本發(fā)明屬于生物制品領(lǐng)域，特別涉及一種檢測(cè)幽門螺桿菌耐藥突變位點(diǎn)的試劑盒與方法。

背景技術(shù)：

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是世界上流行范圍最廣的病原體，全世界大約有50％的人感染了幽門螺桿菌，而在我國有40％-70％的人群感染幽門螺桿菌。幽門螺桿菌主要引起胃腸道消化系統(tǒng)相關(guān)疾病，如慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌等等。目前對(duì)幽門螺桿菌的治療主要采用含有抗生素的三聯(lián)或四聯(lián)療法進(jìn)行，而隨著抗生素的大量使用，幽門螺桿菌已經(jīng)出現(xiàn)了抗生素的耐藥現(xiàn)象。因此，幽門螺桿菌的耐藥檢測(cè)對(duì)臨床用藥的指導(dǎo)具有重要意義。

目前臨床上檢測(cè)幽門螺桿菌是否耐藥主要為藥敏試驗(yàn)，即通過培養(yǎng)Hp與不同抗生素進(jìn)行體外反應(yīng)從而確定其最低抑菌濃度來判斷是否耐藥。藥敏試驗(yàn)的大致步驟為：從病人的感染部位采取含致病菌的標(biāo)本，接種在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上，于一定條件下培養(yǎng)；同時(shí)將分別沾有一定量各種抗生素的紙片貼在培養(yǎng)基表面(或用不銹鋼圈，內(nèi)放定量抗生素溶液)，培養(yǎng)一定時(shí)間后觀察結(jié)果。由于致病菌對(duì)各種抗生素的敏感程度不同，在藥物紙片周圍便出現(xiàn)不同大小的抑制病菌生長而形成的“空圈”，稱為抑菌圈。抑菌圈大小與致病菌對(duì)各種抗生素的敏感程度成正比關(guān)系。然后根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果有針對(duì)性地選用抗生素。

但是上述幽門螺桿菌藥敏試驗(yàn)首先需要對(duì)幽門螺桿菌進(jìn)行培養(yǎng)。二幽門螺旋桿菌是一種螺旋形、微厭氧、對(duì)生長條件要求十分苛刻的革蘭氏陰性桿菌，因此幽門螺桿菌的培養(yǎng)難度大，操作復(fù)雜，且耗時(shí)較長(藥敏試驗(yàn)整個(gè)過程通常需要1-2周)。因此，導(dǎo)致幽門螺桿菌的藥敏試驗(yàn)成本高，靈敏度低，特別難以滿足對(duì)幽門螺桿菌的常用藥物克拉霉素和喹諾酮類抗生素的耐藥性臨床檢測(cè)的要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于針對(duì)上述臨床上對(duì)幽門螺桿菌最常用的藥物克拉霉素和喹諾酮類抗生素，提出一種針對(duì)這幾種藥物高頻耐藥基因的位點(diǎn)開發(fā)的，費(fèi)用低、速度快的幽門螺桿菌耐藥性檢測(cè)技術(shù)。

因此，本發(fā)明的第一目的在于提供一種檢測(cè)幽門螺桿菌耐藥突變位點(diǎn)的試劑盒，包括以下組分：

喹諾酮類抗生素耐藥位點(diǎn)突變引物探針與阻滯序列；

和/或克拉霉素類抗生素耐藥位點(diǎn)突變引物探針與阻滯序列；

和/或與上述引物探針相匹配的PCR試劑組

優(yōu)選地，本發(fā)明檢測(cè)幽門螺桿菌耐藥突變位點(diǎn)的試劑盒中，所述被檢測(cè)的喹諾酮類抗生素耐藥位點(diǎn)突變包括：幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變A259T、幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變T261G、幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變G271A、幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變G271T、與幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變A272G中一種或幾種。

更優(yōu)選地，本發(fā)明檢測(cè)幽門螺桿菌耐藥突變位點(diǎn)的試劑盒中，所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變A259T的引物探針序列為(對(duì)應(yīng)于序列表的SEQ ID NO1～NO3)：

259-F：5’ACCACCCCCATGGCGATT3’

259-R：5’CGCCATCAATAGAGCCAAAGTG3’

259-P：5’GAGAATGGCGCAAGATTTTTCCATGCG3’；

與所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變A259T引物探針序列對(duì)應(yīng)的阻滯序列((對(duì)應(yīng)于序列表的SEQ ID NO4)為：

259-blocker：5’GGTAAATACCACCCCCATGGCGATA3’-NH₂C₆；

所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變T261G的引物探針序列(對(duì)應(yīng)于序列表的SEQ ID NO5～NO7)為：

261-F：5’ACCACCCCCATGGCGATTAG3’

261-R：5’CGCCATCAATAGAGCCAAAGTG3’

261-P：5’GAGAATGGCGCAAGATTTTTCCATGCG3’；

與所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變T261G引物探針序列對(duì)應(yīng)的阻滯序列(對(duì)應(yīng)于序列表的SEQ ID NO8)為：

261-blocker：5’GGTAAATACCACCCCCATGGCGATAAT3’-NH₂C₆；

所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變G271A的引物探針序列(對(duì)應(yīng)于序列表的SEQ ID NO9～NO11)為：

271A-F：5’CCATGGCGATAATGCGGTTTTTA3’

271A-R：5’CGCCATCAATAGAGCCAAAGTG3’

271A-P：5’GAGAATGGCGCAAGATTTTTCCATGCG3’

與所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變G271A引物探針序列對(duì)應(yīng)阻滯序列(對(duì)應(yīng)于序列表的SEQ ID NO12)為：271A-blocker：

5’ACCCCCATGGCGATAATGCGGTTTATG3’-NH₂C₆；

所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變G271T的引物探針序列(對(duì)應(yīng)于序列表的SEQ ID NO13～NO15)為：

271T-F：5’CCATGGCGATAATGCGGTTTTTA 3’

271T-R：5’CCATGGCGATAATGCGGTTTTTT 3’

271T-P：5’GAGAATGGCGCAAGATTTTTCCATGCG3’

與所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變G271T引物探針序列對(duì)應(yīng)的阻滯序列(對(duì)應(yīng)于序列表的SEQ ID NO16)為：

271T-blocker：5’ACCCCCATGGCGATAATGCGGTTTATG3’-NH₂C₆；

所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變A272G的引物探針序列(對(duì)應(yīng)于序列表的SEQ ID NO17～NO19)為：

272-F：5’CATGGCGATAATGCGGTTTAAGG 3’

272-R：5’CCATGGCGATAATGCGGTTTTTT 3’

272-P：5’GAGAATGGCGCAAGATTTTTCCATGCG3’

與所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變A272G引物探針序列對(duì)應(yīng)的阻滯序列(對(duì)應(yīng)于序列表的SEQ ID NO20)為：

272-blocker：5’ACCCCCATGGCGATAATGCGGTTTATGA3’-NH₂C₆。

更優(yōu)選地，所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變A259T的引物探針序列259-P、所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變T261G的引物探針序列261-P、所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變G271A的引物探針序列271A-P、所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變G271T的引物探針序列271T-P、所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變A272G的引物探針272-P的5’端、所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變A259T的引物探針序列259-P、所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變T261G的引物探針序列261-P、所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變G271A的引物探針序列271A-P、所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變G271T的引物探針序列271T-P、所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變A272G的引物探針272-P的3’端為被熒光修飾集團(tuán)所修飾。

本發(fā)明所用的熒光修飾集團(tuán)可使用FAM(6-羧基熒光素)，HEX(六氯-6-甲基熒光素)、VIC、ROX、Cy3(TYE^TM563)、Cy5(TYE^TM665)的一種或幾種。

最優(yōu)選地，所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變A259T的引物探針序列259-P、所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變T261G的引物探針序列261-P、所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變G271A的引物探針序列271A-P、所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變G271T的引物探針序列271T-P、所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變A272G的引物探針272-P的5’端被HEX集團(tuán)修飾，所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變A259T的引物探針序列259-P、所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變T261G的引物探針序列261-P、所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變G271A的引物探針序列271A-P、所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變G271T的引物探針序列271T-P、所述幽門螺桿菌gyrA基因喹諾酮耐藥位點(diǎn)突變A272G的引物探針272-P的3’端被BHQ1集團(tuán)修飾。

優(yōu)選地，本發(fā)明檢測(cè)幽門螺桿菌耐藥突變位點(diǎn)的試劑盒中，所述檢測(cè)的克拉霉素類抗生素耐藥位點(diǎn)突變包括：幽門螺桿菌23SrRNA基因克拉霉素耐藥位點(diǎn)突變A2142C、幽門螺桿菌23SrRNA基因克拉霉素耐藥位點(diǎn)突變A2142G、幽門螺桿菌23SrRNA基因克拉霉素耐藥位點(diǎn)突變A2143G的一種或幾種。

更優(yōu)選地，本發(fā)明檢測(cè)幽門螺桿菌耐藥突變位點(diǎn)的試劑盒中，所述幽門螺桿菌23SrRNA基因克拉霉素耐藥位點(diǎn)突變A2142C的引物探針序列(對(duì)應(yīng)于序列表的SEQ ID NO21～NO23)為:

2142C-F：5’TCCTACCCGCGGCAAGACTGC 3’

2142C-R：5’CCATAAGAGCCAAAGCCCTTACTTCA 3’

2142C-P：5’TGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAG 3’

與所述幽門螺桿菌23SrRNA基因克拉霉素耐藥位點(diǎn)突變A2142C的引物探針序列的阻滯序列(對(duì)應(yīng)于序列表的SEQ ID NO24)為：

2142C-blocker：5’TCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGA 3’-NH₂C₆；所述幽門螺桿菌23SrRNA基因克拉霉素耐藥位點(diǎn)突變A2142G的引物探針序列(對(duì)應(yīng)于序列表的SEQ ID NO25～NO27):

2142G-F：5’CTACCCGCGGCAAGACTGG 3’

2142G-R：5’CCATAAGAGCCAAAGCCCTTACTTCA 3’

2142G-P：5’TGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAG 3’

與所述幽門螺桿菌23SrRNA基因克拉霉素耐藥位點(diǎn)突變A2142G的引物探針序列對(duì)應(yīng)的阻滯序列(對(duì)應(yīng)于序列表的SEQ ID NO28)為：

2142G-blocker：5’TCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGA 3’-NH₂C₆；

所述幽門螺桿菌23SrRNA基因克拉霉素耐藥位點(diǎn)突變A2143G的引物探針序列(對(duì)應(yīng)于序列表的SEQ ID NO29～NO31)為:

2143-F：5’TACCCGCGGCAAGACGTAG 3’

2143-R：5’CCATAAGAGCCAAAGCCCTTACTTCA 3’

2143-P：5’TGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAG 3’

與所述幽門螺桿菌23SrRNA基因克拉霉素耐藥位點(diǎn)突變A2143G的引物探針序列對(duì)應(yīng)的阻滯序列(對(duì)應(yīng)于序列表的SEQ ID NO32)為：

2143-blocker：5’TCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAA3’-NH₂C₆；

更優(yōu)選地，所述幽門螺桿菌23SrRNA基因克拉霉素耐藥位點(diǎn)突變A2142C的引物探針序列2142C–P、所述幽門螺桿菌23SrRNA基因克拉霉素耐藥位點(diǎn)突變A2142G的引物探針序列2142G–P、所述幽門螺桿菌23SrRNA基因克拉霉素耐藥位點(diǎn)突變A2143G的引物探針序列2143–P的5’端、所述幽門螺桿菌23SrRNA基因克拉霉素耐藥位點(diǎn)突變A2142C的引物探針序列2142C–P、所述幽門螺桿菌23SrRNA基因克拉霉素耐藥位點(diǎn)突變A2142G的引物探針序列2142G–P、所述幽門螺桿菌23SrRNA基因克拉霉素耐藥位點(diǎn)突變A2143G的引物探針序列2143–P的3’端為被熒光修飾集團(tuán)所修飾。

最優(yōu)選地，所述幽門螺桿菌23SrRNA基因克拉霉素耐藥位點(diǎn)突變A2142C的引物探針序列2142C–P、所述幽門螺桿菌23SrRNA基因克拉霉素耐藥位點(diǎn)突變A2142G的引物探針序列2142G–P、所述幽門螺桿菌23SrRNA基因克拉霉素耐藥位點(diǎn)突變A2143G的引物探針序列2143–P的5’端被FAM集團(tuán)修飾，所述幽門螺桿菌23SrRNA基因克拉霉素耐藥位點(diǎn)突變A2142C的引物探針序列2142C–P、所述幽門螺桿菌23SrRNA基因克拉霉素耐藥位點(diǎn)突變A2142G的引物探針序列2142G–P、所述幽門螺桿菌23SrRNA基因克拉霉素耐藥位點(diǎn)突變A2143G的引物探針序列2143–P的3’端被BHQ1集團(tuán)修飾。

更優(yōu)選地，本發(fā)明檢測(cè)幽門螺桿菌耐藥突變位點(diǎn)的試劑盒中，所述PCR試劑組包括dNTP、DNA聚合酶、PCR緩沖液。

最優(yōu)選地，本發(fā)明檢測(cè)幽門螺桿菌耐藥突變位點(diǎn)的試劑盒中，所述PCR試劑組包括：按反應(yīng)體系為25μL計(jì)，所述引物探針與阻滯序列的濃度為0.1μM～0.5μM；優(yōu)選地，所述探針濃度為0.1μM～0.5μM；所述DNA聚合酶0.06μM～0.3μM；所述PCR緩沖液包括：Tris濃度為1.0mM～2.0mM；KCl濃度為1.0mM～2.0mM；Mg²⁺濃度為0.6μM～3.0μM；所述dNTP濃度為2.0-2.5μM。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測(cè)幽門螺桿菌耐藥突變位點(diǎn)的方法，包括以下步驟：

1)提取被試樣品中的幽門螺桿菌的DNA；

2)利用權(quán)利要求1～7任意一項(xiàng)所述的試劑盒，對(duì)步驟1)獲得的被試樣品幽門螺桿菌DNA進(jìn)行熒光PCR(；

3)通過熒光PCR的結(jié)果判斷是否發(fā)生耐藥性突變。

9、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述熒光PCR的條件為95℃2min進(jìn)行變性反應(yīng)；95℃10s，55℃40s，40個(gè)循環(huán)，在55℃40s階段收集熒光信號(hào)。

本發(fā)明還提供了上述試劑盒在檢測(cè)幽門螺桿菌對(duì)喹諾酮類抗生素和/或克拉霉素類抗生素中的應(yīng)用。

由上可知，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1)本發(fā)明設(shè)計(jì)的幽門螺桿菌核酸及耐藥檢測(cè)采用熒光PCR的方法進(jìn)行，靈敏度高，耗時(shí)短(一般僅需要2-3小時(shí))，對(duì)目前臨床上對(duì)幽門螺桿菌的耐藥檢測(cè)具有很大的優(yōu)勢(shì)。

2)本發(fā)明檢測(cè)幽門螺桿菌耐藥突變位點(diǎn)的試劑盒與方法，具有靈敏度高，特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，如本發(fā)明后續(xù)實(shí)施例所證明，本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1000拷貝/mL。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1檢測(cè)幽門螺桿菌gyrA基因A259T位點(diǎn)突變的PCR擴(kuò)增圖；

圖2為實(shí)施例2檢測(cè)幽門螺桿菌gyrA基因T261G位點(diǎn)突變的PCR擴(kuò)增圖；

圖3為實(shí)施例3檢測(cè)幽門螺桿菌gyrA基因G271A位點(diǎn)突變的PCR擴(kuò)增圖；

圖4為實(shí)施例4檢測(cè)幽門螺桿菌gyrA基因G271T位點(diǎn)突變的PCR擴(kuò)增圖；

圖5為實(shí)施例5檢測(cè)幽門螺桿菌A272G基因位點(diǎn)突變的PCR擴(kuò)增曲線圖；

圖6為實(shí)施例6檢測(cè)幽門螺桿菌A2142C基因位點(diǎn)突變的PCR擴(kuò)增曲線圖；

圖7為實(shí)施例7檢測(cè)幽門螺桿菌A2142G基因位點(diǎn)突變的PCR擴(kuò)增曲線圖；

圖8為實(shí)施例8檢測(cè)幽門螺桿菌A2143G基因位點(diǎn)突變的PCR擴(kuò)增曲線圖。

具體實(shí)施方式

以下通過具體實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行說明，應(yīng)理解以下僅為本發(fā)明的示例性說明，并不用于限制本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1本發(fā)明試劑盒對(duì)幽門螺桿菌gyrA基因259位點(diǎn)突變耐藥性的檢測(cè)

1.試驗(yàn)樣品的確定

將利用藥敏試驗(yàn)檢測(cè)為幽門螺桿菌喹諾酮耐藥，且通過測(cè)序比對(duì)證明gyrA259位點(diǎn)由A突變?yōu)門的臨床樣本作為待檢樣品。采用柱法或磁珠法抽提幽門螺桿菌基因組DNA，分裝后貯存于-80℃。

2.引物和探針的設(shè)計(jì)：

設(shè)計(jì)了多對(duì)引物和探針，引物長度一般為15-30堿基。

幽門螺桿菌喹諾酮基因gyrA耐藥突變位點(diǎn)A259T引物探針與阻滯序列如下：

上游引物259-F：5’ACCACCCCCATGGCGATT3’

下游引物259-R：5’CGCCATCAATAGAGCCAAAGTG3’

探針259-P：5’HEXGAGAATGGCGCAAGATTTTTCCATGCGBHQ13’

阻滯序列259-blocker：5’GGTAAATACCACCCCCATGGCGATA3’-NH₂C₆

3.反應(yīng)體系的優(yōu)化

3.1引物濃度的優(yōu)化

在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將259位點(diǎn)引物濃度分別從0.06μM至0.48μM作倍比連續(xù)稀釋，通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳引物濃度是0.24μM。

3.2探針濃度的優(yōu)化

在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將259探針濃度分別從0.03μM至0.24μM作倍比連續(xù)稀釋，通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳探針濃度是0.12μM。

利用上述引物和探針進(jìn)行反應(yīng)體系的建立，最后確定采用的幽門螺桿菌耐藥突變檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系為25μL。

按照一步法熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行反應(yīng)液的配置：

Tris(1M)：1μL；KCl(1M)：2μL；dNTP(2.5mM)：2μL；259-F(20μM)：0.3μL；259-R(20μM)：0.3μL；259-P(20μM)：0.15μL；DNA聚合酶(5U)：0.4；H₂O：13.85μL；合計(jì)：20μL；模板：5μL。

4.儀器檢測(cè)通道的選擇

選擇的熒光檢測(cè)通道應(yīng)與探針?biāo)鶚?biāo)記的報(bào)告熒光基團(tuán)一致，具體按照儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置。

5.PCR反應(yīng)條件如下

95℃2min進(jìn)行變性反應(yīng)；95℃10s，55℃40s，40個(gè)循環(huán)，在55℃40s階段收集熒光信號(hào)。

6.檢測(cè)結(jié)果分析

待檢樣本中的幽門螺桿菌gyrA基因259位點(diǎn)由A突變?yōu)門，顯示陽性擴(kuò)增曲線，其檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1000拷貝/mL；

在對(duì)照樣本中沒有幽門螺桿菌或者幽門螺桿菌gyrA基因259位點(diǎn)未發(fā)生由A至T的突變，顯示陰性擴(kuò)增曲線，即無擴(kuò)增信號(hào)，提示上述引物對(duì)和探針具有良好的特異性和靈敏度。如圖1所示：其中上面曲線為gyrA259位點(diǎn)突變樣本擴(kuò)增曲線，Ct值為18.3；下面曲線為野生型樣本擴(kuò)增曲線，NO Ct(即無Ct值，下同)。

實(shí)施例2本發(fā)明試劑盒對(duì)幽門螺桿菌gyrA基因261位點(diǎn)突變耐藥性的檢測(cè)

1.試驗(yàn)樣品的確定

將利用藥敏試驗(yàn)檢測(cè)為幽門螺桿菌喹諾酮耐藥，且通過測(cè)序比對(duì)證明gyrA261位點(diǎn)由T突變?yōu)镚的臨床樣本作為待檢樣品。采用柱法或磁珠法抽提細(xì)菌基因組DNA，分裝后貯存于-80℃。

2.引物和探針的設(shè)計(jì)：

設(shè)計(jì)了多對(duì)引物和探針，引物長度一般為15-30堿基。

本實(shí)施例幽門螺桿菌喹諾酮基因gyrA耐藥突變位點(diǎn)T261G引物探針與阻滯序列如下：

261-F：5’ACCACCCCCATGGCGATTAG3’

261-R：5’CGCCATCAATAGAGCCAAAGTG3’

261-P：5’HEXGAGAATGGCGCAAGATTTTTCCATGCGBHQ13’

阻滯序列261-blocker：

5’GGTAAATACCACCCCCATGGCGATAAT3’-NH₂C₆；

3.反應(yīng)體系的優(yōu)化

3.1引物濃度的優(yōu)化

在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將261位點(diǎn)引物濃度分別從0.06μM至0.48μM作倍比連續(xù)稀釋，通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳引物濃度是0.24μM。

3.2探針濃度的優(yōu)化

在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將261探針濃度分別從0.03μM至0.24μM作倍比連續(xù)稀釋，通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳探針濃度是0.12μM。

利用上述引物和探針進(jìn)行反應(yīng)體系的建立，最后確定采用的幽門螺桿菌耐藥突變檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系為25μL。

按照一步法熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行反應(yīng)液的配置：

Tris(1M)：1μL；KCl(1M)：2μL；dNTP(2.5mM)：2μL；261-F(20μM)：0.3μL；261-R(20μM)：0.3μL；261-P(20μM)：0.15μL；DNA聚合酶(5U)：0.4；H₂O：13.85μL；合計(jì)：20μL；模板：5μL。

4.儀器檢測(cè)通道的選擇

選擇的熒光檢測(cè)通道應(yīng)與探針?biāo)鶚?biāo)記的報(bào)告熒光基團(tuán)一致，具體按照儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置。

5.PCR反應(yīng)條件如下

95℃2min進(jìn)行變性反應(yīng)；95℃10s，55℃40s，40個(gè)循環(huán)，在55℃40s階段收集熒光信號(hào)。

6.檢測(cè)結(jié)果分析

待檢樣本中的幽門螺桿菌gyrA基因261位點(diǎn)由T突變?yōu)镚，顯示陽性擴(kuò)增曲線，其檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1000拷貝/mL；

在對(duì)照樣本中沒有幽門螺桿菌或者幽門螺桿菌gyrA基因261位點(diǎn)未發(fā)生由T至G的突變，顯示陰性擴(kuò)增曲線，即無擴(kuò)增信號(hào)，提示上述引物對(duì)和探針具有良好的特異性和靈敏度。如圖2所示：其中上面曲線為gyrA261位點(diǎn)突變樣本擴(kuò)增曲線，Ct值為17.8；下面曲線為野生型樣本擴(kuò)增曲線，NO Ct。

實(shí)施例3本發(fā)明試劑盒對(duì)幽門螺桿菌gyrA基因271位點(diǎn)突變耐藥性的檢測(cè)

1.試驗(yàn)樣品的確定

將利用藥敏試驗(yàn)檢測(cè)為幽門螺桿菌喹諾酮耐藥，且通過測(cè)序比對(duì)證明gyrA271位點(diǎn)由G突變?yōu)锳的臨床樣本作為待檢樣品。采用柱法或磁珠法抽提細(xì)菌基因組DNA，分裝后貯存于-80℃。

2.引物和探針的設(shè)計(jì)：

設(shè)計(jì)了多對(duì)引物和探針，引物長度一般為15-30堿基。

本實(shí)施例幽門螺桿菌喹諾酮基因gyrA耐藥突變位點(diǎn)G271A引物探針與阻滯序列如下：

271A-F：5’CCATGGCGATAATGCGGTTTTTA3’

271A-R：5’CGCCATCAATAGAGCCAAAGTG3’

271A-P：5’HEXGAGAATGGCGCAAGATTTTTCCATGCGBHQ13’

阻滯序列271A-blocker：

5’ACCCCCATGGCGATAATGCGGTTTATG3’-NH₂C₆；

3.反應(yīng)體系的優(yōu)化

3.1引物濃度的優(yōu)化

在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將271位點(diǎn)引物濃度分別從0.06μM至0.48μM作倍比連續(xù)稀釋，通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳引物濃度是0.24μM。

3.2探針濃度的優(yōu)化

在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將271探針濃度分別從0.03μM至0.24μM作倍比連續(xù)稀釋，通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳探針濃度是0.12μM。

利用上述引物和探針進(jìn)行反應(yīng)體系的建立，最后確定采用的幽門螺桿菌耐藥突變檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系為25μL。

按照一步法熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行反應(yīng)液的配置：

Tris(1M)：1μL；KCl(1M)：2μL；dNTP(2.5mM)：2μL；271A-F(20μM)：0.3μL；271A-R(20μM)：0.3μL；271A-P(20μM)：0.15μL；DNA聚合酶(5U)：0.4；H₂O：13.85μL；合計(jì)：20μL。模板：5μL。

4.儀器檢測(cè)通道的選擇

選擇的熒光檢測(cè)通道應(yīng)與探針?biāo)鶚?biāo)記的報(bào)告熒光基團(tuán)一致，具體按照儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置。

5.PCR反應(yīng)條件如下

95℃2min進(jìn)行變性反應(yīng)；95℃10s，55℃40s，40個(gè)循環(huán)，在55℃40s階段收集熒光信號(hào)。

6.檢測(cè)結(jié)果分析

待檢樣本中的幽門螺桿菌gyrA基因271位點(diǎn)由G突變?yōu)锳，顯示陽性擴(kuò)增曲線，其檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1000拷貝/mL；

在對(duì)照樣本中沒有幽門螺桿菌或者幽門螺桿菌gyrA基因271位點(diǎn)未發(fā)生由G至A的突變，顯示陰性擴(kuò)增曲線，即無擴(kuò)增信號(hào)，提示上述引物對(duì)和探針具有良好的特異性和靈敏度。如圖3所示：其中上面曲線為gyrA271位點(diǎn)突變樣本擴(kuò)增曲線，Ct值為16.9；下面曲線為野生型樣本擴(kuò)增曲線，NO Ct。

實(shí)施例4本發(fā)明試劑盒對(duì)幽門螺桿菌gyrA基因271位點(diǎn)突變耐藥性的檢測(cè)

1.試驗(yàn)樣品的確定

將利用藥敏試驗(yàn)檢測(cè)為幽門螺桿菌喹諾酮耐藥，且通過測(cè)序比對(duì)證明gyrA271位點(diǎn)由G突變?yōu)門的臨床樣本作為待檢樣品。采用柱法或磁珠法抽提細(xì)菌基因組DNA，分裝后貯存于-80℃。

2.引物和探針的設(shè)計(jì)：

設(shè)計(jì)了多對(duì)引物和探針，引物長度一般為15-30堿基。

本實(shí)施例幽門螺桿菌喹諾酮基因gyrA耐藥突變位點(diǎn)G271T引物探針與阻滯序列如下：

271T-F：5’CCATGGCGATAATGCGGTTTTTA 3’

271T-R：5’CCATGGCGATAATGCGGTTTTTT 3’

271T-P：5’HEXGAGAATGGCGCAAGATTTTTCCATGCGBHQ13’

阻滯序列271T-blocker：

5’ACCCCCATGGCGATAATGCGGTTTATG3’-NH₂C₆；

3.反應(yīng)體系的優(yōu)化

3.1引物濃度的優(yōu)化

在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將271位點(diǎn)引物濃度分別從0.06μM至0.48μM作倍比連續(xù)稀釋，通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳引物濃度是0.24μM。

3.2探針濃度的優(yōu)化

在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將271探針濃度分別從0.03μM至0.24μM作倍比連續(xù)稀釋，通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳探針濃度是0.12μM。

利用上述引物和探針進(jìn)行反應(yīng)體系的建立，最后確定采用的幽門螺桿菌耐藥突變檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系為25μL。

按照一步法熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行反應(yīng)液的配置：

Tris(1M)：1μL；KCl(1M)：2μL；dNTP(2.5mM)：2μL；271T-F(20μM)：0.3μL；271T-R(20μM)：0.3μL；271T-P(20μM)：0.15μL；DNA聚合酶(5U)：0.4；H₂O：13.85μL；合計(jì)：20μL；模板：5μL。

4.儀器檢測(cè)通道的選擇

選擇的熒光檢測(cè)通道應(yīng)與探針?biāo)鶚?biāo)記的報(bào)告熒光基團(tuán)一致，具體按照儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置。

5.PCR反應(yīng)條件如下

95℃2min進(jìn)行變性反應(yīng)；95℃10s，55℃40s，40個(gè)循環(huán)，在55℃40s階段收集熒光信號(hào)。

6.檢測(cè)結(jié)果分析

待檢樣本中的幽門螺桿菌gyrA基因271位點(diǎn)由G突變?yōu)門，顯示陽性擴(kuò)增曲線，其檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1000拷貝/mL；

在對(duì)照樣本中沒有幽門螺桿菌或者幽門螺桿菌gyrA基因271位點(diǎn)未發(fā)生由G至T的突變，顯示陰性擴(kuò)增曲線，即無擴(kuò)增信號(hào)，提示上述引物對(duì)和探針具有良好的特異性和靈敏度。如圖4所示：其中藍(lán)色曲線為gyrA271位點(diǎn)突變樣本擴(kuò)增曲線，Ct值為16.8；紅色曲線為野生型樣本擴(kuò)增曲線，NO Ct。

實(shí)施例5本發(fā)明試劑盒對(duì)幽門螺桿菌gyrA基因272位點(diǎn)突變耐藥性的檢測(cè)

1.試驗(yàn)樣品的確定

將利用藥敏試驗(yàn)檢測(cè)為幽門螺桿菌喹諾酮耐藥，且通過測(cè)序比對(duì)證明gyrA272位點(diǎn)由A突變?yōu)镚的臨床樣本作為待檢樣品。采用柱法或磁珠法抽提細(xì)菌基因組DNA，分裝后貯存于-80℃。

2.引物和探針的設(shè)計(jì)：

設(shè)計(jì)了多對(duì)引物和探針，引物長度一般為15-30堿基。

本實(shí)施例幽門螺桿菌喹諾酮基因gyrA耐藥突變位點(diǎn)A272G引物探針與阻滯序列如下：

272-F：5’CATGGCGATAATGCGGTTTAAGG 3’

272-R：5’CCATGGCGATAATGCGGTTTTTT 3’

272-P：5’HEXGAGAATGGCGCAAGATTTTTCCATGCGBHQ13’

阻滯序列272-blocker：

5’ACCCCCATGGCGATAATGCGGTTTATGA3’-NH₂C₆。

3.反應(yīng)體系的優(yōu)化

3.1引物濃度的優(yōu)化

在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將272位點(diǎn)引物濃度分別從0.06μM至0.48μM作倍比連續(xù)稀釋，通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳引物濃度是0.24μM。

3.2探針濃度的優(yōu)化

在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將272探針濃度分別從0.03μM至0.12μM作倍比連續(xù)稀釋，通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳探針濃度是0.12μM。

利用上述引物和探針進(jìn)行反應(yīng)體系的建立，最后確定采用的幽門螺桿菌耐藥突變檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系為25μL。

按照一步法熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行反應(yīng)液的配置：

Tris(1M)：1μL；KCl(1M)：2μL；dNTP(2.5mM)：2μL；272-F(20μM)：0.3μL；272-R(20μM)：0.3μL；272-P(20μM)：0.15μL；DNA聚合酶(5U)：0.4；H₂O：13.85μL；合計(jì)：20μL；模板：5μL。

4.儀器檢測(cè)通道的選擇

選擇的熒光檢測(cè)通道應(yīng)與探針?biāo)鶚?biāo)記的報(bào)告熒光基團(tuán)一致，具體按照儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置。

5.PCR反應(yīng)條件如下

95℃2min進(jìn)行變性反應(yīng)；95℃10s，55℃40s，40個(gè)循環(huán)，在55℃40s階段收集熒光信號(hào)。

6.檢測(cè)結(jié)果分析

待檢樣本中的幽門螺桿菌gyrA基因272位點(diǎn)由A突變?yōu)镚，顯示陽性擴(kuò)增曲線，其檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1000拷貝/mL；

在對(duì)照樣本中沒有幽門螺桿菌或者幽門螺桿菌gyrA基因272位點(diǎn)未發(fā)生由A至G的突變，顯示陰性擴(kuò)增曲線，即無擴(kuò)增信號(hào)，提示上述引物對(duì)和探針具有良好的特異性和靈敏度。如圖5所示：其中上面曲線為gyrA272位點(diǎn)突變樣本擴(kuò)增曲線，Ct值為17.2；下面曲線為野生型樣本擴(kuò)增曲線，NO Ct。

實(shí)施例6本發(fā)明試劑盒對(duì)幽門螺桿菌23SrRNA基因2142位點(diǎn)突變耐藥性的檢測(cè)

1.試驗(yàn)樣品的確定

將利用藥敏試驗(yàn)檢測(cè)為幽門螺桿菌克拉霉素耐藥，且通過測(cè)序比對(duì)證明23SrRNA 2242位點(diǎn)由A突變?yōu)镃的臨床樣本作為待檢樣品。采用柱法或磁珠法抽提細(xì)菌基因組DNA，分裝后貯存于-80℃。

2.引物和探針的設(shè)計(jì)：

設(shè)計(jì)了多對(duì)引物和探針，引物長度一般為15-30堿基。

本實(shí)施例幽門螺桿菌23SrRNA基因耐藥突變位點(diǎn)A2142C引物探針與阻滯序列如下：

2142C-F：5’TCCTACCCGCGGCAAGACTGC 3’

2142C-R：5’CCATAAGAGCCAAAGCCCTTACTTCA 3’

2142C-P：5’FAMTGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAG BHQ13’

阻滯序列2142C-blocker：

5’TCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGA3’-NH₂C₆；

3.反應(yīng)體系的優(yōu)化

3.1引物濃度的優(yōu)化

在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將2142位點(diǎn)引物濃度分別從0.06μM至0.48μM作倍比連續(xù)稀釋，通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳引物濃度是0.24μM。

3.2探針濃度的優(yōu)化

在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將2142探針濃度分別從0.03μM至0.24μM作倍比連續(xù)稀釋，通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳探針濃度是0.12μM。

利用上述引物和探針進(jìn)行反應(yīng)體系的建立，最后確定采用的幽門螺桿菌耐藥突變檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系為25μL。

按照一步法熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行反應(yīng)液的配置：

Tris(1M)：1μL；KCl(1M)：2μL；dNTP(2.5mM)：2μL；2142C-F(20μM)：0.3μL；2142C-R(20μM)：0.3μL；2142C-P(20μM)：0.15μL；DNA聚合酶(5U)：0.4；H₂O：13.85μL；合計(jì)：20μL；模板：5μL。

4.儀器檢測(cè)通道的選擇

選擇的熒光檢測(cè)通道應(yīng)與探針?biāo)鶚?biāo)記的報(bào)告熒光基團(tuán)一致，具體按照儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置。

5.PCR反應(yīng)條件如下

95℃2min進(jìn)行變性反應(yīng)；95℃10s，55℃40s，40個(gè)循環(huán)，在55℃40s階段收集熒光信號(hào)。

6.檢測(cè)結(jié)果分析

待檢樣本中的幽門螺桿菌23SrRNA基因2142位點(diǎn)由A突變?yōu)镃，顯示陽性擴(kuò)增曲線，其檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1000拷貝/mL；

在對(duì)照樣本中沒有幽門螺桿菌或者幽門螺桿菌23SrRNA基因2142位點(diǎn)未發(fā)生由A至C的突變，顯示陰性擴(kuò)增曲線，即無擴(kuò)增信號(hào)，提示上述引物對(duì)和探針具有良好的特異性和靈敏度。如圖6所示：其中上面曲線為23SrRNA2142位點(diǎn)突變樣本擴(kuò)增曲線，Ct值為18.7；下面曲線為野生型樣本擴(kuò)增曲線，NO Ct。

實(shí)施例7本發(fā)明試劑盒對(duì)幽門螺桿菌23SrRNA基因2142位點(diǎn)突變耐藥性的檢測(cè)

1.試驗(yàn)樣品的確定

將利用藥敏試驗(yàn)檢測(cè)為幽門螺桿菌克拉霉素耐藥，且通過測(cè)序比對(duì)證明23SrRNA 2242位點(diǎn)由A突變?yōu)镚的臨床樣本作為待檢樣品。采用柱法或磁珠法抽提細(xì)菌基因組DNA，分裝后貯存于-80℃。

2.引物和探針的設(shè)計(jì)：

設(shè)計(jì)了多對(duì)引物和探針，引物長度一般為15-30堿基。

本實(shí)施例幽門螺桿菌23SrRNA基因耐藥突變位點(diǎn)A2142G引物探針與阻滯序列如下：

2142G-F：5’CTACCCGCGGCAAGACTGG 3’

2142G-R：5’CCATAAGAGCCAAAGCCCTTACTTCA 3’

2142G-P：5’FAMTGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAG BHQ13’

阻滯序列2142G-blocker：

5’TCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGA 3’-NH₂C₆；

3.反應(yīng)體系的優(yōu)化

3.1引物濃度的優(yōu)化

在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將2142位點(diǎn)引物濃度分別從0.06μM至0.48μM作倍比連續(xù)稀釋，通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳引物濃度是0.24μM。

3.2探針濃度的優(yōu)化

在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將2142探針濃度分別從0.03μM至0.24μM作倍比連續(xù)稀釋，通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳探針濃度是0.12μM。

利用上述引物和探針進(jìn)行反應(yīng)體系的建立，最后確定采用的幽門螺桿菌耐藥突變檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系為25μL。

按照一步法熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行反應(yīng)液的配置：

Tris(1M)：1μL；KCl(1M)：2μL；dNTP(2.5mM)：2μL；2142G-F(20μM)：0.3μL；2142G-R(20μM)：0.03μL；2142G-P(20μM)：0.15μL；DNA聚合酶(5U)：0.4；H₂O：13.85μL；合計(jì)：20μL；模板：5μL。

4.儀器檢測(cè)通道的選擇

選擇的熒光檢測(cè)通道應(yīng)與探針?biāo)鶚?biāo)記的報(bào)告熒光基團(tuán)一致，具體按照儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置。

5.PCR反應(yīng)條件如下

95℃2min進(jìn)行變性反應(yīng)；95℃10s，55℃40s，40個(gè)循環(huán)，在55℃40s階段收集熒光信號(hào)。

6.檢測(cè)結(jié)果分析

待檢樣本中的幽門螺桿菌23SrRNA基因2142位點(diǎn)由A突變?yōu)镚，顯示陽性擴(kuò)增曲線，其檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1000拷貝/mL；

在對(duì)照樣本中沒有幽門螺桿菌或者幽門螺桿菌23SrRNA基因2142位點(diǎn)未發(fā)生由A至G的突變，顯示陰性擴(kuò)增曲線，即無擴(kuò)增信號(hào)，提示上述引物對(duì)和探針具有良好的特異性和靈敏度。如圖7所示：其中上面曲線為23SrRNA 2142位點(diǎn)突變樣本擴(kuò)增曲線，Ct值為18.8；下面曲線為野生型樣本擴(kuò)增曲線，NO Ct。

實(shí)施例8本發(fā)明試劑盒對(duì)幽門螺桿菌23SrRNA基因2243位點(diǎn)突變耐藥性的檢測(cè)

1.試驗(yàn)樣品的確定

將利用藥敏試驗(yàn)檢測(cè)為幽門螺桿菌克拉霉素耐藥，且通過測(cè)序比對(duì)證明23SrRNA 2243位點(diǎn)由A突變?yōu)镚的臨床樣本作為待檢樣品。采用柱法或磁珠法抽提細(xì)菌基因組DNA，分裝后貯存于-80℃。

2.引物和探針的設(shè)計(jì)：

設(shè)計(jì)了多對(duì)引物和探針，引物長度一般為15-30堿基。

本實(shí)施例幽門螺桿菌23SrRNA基因耐藥突變位點(diǎn)A2143G引物探針與阻滯序列如下：

2143-F：5’TACCCGCGGCAAGACGTAG 3’

2143-R：5’CCATAAGAGCCAAAGCCCTTACTTCA 3’

2143-P：5’FAMTGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAG BHQ13’

阻滯序列2143-blocker：

5’TCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAA3’-NH₂C₆。

3.反應(yīng)體系的優(yōu)化

3.1引物濃度的優(yōu)化

在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將2143位點(diǎn)引物濃度分別從0.06μM至0.48μM作倍比連續(xù)稀釋，通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳引物濃度是0.24μM。

3.2探針濃度的優(yōu)化

在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將2143探針濃度分別從0.03μM至0.24μM作倍比連續(xù)稀釋，通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳探針濃度是0.12μM。

利用上述引物和探針進(jìn)行反應(yīng)體系的建立，最后確定采用的幽門螺桿菌耐藥突變檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系為25μL。

按照一步法熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行反應(yīng)液的配置：

Tris(1M)：1μL；KCl(1M)：2μL；dNTP(2.5mM)：2μL；2143-F(20μM)：0.3μL；2143-R(20μM)：0.3μL；2143-P(20μM)：0.15μL；DNA聚合酶(5U)：0.4；H₂O：13.85μL；合計(jì)：20μL；模板：5μL。

4.儀器檢測(cè)通道的選擇

選擇的熒光檢測(cè)通道應(yīng)與探針?biāo)鶚?biāo)記的報(bào)告熒光基團(tuán)一致，具體按照儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置。

5.PCR反應(yīng)條件如下

95℃2min進(jìn)行變性反應(yīng)；95℃10s，55℃40s，40個(gè)循環(huán)，在55℃40s階段收集熒光信號(hào)。

6.檢測(cè)結(jié)果分析

待檢樣本中的幽門螺桿菌23SrRNA基因2143位點(diǎn)由A突變?yōu)镚，顯示陽性擴(kuò)增曲線，其檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1000拷貝/mL；

在對(duì)照樣本中沒有幽門螺桿菌或者幽門螺桿菌23SrRNA基因2143位點(diǎn)未發(fā)生由A至G的突變，顯示陰性擴(kuò)增曲線，即無擴(kuò)增信號(hào)，提示上述引物對(duì)和探針具有良好的特異性和靈敏度。如圖8所示：其中上面曲線為23SrRNA 2142位點(diǎn)突變樣本擴(kuò)增曲線，Ct值為18.5；下面曲線為野生型樣本擴(kuò)增曲線，NO Ct。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 江蘇默樂生物科技股份有限公司

<120> 一種檢測(cè)幽門螺桿菌耐藥突變位點(diǎn)的試劑盒和方法

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<170> PatentIn version 3.5

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