專利名稱：一種支氣管敗血波氏桿菌基因缺失菌株及由其制備的疫苗和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種不含抗性標記的支氣管敗血波氏桿菌基因缺失菌株，由其構(gòu)建的疫苗及該疫苗的應用，屬于動物細菌基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica, Bb)是一種革蘭氏陰性的需氧小桿菌，與專性感染人的百日咳波氏桿菌(B. pertussis, Bp)、副百日咳波氏桿菌(B. parapertussis, Bpp)同屬于波氏菌屬。Bb可廣泛感染多種哺乳動物，豬、兔、犬的感染尤其普遍，表現(xiàn)為呼吸道的急慢性炎癥，統(tǒng)稱為波氏菌病。在豬群中，支氣管敗血波氏桿菌可引起豬發(fā)生肺炎和萎縮性鼻炎(atrophic rhinitis, AR),也是豬呼吸道疾病綜合征(porcine respiratory disease complex, PRDC)的重要致病因子。以萎縮性鼻炎為代表 的豬波氏菌病現(xiàn)已遍布養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達國家，世界豬群約有25-50%受感染，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失，是危害集約化養(yǎng)殖效率的重要呼吸道傳染病之一(陳溥言.獸醫(yī)傳染病學.第5版.北京中國農(nóng)業(yè)出版社,2010. p. 260-264.)。更重要的是,支氣管敗血波氏桿菌的先期感染易于導致其他多種病原，如多殺性巴氏桿菌、鏈球菌、副豬嗜血桿菌、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流感病毒等的繼發(fā)感染，從而提高豬群呼吸道疾病的發(fā)病率和嚴重程度，造成直大經(jīng)濟損失(Soensen V, Jorsal SE,Mousing J. Diseases of the respiratorysystem. In Straw BE, Zimmerman JJ, d’Allaire S, Taylor DJ. Diseases of Swine(9edition), Blackwell Publishing, IA, USA, 2006, p. 161-194·)。2003 年到 2008 年間，趙戰(zhàn)勤等從全國各地有呼吸道癥狀豬的3506份肺臟病料中分離到652株Bb，分離率高達18.6%，各省份之間沒有明顯差異，表明Bb在我國豬場廣泛流行和致病(Zhao Z，Wang C，Xue Y, et al. 1'he occurrence of Bordetella bronchiseptica m pigs with clinicalrespiratory disease. Vet J. 2011,188(3) :337-340.)。支氣管敗血波氏桿菌是ー種古老的微生物，它廣泛感染多種哺乳動物，已和宿主共同進化了億萬年，形成了獨特的感染與免疫機制(Parkhill J, Sebaihia M, Preston A,et al. 2003.しomparative analysis of the genome sequences of Bordetellapertussis,Bordetella parapertussis and Bordetella bronchiseptica. Nat Genet,35 (I)32-40.)。根據(jù)不同的生存環(huán)境(在宿主體內(nèi)或體外、在動物或人等)，Bb有著不同層次的復雜調(diào)節(jié)機制與之相適應，引起各種表面抗原、毒力因子甚至整個菌相(I相 II相 III相)的變化。得益于作為人百日咳波氏桿菌的ー個模式菌，以及全基因組測序和注釋工作的開展，目前對支氣管敗血波氏桿菌毒力因子的研究已經(jīng)比較明晰?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)與支氣管敗血波氏桿菌致病性有關(guān)的毒力因子主要包括脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)、黏附素、外毒素、鐵利用相關(guān)蛋白、III型分泌系統(tǒng)、尿酶、蛋白酶等。其中，前三類毒カ因子也均是其重要的保護性抗原。國外學者使用體外研究方法，如克隆篩選法、調(diào)控篩選法等鑒定出支氣管敗血波氏桿菌的多種粘附素和外毒素，包括絲狀血凝素(filamentoushemagglutinin, FHA)、百日咳桿菌粘附素(pertactin, PRN)、菌毛(fimbriae, FIM)、氣管疋ノ古因子(tracheal colonization factor, TCF)、皮膚壞タ七毒素(dermonecrotic toxin,DNT)、氣管細胞韋素(tracheal cytotocin, TC)、腺昔酸環(huán)化酶韋素(adenylate cyclasetoxin, CyaA)、波氏桿菌定植因子 A(Bordetella colonization factorA, BcfA)等。同時，通過基因的體外表達、缺失突變等方法，對這些基因的編碼產(chǎn)物與免疫反應之間的關(guān)系進行了初歩闡釋。支氣管敗血波氏桿菌的毒力因子均由BvgA/S雙因子調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)節(jié)表達。Bvg的激活能夠顯著改變支氣管敗血波氏桿菌抗原基因的表達水平(Cotter PA，JonesAM. 2003. Phosphorelay control οι virulence gene expression in Bordetella. TrendsMicrobiol,11 (8) :367-373.)。由于對支氣管敗血波氏桿菌的危害認識不足，導致人們對豬波氏菌病的防治遠落后于其他疾病。目前，世界范圍內(nèi)廣泛使用支氣管敗血波氏桿菌常規(guī)滅活苗(支氣管敗血波氏桿菌的I相菌培養(yǎng)物經(jīng)滅活制備，部分為支氣管敗血波氏桿菌和多殺性巴氏桿菌聯(lián)苗)，但多年的臨床調(diào)查結(jié)果表明，盡管該類疫苗能夠誘導仔豬產(chǎn)生較高的菌體抗體水平，但保護效果普遍較差，豬波氏菌病的發(fā)生仍然十分普遍(United States Department of Agriculture (UbDA). Part 丄丄refe;rence of swine health and health managementin the United States, 2000. CO USDA APHIS VS, CEAH, National Animal HealthMonitoring System, Fort Collins, #N355. 0202 ；2002. p. 29-32.) 后來，各國學者曾嘗試使用支氣管敗血波氏桿菌的天然弱毒菌株和化學方法致弱的菌株作為弱毒疫苗菌株，但其遺傳背景不清，且存在毒カ返強的風險，沒有得到廣泛使用。隨著分子生物學的發(fā)展，基因缺失疫苗等新型疫苗成為其研究的重要方向。目前，構(gòu)建細菌突變株所缺失的靶基因主要有兩類，一類是缺失相關(guān)毒カ基因，如毒素和黏附素；另一類是缺失細菌代謝途徑或適應環(huán)境調(diào)節(jié)中的“看家”基因。由干支氣管敗血波氏桿菌含多個毒カ因子，不同毒株之間，存在明顯的毒力和致病差異，且目前還未明確哪ー個或哪ー類毒カ相關(guān)基因在致病與免疫相關(guān)功能上起著決定性的作用，因此，選擇缺失某ー個或幾個靶基因，有一定的盲目性。而代謝途徑或環(huán)境調(diào)節(jié)中的“看家”基因是每ー個細菌都含有的，通過分子生物學的方法缺失該類基因，進而達到使野毒株致弱，具有更好的普適性。芳香族(aro)化合物生物合成途徑是革蘭氏陰性菌和陽性菌共有的代謝途徑。aroA基因編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶，缺失該基因可影響芳香族氨基酸、氨基苯甲酸及其他芳香族化合物的合成，使細菌只能在宿主體內(nèi)有限繁殖，進而使其毒カ減弱；同時，該類基因缺失株具還具有其他優(yōu)點，如可有效表達支氣管敗血波氏桿菌的各種免疫原性基因；在宿主體內(nèi)定殖的數(shù)周內(nèi)，既可激發(fā)機體強大的免疫應答，又能及時被宿主清除，具有更好的安全性和免疫效カ；通過鼻腔粘膜免疫途徑，即使動物機體內(nèi)含有少量的抗生素也難以影響疫苗菌株在局部増殖和誘導的免疫應答(Spreng S,Dietrich G,Weidinger G. 2006. Rational design of Salmonella-basedvaccination strategies. Methods, 38 (5) : 133-143.)。本發(fā)明以擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的支氣管敗血波氏桿菌強毒菌株LYl為研究對象，通過自殺性質(zhì)粒介導的同源重組技術(shù)構(gòu)建了不含抗性標記基因和其他外源基因的支氣管敗血波氏桿菌弱毒疫苗菌株，該疫苗菌株喪失了對宿主豬的致病性，但能提供接種仔豬針對支氣管敗血波氏桿菌感染的完全保護
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個目的在于提供ー種免疫原性更好和安全性更強的支氣管敗血波氏桿菌基因缺失菌株。進ー步地，本發(fā)明的第二個目的在于提供了ー種利用支氣管敗血波氏桿菌基因缺失菌株制備的支氣管敗血波氏桿菌基因缺失疫苗。更進一歩地，本發(fā)明的第三個目的在于提供一種支氣管敗血波氏桿菌基因缺失菌株在制備支氣管敗血波氏桿菌基因缺失疫苗中的應用。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種不含抗性標記的支氣管敗血波氏桿菌(分類命名Bordetella bronchiseptica)aroA基因缺失菌株aroA_LYl (簡稱aroA_LYl，下同)，于2011年12月23日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號CCTCC NO M 2011479。所述的不含抗性標記的支氣管敗血波氏桿菌缺失了支氣管敗血波氏桿菌LYl株的營養(yǎng)代謝基因aroA，缺失后支氣管敗血波氏桿菌毒力顯著減弱，但仍具有很好免疫原性。 本發(fā)明的不含抗性標記支氣管敗血波氏桿菌基因缺失菌株aroA_LYl，其基因工程菌株衍生干支氣管敗血波氏桿菌LYl株(簡稱LY1，下同)。其中，LYl為分離自豬的野生型支氣管敗血波氏桿菌強毒菌株，于2011年12月23日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為 CCTCC NO M 2011478。所述的支氣管敗血波氏桿菌基因缺失菌株aroA_LYl缺失了其營養(yǎng)代謝基因aroA1315bp的DNA片段，缺失該基因可影響芳香族氨基酸、氨基苯甲酸及其他芳香族化合物的合成，使細菌只能在宿主體內(nèi)有限繁殖，生長比較緩慢，進而使其毒カ減弱，且毒カ大大降低，因而具有很高的安全性。經(jīng)動物試驗證實，該基因缺失菌株仍具有很好的免疫保護力。本發(fā)明的基本構(gòu)建方法是利用基因工程技術(shù)缺失了支氣管敗血波氏桿菌野生型強毒株LYl的營養(yǎng)代謝基因aroA，從而構(gòu)建成新的弱毒菌株aroA_LYl。通過大量的生物學實驗數(shù)據(jù)證明本發(fā)明制備的基因缺失菌株aroA_LYl可用于制備針對豬支氣管敗血波氏桿菌感染的弱毒活疫苗。本發(fā)明的支氣管敗血波氏桿菌基因缺失菌株具有很好的免疫保護性，且毒カ較弱，對免疫豬無任何不良副作用，跟傳統(tǒng)該類疫苗相比更安全。因此，用該親本菌株構(gòu)建的基因缺失菌株制成疫苗，具有廣闊的市場應用前景。另外，本發(fā)明支氣管敗血波氏桿菌基因缺失菌株保留了針對支氣管敗血波氏桿菌感染的免疫保護效力，而且遺傳背景清晰，性狀穩(wěn)定，因而具有更好的生物安全性。本發(fā)明的支氣管敗血波氏桿菌基因缺失菌株不含抗性標記，完全符合疫苗生物安全性要求。


序列I是本發(fā)明構(gòu)建支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失株所用的上游同源臂的序列(927bp)；序列2是本發(fā)明的來源菌株支氣管敗血波氏桿菌野生菌LYl中缺失部分的aroA基因序列(1315bp)；序列3是本發(fā)明構(gòu)建支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失株所用的下游同源臂的序列(887bp)；圖I為本發(fā)明制備的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pREaroA12的物理圖譜；
圖2為本發(fā)明制備的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pREaroA12構(gòu)建的流程圖；圖3為本發(fā)明所使用的基因同源重組原理示意圖；圖4為本發(fā)明中不含抗性標記的支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失菌株aroAXYl的PCR篩選。圖中M為DNAmarker (DL 2，000) ;I為H2O空白對照；2和3為親本菌株 LYl 對照(3127bp) ；4 為篩選的 aroAXYl 株(1813bp)；圖5為本發(fā)明中的不含抗性標記的支氣管敗血波氏桿菌株aroA_LYl在含有10%小牛血清的LB固體培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)；圖中A和B分別為親本菌株LYl (菌落較大，約I. 5mm左右)和缺失菌株aroA—LYl (菌落較小，約O. 7mm左右)在含有10%小牛血清的LB固體培養(yǎng)基上生長36h后的菌落形態(tài)；圖6為本發(fā)明中的支氣管敗血波氏桿菌株aroATYl的生長特性試驗結(jié)果；

圖7為本發(fā)明中一種支氣管敗血波氏桿菌缺失菌株aroA_LYl的遺傳穩(wěn)定性實驗結(jié)果。注是引物ar l/ar4對缺失菌株aroA_LYl遺傳穩(wěn)定性的PCR鑒定圖，圖中M :DNAmarker (DL 2，000) ;1_6為I、10、20、30、40和50代缺失菌株模板的擴增結(jié)果;7為H2O
空白對照。
具體實施例方式實施例I支氣管敗血波氏桿菌LYlaroA基因缺失菌株的構(gòu)建與鑒定I、引物設(shè)計(用于基因克隆和分子檢測)參照已報道的支氣管敗血波氏桿菌株RB50的aroA基因序列(GenBank No:AF315119)設(shè)計2對引物(arl/ar2和ar3/ar4，見表I)，從支氣管敗血波氏桿菌強毒株LYl (LYl為分離自豬的野生型支氣管敗血波氏桿菌強毒菌株，于2011年12月23日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號CCTCC NO M2011478o )基因組中分別擴增aroA基因上下游片段aroAl (上臂)和aroA2 (下臂)，擴增片段大小分別為927bp和887bp，上臂兩端分別引入Kpn I和BamH I酶切位點，下臂兩端分別引入BamH I和Sac I酶切位點。引物均由上海Sangon公司合成。表1:PCR 引物
基因引物引物序列(5’-3つ目的片段酶切位點
名稱名稱しぐ度(bp) (下劃線)
aroA 上游 arl AAGGTACCTCCGGCGCTGCC.ATATTGTTKpn I
927
片段 arad/ ar2 AAGGATC.CTGGAATC.C.TTGC.GC.CAATTGBamH I
aroA 卜.游 ar3 AAGGATCCGCCGCGCGGGACTGAACGGCBamH I
S8っ
片段 aroA2 ar4 AAGAGCTCTAGGTTGGAATCCATTTGGCSac I2、支氣管敗血波氏桿菌LYl aroA基因上下游基因片段的克隆將凍干的支氣管敗血波氏桿菌LYl在含有10%小牛血清的TSA固體(40g，蒸餾水定容至1000mL，12rC高壓15min)培養(yǎng)基上劃線，37°C培養(yǎng)36h。挑取單菌落接種于含有10%小牛血清的TSB液體培養(yǎng)基(40g，蒸餾水定容至1000mL，121°C高壓15min)中，37°C、200r/min振搖培養(yǎng)16h。按細菌基因組提取試劑盒(購自北京TIANGEN公司)說明書提取基因組為PCR模板。aroAl和aroA2擴增反應均在25 μ L的體系中進行，反應體系(PCR相關(guān)試劑均購自上海 Sangon 公司)如下模板 DNA I μ L，10 XPCR 緩沖液 2. 5 μ L，25mmol/L MgCl22“し1(^11101/1上、下游引物各14し2臟01/1 dNTPs I μ L,2U/y L Taqase O. 5 μ L, ddH2016 μしaroAl和aroA2擴增條件為95°C變性5min后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94°C lmin,58°C lmin，72°C lmin。30個循環(huán)后，72°C延伸IOmin0擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)O. 8%的瓊脂糖凝膠電泳分析，擴增2個片段大小與預期大小相當，分別為927bp和887bp。將得到的目的基因克隆到PMD18-T載體(購自大連TaKaRa公司)，送上海Sangon公司進行基因序列的測
定。 3、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pREaroA12的構(gòu)建用Kpn I 和 BamH I 雙酶切 aroAl 和 pBluescriptSK (+)載體(購自美國 Stratagene公司)，回收純化后用T4DNAligase (購自上海Sangon公司)連接，16°C水浴12h，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細菌(購自大連TaKaRa公司)，37°C在固體LB平板上培養(yǎng)12h，挑菌到液體LB培養(yǎng)基，37°C、200r/min振搖培養(yǎng)12h，使用質(zhì)粒提取試劑盒(購自北京TIANGEN公司)小量制備質(zhì)粒從而獲得質(zhì)粒pSKaroAl。再用BamH I和Sac I雙酶切aroA2與質(zhì)粒pSKaroAl?；厥蘸笥肨4DNAligase連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細菌，37 °C培養(yǎng)12h，挑菌到液體LB培養(yǎng)基，37°C、200r/min振搖培養(yǎng)12h，小量制備質(zhì)粒從而獲得質(zhì)粒pSKaroA12。用Kpn I和SacI雙酶切轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKaroA12與自殺性質(zhì)粒pRE112(由美國華盛頓大學Dr. Roy Curtiss
III教授惠贈；Miller VL,Mekalanos JJ 1988. A novel suicide vector and its use inconstruction on insertion mutations osmoregulation of outer membrane proteinsand virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR. J. Bacteriol,170 2575-2583)，回收“aroAl+aroA2”片段和質(zhì)粒 pRE112，用 T4DNA ligase 連接，16°C水浴 12h，電轉(zhuǎn)化(黃培堂等譯.薩姆布魯克J，拉塞爾DW著.分子克隆實驗指南(第三版).北京科學出版社，2002)大腸桿菌X 7213(由美國華盛頓大學Dr. Roy Curtiss III教授惠贈；Edwards RA,Keller LH, Schifferli DM. 1998. Improved allelic exchange vectors andtheir use to analyze 987Pf imbria gene expression. Gene, 207 149-157)構(gòu)建重組菌株X 7213(pREaroA12)，37°C培養(yǎng)12h挑菌到液體LB培養(yǎng)基，37°C、200r/min振搖培養(yǎng)12h，小量制備質(zhì)粒從而獲得pREaroA12轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，其物理圖譜見圖I。酶切鑒定結(jié)果證實構(gòu)建的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pREaroA12是正確的。pREaroA12中的“aroAl+aroA2’T)NA片段含有缺失了 1315bp的aroA基因片段。轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pREaroA12構(gòu)建流程如圖2所示。4、支氣管敗血波氏桿菌LYlaroA基因缺失菌株aroA_LYl的構(gòu)建與鑒定本發(fā)明所使用的基因同源重組原理如圖3所示。以X 7213(pREaroA12)為供體菌，LYl為受體菌進行接合轉(zhuǎn)移。供體菌和受體菌分別在含有10%小牛血清的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，無菌磷酸鹽緩沖液(PBS，NaCl 8. Og7KCl O. 2g, Na2HPO4. 12H20 2. 9g，KH2PO4O. 2g，蒸餾水加至lOOOmL，經(jīng)121°C高壓滅菌30min)洗兩遍，調(diào)整菌濃度至OD6tltl為O. 8，各取100 μ L菌懸液混合。將無菌硝酸纖維濾膜貼于固體含10%小牛血清的TSA平板上，將混合菌液滴于濾膜上，37°C培養(yǎng)12h，同時做供體和受體對照。洗下濾膜上菌液，無菌PBS洗兩遍，涂布含氯霉素(Cm，終濃度30 μ g/mL)的TSA平板(加有10 %小牛血清)，37°C培養(yǎng)24h，將Cm抗性菌落同時轉(zhuǎn)接含Cm和5%蔗糖的TSA平板(加有10%小牛血清)，篩選Cm抗性(Cnf)接合子，提取基因組，用引物上臂上游引物和下臂下游引物arl/ar4(見表I)擴增鑒定，野生型擴增出3127bp的條帶，缺失型擴增出1813bp的條帶(如圖5)。陽性接合子在無抗性、含10%小牛血清的TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，連續(xù)10倍稀釋，涂布含5%蔗糖的固體TSA平板(加有10%小牛血清)，挑取單菌落復制在含Cm和5%蔗糖的固體平板，篩選Cm敏感(Cms)菌落。提取基因組，再次用引物arl/ar4擴增鑒定，野生型擴增出3127bp的條帶，缺失型擴增出1813bp的條帶(見圖4)。將缺失型擴增得到的片段進行序列測定(由上海Sangon公司完成)，測序結(jié)果表明，所構(gòu)建的LYlaroA基因缺失菌株aroA_LYl是正確的，缺失了 310bp的aroA全基因片段。實施例2支氣管敗血波氏桿菌基因缺失菌株aroA_LYl的生長特性分析基因缺失菌株aroA_LYl在含有10%小牛血清的TSA平板上37°C培養(yǎng)36h，菌落其 直徑約為O. 7mm，較親本菌株LYl (I. 5mm)顯著減小(見圖5)。親本菌株LYl與基因缺失菌株aroA_LYl從106CFU/mL開始培養(yǎng)，每Ih取樣，并進行活菌計數(shù)。結(jié)果顯示，基因缺失菌株aroATYl生長速度顯著慢于親本菌株LYl (見圖6),其平均世代間_ (Mean generationtime)為38. 7min，較親本菌株(26. lmin)延長12. 6min，說明基因缺失菌株LYl生長速度顯著慢于親本菌株LYl。 實施例3基因缺失菌株aroA_LYl的遺傳穩(wěn)定性將本發(fā)明制備的基因缺失菌株aroA_LYl在含有10%小牛血清的TSA平板上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落于含有10%小牛血清的TSA上，37°C溫箱培養(yǎng)24h，然后在培養(yǎng)好的平板上再挑取單菌落到含有10%小牛血清的TSA平板上，連續(xù)進行50次轉(zhuǎn)接，觀察菌落大小。結(jié)果表明基因缺失菌株aroA_LYl的菌落直徑仍約為O. 7mm，較親本菌株LYl (約為I. 5mm)顯著減小，仍符合aroA_LYl基因缺失菌株生長速度明顯偏慢的生長特征。同時用引物arl/ar4(見表I)進行PCR鑒定，基因缺失菌株aroA_LYl中的aroA缺失基因遺傳情況見圖7。圖7表明，缺失菌株的1、10、20、30、40和50代模板的均能擴增出缺失型1763bp的條帶，表明本發(fā)明制備的基因缺失菌株aroA—LYl能夠穩(wěn)定遺傳缺失型基因片段。實施例3支氣管敗血波氏桿菌基因缺失疫苗將獲得的支氣管敗血波氏桿菌基因缺失菌株aroA_LYl在含10%小牛血清的TSA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單菌落于含有10%小牛血清的TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到活菌濃度達到5.0X109CFU/mL。按細菌液明膠保護劑(體積體積)為7 : I的比例加入明膠保護劑(該明膠保護劑配制方法是姆IOOmL去離子水中加蔗糖40g，明膠Sg，充分融化后，置121 °C下滅菌30min后保存?zhèn)溆?，于滅菌凍干瓶中按2. OmL/瓶分裝，置_50°C冷凍干燥機中凍干，凍干36h后壓蓋，用10%鋁膠生理鹽溶解并進行活菌計數(shù)(CFU)，并確定沒有雜菌污染，置_20°C保存?zhèn)溆?，作為研制基因缺失疫苗的疫苗菌株。實施?支氣管敗血波氏桿菌基因缺失疫苗aroA_LYl的安全性評價I、本發(fā)明的基因缺失菌株aroATYl的毒カ測定為測定構(gòu)建的基因缺失菌株aroA_LYl對BALB/c小鼠的毒力，將32只BALB/c小鼠平均分為8組。第1-4組小鼠進行腹腔接種基因缺失菌株aroA—LYl，每小組每只分別注射4.2Χ108、4·之※！。7、‘· 2 X IO6和4. 2 X IO5CFU ;第5-8組進行腹腔接種親本菌株LYl，每小組每只分別注射5. 6 X 107、5. 6 X 106、5. 6 X IO5和5. 6 X 104CFU。記錄死亡情況并按照Reed andMuencn 法(Reed L J, Muench H. 1938. A simple method of estimating fifty percentendpoints. Am J Hyg, 27 :493-497)進行計算小鼠半數(shù)致死劑量(50% lethal dose, LD50)。評價基因缺失菌株aroA_LYl與親本菌株LYl相比毒カ減弱程度，結(jié)果見表2。親本菌株和缺失菌株對小鼠的LD5tl分別為5. 6 X IO6CFU和4. 2X 107CFU。說明aroA_LYl的毒力較親本菌株LYl降低了 7. 5倍。這表明本發(fā)明的基因缺失菌株aroA_LYl與親本菌株LYl相比其毒力明顯降低。表2本發(fā)明的基因缺失疫苗菌株與親本菌株毒力比較試驗
,f接種劑量f死亡數(shù)量/ I半數(shù)致死量 試驗菌株
(ロ服)試驗總數(shù) LD5Q(CFU)
5.6χ1074/4
5.6χ1062/4
LYl親本菌株--5.6χ106
5.6χ1050/4--
5.6xl040/4
4.2χ1084/4
aroA\X\ 4.2χ107 2/4 7 --4.2χ107
基因缺失菌株 42x1060/4
4.2χ1050/42、本發(fā)明的基因缺失菌株aroA_LYl對豬的安全性評價選擇22-25日齡、支氣管敗血波氏桿菌陰性的斷奶仔豬10頭，將本發(fā)明制備的aroAXYl基因缺失疫苗按每頭豬2mL (含4. OX IO9CFU活菌數(shù))的劑量通過耳靜脈接種仔豬，接種后12-48h仔豬出現(xiàn)輕度的ー過性的發(fā)熱、體溫升高反應，48h后均恢復正常，在此期間注射本發(fā)明制備的基因缺失疫苗的仔豬的精神食欲正常，未見異常變化，接種后14天均可檢測到支氣管敗血波氏桿菌抗體。將本發(fā)明制備的基因缺失菌株aroA—LYl按每頭豬2mL (含4. O X IO9CFU活菌數(shù))的劑量通過耳靜脈接種妊娠母豬10頭，所有妊娠母豬的精神食欲正常，未見異常變化，接種后14天均可檢測到支氣管敗血波氏桿菌抗體；和未接種的妊娠母豬比較，窩產(chǎn)仔數(shù)基本相當，均沒有出現(xiàn)死胎、木乃伊胎等。這兩個試驗證實本發(fā)明制備的基因缺失菌株aroA—LYl對斷奶仔豬和妊娠母豬均是安全的。實施例5本發(fā)明的基因缺失菌株aroATYl在小鼠體內(nèi)的免疫效カ檢測I、小鼠的免疫程序?qū)?-6周齡、支氣管敗血波氏桿菌陰性BALB/c小鼠30只，平均分為2組，分別為本發(fā)明制備的aroA_LYl基因缺失疫苗組和PBS空白對照組。免疫途徑為鼻腔接種0. ImL(含
I.OX IO8CFU活菌量)細菌液和PBS，14天后加強免疫I次(鼻腔接種方法參照Zhao Z,XueY,Wu B,et al. 2008. subcutaneous vaccination with attenuated Salmonella entericaserovar しholeraesuis C500expressing recombinant 11lamentous hemagglutinin andpertactin antigens protects mice against fatal infections with both S. entericaserovar Choleraesuis and Bordetella bronchiseptica. Infect Immun,76 (5)2157-2163.)。分別于免疫前O天、首免后14天和28天檢測支氣管敗血波氏桿菌血清抗體(標準ELISA方法，參照趙戰(zhàn)勤.支氣管敗血波氏桿菌的重組沙門氏菌基因工程疫苗研究[A],華中農(nóng)業(yè)大學圖書館.2008,97-107.)。2、免疫小鼠體液免疫抗體水平檢測小鼠免疫前采血，第二、三次采血分別在首免后14、28天進行，每組選取5只經(jīng)尾靜脈負壓采血，分離血清，取等量混勻后檢測抗支氣管敗血波氏桿菌平均血清抗體水平。結(jié)果見表3。從表3中可以看出，首免后第14天本發(fā)明的aroA—LYl基因缺失疫苗組小鼠的支氣管敗血波氏桿菌抗體為I : 32，ニ免后14天(即首免后28天)，本發(fā)明的支氣管敗血波氏桿菌基因缺失疫苗組小鼠的支氣管敗血波氏桿菌抗體效價升至在I : 256。而同步進行的PBS對照均為陰性(< I : 10)。上述試驗結(jié)果表明本發(fā)明制備的aroA_LYl基因缺失疫 苗免疫小鼠后能誘導機體產(chǎn)生特異性的抗支氣管敗血波氏桿菌的免疫應答反應。表3本發(fā)明制備的aroA_LYl基因缺失疫苗免疫小鼠血清抗體檢測(ELISA法)
I支氣管敗血波氏桿菌抗體效價
試驗分組P- 1 ^ I~
|-0058]首免后14天首免后28天
本發(fā)明的 /ro jLYl 基因缺失疫苗組1:321256
r PBS IΓ"<1.10<1.10
對照組_____3、aroAXYl基因缺失疫苗免疫BALB/c小鼠的保護性試驗 小鼠免疫后30天，將上述aroA_LYl基因缺失疫苗組和PBS空白對照組小鼠BALB/c小鼠各取10只，均使用5 X LD50 (見表2，含有2. 8 X IO7CFU)支氣管敗血波氏桿菌強毒株LYl對小鼠腹腔攻毒，觀察30天。PBS對照組小鼠攻毒后8h開始呈現(xiàn)精神沉郁、不食、扎堆;第3天開始出現(xiàn)死亡，死亡高峰出現(xiàn)在第5天，到第10天全部死亡。本發(fā)明制備的aroA_LYl基因缺失疫苗組攻毒后沒有出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀，沒有死亡情況發(fā)生。這說明本發(fā)明制備的aroA_LYl基因缺失疫苗免疫小鼠能夠抵御5 X LD5tl支氣管敗血波氏桿菌強度株LYl的攻擊。攻毒后保護率情況見表4所示。表4本發(fā)明制備的aroA_LYl基因缺失疫苗對支氣管敗血波氏桿菌LYl強毒株攻擊BALB/c小白鼠的保護性評價
w八和ロ服免疫 ロ服攻毒劑す年澌廣保護率
試驗刀組劑量量(CFU)存活數(shù)/心 (0/0)
__(CTU)___5__
_3]本發(fā)明的 i/ro4LYl 4.2χ108 2.8χ10710/10 100
基因缺失疫苗組_____
PBS7
^100 μ 2.8Χ1070/10O實施例6本發(fā)明制備的aroA—LYl基因缺失疫苗在仔豬體內(nèi)的免疫效カ檢測
I、豬的免疫程序選擇7-8日齡、支氣管敗血波氏桿菌陰性的仔豬12頭，試驗分3組，第I組為本發(fā)明的aroA_LYl基因缺失疫苗組，編號1_4，第2組為支氣管敗血波氏桿菌滅活疫苗(制備方法參照趙戰(zhàn)勤.支氣管敗血波氏桿菌的重組沙門氏菌基因工程疫苗研究[AL華中農(nóng)業(yè)大學圖書館.2008,97-107)組，編號5_8。第3組為PBS對照組，編號9_12。第I組通過滴鼻接種本發(fā)明的aroA_LYl基因缺失弱毒疫苗2mL (活菌含量3. OX IO9CFU)，第2組通過頸部肌肉注射2mL滅活疫苗(菌體含量3. OX IO9CFU)，第3組PBS對照組每頭豬通過頸部肌肉注射2mL無菌PBS。所有仔豬于首免后21d采取同樣的方法進行ニ免。在首免后20天和30天各采血一次，分別用ELISA方法檢測支氣管敗血波氏桿菌血清抗體(標準ELISA方法，方法同實施例 5,參照 Zhao Z, Xue Y, Wu B, et al. 2008. Subcutaneous vaccination withattenuated Salmonella enterica serovar CholeraesuisC500expressing recomomantIilamentous hemagglutinin and pertactin antigens protects mice againstfatal infections with both S.enterica serovar Choleraesuis and Bordetellabronchiseptica. Infect Immun, 76 (5) :2157-2163.)。試驗分組、免疫途徑和免疫劑量詳細情況見表5。2、免疫仔豬ELISA抗體水平檢測分別在免疫后20天和30天對每組仔豬豬進行前腔靜脈采血，分離血清，取等量混勻后采用間接ELISA方法檢測支氣管敗血波氏桿菌血清平均抗體水平，結(jié)果見表5。免疫后20天本發(fā)明的aroA_LYl基因缺失疫苗組和滅活疫苗組的平均抗體效價分別為I : 40和I : 80，免疫后30天，本發(fā)明的aroA_LYl基因缺失疫苗組平均抗體效價升至在I : 160和I : 640。而同步進行的PBS對照均為陰性(< I : 10)。上述結(jié)果表明本發(fā)明制備的aroA_LYl基因缺失疫苗免疫仔豬后能誘導機體產(chǎn)生特異性的抗支氣管敗血波氏桿菌特異性的體液免疫應答。表5本發(fā)明制備的aroA_LYl基因缺失疫苗免疫仔豬血清抗體檢測
權(quán)利要求
1.一種不含抗性標記的支氣管敗血波氏桿菌缺失菌株，其特征在于該aroA基因缺失菌株aroA-LYl (Bordetella bronchiseptica),于2011年12月23日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCC NO :M2011479。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的不含抗性標記的支氣管敗血波氏桿菌缺失菌株，其特征在于所述的不含抗性標記的支氣管敗血波氏桿菌缺失了支氣管敗血波氏桿菌LYl株的營養(yǎng)代謝基因aroA。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的不含抗性標記的支氣管敗血波氏桿菌缺失菌株，其特征在于不含抗性標記支氣管敗血波氏桿菌基因缺失菌株aroA-LYl，其基因工程菌株衍生于支于2011年12月23日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO M2011478。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的不含抗性標記的支氣管敗血波氏桿菌缺失菌株，其特征在于所述的支氣管敗血波氏桿菌基因缺失菌株aroA-LYl缺失了其營養(yǎng)代謝基因aroA1315bp 的 DNA 片段。
5.—種不含抗性標記的支氣管敗血波氏桿菌缺失菌株在制備支氣管敗血波氏桿菌基因缺失疫苗方面的應用。
6.一種由權(quán)利要求I所述的保藏號為CCTCC NO M 2011479的支氣管敗血波氏桿菌缺失菌株制備的支氣管敗血波氏桿菌基因缺失疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種支氣管敗血波氏桿菌基因缺失菌株及由其制備的疫苗和應用，該aroA基因缺失菌株aroA-LY1(Bordetella bronchiseptica)，于2011年12月23日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCCNOM 2011479。本發(fā)明的支氣管敗血波氏桿菌基因缺失菌株具有很好的免疫保護性，且毒力較弱，對免疫豬無任何不良副作用，跟傳統(tǒng)該類疫苗相比更安全。因此，用該親本菌株構(gòu)建的基因缺失菌株制成疫苗，具有廣闊的市場應用前景。另外，本發(fā)明支氣管敗血波氏桿菌基因缺失菌株保留了針對支氣管敗血波氏桿菌感染的免疫保護效力，而且遺傳背景清晰，性狀穩(wěn)定，因而具有更好的生物安全性，本發(fā)明的支氣管敗血波氏桿菌基因缺失菌株不含抗性標記，完全符合疫苗生物安全性要求。
文檔編號A61P31/04GK102676421SQ20121001149
公開日2012年9月19日 申請日期2012年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月15日
發(fā)明者馮書營, 薛云, 趙戰(zhàn)勤 申請人:河南科技大學