專利名稱：吡啶并咔唑類化合物及其應(yīng)用的制作方法
吡啶并咔唑類化合物及其應(yīng)用本發(fā)明涉及吡啶并咔唑類化合物作為藥物的用途，更具體地涉及其在抗癌癥化療和其它類型疾病(精神病、病毒性疾病、寄生性疾病或真菌疾病)治療中的應(yīng)用；所述化合物對應(yīng)于式(I)，其結(jié)構(gòu)原型可與玫瑰樹堿的相類比；本發(fā)明還涉及式(I)的具體化合物， 并還涉及包含式(I)化合物的藥物組合物。考慮到有絲分裂紡錘體在細(xì)胞分裂中起關(guān)鍵作用，已長期將其認(rèn)定為抗癌化療中的重要靶標(biāo)。微管功能的損傷可對細(xì)胞存活力產(chǎn)生巨大影響，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯并且甚至可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。微管連同肌動蛋白微絲和中間絲形成真核細(xì)胞的細(xì)胞骨架。這些是由單一的二聚蛋白即微管蛋白構(gòu)成的中空的管狀聚集物。在哺乳動物細(xì)胞中，微管網(wǎng)絡(luò)通常在組織中心 (中心體)成核。所述網(wǎng)絡(luò)擔(dān)當(dāng)多個(gè)重要角色，例如胞質(zhì)的組織、細(xì)胞器定位、細(xì)胞運(yùn)動和細(xì)胞分裂。在有絲分裂期間，在細(xì)胞分裂成兩個(gè)子細(xì)胞前，微管網(wǎng)絡(luò)被重組織以形成有絲分裂紡錘體，所述有絲分裂紡錘體是細(xì)胞用以將二倍化的染色體分成兩個(gè)相同組的工具。有絲分裂紡錘體的完整性由特定檢驗(yàn)點(diǎn)控制。任何未檢出的有絲分裂紡錘體功能異常都可能源自基因組的不穩(wěn)定，并因此代表了腫瘤發(fā)生的潛在起源(Castillo et al. ,2007 ；Kops et al.，2005)。微管通過微管蛋白的α，β-二聚體的多聚化而組裝。微管是高度動態(tài)的多聚物， 其能夠由游離的微管蛋白二聚體快速多聚化并能夠同樣快速解聚。微管動力學(xué)是有絲分裂的關(guān)鍵(Jordan and Wilson, 2004 ；Niethammer et al.，2007)。微管動態(tài)行為網(wǎng)絡(luò)在細(xì)胞內(nèi)受到嚴(yán)格控制，其通過微管穩(wěn)定化和微管去穩(wěn)定化蛋白活性之間的平衡而調(diào)節(jié)，所述蛋白根據(jù)細(xì)胞類型包括以下的家族所謂的微管結(jié)合蛋白(MAP)STOP蛋白、tau蛋白、存活蛋白、stathmin/0pl8、Tog和微管解聚驅(qū)動蛋白、MCAK 和Kif2A。此外，微管生長尖端和諸如CLIP 170的一些蛋白的相互作用導(dǎo)致微管穩(wěn)定化。 所有這些看似不相關(guān)的蛋白都具有共性，即它們沿微管網(wǎng)架或在微管末端結(jié)合微管蛋白二聚體。所述蛋白與微管蛋白的結(jié)合通過磷酸化/去磷酸化過程或通過諸如微管蛋白酪氨酸化循環(huán)(

圖1)的微管蛋白翻譯后修飾而受到嚴(yán)格調(diào)控，例如(Barra et al. , 1998 ； Lafanechere and Job, 2000 ；MacRae,1997 ；Peris et al.，2006 ；Peris et al.，2009)。所述后一修飾涉及未表征的微管蛋白羧肽酶(TCP)對α-微管蛋白鏈羧基末端酪氨酸殘基的周期性移除和微管蛋白酪氨酸連接酶(TTL)在相同位置重新添加酪氨酸殘基。近來已表明，微管蛋白酪氨酸化調(diào)節(jié)與諸如CLIP-170的CAP-Gly微管蛋白正端跟蹤蛋白的微管相互作用(Peris et al.，2006)。催化微管蛋白酪氨酸化反應(yīng)的酶TTL將酪氨酸添加至可溶的去酪氨酸化微管蛋白，并且一旦組裝成微管便不與微管蛋白有效反應(yīng)。對TCP的了解更少，這主要是因?yàn)樗形幢患兓辆弧ｉg接證據(jù)表明，TCP可能偏愛多聚底物，并且其功能可能需要與微管的結(jié)合。TCP緩慢作用于微管，而在從微管釋放后，TTL使得GlU-微管蛋白快速再裝載(圖1) (MacRae，1997)。作為TTL底物特異性以及TTL和TCP動力學(xué)差異的結(jié)果，酪氨酸化微管蛋白(Tyr-微管蛋白)由于是體外循環(huán)細(xì)胞中的主要微管蛋白變體而是動態(tài)微管的主要組分，然而Glu-微管蛋白是長時(shí)間的穩(wěn)定微管蛋白的標(biāo)志物(Gimdersen et al. , 1984 ； Gundersen et al.，1987 ；Wheland and Weber，1987)。依細(xì)胞類型，所述去酪氨酸化微管是不可檢測的或代表所述細(xì)胞的小亞群。當(dāng)效應(yīng)物蛋白或諸如紫杉醇的藥物將微管穩(wěn)定時(shí)， 去酪氨酸化微管集聚(Fonrose et al. ,2007 ；Vassal et al. ,2006) 包括長春花生物堿、長春堿、長春新堿和長春瑞濱以及紫杉烷類(紫杉醇和多西紫杉醇)在內(nèi)的數(shù)種臨床上重要的抗癌藥物特異性靶向微管蛋白并調(diào)整微管動力學(xué)。考慮到所述藥劑在臨床上的成功，微管蛋白代表了迄今所鑒定的最高效的癌癥靶標(biāo)之一。此外，除癌癥之外，已描述微管細(xì)胞骨架參與大量疾病的病因?qū)W，所述疾病諸如精神病癥(Andrieux et al.，2006 ；Andrieux et al.，2002 ；Begou et al.，2008)和神經(jīng)退行性疾病(Dermaut et al. ,2005 ；Garcia et Cleveland, 2001)以及病毒性(Ruthel et al., 2005)、細(xì)菌性(Margalit et al.，2004)和寄生性(Morrissette and Sibley, 2002)感染。 因此，靶向微管細(xì)胞骨架及其多種效應(yīng)物的藥理學(xué)試劑可以對大量疾病的治療展現(xiàn)出治療優(yōu)勢(Lafanech6re，2008)。因此，抗癌化療中使用的治療以偏好方式靶向微管的動態(tài)行為，特別地，其可以被能夠與微管蛋白的不同位點(diǎn)結(jié)合的許多藥劑所阻斷?，F(xiàn)已獲得關(guān)于所述不同藥劑結(jié)合微管蛋白的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。紫杉醇穩(wěn)定化的微管蛋白原絲的鋅誘導(dǎo)片層已被用于構(gòu)建結(jié)合有紫杉醇的微管蛋白模型。在使該模型擬合電子密度微管圖后，作者得出結(jié)論，認(rèn)為紫杉醇結(jié)合面向微管腔的β-微管蛋白(Snyder et al.，2001)。在與蛋白stathmin的復(fù)合體中，與微管蛋白結(jié)合的長春堿的X射線結(jié)構(gòu)已表明，長春堿在兩個(gè)微管蛋白分子界面處引入楔形并因此干預(yù)微管蛋白組裝(Gigant et al.，2005)。迄今為止，所述研究已形成對微管毒物在微管蛋白上的三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的表征位于兩個(gè)α/β-微管蛋白二聚體間界面處的長春花生物堿結(jié)構(gòu)域、位于β亞基上的紫杉類物質(zhì)(taxoids)位點(diǎn)和位于α亞基和β亞基間界面處的秋水仙堿位點(diǎn)。所述多種藥劑根據(jù)它們使微管去穩(wěn)定化或穩(wěn)定化而分類為-使微管去穩(wěn)定化的藥劑能夠使微管解聚的長春花生物堿已被鑒定為能夠使細(xì)胞阻滯在有絲分裂中并帶來異常有絲分裂紡錘體的藥劑。隨后，在20世紀(jì)60年代引入長春新堿和長春堿作為臨床藥物，并仍廣泛用在睪丸癌、霍奇金病或急性淋巴細(xì)胞性白血病的化療中。還可能提及抑制微管多聚化的秋水仙堿或考布他汀(combretastatin)以及諾考達(dá)唑。-使微管穩(wěn)定化的藥劑紫杉烷類物質(zhì)(taxanes)，且更具體的為紫杉醇以每摩爾微管蛋白約1摩爾紫杉烷類物質(zhì)的化學(xué)計(jì)量特異且可逆地與微管相互作用。這種相互作用伴有對微管的穩(wěn)定化， 所述微管隨后可抵抗低溫或存在的Ca2+離子在體外誘導(dǎo)的解聚。紫杉醇和其它紫杉烷類物質(zhì)與其它抗微管蛋白毒物的主要區(qū)別在于其對微管的穩(wěn)定化作用。之前認(rèn)為諸如紫杉醇或長春花生物堿的癌癥藥物通過相反的機(jī)制發(fā)揮作用， 現(xiàn)在已經(jīng)知曉其通過調(diào)整微管動力學(xué)而不是通過增加或減少總體微管量來發(fā)揮作用。紫杉烷類物質(zhì)盡管具有抗腫瘤功效(尤其是在乳癌、卵巢癌和肺癌中)，但卻由于其還作用于增殖中的非癌性細(xì)胞(造血細(xì)胞、粘液細(xì)胞等)的微管而極具毒性。最后，紫杉烷類物質(zhì)可對于周圍神經(jīng)元產(chǎn)生不利作用并帶來顯著的副作用。顯示微管穩(wěn)定化性質(zhì)的其它天然產(chǎn)物(例如埃博霉素類和圓皮海綿內(nèi)酯 (discodermolide))因其抗腫瘤性質(zhì)而現(xiàn)正處于人臨床試驗(yàn)的研究中。紫杉醇在治療上的成功己保持了搜尋靶向微管蛋白的治療性藥劑的優(yōu)勢?？紤]到所述藥劑在臨床上的成功，微管蛋白現(xiàn)在是抗癌化療中最為有效的靶標(biāo)之一(Giarmakakou et al. , 2000 ； Jackson et al. , 2007 ；Zhou and Giannakakou,2005)。然而，盡管最有價(jià)值，但是現(xiàn)有技術(shù)的已知物質(zhì)并不理想。這些物質(zhì)具有數(shù)種副作用，主要是骨髓抑制和外周神經(jīng)毒性。與微管蛋白藥物相關(guān)的神經(jīng)毒性副作用并不令人驚訝，因?yàn)槲⒐艿鞍撞粌H是細(xì)胞分裂的主要參與者，還是獨(dú)立于有絲分裂的細(xì)胞骨架功能的主要參與者。此外，許多癌癥本身對所述藥物具有抗性或在長期治療過程中變得對所述藥物具有抗性。這通常是P-糖蛋白(其功能是藥物外排泵)或諸如乳癌抗性蛋白BCRP的其它藥物外排泵的過表達(dá)造成的多藥抗性的結(jié)果?？剐缘钠渌鼇碓窗ㄎ⒐艿鞍淄N型(特定藥物與以較低效率與之結(jié)合)的表達(dá)提高以及微管蛋白結(jié)構(gòu)的改變(通過翻譯后修飾或突變，所述改變降低結(jié)合)。為開發(fā)潛在更為有效且較低毒的藥物，己提出了數(shù)種策略。一種策略是改良現(xiàn)有藥物或?qū)ふ野邢蛭⒐艿鞍椎男滤?。另一種途徑在于靶向諸如有絲分裂檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白的僅在分裂中的細(xì)胞表達(dá)且其抑制也導(dǎo)致有絲分裂阻滯的其它蛋白。當(dāng)前正研究不同蛋白家族(激酶和驅(qū)動蛋白)的成員。 因?yàn)檫@些蛋白中的許多都被認(rèn)為在分離期有絲分裂具有專門化的特定功能，因而認(rèn)為對所述蛋白的抑制可能潛在地可相對靶向微管蛋白的現(xiàn)有抗有絲分裂療法而具有改善的治療指數(shù)。然而，搜尋具有潛在較小副作用的有絲分裂紡錘體特定抑制劑而非新的微管蛋白藥劑的基本原理越來越弱。一方面，諸如Aurora A(己知其在有絲分裂中的特定作用)的激酶近來已顯示作用于間期微管骨架。另一方面，原因是微管毒物的抗腫瘤作用中的一些可能也歸因于與微管蛋白細(xì)胞骨架的間期相互作用(Pan and Snell，2007 ；Pugacheva et al.， 2007)。搜尋直接靶向微管蛋白(或微管)或靶向能夠調(diào)節(jié)微管動力學(xué)的蛋白的破壞微管動力學(xué)的藥劑(Bhat and Setaluri, 2007 ；Muller et al.，2007)仍是癌學(xué)的重要問題。本申請人已驚訝地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的式⑴的化合物相比現(xiàn)有技術(shù)已知的化合物具有數(shù)點(diǎn)優(yōu)勢-它們能夠生成Glu-微管蛋白并誘導(dǎo)微管網(wǎng)絡(luò)對諾考達(dá)唑誘導(dǎo)的解聚的抗性。在體外，它們不直接作用于微管蛋白。因此，它們穩(wěn)定微管但具有不同于其它已知微管穩(wěn)定化化合物的作用模式，所述其它已知微管穩(wěn)定化化合物諸如紫杉烷類物質(zhì)或埃博霉素能夠附著至微管蛋白；-它們相比現(xiàn)有技術(shù)已知的化合物毒性顯著較小，并且即使在使用現(xiàn)有技術(shù)化合物觀察到的高抗性情況下仍具有活性；-此外，它們還對肌動蛋白細(xì)胞骨架具有作用。肌動蛋白細(xì)胞骨架被重組織并在某種程度上對拉春庫林(latrimculine)誘導(dǎo)的解聚更具抗性。細(xì)胞運(yùn)動受到抑制。因此，通過抑制細(xì)胞運(yùn)動，所述化合物可減少腫瘤的遠(yuǎn)程散播，因而具有額外的抗轉(zhuǎn)移性質(zhì)；
-它們因而構(gòu)成有利的可選擇性治療，尤其是觀察到例如出現(xiàn)對其它治療(紫杉烷類物質(zhì))的抗性時(shí)。本發(fā)明的一個(gè)主題因而是作為藥物的式(I)的化合物。因此，本發(fā)明的第一主題涉及作為藥物的對應(yīng)于下式(I)的四環(huán)化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽
權(quán)利要求
1.作為藥物的四環(huán)化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于所述化合物對應(yīng)于下式
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于R1是氫原子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2中任一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于&是甲基基團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于民是甲基基團(tuán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于所述-OR4基團(tuán)是-OH基團(tuán)或甲氧基基團(tuán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于所述-OR4基團(tuán)是式-O-CH2-C6H5的苯甲基醚基團(tuán)或式-OC(O)C6H5的苯甲酸酯基基團(tuán)，后者可在鄰位、間位或?qū)ξ槐贿x自-NO2、-NH2、-N (CH3) 2、-CN、-CH2NH2或-CH2N(CH3)2基團(tuán)的取代基任選地取代。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于所述&基團(tuán)是氫原子或二甲基氨甲基基團(tuán)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于所述&基團(tuán)是通過雙鍵與環(huán) D結(jié)合的氧原子。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于所述&基團(tuán)是氫原子。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于所述化合物對應(yīng)于下式
11.化合物，其特征在于所述化合物對應(yīng)于下式(I)
12.藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物包含作為活性成分的至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的化合物和至少一種藥學(xué)上可接受的載體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其特征在于所述組合物還包含另一抗癌活性成分。
14.評價(jià)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的式(I)化合物的抗癌活性的方法，其特征在于所述方法包括1).在用待測試化合物孵育真核細(xì)胞后，用保護(hù)微管網(wǎng)絡(luò)但可清除解聚微管蛋白的緩沖液透化所述細(xì)胞；2).在固定所述細(xì)胞后，用抗酪氨酸化微管蛋白一抗和在波長λ1發(fā)射的二抗標(biāo)記 Tyr-微管蛋白，用抗去酪氨酸化微管蛋白一抗和在波長λ 2發(fā)射的二抗標(biāo)記Glu-微管蛋白，隨后在所述各波長下進(jìn)行熒光定量，目的在于鑒定對所述解聚試劑最為敏感的動態(tài)微管和穩(wěn)定化的微管；3).補(bǔ)充標(biāo)記細(xì)胞核，以評價(jià)所述細(xì)胞層的狀態(tài)；4).在與步驟1)相同的條件下，將HeLa細(xì)胞與待測試化合物孵育，如果在所述波長 λ 2觀察到熒光，則排除所述化合物；5).用線粒體標(biāo)記物對所孵育細(xì)胞的樣品染色，用疊氮化鈉對孵育細(xì)胞的樣品染色，并比較所述疊氮化鈉和所述待測試化合物對線粒體的作用，如果所述化合物顯示對線粒體染色的調(diào)整與疊氮化鈉相似，則排除所述化合物；6).將HeLa細(xì)胞與待測試分子孵育，任選地用諾考達(dá)唑處理，隨后分析微管網(wǎng)絡(luò)的免疫熒光標(biāo)記，并使用檢測儀定量；和7).用待測試化合物孵育所述HeLa細(xì)胞，隨后任選地與拉春庫林B共孵育，并用偶聯(lián)有熒光團(tuán)(λ2下發(fā)射)的毒蕈肽標(biāo)記F-肌動蛋白，以分析所述待測試化合物對肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)的作用，當(dāng)所述化合物未調(diào)整肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)形態(tài)時(shí)，排除所述化合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的式(I)的化合物，所述化合物用作用于預(yù)防和 /或治療神經(jīng)退行性病變的藥物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的式(I)的化合物，所述化合物用作用于預(yù)防和/或治療阿爾茨海默氏病和精神分裂癥的藥物。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的式(I)的化合物，所述化合物用作用于預(yù)防和 /或治療寄生蟲病的藥物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的式(I)的化合物，所述化合物用作用于預(yù)防和/或治療瘧疾的藥物。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的式(I)的化合物，所述化合物用作用于預(yù)防和 /或治療青光眼的藥物。
20.體外篩選易于抑制或穩(wěn)定LIMKl活性的分子的方法，所述方法包括(i)使LIMKl與任選具有標(biāo)記的權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的式(I)化合物接觸；( )加入所述待測試化合物，和(iii)評價(jià)所述待測試化合物對式(I)化合物的置換。
21.體內(nèi)篩選直接或間接的LIMKl活化劑或磷酸酶抑制劑的方法，所述方法包括 (i)使權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的式(I)化合物與真核細(xì)胞、優(yōu)選人細(xì)胞接觸， ( )通過測定LIMKl底物例如絲切蛋白的磷酸化的降低，評價(jià)所述式(I)化合物的抑制作用，(iii)加入所述待測試化合物，和(iv)測定所述待測試化合物在抑制LIMKl底物磷酸化中的作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及對應(yīng)于以下通式(I)的吡啶并咔唑類化合物作為藥物的用途，更具體地，涉及其在抗癌癥化療中的應(yīng)用本發(fā)明的另一主題是式(I)的具體化合物以及包括本發(fā)明式(I)化合物的藥物組合物。本發(fā)明還涉及式(I)化合物在制備旨在用于預(yù)防和/或治療諸如阿爾茨海默氏病和精神分裂癥的神經(jīng)退行性病變的藥物，制備旨在用于預(yù)防和/或治療諸如瘧疾的寄生蟲病的藥物或制備旨在用于預(yù)防和/或治療青光眼的藥物中的用途。
文檔編號A61K31/475GK102395587SQ201080017070
公開日2012年3月28日 申請日期2010年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月20日
發(fā)明者克里斯蒂安·里瓦勒, 勞倫斯·拉法內(nèi)謝爾, 卡羅琳·巴雷特, 吉亨·源, 埃米莉亞·瓦薩爾, 雷諾·普呂當(dāng) 申請人:原子能與替代能源署, 國家科學(xué)研究中心, 居里研究所