專利名稱：一種miR-132在制備治療帕金森病藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種微小RNA的應用，具體地說，是ー種miR-132在制備治療帕金森病藥物中的應用。
背景技術：
帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是發(fā)病率居第二位的常見的神經系統變性疾病，其病理特征主要表現為黑質多巴胺(Dopamine, DA)神經元的丟失和路易小體(Lewybody, LB)的形成。國際上關于的發(fā)病機制和治療方面的研究不少，但沒有一個系統全面的認識，也缺乏針對疾病的有效治療手段。常用的治療策略僅僅局限于對癥治療，盡量減輕患者的臨床癥狀，這類治療手段并不能夠從根本上逆轉ro的發(fā)生和發(fā)展。胚胎干細胞(Embryonic stem cells, ES細胞)是具有多種分化潛能的細胞,能夠誘導分化成為特定的細胞類型，這種特性使其在細胞替代治療方面具有廣闊的前景。近幾年國外許多實驗室開始研究ES細胞向DA神經元的定向誘導分化,期望能用于F1D患者DA神經元缺失的替代治療。但目前ES細胞分化過程中的分子機制還不清楚，誘導ES細胞精確定向分化的技術還不成熟，且分化成為DA神經元的比例仍然偏低。miRNA是ー類 22nt的內源RNA小分子。它來自于基因組編碼的初始轉錄本上剪切出來的發(fā)夾前體。成熟的miRNA通過識別并結合到靶基因上的互補序列而特異性地沉默靶基因的表達，并由此參與了生物體各種功能。miRNA在DA神經元分化和保護以及中的作用已經有初歩研究，目前已經發(fā)現miR-133b能夠通過調節(jié)Pitx3基因的表達調節(jié)DA神經元的發(fā)育和成熟，進而對F1D發(fā)病產生作用；MiR-7則通過調節(jié)alpha-synuclein的表達保護DA神經元抵御氧化應激等損傷。而miR-433則通過直接調節(jié)FGF20的表達,進而抑制FGF20的過度表達而保護DA神經元因alpha-synuclein的過度聚集而引起的損傷。Cuellar等制備了 DA 能神經元Dicer基因敲除小鼠，雖然該系小鼠可發(fā)育至成年，但具有典型的帕金森樣行為表現，利用基因印跡技術(southern blot)研究10-12周的該系小鼠新紋狀體神經元中miRNA表達情況，發(fā)現miR-124a、miR-132和miR-134表達明顯受到抑制，特別是miR-124a在新紋狀體中的表達抑制接近90%，認為新紋狀體中Dicer酶的缺失導致特定miRNA的表達減少，促進了的發(fā)展。這些新發(fā)現的miRNA通過調節(jié)不同的靶基因，影響DA神經元發(fā)育與分化、直接或者間接保護神經毒素對DA神經元的損傷。目前已經發(fā)現并確認的在中發(fā)揮作用的miRNA只有少數幾個，而許多實驗表明在DA神經元發(fā)育和分化過程中仍然有更多的miRNA有待發(fā)現和驗證。中國專利文獻CN102031261A公開了ー種與妊娠期糖尿病相關的血清/血漿miRNA標志物及其應用，該標志物為miR-132、miR-29a和miR-222的組合，該標志物及其引物可用于制備診斷試劑盒，用于妊娠期糖尿病的輔助早期診斷。但是關于miR-132在制備治療帕金森病藥物中的應用目前還未見報道
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對現有技術中的不足，提供ー種miR-132在制備治療帕金森病藥物中的應用。本發(fā)明的再ー個目的是，提供ー種miR-132作為診斷分子標志物在制備診斷帕金森病產品中的應用。為實現上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是ー種miR-132在制備治療帕金森病藥物中的應用，所述的miR-132具有SEQ ID NO. 16所述的核苷酸序列。為實現上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是ー種miR-132作為診斷分子標志物在制備診斷帕金森病產品中的應用，所述的miR-132具有SEQ ID NO. 16所述的核苷酸序列。所述的miR-132的靶基因是轉錄因子Nurrl。本發(fā)明優(yōu)點在于
本發(fā)明首次驗證了 miR-132在DA神經元發(fā)育中的作用，鑒定了 miR-132的靶基因是DA神經元發(fā)育和F1D發(fā)病中的重要轉錄因子Nurrl ;對于進ー步研究Nurrl以及miRNA在帕金森病發(fā)病以及臨床診斷和治療中的功能具有重要的意義。


`附圖1是TH-GFP載體示意圖。通過將IOkb大小的TH基因啟動子片段克隆入pEGFP-1 獲得。附圖2是穩(wěn)定轉染CGR8細胞株的鑒定。加入G418篩選2周后，本發(fā)明挑選了 48個單克隆進行TH啟動子表達，經過基因組DNA抽提和針對GFP的PCR鑒定，選擇了 12個表達較高的單克隆進行后續(xù)分化和染色的鑒定。附圖3是TH-GFP穩(wěn)定轉染的細胞分化為GFP表達的細胞。12個單克隆擴增以后通過與PA6細胞共培養(yǎng)進行分化，分化10-14天后進行TH染色。12個克隆中No. 12，24，30，42 and 48有較多的GFP和TH共定位的細胞出現，其中TH-GFP48具有比例最高的GFP和TH共定位細胞(60-70%)。附圖4是流式細胞儀分選的GFP陽性細胞。TH-GFP48分化為GFP表達的多巴胺神經元，并通過流式細胞儀進行分選。分選以后大約90%的細胞為GFP表達的多巴胺神經元。圖中所示為GFP細胞和明場細胞的共定位。附圖5是RT-PCR分析GFP分選的細胞。對Nurrl，TH，等多巴胺神經元標記基因進行RT-PCR分析。通過抽提神經前體細胞(NP)，GFP陽性細胞(GFP+)和GFP陰性細胞進行RT-PCR實驗。附圖6是miR-132反義核酸能夠促進多巴胺神經元分化。通過轉染合成的miR-132的抑制劑觀察其對多巴胺神經元分化的影響。TH染色(紅色)結果說明與對照組相比，miR-132表達下調后促進了多巴胺神經元的分化。附圖7是生物信息學分析miR-132和Nurrl的潛在調節(jié)關系。通過生物信息學分析，紅線代表了 Nurrl中與miRNA調節(jié)的種子序列配對的區(qū)域及其在不同物種中的保守性。突變的Nurrl (Mutant-Nurrl)中將C和T兩個堿基突變?yōu)镚和A進行后續(xù)的功能驗證實驗。附圖8是在293T和SK-N-SH細胞中進行熒光素酶報告基因分析驗證miR-132對Nurrl的調節(jié)。在焚光素酶報告基因分析中，將pGL_Mir_Nurrl/ pGL-Mir-Mutant-Nurrl和miRNA轉染入293T and SK-N-SH細胞中轉染24小時后通過化學發(fā)光檢測儀Bertholdmultimode reader進行焚光素酶分析。結果顯不miR-132能夠顯著下調野生型Nurrl的熒光素酶表達，而針對突變型的Nuirl，則不能有效下調熒光素酶表達(** p〈0.01)。附圖9是miR-132轉染后對Nuirl蛋白表達水平的調節(jié)作用。通過將pcDNA3.1-Nurrl和miR-132共轉染入293T細胞，48小時后進行蛋白抽提，通過westernblot方法檢測Nurrl表達，結果證明miR-132能夠顯著下調Nurrl的蛋白表達。
具體實施例方式下面結合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式
作詳細說明。實施例1
一、材料與方法
1.主要的試劑和材料
權利要求
1.一種miR-132在制備治療帕金森病藥物中的應用，所述的miR-132具有SEQ IDNO. 16所述的核苷酸序列。
2.—種m i R-13 2作為診斷分子標志物在制備診斷帕金森病產品中的應用，所述的miR-132具有SEQ ID NO. 16所述的核苷酸序列。
3.根據權利要求1和2任一所述的應用，其特征在于，所述的miR-132的靶基因是轉錄因子Nurrl。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種miR-132在制備治療帕金森病藥物中的應用，所述的miR-132具有SEQIDNO.16所述的核苷酸序列。本發(fā)明還提供一種miR-132作為診斷分子標志物在制備診斷帕金森病產品中的應用。本發(fā)明優(yōu)點在于本發(fā)明首次驗證了miR-132在DA神經元發(fā)育中的作用，鑒定了miR-132的靶基因是DA神經元發(fā)育和PD發(fā)病中的重要轉錄因子Nurr1；對于進一步研究Nurr1以及miRNA在帕金森病發(fā)病以及臨床診斷和治療中的功能具有重要的意義。
文檔編號A61P25/16GK103028119SQ20111037235
公開日2013年4月10日 申請日期2011年11月22日 優(yōu)先權日2011年11月22日
發(fā)明者樂衛(wèi)東, 楊德華, 李廳, 王頤 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院