，2，5)的粒徑大小進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖6所示，隨著h-R3與MDR1siRNA的質(zhì)量比的提高，復(fù)合物的粒徑呈增大趨勢(shì)，當(dāng)h-R3與MDR1siRNA的質(zhì)量比大于1時(shí)，復(fù)合物的粒徑明顯增大。實(shí)施例2、h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物在抑制腫瘤細(xì)胞多藥耐藥中的應(yīng)用1、h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物的細(xì)胞胞吞情況測(cè)定采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物(氮/磷比為20:1；h-R3與MDR1siRNA質(zhì)量比為0.5)的細(xì)胞胞吞情況。具體轉(zhuǎn)染方法為：轉(zhuǎn)染前12h，24孔板以5×104/孔HepG2細(xì)胞鋪板,培養(yǎng)基為含10％血清的DMEM,培養(yǎng)于37℃的含5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。按照要求配制不同轉(zhuǎn)染復(fù)合物,復(fù)合物體系中含1μgcy5-siRNA。細(xì)胞密度長(zhǎng)至60％左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染,每皿加入相應(yīng)轉(zhuǎn)染opti-MEM液。轉(zhuǎn)染后4h,每皿補(bǔ)充1ml新鮮的培養(yǎng)基；繼續(xù)培養(yǎng)44h后，消化收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，PBS沖洗3遍，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)cy5熒光信號(hào)分析吞噬siRNA情況。以如下為對(duì)照組：PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物(PAMAM)：與h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物(h-R3-dendriplex)制備方法基本相同，不同的是不加入h-R3；EGF/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物(EGF-dendriplex)：與h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物制備方法基本相同，不同的是用同樣量的EGF蛋白替換h-R3；HSA/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物(HSA-dendriplex)：與h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物制備方法基本相同，不同的是用同樣量的HSA蛋白替換h-R3；結(jié)果如圖7所示，與其他修飾相比，h-R3修飾PAMAM能夠明顯介導(dǎo)MDR1siRNA胞吞進(jìn)入耐藥細(xì)胞。2、激光共聚焦顯微鏡考察轉(zhuǎn)染h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞后的胞吞情況利用激光共聚焦顯微鏡考察轉(zhuǎn)染h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物(氮/磷比為20:1；h‐R3與MDR1siRNA質(zhì)量比為0.5)進(jìn)入HepG2細(xì)胞后的胞吞情況。以如下為對(duì)照組：PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物(dendriplex)：與h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物(h-R3-dendriplex)制備方法基本相同，不同的是不加入h-R3；EGF/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物(EGF-dendriplex)：與h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物制備方法基本相同，不同的是用同樣量的EGF蛋白替換h-R3；HSA/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物(HSA-dendriplex)：與h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物制備方法基本相同，不同的是用同樣量的HSA蛋白替換h-R3；結(jié)果如圖8所示，所用siRNA為cy5標(biāo)記的siRNA(紅色)。觀察前，用LysoTrackerGreen染細(xì)胞中的溶酶體(綠色)，Hoechst33342用于對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色(藍(lán)色)。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染24h，h-R3-dendriplex和HSA-dendriplex相對(duì)于未修飾的dendriplex有較高的轉(zhuǎn)染能力,而EGF-dendriplex無明顯提高轉(zhuǎn)染的能力。此外，也可看到紅色與綠色共標(biāo)的黃色信號(hào)，則代表此時(shí)siRNA已被胞吞，但仍在溶酶體/內(nèi)涵體中沒有釋放出來。轉(zhuǎn)染24h后，h-R3修飾的h-R3-dendriplex有部分siRNA明顯從內(nèi)涵體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。由此可見，相對(duì)于非修飾的dendriplex、EGF-dendriplexh-R3-dendriplex以及HSA-dendriplex，h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物擁有較好的逃逸過程，從而可以更好地發(fā)揮沉默目的基因的功效。3、h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA轉(zhuǎn)染后多藥耐藥基因MDR1沉默效果上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA相比于非修飾的PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物以及HSA或EGF修飾的PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物具有更好的進(jìn)入細(xì)胞并且胞吞的能力，因此在之后的實(shí)驗(yàn)中不再選擇HSA或EGF修飾的PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物作為對(duì)照，僅選擇非修飾的PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物作為對(duì)照，進(jìn)一步驗(yàn)證h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA轉(zhuǎn)染后MDR1基因的沉默效果。按實(shí)施例1所述的方法制備PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物和h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物，其中PAMAM與DNA的氮/磷比確定為20:1，h‐R3與MDR1siRNA的質(zhì)量比為0.5:1。利用RT-PCR法檢測(cè)兩種復(fù)合物轉(zhuǎn)染進(jìn)入耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR后MDR1基因表達(dá)量的變化。引物序列為：MDR1forATATCAGCAGCCCACATCATMDR1reGAAGCACTGGGATGTCCGGT以GAPDH為內(nèi)參基因。結(jié)果如圖9所示，1:未轉(zhuǎn)染MCF-7/ADR中的MDR1；2:轉(zhuǎn)染PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物MCF-7/Adr中的MDR1；3:轉(zhuǎn)染h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物MCF-7/ADR中的MDR1；看出，相比于非修飾的PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物，h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染后耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR中幾乎檢測(cè)不出MDR1基因的表達(dá)，說明MDR1基因有可能被完全沉默，進(jìn)一步證明了h-R3/PAMAMG5能夠攜載MDR1siRNA更好地靶向到腫瘤耐藥細(xì)胞，并且易被細(xì)胞內(nèi)吞而且可以逃逸溶酶體，從而更為有效地發(fā)揮沉默目的基因的功能。4、激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)耐藥細(xì)胞攝取阿霉素的量通過激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)耐藥細(xì)胞攝取阿霉素的量，進(jìn)一步驗(yàn)證MDR1基因沉默的效果，MCF-7/ADR細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后加入阿霉素(ADM)，觀察其被細(xì)胞攝取的情況。觀察前，采用Hoechst33342對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色(藍(lán)色)，阿霉素(ADM)具有自發(fā)的熒光(紅色)，結(jié)果如圖10所示。圖中A-C依次為未處理細(xì)胞組、PAMAMG5/MDR1siRNA組、三元復(fù)合物h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA組(氮/磷比為20:1；h-R3與MDR1siRNA質(zhì)量比為0.5)。結(jié)果表明，相比于未處理的細(xì)胞(A)、PAMAMG5/MDR1siRNA組(B)，三元復(fù)合物h-R3/PAMAMG5/MDR1siRNA(C)轉(zhuǎn)染后耐藥細(xì)胞能夠明顯攝取阿霉素，進(jìn)一步驗(yàn)證了h-R3/PAMAM復(fù)合物能夠更好地介導(dǎo)MDR1siRNA進(jìn)入到腫瘤多藥耐藥細(xì)胞從而逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥。