矮地茶總黃酮在制備保護(hù)肝臟藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中醫(yī)藥領(lǐng)域，公開了以矮地茶根為原料提取純化出矮地茶總黃酮，并將其作為在制備保護(hù)肝臟藥物中的應(yīng)用。通過小鼠急性肝損傷實驗，發(fā)現(xiàn)其能夠降低肝損傷小鼠血清或組織中ALT、AST、TNF-α、IL-1β和IL-6活性(P<0.01，p＜0.05)；體外抗乙肝實驗發(fā)現(xiàn)矮地茶總黃酮對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg均有明顯抑制作用(P<0.01，p＜0.05)，可見矮地茶總黃酮具有較好的保肝和抗乙肝病毒作用，這種新用途為其藥用價值開拓了新領(lǐng)域，具有重要的應(yīng)用價值和經(jīng)濟(jì)效益。
【專利說明】矮地茶總黃酮在制備保護(hù)肝臟藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及以矮地茶根為原料提取純化出矮地茶總黃酮及其在 制備保護(hù)肝臟藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 矮地茶(Hornsted) BL.為紫金牛科紫金牛屬植物，別名紫金牛、 矮茶風(fēng)、四葉茶、矮腳樟等，主要分布于長江流域以南各省區(qū)，朝鮮、日本亦有分布。具有清 熱、利濕、祛淤生新、活血止血、解毒、鎮(zhèn)咳祛痰、除濕消腫、利尿的功效；可治腰酸痛、痢疾、 骨折、肺疥咳血、勞傷、筋骨酸痛、腫毒、慢性氣管炎、肝炎、急慢性腎炎、高血壓等癥。矮地茶 民間將其用治肝臟疾病方面歷史悠久，長期經(jīng)驗用藥表明，其藥用價值較高，尚未發(fā)現(xiàn)明顯 毒副作用?，F(xiàn)代實驗研究表明，矮地茶中含有豐富黃酮類等化合物。經(jīng)檢索，尚未見矮地茶 在肝損傷方面的實驗研究報道，因此，本發(fā)明以矮地茶總黃酮作為藥效物質(zhì)，通過小鼠體內(nèi) 保肝和體外抗乙肝實驗，研究其在制備保護(hù)肝臟藥物中的應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是以矮地茶根為原料提取純化出矮地茶總黃酮，并將這一有效部位 除雜后制備成中藥制劑，將其作為在制備保護(hù)肝臟藥物中的應(yīng)用，這在國內(nèi)尚未見有文獻(xiàn) 報道過。
[0004] 實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是： 一種矮地茶總黃酮的新用途，用于制備保護(hù)肝臟的藥物。 所述矮地茶總黃酮是取矮地茶根，粉碎成粗粉，加30%-95%乙醇回流提取1-3次，合并 提取液并過濾，減壓回收濾液中的乙醇，濃縮得矮地茶浸膏；浸膏加適量的水，充分混勻成 混懸液，加鹽酸調(diào)pH=3-5,采用D102型大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，上樣流速1-5 mL · mirT1，上 樣后靜止6-15 h，用1-5倍樹脂體積的35%-95%乙醇洗脫，洗脫液經(jīng)硝酸鋁絡(luò)合分光光度法 測定總黃酮純度達(dá)48. 68%-78. 68%。
[0005] 取矮地茶總黃酮，加入藥用輔料，按常規(guī)方法制備成各種藥物制劑，包括片劑、顆 粒劑、口服液、注射劑、膠囊、丸劑；制劑中矮地茶總黃酮含量0. 01%?99. 9%，余量為藥劑成 型輔料。
[0006] 矮地茶保肝降酶有效成分總黃酮的提取方法，尚未見有文獻(xiàn)報道。發(fā)明人通過實 驗研究發(fā)現(xiàn)，矮地茶有效成分總黃酮較好的溶解于30%以上的乙醇中，因此，發(fā)明中采用 30%?95%的乙醇回流提取。但因醇提液中含有大量的雜質(zhì)，本發(fā)明從多種大孔樹脂中篩選 出D102型除雜，純化后得到有效部位矮地茶總黃酮，其可制備成供口服的中藥制劑，制成 片劑、顆粒劑、口服液、注射劑、膠囊、丸劑等，其制法與文獻(xiàn)記載的相應(yīng)劑型的制法是通用 的。
[0007] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首次公開了以矮地茶根為原料提取純化出矮地茶總黃酮 的方法，并將該有效部位制備成片劑、顆粒劑、口服液、注射劑、膠囊、丸劑等、以及對該有效 部位進(jìn)行體內(nèi)保肝和體外抗乙肝實驗的研究，通過實驗證明矮地茶總黃酮具有保肝護(hù)肝的 作用，可用于制備保護(hù)肝臟的藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0008] 圖1為本發(fā)明矮地茶總黃酮抗小鼠急性肝損傷實驗空白組的病理切片圖（HE染 色，X200); 圖2為本發(fā)明矮地茶總黃酮抗小鼠急性肝損傷實驗?zāi)Ｐ徒M的病理切片圖（HE染 色，X200); 圖3為本發(fā)明矮地茶總黃酮抗小鼠急性肝損傷實驗陽性組的病理切片圖（HE染 色，X200); 圖4為本發(fā)明矮地茶總黃酮抗小鼠急性肝損傷實驗高劑量組的病理切片圖（HE染 色，X200); 圖5為本發(fā)明矮地茶總黃酮抗小鼠急性肝損傷實驗中劑量組的病理切片圖（HE染 色，X200); 圖6為本發(fā)明矮地茶總黃酮抗小鼠急性肝損傷實驗低劑量組的病理切片圖（HE染 色，X200)。

【具體實施方式】
[0009] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步的說明，但并不是對本發(fā)明的限定。
[0010] 一、矮地茶總黃酮的提取和純化： 取矮地茶根打成粗粉，取粗粉lkg，加60%乙醇6 L回流提取2次，每次1. 5 h，合并提 取液并過濾，減壓回收濾液中的乙醇，濃縮得矮地茶浸膏；浸膏加適量的水，充分混勻成混 懸液，加鹽酸調(diào)pH=5,采用D102型大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，上樣流速3 mL · mirT1，上樣后靜 止12 h，先用2倍樹脂體積的35%乙醇洗脫，而后用4倍樹脂體積70%乙醇洗脫，流速2. 5 mL · mirT1，收集70%乙醇洗脫液，70%乙醇洗脫液經(jīng)硝酸鋁絡(luò)合分光光度法測定總黃酮純度 達(dá)到71. 20%，減壓濃縮洗脫液，干燥后得矮地茶總黃酮干膏；將矮地茶總黃酮干膏打成細(xì) 粉，可加入相應(yīng)輔料，制成片劑、顆粒劑、口服液、注射劑、膠囊、丸劑等。
[0011] 二、將矮地茶總黃酮干膏制備成藥物的實施例： 藥物制劑實施例一：取矮地茶總黃酮干膏細(xì)粉，約重20g，加淀粉至總量100g，制粒，壓 成片劑，素片重〇. 3g，每片含矮地茶總黃酮0. 5g。
[0012] 藥物制劑實施例二：取矮地茶總黃酮干膏細(xì)粉，約重20g，加蔗糖粉與糊精（蔗糖： 糊精=3:1)的混合物至總量500g，制粒，得顆粒劑，分裝，每小包5g，每小包含矮地茶總黃酮 0. 2g〇
[0013] 藥物制劑實施例三：取矮地茶總黃酮干膏細(xì)粉，約重20g，加白砂糖100g，食用白 酒60mL，加熱溶解，最后加水到500ml，過濾，得口服液，分裝，每支5ml，每支含矮地茶總黃 酮 〇. 2g。
[0014] 藥物制劑實施例四：取矮地茶總黃酮干膏細(xì)粉，約重10 g，加注射用水至500ml，加 熱，濾過,濾液用1 %氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6. 5-7. 0,冷藏，濾過，濾液加甘露醇，并加注 射用水至規(guī)定量，濾過，灌封，滅菌，即得。 藥物制劑實施例五：取矮地茶總黃酮干膏細(xì)粉，約重20g，加入膠囊共制200粒，每粒含 矮地茶總黃酮0. lg。
[0015] 藥物制劑實施例六：取矮地茶總黃酮干膏細(xì)粉，約重20g，加入煉蜜至重量達(dá)500g ，5g分裝成1粒，每粒含矮地茶總黃酮0. 2g。
[0016] 三、矮地茶總黃酮體內(nèi)保肝實驗和體外抗乙肝實驗的方法和結(jié)果： 實驗一、矮地茶總黃酮保護(hù)肝臟實驗如下： (一）矮地茶總黃酮的制備 取矮地茶根粗粉lkg，加60%乙醇6 L回流提取2次，每次1. 5 h，合并提取液并過濾， 減壓回收濾液中的乙醇，濃縮得矮地茶浸膏；浸膏加適量水，充分混勻成混懸液，加鹽酸調(diào) pH=5,采用D102型大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，上樣流速3 mL · mirT1，上樣后靜止12 h，先用2 倍樹脂體積的35%乙醇洗脫，而后用4倍樹脂體積70%乙醇洗脫，流速2. 5 mL · mirT1，收集 70%乙醇洗脫液，70%乙醇洗脫液經(jīng)硝酸鋁絡(luò)合分光光度法測定總黃酮純度達(dá)到71. 20%?；?收乙醇，減壓濃縮，干燥后即得矮地茶總黃酮。矮地茶總黃酮中加入相應(yīng)輔料，制成片劑、顆 粒劑、口服液、注射劑、膠囊、丸劑等。
[0017](二）保肝實驗 1. 1儀器、藥物和動物 TGL-16K臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀離心機廠；AU600全自動生化檢測儀，奧林巴 斯生產(chǎn)；01ymPusBX51顯微鏡，奧林巴斯生產(chǎn)；BS1105電子天平，德國sartorius公司。恒溫 水浴鍋XMTD - 6000,上海長風(fēng)儀器廠；THZ-C-1臺式冷凍恒溫振蕩器，太倉市實驗設(shè)備廠。
[0018] 矮地茶經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院杜澤鄉(xiāng)教授鑒定為紫金牛屬植物矮地茶 (Hornsted)BL.的根。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、 白介素-6 (IL-6)均購于南京建成生物工程研究所，批號分別為：20130212、20130414、 20130418、20130316、20130612,四氯化碳（CC1 4):武漢市江北化學(xué)試劑廠，批號：20070908 ; 聯(lián)苯雙酯滴丸：浙江萬邦藥業(yè)有限公司，批號=140112。
[0019] 昆明種SPF級小鼠60只，體重19-22g，雌雄各半，由桂林醫(yī)學(xué)院SPF實驗動物中心 提供（許可證號SCXK2007-0001)。
[0020] 1. 2 方法 60只小鼠隨機分為空白對照組、模型組、陽性藥物聯(lián)苯雙酯組和供試藥物高、中、低劑 量組。陽性對照組按150 mg · kg_S供試藥物組按600、400、200 mg · kg4劑量灌胃給藥，每 天1次，共7天。末次給藥后，除空白對照組外，其余各組動物均腹腔注射0. 12% CC14花生油 (O.OlmL.g4)，禁食不禁水24h，眼球取血，離心，分離出血清，生物化學(xué)法檢測ALT、 AST的活性；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)法檢測TNF-α、IL-1 B和IL-6生化指標(biāo)。采血后， 迅速解剖，取出肝臟，在同一位置肝小葉上取肝組織，固定于4%多聚甲醛溶液中，石蠟包 埋、切片、HE染色，觀察肝組織病理學(xué)變化。應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以X 土 s表不（結(jié)果見表1、表2)。
[0021] 1.3 結(jié)果 由表1和表2結(jié)果可見，模型組與空白對照組相比較，ALT、AST、TNF-a、IL-ie和IL-6 活性有極顯著性差異（P〈0.01)，說明本實驗造模成功。與模型組比較，小鼠口服陽性藥和 矮地茶黃酮均能明顯的抑制ALT、AST、TNF- a、IL-1 β和IL-6活性（P〈0. 01，P〈0. 05)，且 成量效關(guān)系。因此可判斷矮地茶總黃酮具有保肝護(hù)肝的作用，其作用機理可能通過抑制肝 內(nèi)的炎癥反應(yīng)來起到保肝作用。經(jīng)HE染色，光鏡下觀察，正常小鼠肝細(xì)胞均勻排列，結(jié)構(gòu)完 整。模型組肝組織損傷嚴(yán)重，肝細(xì)胞排列紊亂，數(shù)量減少，出現(xiàn)不同程度的水腫，出現(xiàn)壞死和 淤血，病變以靜脈分布為主。而矮地茶總黃酮用藥組的肝細(xì)胞壞死程度較模型組都有明顯 改善，提示矮地茶總黃酮能夠有效改善小鼠急性肝損傷（圖1)。
[0022] 表1矮地茶總黃酮對CCL4致肝損傷小鼠血清中ALT和AS的影響/7=10)

【權(quán)利要求】
1. 矮地茶總黃酮在制備保護(hù)肝臟藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是：所述矮地茶總黃酮的提取和純化方法是 取矮地茶根，粉碎成粗粉，加30%-95%乙醇回流提取1-3次，合并提取液并過濾，減壓回收 濾液中的乙醇，濃縮得矮地茶浸膏；浸膏加適量水，充分混勻成混懸液，加鹽酸調(diào)pH=3-5， 采用D102型大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，上樣流速1-5 mL · mirT1，上樣后靜止6-15 h，用1-5 倍樹脂體積的35%-95%乙醇洗脫，洗脫液經(jīng)硝酸鋁絡(luò)合分光光度法測定總黃酮純度達(dá)到 48.68%-78. 68%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征是：取矮地茶總黃酮，加入藥用輔料，按常規(guī)方 法制備成各種藥物制劑，包括片劑、顆粒劑、口服液、注射劑、膠囊、丸劑；制劑中矮地茶總黃 酮含量0. 01%?99. 9%，余量為藥劑成型輔料。
【文檔編號】A61K36/185GK104042647SQ201410266578
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月16日
【發(fā)明者】張可鋒, 高雅, 鐘明利 申請人:桂林醫(yī)學(xué)院