專利名稱：與淀粉樣物質(zhì)結(jié)合的金屬螯合劑的制作方法
政府利益本文所述工作得到National Institutes of Health/National Institute ofMental Health(國家衛(wèi)生研究院/國家精神衛(wèi)生研究院)的資助(資助號5K01 MH002001-02)。美國政府可在本發(fā)明中具有某些權(quán)利。
相關(guān)申請本申請要求2003年1月22日提交的臨時(shí)專利申請60/441,719的優(yōu)先權(quán)，該申請被全文并入本文作為參考。
背景技術(shù)：
淀粉樣病變(amyloidosis)為一類疾病和病癥，其特征在于被稱為淀粉樣物質(zhì)的類蛋白物質(zhì)(protein-like substance)在身體的一個(gè)和多個(gè)器官和組織中積聚。可系統(tǒng)發(fā)生或局部發(fā)生的淀粉樣物質(zhì)積聚可損害正常的生命機(jī)能并引起器官衰竭。已經(jīng)識別了至少15種淀粉樣病變(每一種都與不同類型的淀粉樣沉積物有關(guān))。積聚后的蛋白質(zhì)的性質(zhì)以及聚集的位置決定癥狀，其可為從輕度到危急生命的程度。淀粉樣沉積物為臨床狀況病理學(xué)的重要部分，如阿爾茨海默氏病、成人發(fā)病型糖尿病、慢性炎性疾病、透析相關(guān)性關(guān)節(jié)病、腫瘤、和家族性神經(jīng)病。
在淀粉樣病變中，通?？扇苄怨δ艿鞍踪|(zhì)的異常折疊和聚合為不溶性的富含β折疊的(β-sheet-rich)四級結(jié)構(gòu)引起聚集的蛋白質(zhì)從細(xì)胞分泌出來并形成細(xì)胞外淀粉樣沉積物(即小纖維、纖絲、蛋白斑、和纏結(jié))。在可以經(jīng)歷這種轉(zhuǎn)變的20種蛋白質(zhì)中，一些優(yōu)先地在腦中積聚，并且其與神經(jīng)退行性疾病狀況有關(guān)。這些蛋白質(zhì)包括例如朊病毒蛋白，其與朊病毒疾病有關(guān)；和β淀粉樣肽(Aβ)，其沉積在患有阿爾茨海默氏病、唐氏綜合癥、路易體癡呆、淀粉樣病變(荷蘭型)遺傳性腦出血、關(guān)島帕金森癡呆、和腦外傷患者的腦中有發(fā)現(xiàn)。
雖然淀粉樣病變通常是罕見的病理生理學(xué)狀況，但阿爾茨海默氏病(AD)在美國是最常見的癡呆形式。流行病學(xué)研究估計(jì)有40％到50％的人在他們接近90歲時(shí)患有AD(D.A.Evans等人，JAMA，1989，2622551-2556；R.Katzman，Neurology，1993，4313-20)。該疾病的第一個(gè)癥狀通常為記憶缺失，隨后是語言、認(rèn)知、和活動(dòng)性損傷，并最終導(dǎo)致精神功能喪失，衰弱到使患者變得完全依賴他人照顧他們的日常生活。這種不可逆的退化最終導(dǎo)致死亡。除了其對個(gè)人和家庭的巨大影響之外，AD還造成了重大的公共衛(wèi)生難題。根據(jù)the NationalInstitute on Aging(國家衰老研究院)，估計(jì)目前有4百萬美國人患有該疾病，并且每年新診斷出約360,000例新病例(R.Brookmeyer等人，Am.J.Public.Health.，1998，881337-1342)。估計(jì)每年國家照顧AD患者的直接或間接費(fèi)用有1000億美元(R.L.Ernst等人，Arch.Neurol.，1997，54687-693)，AD還對社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)荷。
在阿爾茨海默氏病患者中，β淀粉樣肽的聚集導(dǎo)致在腦血管系統(tǒng)中形成淀粉樣沉積物和在新皮層中形成老年斑(C.L.Masters等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1985，824245-4249)。因?yàn)闆]有侵入性活組織檢查很難進(jìn)行診斷，只能通過腦組織的死后驗(yàn)尸檢查實(shí)現(xiàn)明確的診斷(G.McKhann等人，Neurology，1984，34939-944；D.M.Mann，Mech.AgeingDev.，1985，31213-255)，研究AD仍然是一項(xiàng)使人畏縮的工作，迄今為止，處置和治療的進(jìn)展還難以捉摸。FDA批準(zhǔn)的多個(gè)作為“認(rèn)知增強(qiáng)劑”的治療劑(如Aricept_、Cognex_、Exelon_、和Mentane_)在一些AD患者中提供了輕微的緩解。然而，這些治療劑不改變疾病的潛在進(jìn)程，目前還沒有對阿爾茨海默氏病在其發(fā)展的任何階段提供治愈或有效的治療。
一直以來，淀粉樣物質(zhì)積聚被認(rèn)為在神經(jīng)元細(xì)胞高死亡的區(qū)域濃度最高。這種關(guān)系得到了其中β淀粉樣肽當(dāng)以特定的β折疊構(gòu)造聚集時(shí)產(chǎn)生高神經(jīng)元毒性的事實(shí)的支持(J.Y.Koh等人，Brain Res.，1990，533315-320；B.A.Yankner等人，Science，1990，250279-282)。雖然越來越多的證據(jù)暗示淀粉樣沉積物與AD患者中觀察到的神經(jīng)元功能障礙密切相關(guān)(J.W.Kelly，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95930-932)，但仍不清楚毒性機(jī)理和引起Aβ沉積的神經(jīng)化學(xué)事件的機(jī)理。
最近提出假說，認(rèn)為過渡金屬在阿爾茨海默氏病的發(fā)病機(jī)理中起到了決定性的作用(C.S.Atwood等人，Met.Ions Biol.Syst.，1999，36309-364；A.I.Bush，Curr.Opin.Chem.Biol.，2000，4184-191)。在小鼠和人中，已經(jīng)表明隨著自然老化在幾個(gè)組織中包括腦中鐵和銅水平增加(H.R.Massie等人，Ageing Dev.1979，1093-99；B.Drayer等人，Am.J.Roentgenol.，1986，147103-110；G.Bartzokis等人，Magn.Reson.Imaging，1997，1529-35；L.Del Corso等人，Panminerva Med.，2000，42273-277)。在AD患者的腦中也觀察到了過渡金屬失衡(J.R.Connor等人，J.Neurosci.Res.，1992，31327-335；D.A.Loeffler等人，Brain Res.，1996，738265-274；M.A.Deibel等人，J.Neurol.Sci.，1996，143137-142；R.Cornett等人，Neurotox.，1998，19339-345)，其中發(fā)現(xiàn)鋅、銅、和鐵的濃度在淀粉樣蛋白斑內(nèi)和周圍變大(M.A.Lovell等人，J.Neurol.Sci.，1998，15847-52)。此外，β淀粉樣肽表現(xiàn)出高的對過渡金屬離子的親合性；并且Zn2+對Aβ的結(jié)合和Cu2+和Fe3+對Aβ的較小程度的結(jié)合顯著地增加蛋白質(zhì)聚集和形成淀粉樣沉積物(A.I.Bush等人，Science，1994，2651464-1467)。在金屬螯合劑的存在下可使這兩個(gè)過程(聚集和沉積)反轉(zhuǎn)(X.Huang等人，J.Biol.Chem.，1997，27226464-26470；C.S.Atwood等人，J.Biol.Chem.1998，27312817-12826；R.A.Cherny等人，J.Biol.Chem.，1999，27423223-23228)。
除了促進(jìn)蛋白質(zhì)聚集和淀粉樣物質(zhì)積聚之外，氧化還原活性過渡金屬(即Cu2+和Fe3+)對Aβ的結(jié)合也導(dǎo)致活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生(X.Huang等人，J.Biol.Chem.，1999，27437111-37116；X.Huang等人，Biochem.1999，387609-7616；L.M.Sayre等人，J.Neurochem.，2000，74270-279)，已知其對多種生物分子產(chǎn)生有害作用。生物金屬介導(dǎo)的和淀粉樣物質(zhì)介導(dǎo)的活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生被認(rèn)為至少部分地與AD患者腦中觀察到的氧化應(yīng)激有關(guān)(M.A.Pappolla等人，Am.J.Pathol.，1992，40621-628；W.R.Markesbery，F(xiàn)ree Radic.Biol.Med.，1997，23134-147；P.Gabbita等人，J.Neurochem.，1998，712034-2040；M.A.Smith等人，Antioxid.Redox Signal，2000，2413-420；M.P.Cuajungco等人，J.Biol.Chem.，2000，27519439-19422)。
過渡金屬離子可在阿爾茨海默氏病的一些病理效果中起作用這一發(fā)現(xiàn)為診斷方法和治療處置的開發(fā)提供了新的途徑。例如，在美國專利6,323,218中，金屬螯合劑或金屬復(fù)合化合物(如EDTA、4，7-二苯基-1，10-菲繞啉、2，9-二甲基-4，7-二苯基-1，10-菲繞啉、和青霉胺)被描述為是用于治療與淀粉樣病變有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的治療劑。最近，氯碘羥喹，一種口服可生物利用的金屬螯合劑，已經(jīng)在阿爾茨海默氏病的Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠模型中表現(xiàn)出顯著抑制皮層淀粉樣物質(zhì)積聚(R.A.Cherny等人，Neuron.，2001，30665-676)。雖然這些研究結(jié)果令人充滿希望，并且暗示金屬螯合劑可能具有用于治療與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的狀況的治療價(jià)值，但可以證明許多非特異性金屬螯合劑的潛在的副作用對于臨床應(yīng)用來說太大，因?yàn)樗鼈兛梢詳_亂其它需要金屬的生物分子的正常的生理功能。
因此，仍然非常期望開發(fā)用于早期診斷、預(yù)防、和治療通常是淀粉樣病變、特別是阿爾茨海默氏病的有效的藥物和方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的診斷、預(yù)防、和治療。具體地，本發(fā)明包括用于檢測淀粉樣沉積物的存在、和用于預(yù)防或治療與淀粉樣物質(zhì)有關(guān)的狀況的試劑和對策。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明可用于與腦中淀粉樣蛋白和類淀粉樣蛋白的聚集和積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的診斷、預(yù)防、和治療。
一方面，本發(fā)明提供充當(dāng)金屬螯合劑并表現(xiàn)出對淀粉樣沉積物具有某種程度的吸引力的靶向治療劑。更具體地，本發(fā)明提供包括與至少一個(gè)淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分結(jié)合的至少一個(gè)金屬螯合部分的雙官能分子。優(yōu)選地，淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分表現(xiàn)出對Aβ淀粉樣沉積物的高親合性和特異性。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分可透過血腦屏障。例如，在某些這種實(shí)施方案中，淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分可以是苯并噻唑衍生物。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，金屬螯合部分與生物學(xué)相關(guān)的高親合性過渡金屬離子結(jié)合，所述過渡金屬如鋅II(Zn2+)、銅II(Cu2+)、和鐵III(Fe3+)。例如，在這種實(shí)施方案中，金屬螯合部分可為DTPA或α-硫辛酸衍生物。
本發(fā)明優(yōu)選的雙官能分子包括化合物XH1及其類似物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)示于圖4中。其它優(yōu)選的本發(fā)明的雙官能分子包括化合物XH2及其類似物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)示于圖6中。
另一方面，本發(fā)明提供表現(xiàn)出對淀粉樣沉積物有某種程度的吸引力并且可通過成像技術(shù)檢測到的靶向治療劑。更具體地，本發(fā)明提供對比成像劑，其包括與至少一個(gè)淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分結(jié)合的至少一個(gè)成像部分。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分可透過血腦屏障。優(yōu)選地，淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分表現(xiàn)出對Aβ淀粉樣沉積物的高的親合性和特異性。例如，優(yōu)選的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分可以是苯并噻唑衍生物。成像部分可以是本領(lǐng)域中已知的可被成像技術(shù)檢測到的任何適當(dāng)?shù)膶?shí)體。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，成像部分包括與可檢測金屬實(shí)體復(fù)合的至少一個(gè)金屬螯合部分。優(yōu)選地，金屬螯合部分與生理學(xué)可接受的金屬實(shí)體復(fù)合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，金屬實(shí)體是順磁性金屬離子，對比成像劑可通過磁共振成像(MRI)檢測到。優(yōu)選地，順磁性金屬離子為釓III(Gd3+)。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，金屬實(shí)體是放射性核素，對比顯影劑可通過單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像(SPECT)檢測到。優(yōu)選地，放射性核素為锝99m(99mTc)。
本發(fā)明還提供對比成像劑，其包括與至少一個(gè)淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分結(jié)合的至少一個(gè)金屬螯合部分，所述淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分由可通過核磁共振(NMR)檢測到的穩(wěn)定的順磁性同位素標(biāo)記。在優(yōu)選實(shí)施方案中，穩(wěn)定的順磁性同位素是碳-13(13C)或氟-19(19F)；并且對比成像劑可通過磁共振光譜分析(MRS)檢測到。
優(yōu)選的本發(fā)明的對比成像劑是本文中所述的雙官能分子的釓III(Gd3+)復(fù)合體。
另一方面，本發(fā)明提供藥學(xué)組合物。本發(fā)明的藥學(xué)組合物包括至少一種本發(fā)明的試劑或其生理學(xué)可耐受的鹽，和至少一種藥學(xué)可接受的載體。在這些藥學(xué)組合物中，試劑的存在量足夠滿足其預(yù)定目的。更具體地，本發(fā)明提供藥學(xué)組合物，其包括有效量的至少一種雙官能分子或其生理學(xué)可耐受的鹽、和至少一種藥學(xué)可接受的載體。本發(fā)明還提供藥學(xué)組合物，其包括成像有效量的至少一種對比成像劑或其生理學(xué)可耐受的鹽、和至少一種藥學(xué)可接受的載體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，對比成像劑中的成像部分包括與釓III(Gd3+)或锝-99m(99mTc)復(fù)合的至少一個(gè)金屬螯合部分。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，對比成像劑中的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分由碳-13(13C)或氟-19(19F)標(biāo)記。
在另一方面中，本發(fā)明提供在體外或體內(nèi)降低或抑制淀粉樣物質(zhì)毒性的方法。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明可通過預(yù)防、減慢、或停止淀粉樣物質(zhì)積聚和/或通過促進(jìn)、誘導(dǎo)、或幫助淀粉樣沉積物溶解而降低或抑制淀粉樣物質(zhì)毒性。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明可通過減少、抑制、或干擾淀粉樣物質(zhì)介導(dǎo)的活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生而降低或抑制淀粉樣物質(zhì)的毒性。
更具體地，本發(fā)明提供了降低或抑制系統(tǒng)中淀粉樣物質(zhì)毒性的方法，其包括使系統(tǒng)與本發(fā)明的雙官能分子或其藥學(xué)組合物接觸。該系統(tǒng)可為已知能夠產(chǎn)生和/或包含淀粉樣沉積物的任何生物實(shí)體。例如系統(tǒng)可為細(xì)胞、生物流體、生物組織或動(dòng)物。該系統(tǒng)可來源于活著的患者(如其可通過活組織檢查得到)或死亡的患者(如其可通過尸體解剖得到)?；颊呖梢允侨嘶蚱渌溉閯?dòng)物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞、生物流體、或生物組織來源于懷疑患有與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的患者。
本文還提供治療患有與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的患者的方法，其包括對患者給予有效量的本發(fā)明的雙官能分子或其藥學(xué)組合物。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，病理生理學(xué)狀況與β淀粉樣肽的積聚有關(guān)。
另一方面，本發(fā)明提供了用于檢測系統(tǒng)中或患者體內(nèi)淀粉樣沉積物存在的方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法基于靶向?qū)Ρ瘸上駝┖统上窦夹g(shù)的使用。
更具體地，本發(fā)明提供了用于檢測系統(tǒng)中淀粉樣沉積物存在的方法，其包括使系統(tǒng)與成像有效量的對比成像劑或其藥學(xué)組合物接觸。優(yōu)選接觸在可使對比成像劑與系統(tǒng)中存在的淀粉樣沉積物相互作用、相互作用進(jìn)而導(dǎo)致對比成像劑與淀粉樣沉積物結(jié)合的條件下進(jìn)行。然后使用成像技術(shù)檢測系統(tǒng)中存在的與淀粉樣沉積物結(jié)合的對比成像劑，并且產(chǎn)生系統(tǒng)的至少一部分的一個(gè)或多個(gè)圖像。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于鑒別用于治療與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的潛在治療劑。本發(fā)明包括通過該方法鑒別的藥物。
本發(fā)明還提供了用于檢測患者體內(nèi)淀粉樣沉積物存在的方法。這些方法包括對患者給予成像有效量的靶向?qū)Ρ瘸上駝┗蚱渌帉W(xué)組合物。優(yōu)選給藥在可使對比成像劑與患者體內(nèi)存在的淀粉樣沉積物相互作用、相互作用進(jìn)而導(dǎo)致對比成像劑與淀粉樣沉積物結(jié)合的條件下進(jìn)行。在給藥之后，使用成像技術(shù)檢測患者體內(nèi)存在的與淀粉樣沉積物結(jié)合的對比成像劑，并且產(chǎn)生患者身體的至少一部分的一個(gè)或多個(gè)圖像。
在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，通過使用對比成像劑進(jìn)行本發(fā)明的檢測系統(tǒng)或患者體內(nèi)淀粉樣沉積物存在的方法，其中成像部分包括與順磁性金屬離子復(fù)合的至少一個(gè)金屬螯合部分；通過磁共振成像(MRI)進(jìn)行檢測；產(chǎn)生MR圖像。優(yōu)選地，順磁性金屬離子是釓III(Gd3+)。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，通過使用對比成像劑進(jìn)行本發(fā)明的方法，其中成像部分包括與放射性核素復(fù)合的至少一個(gè)金屬螯合部分；通過單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像(SPECT)進(jìn)行檢測；和產(chǎn)生SPECT圖像。優(yōu)選地，放射性核素是锝-99m(99mTc)。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，通過使用對比成像劑進(jìn)行本發(fā)明的方法，其中淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分由穩(wěn)定的順磁性同位素標(biāo)記；通過磁共振光譜分析(MRS)進(jìn)行檢測；和產(chǎn)生MR圖像。優(yōu)選地，穩(wěn)定的順磁性同位素是碳-13(13C)或氟-19(19F)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于定位患者體內(nèi)的淀粉樣沉積物。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于診斷與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況。在其它實(shí)施方案中，上述方法用于跟蹤與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的進(jìn)展。在其它實(shí)施方案中，上述方法用于監(jiān)測患者對與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的治療的應(yīng)答。
本文中所述的雙官能治療分子、靶向?qū)Ρ瘸上駝?、藥學(xué)組合物和方法也可用于診斷、預(yù)防或治療受到淀粉樣物質(zhì)相關(guān)狀況影響的不同于人的哺乳動(dòng)物。例如，它們可用于人淀粉樣病變的動(dòng)物模型的情況中，以及動(dòng)物朊病毒疾病中，如牛的牛海綿狀腦病、綿羊的癢病；貂的傳染性腦病、和黑尾鹿和麇鹿的慢性消耗性疾病。
通過以下詳細(xì)說明可使本發(fā)明的其它方面、特征和優(yōu)點(diǎn)變得顯而易見。然而，應(yīng)該理解，表明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說明和具體的實(shí)施例只是以示例的方式給出。


圖1表示在本領(lǐng)域中已經(jīng)表現(xiàn)出高的對淀粉樣蛋白的親合性的剛果紅(圖1A)、柯胺-G(圖1B)、(反，反)-1-溴-2，5-雙-(3-羥基羰基-4-羥基)-苯乙烯基苯(圖1C)、4′-碘-4′-脫氧多柔比星(圖1D)、和硫代黃素T(圖1E)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖2表示已知的金屬鰲合劑4，7-二苯基-1，10-菲繞啉(圖2A)、2，9-二甲基-4，7-二苯基-1，10-菲繞啉(圖2B)、去鐵草酰胺(圖2C、青霉胺(圖2D)、EDTA(圖2E)、EGTA(圖2F)、DTPA(圖2G)、TETA(圖2H)、TPEN(圖2I)、和α-硫辛酸(圖2J)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖3表示本領(lǐng)域中已知的可與由成像技術(shù)檢測到的金屬實(shí)體復(fù)合的DOTA(圖3A)、TTHA(圖3B)、ECD(圖3C)、EDTMP(圖3D)、和HMPAO(圖3E)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖4表示一類新的雙官能分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，該化學(xué)結(jié)構(gòu)包括DTPA，DTPA擔(dān)當(dāng)金屬螯合部分并以共價(jià)鍵結(jié)合于兩個(gè)相同的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分(硫代黃素衍生物)。該類化合物的母體分子(化合物XH1)和各種類似物分別出現(xiàn)在圖4A和圖4B中。
圖5表示化合物XH1的化學(xué)表征結(jié)果。XH1的質(zhì)譜和1H-NMR光譜分別表示在圖5A和圖5B中。
圖6表示一類新的雙官能分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，該化學(xué)結(jié)構(gòu)包括α-硫辛酸，α-硫辛酸擔(dān)當(dāng)金屬螯合部分并以共價(jià)鍵結(jié)合于一個(gè)淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分(硫代黃素衍生物)。該類化合物的母體分子(化合物XH2)和各種類似物分別表示在圖6A和圖6B中。
圖7表示化合物XH2的化學(xué)表征結(jié)果。XH2的質(zhì)譜和1H-NMR光譜分別表示在圖7A和圖7中。
圖8為表示雙官能分子XH1、金屬螯合化合物DTPA的存在對Aβ1-40聚集的效果。通過在400nm測量混濁度評價(jià)聚集。
圖9表示XH1對E17大鼠皮層原代神經(jīng)元存活率的影響(圖9A)和對人SH-SY5Y成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞的影響。在用XH1處理后48小時(shí)通過MTT試驗(yàn)和/或LDH釋放試驗(yàn)評價(jià)細(xì)胞存活率。數(shù)據(jù)報(bào)告為平均細(xì)胞存活率(相對于未處理培養(yǎng)物的百分比％)±標(biāo)準(zhǔn)偏差。分別對每個(gè)濃度的XH1進(jìn)行至少三次實(shí)驗(yàn)。
圖10表示SDS-PAGE凝膠表現(xiàn)出增加XH1濃度對APP表達(dá)的影響(圖10A)、和對用作對照的不同蛋白質(zhì)(β-微管蛋白(圖10A)、APLP1和APLP2(圖10B))表達(dá)的影響。在用XH1處理SH-SY5Y人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞后48小時(shí)測量蛋白質(zhì)合成。使用A8717作為APP的檢測抗體。
圖11表示在有或沒有Aβ1-40或HSA的存在下從使用對比成像劑(Gd-XH1或Gd-DTPA)培養(yǎng)的球形圖測量的T1-加權(quán)MRI信號。在A1-5中，Gd-XH1的濃度為0mM(A1)到0.5mM(A5)。在B1-5中，Gd-DTPA的濃度為0mM(B1)到1mM(B5)。C道中所有的球形圖都包含0.025mM的HSA，和濃度為0mM(C1)到0.25mM(C5)的Gd-XH1。D道中的球形圖包含0.5mM的HSA，和濃度為0mM(D1)到0.025mM(D5)的Aβ1-40。而E道中所有球形圖都包含1mM的Gd-XH1，和濃度為0mM(E1)到0.025mM(E5)的Aβ1-40。對比成像劑濃度增加產(chǎn)生更短的T1，從而產(chǎn)生更亮的信號。在這些實(shí)驗(yàn)中沒有觀察到信號飽和。
圖12所示為表示球形圖的MRI信號變量作為對比成像劑(Gd-XH1或Gd-DTPA)和蛋白質(zhì)(HSA或Aβ1-40)的函數(shù)的兩個(gè)圖。在圖12A中，報(bào)告了兩種對比成像劑Gd-XH1和Gd-DTPA的R1(即1/T1)的百分增長作為Aβ1-40濃度的函數(shù)。在圖12B中，報(bào)告了在有或沒有HSA(0.025mM)存在下，不同濃度的Gd-XH1的R1。
圖13為表示作為從包含Gd-DTPA(0.25mM)或Gd-XH1(0.25mM)和不同濃度的Aβ1-42的球形圖計(jì)算的R1(即1/T1)的MRI信號變化的圖。
圖14表示MRI信號，其在當(dāng)AD小鼠和人腦組織提取物與Gd-XH1(0.025mM)混合時(shí)增強(qiáng)。
圖15表示MRI成像。第一組圖像(在圖15A中)為表示解剖特性的大鼠腦的基線圖像，第二組圖像(在圖15B中)表示在i.p.注射Gd-XH1之后約1小時(shí)測量的MRI信號的增加百分?jǐn)?shù)。
定義在整個(gè)說明書中，使用若干術(shù)語，其在下文中定義。
術(shù)語“淀粉樣病變”和“淀粉樣物質(zhì)相關(guān)狀況”在本文中可互換地使用。它們是指影響人或其它哺乳動(dòng)物的任何病理生理學(xué)狀況，其特征在于淀粉樣物質(zhì)在身體的任何器官或組織中的細(xì)胞外積聚。淀粉樣病變與多種醫(yī)學(xué)病癥有關(guān)，但也可作為原發(fā)性疾病發(fā)生。
如本文中使用的，術(shù)語“淀粉樣物質(zhì)”是指淀粉樣蛋白的聚集(如聚合)形式，所述積聚產(chǎn)生細(xì)胞外的淀粉樣沉積物。無論淀粉樣蛋白的組成性質(zhì)如何，所有的淀粉樣物質(zhì)共有某些性質(zhì)它們形成對剛果紅具有高親合性的不溶性β-褶狀折疊結(jié)構(gòu)，其偏振光產(chǎn)生雙折射，給出特征X射線衍射圖形，并且對蛋白酶不敏感。
如本文中使用的，術(shù)語“淀粉樣沉積物”是指由細(xì)胞外的淀粉樣物質(zhì)積聚產(chǎn)生的任何不溶性的四級結(jié)構(gòu)。淀粉樣沉積物可為小纖維、纖絲、蛋白斑、或纏結(jié)的形式。
術(shù)語“淀粉樣蛋白”和“淀粉樣蛋白肽”在本文中可可互換地使用。它們是指單體(即未聚集)形式的淀粉樣蛋白氨基酸序列。淀粉樣蛋白(和類淀粉樣蛋白)的例子包括但不限于淀粉樣蛋白免疫球蛋白輕鏈(AL，涉及漿細(xì)胞惡液質(zhì)，并在例如骨髓性白血病即骨髓癌患者中有發(fā)現(xiàn))；血清淀粉樣蛋白相關(guān)蛋白質(zhì)(AA或SAP，涉及慢性炎性狀況，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨髓炎)；β淀粉樣肽(Aβ，其涉及神經(jīng)退行性病癥如阿爾茨海默氏病、唐氏綜合癥、路易體癡呆、具有淀粉樣物質(zhì)的(荷蘭型)遺傳性腦出血、關(guān)島帕金森癡呆；和有可能在患有腦外傷的個(gè)體的腦中積聚)；改變型甲狀腺素運(yùn)載蛋白(ATTR，涉及家族性淀粉樣病變)；小島淀粉樣物質(zhì)多肽(islet amyloid-polypeptide，IAPP或Amylin，其在患有II型糖尿病的患者的胰腺中積聚)；和朊病毒蛋白(PrP，其涉及朊病毒疾病)。
術(shù)語“β淀粉樣肽”、“Aβ肽”、和“Aβ”在本文可互換地使用。它們在本領(lǐng)域還已知為β-蛋白、β-A4和A4。Aβ為小的、可溶性的、4.3kDa、39-43個(gè)氨基酸長度的肽，其序列以前被公開過(參見C.Hilbich等人，J.Mol.Biol.，1992，228460-473)。在本發(fā)明中，術(shù)語β淀粉樣肽包括Aβ1-43、以及Aβ1-42、Aβ1-41、Aβ1-40和Aβ1-39。術(shù)語“Aβ淀粉樣物質(zhì)”是指聚集狀態(tài)的β淀粉樣肽。在例如阿爾茨海默氏病患者的腦中、唐氏綜合癥的成人患者的腦中發(fā)現(xiàn)Aβ淀粉樣沉積物，并且在患有腦外傷的個(gè)人中偶有發(fā)現(xiàn)。
術(shù)語“結(jié)合親合性”和“親合性”在本文中可互換地使用，是指分子實(shí)體之間的吸引力水平。親合性可定量地表示為離解常數(shù)(Kd)、或其倒數(shù)，即締合常數(shù)(Ka)。在本發(fā)明的情況中，考慮兩種類型的親合性(1)淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分對淀粉樣沉積物的親合性、和(2)金屬螯合部分對過渡金屬離子或其它金屬實(shí)體的親合性。
術(shù)語“淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分”是指表現(xiàn)出對淀粉樣沉積物具有高親合性和特異性的任何實(shí)體。當(dāng)?shù)矸蹣游镔|(zhì)結(jié)合部分為分子的一部分時(shí)。其將自身的性質(zhì)賦予分子，使分子變?yōu)椤鞍邢虻摹?即其特異性地和有效地與淀粉樣沉積物相互作用并結(jié)合)。淀粉樣物質(zhì)和淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分的結(jié)合可為共價(jià)的或非共價(jià)的(如疏水性相互作用、靜電相互作用、偶極相互作用、范德華相互作用、氫鍵合等等)。最常見的結(jié)合為非共價(jià)形式。
在本文中用于化學(xué)部分、試劑、化合物、或分子的術(shù)語“金屬螯合”和“螯合”是指實(shí)體的特征為存在參與與過渡金屬離子或其它金屬實(shí)體形成復(fù)合體(包含超過一個(gè)配價(jià)鍵)的兩個(gè)或多個(gè)極性基團(tuán)的能力。金屬螯合劑在本領(lǐng)域中已知。金屬螯合劑的例子包括但不限于2，9-二甲基-4，7-二苯基-1，10-菲繞啉、乙二胺四乙酸、4，7-二苯基-1，10-菲繞啉、去鐵草酰胺、和氯碘羥喹。
在本發(fā)明的情況中，術(shù)語“雙官能分子”是指包括與至少一個(gè)淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分連接的至少一個(gè)金屬螯合部分并且因此表現(xiàn)出雙重選擇性的分子。更具體地，本發(fā)明的雙官能分子(1)以高的親合性與過渡金屬離子結(jié)合、并且(2)對淀粉樣沉積物表現(xiàn)出高的親合性和特異性。金屬螯合部分和淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分可通過共價(jià)或非共價(jià)鍵連接。優(yōu)選地，連接為共價(jià)連接。
如本文中使用的，術(shù)語“過渡金屬離子”是指本領(lǐng)域中已知作為過渡金屬的元素的離子形式。更具體地，在本發(fā)明的情況中，考慮三種生物學(xué)相關(guān)的過渡金屬離子，即“鋅II”、“銅II”、和“鐵III”，除非另作說明，其分別指Zn2+、Cu2+、和Fe3+。
如本文中使用的，術(shù)語“對比成像劑”是指可用于使用成像技術(shù)檢測特定的生物元素的任何實(shí)體。本發(fā)明的對比成像劑是包括與至少一個(gè)淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分連接的至少一個(gè)成像部分的靶向分子。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，對比成像劑的成像部分包括至少一個(gè)與金屬實(shí)體復(fù)合的金屬螯合劑。本發(fā)明的其它對比成像劑包括與至少一個(gè)淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分結(jié)合的至少一個(gè)金屬螯合部分，所述淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分由可通過NMR檢測到的穩(wěn)定的順磁性同位素標(biāo)記。本發(fā)明的對比成像劑可用于檢測體外、體內(nèi)、和回體(ex vivo)系統(tǒng)以及存活患者體內(nèi)的淀粉樣沉積物。
如本文中使用的，術(shù)語“金屬實(shí)體”是指可通過成像技術(shù)如磁共振成像(MRI)檢測到的順磁性金屬離子、或可通過成像技術(shù)如單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像(SPECT)和正電子發(fā)射層析成像(PET)檢測到的放射性核素。
如本文中使用的，術(shù)語“順磁性金屬離子”是指可復(fù)合于金屬螯合劑并可通過MRI檢測到的生理學(xué)可耐受的實(shí)體。優(yōu)選地，順磁性金屬離子選自釓III(Gd3+)、鉻III(Cr3+)、鏑III(Dy3+)、鐵III(Fe3+)、錳II(Mn2+)、和鐿III(Yb3+)。
如本文中使用的，術(shù)語“放射性核素”是指可復(fù)合于金屬螯合劑并用于放射性藥物技術(shù)中的金屬元素的放射性同位素。優(yōu)選的放射性核素為锝-99m(99mTc)、鎵-67(67Ga)、釔-91(91Y)、銦-111(111In)、錸-186(186Re)和鉈-201(201Tl)。
如本文中使用的，術(shù)語“穩(wěn)定的順磁性同位素”是指可通過核磁共振光譜法(MRS)檢測到的順磁性核。用于本發(fā)明的優(yōu)選的穩(wěn)定順磁性同位素是碳-13(13C)和氟-19(19F)。
在本發(fā)明的情況中，術(shù)語“氧化還原活性過渡金屬離子”是指可通過參與一系列涉及淀粉樣物質(zhì)和/或淀粉樣沉積物和氧(O2)的反應(yīng)被還原、并從而形成活性氧物質(zhì)的過渡金屬離子(例如Cu2+和Fe3+，可分別被還原為Cu+和Fe2+)。不能經(jīng)歷這種反應(yīng)的鋅II(Zn2+)，被稱為“氧化還原非活性過渡金屬離子”。
如本文中使用的，術(shù)語“活性氧物質(zhì)”是指衍生自氧并通常具有生物系統(tǒng)毒性或容易參加毒性副產(chǎn)物生成反應(yīng)的分子?；钚匝跷镔|(zhì)包括超氧化物自由基陰離子(O2·-)、羥基自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)、和單線態(tài)氧(1O2，1Δg)。
術(shù)語“淀粉樣物質(zhì)介導(dǎo)的”，當(dāng)用于活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生時(shí)，是指涉及單體或聚合形式的淀粉樣蛋白、氧化還原活性過渡金屬離子、和氧并形成活性氧物質(zhì)的一系列過程。
“氧化應(yīng)激”在本文中是描述系統(tǒng)直接或間接由淀粉樣物質(zhì)介導(dǎo)的活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生引起的損傷狀態(tài)的通用術(shù)語。當(dāng)系統(tǒng)的抗氧化防衛(wèi)機(jī)制不再能抑制產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)的有害作用時(shí)發(fā)生氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激首先可影響特定的生物分子(如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、和核酸)，最終誘導(dǎo)可以產(chǎn)生細(xì)胞突變、細(xì)胞死亡、和組織破壞的大量細(xì)胞損壞。
在本發(fā)明的情況中，術(shù)語“淀粉樣物質(zhì)毒性”是指當(dāng)以β-折疊構(gòu)造聚集時(shí)淀粉樣蛋白具有毒性的能力、和/或淀粉樣蛋白和/或淀粉樣沉積物產(chǎn)生對多種生物分子具有有害作用并可最終誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的活性氧物質(zhì)的能力。
術(shù)語“預(yù)防”在本文中是表征目的在于延遲或預(yù)防與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況發(fā)病的方法。術(shù)語“治療”在本文中是表征目的在于(1)延遲或預(yù)防與淀粉樣病變有關(guān)的狀況的發(fā)??；或(2)減慢或終止?fàn)顩r癥狀的進(jìn)展、惡化、或退化；或(3)改善狀況癥狀；或(4)治愈該狀況的方法。治療可在疾病發(fā)病之前進(jìn)行，作為預(yù)防處置或預(yù)防性措施。其也可在疾病開始之后進(jìn)行，用于治療作用。
術(shù)語“個(gè)體”或“患者”在本文中可互換地使用。它們是指可能受到與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況影響但可能患有或未患有這種疾病的人或其它哺乳動(dòng)物。
如本文中使用的，術(shù)語“系統(tǒng)”是指本領(lǐng)域中已知能夠產(chǎn)生和/或包含淀粉樣沉積物的生物實(shí)體。在本發(fā)明的情況中，考慮了體外、體內(nèi)、和回體系統(tǒng)；并且系統(tǒng)可為細(xì)胞、生物流體、生物組織、或動(dòng)物。系統(tǒng)可來源于例如活著的患者(如其可通過活組織檢查得到)、或得自死亡的患者(如其可通過尸體解剖得到)?；颊呖梢允侨嘶蚱渌溉閯?dòng)物。
如本文中使用的，術(shù)語“生物流體”是指由患者產(chǎn)生并得自患者的流體。生物流體的例子包括但不限于腦脊髓液(CSF)、血清、尿液、和血漿。在本發(fā)明中，生物流體包括通過例如超濾作用或色譜分離法純化分離的這種流體的全部級分或任何級分。
如本文中使用的，術(shù)語“生物組織”是指得自患者的組織。生物組織可為體內(nèi)的任何器官或系統(tǒng)的全部或其一部分(如腦、胰腺、心臟、腎、胃腸道、甲狀腺、神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚等)。
如本文中使用的，術(shù)語“有效量”是指足夠滿足其預(yù)定目的(如所述目的可為減慢或預(yù)防與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的發(fā)??；減慢或終止該狀況癥狀的進(jìn)展、惡化、或退化；引起狀況癥狀改善；或治愈該狀況。上述目的還可為預(yù)防、減慢、或終止系統(tǒng)或患者體內(nèi)淀粉樣物質(zhì)積聚；促進(jìn)、誘導(dǎo)、或幫助溶解系統(tǒng)或患者體內(nèi)存在的淀粉樣沉積物；或減少、抑制或干擾淀粉樣物質(zhì)介導(dǎo)的活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生)的任何量的本發(fā)明的雙官能分子、或其藥學(xué)組合物。
如本文中使用的，術(shù)語“成像有效量”是指足夠允許使用成像技術(shù)檢測系統(tǒng)或患者體內(nèi)存在的淀粉樣沉積物的任何量的本發(fā)明的對比成像劑或其藥學(xué)組合物。
如本文中使用的，“藥學(xué)組合物”定義為包括至少一種本發(fā)明的試劑(雙官能治療分子或靶向?qū)Ρ瘸上駝?或其生理學(xué)可耐受的鹽、和至少一種藥學(xué)可接受的載體。
術(shù)語“生理學(xué)可耐受的鹽”是指分別保留游離堿或游離酸的生物活性和性質(zhì)的任何酸加成鹽或堿加成鹽，并且其不是生物學(xué)不合需要的或其它方面不合需要的。酸加成鹽是與無機(jī)酸(如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等)；和有機(jī)酸(如乙酸、丙酸、丙酮酸、馬來酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、安息香酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸等等)形成的鹽。堿加成鹽是與無機(jī)堿形成的鹽(如鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂、鋅、鋁鹽等)和與有機(jī)堿形成的鹽(如伯、仲、叔胺、包括天然存在的取代胺的取代胺、環(huán)胺和堿離子交換樹脂的鹽，如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、三甲胺、二環(huán)己基胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡因、普魯卡因、hydrabamine、膽堿、甜菜堿、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可堿、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺樹脂等)形成的。
如本文中使用的，術(shù)語“藥學(xué)可接受的載體”是指不干擾活性成分的生物活性的有效性并在其給藥濃度下不對宿主產(chǎn)生過多毒性的載體介質(zhì)。該術(shù)語包括溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌藥和抗真菌藥、等滲劑、吸收延遲劑等等。這種介質(zhì)和試劑在藥學(xué)活性物質(zhì)中的使用在本領(lǐng)域中是公知的(參見例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，E.W.Martin，第十八版，1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA)。
另外的定義在整個(gè)詳細(xì)說明中提供。
某些優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的診斷、預(yù)防、和治療。具體地，本發(fā)明包括用于檢測淀粉樣沉積物的存在和用于預(yù)防或治療淀粉樣物質(zhì)相關(guān)狀況的試劑和對策。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明可用于腦中與淀粉樣蛋白和類淀粉樣蛋白的聚集和積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的診斷、預(yù)防、和治療。
I.雙官能治療分子本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一類新的靶向治療劑。
對正常衰老個(gè)體和阿爾茨海默患者腦中生物金屬作用的研究為開發(fā)更有效的治療設(shè)定了新的方向。使用金屬螯合分子調(diào)節(jié)過渡金屬離子的水平已經(jīng)在體外表現(xiàn)出能夠溶解淀粉樣沉積物和預(yù)防氧化性損傷。還發(fā)現(xiàn)金屬螯合劑顯著地降低轉(zhuǎn)基因小鼠腦中的淀粉樣蛋白負(fù)荷(R.A.Cherny等人，Neuron.，2001，30665-676)。這些結(jié)果非常有希望并顯示了這種方法用于治療淀粉樣物質(zhì)相關(guān)狀況的潛力。然而，大多數(shù)已知的金屬螯合劑為非特異性的并且可干擾其它需要金屬的生物分子的正常生理功能，從而產(chǎn)生對于臨床應(yīng)用來說太大的副作用。
本發(fā)明包括對靶向金屬螯合劑的以下鑒別能夠防止金屬離子干擾淀粉樣蛋白和淀粉樣沉積物而不干擾其它重要生物分子的作用；應(yīng)該表現(xiàn)出較少的不希望的副作用；并且比目前使用的、試驗(yàn)的、或建議作為用于治療淀粉樣物質(zhì)相關(guān)的病理生理學(xué)狀況的治療劑的大多數(shù)非特異性金屬螯合劑更有效。因此，本發(fā)明提供治療劑，其設(shè)計(jì)為用于(1)對淀粉樣物質(zhì)有某種程度的吸引力、和(2)作為金屬鰲合劑。更具體地，本發(fā)明提供雙官能分子，其包括與至少一個(gè)淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分結(jié)合的至少一個(gè)金屬螯合部分。
淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分是對淀粉樣沉積物具有某種程度的吸引力并且可以在當(dāng)其被包含在雙官能分子中時(shí)起到靶向作用的實(shí)體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分表現(xiàn)出對淀粉樣沉積物高的親合性和特異性，即它們特異性地和/或有效地與淀粉樣物質(zhì)相互作用、結(jié)合、或?qū)Φ矸蹣游镔|(zhì)標(biāo)記。優(yōu)選地，淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分是在體外和體內(nèi)條件下保留其結(jié)合性質(zhì)的穩(wěn)定的無毒性實(shí)體。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分對Aβ淀粉樣物質(zhì)具有高的親合性和特異性。更具體地，當(dāng)使用合成的Aβ肽或阿爾茨海默氏病腦組織(如實(shí)施例部分中所述)測定時(shí)，這些淀粉樣蛋白結(jié)合實(shí)體以0.1nM到10μM的離解常數(shù)(Kd)與Aβ結(jié)合。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分能夠透過血腦屏障。這種性質(zhì)對于當(dāng)雙官能分子用作用于治療以腦中聚集的淀粉樣蛋白和類淀粉樣物質(zhì)積聚為特征的神經(jīng)退行性病癥的治療劑時(shí)特別重要。
淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分與淀粉樣沉積物之間的相互作用可為共價(jià)的或非共價(jià)的。最經(jīng)常是，淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分與淀粉樣沉積物之間的相互作用為非共價(jià)的(見下文)。非共價(jià)相互作用的例子包括但不限于疏水性相互作用、靜電相互作用、偶極相互作用、范德華相互作用、和氫鍵。不管相互作用的性質(zhì)如何，淀粉樣沉積物與本發(fā)明雙官能分子內(nèi)的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分之間的結(jié)合應(yīng)該為選擇性的、特異性的、并且足夠強(qiáng)以使得金屬螯合部分發(fā)揮其作用(即預(yù)防、抑制、或反轉(zhuǎn)過渡金屬離子與淀粉樣蛋白和/或淀粉樣沉積物之間的相互作用)。
用于本發(fā)明中的適當(dāng)?shù)牡矸蹣游镔|(zhì)結(jié)合部分包括滿足要求上列條件的任何淀粉樣蛋白結(jié)合實(shí)體。實(shí)際上，淀粉樣沉積物的生物標(biāo)志物的開發(fā)作為研究目標(biāo)已經(jīng)多年了(W.E.Klunk，Neurobiol.Aging，1998，19145-147)，并且現(xiàn)有多個(gè)這種化合物。剛果紅(其化學(xué)結(jié)構(gòu)在圖1A中示出)用于體外對淀粉樣沉積物染色已經(jīng)有數(shù)十年了(M.Tubis等人，J.Am.Pharm.Assoc.，1960，49422-425；M.Tubis等人，Nukl.Med.，1962，325-38)。
已經(jīng)提出了幾種模型用于說明剛果紅對以β折疊構(gòu)造聚集的淀粉樣蛋白的特異性親合性(W.E.Klung等人，J.Histochem.Cytochem.，1989，371273-1281；W.E.Klunk等人，Neurol.Aging，1994，15691-698；D.B.Carter和K.-C.Chou，Neurol.Aging，1998，1937-40)。在所有提出的模型中，認(rèn)為剛果紅的陰離子型磺酸鹽基團(tuán)和淀粉樣蛋白肽上的堿性氨基酸如精氨酸和賴氨酸之間的化學(xué)計(jì)量的和飽和的靜電相互作用在優(yōu)先結(jié)合中起到重要作用。在一些提出的模型中，還假設(shè)所述相互作用中涉及剛果紅的聯(lián)苯部分與淀粉樣蛋白肽的苯丙氨酸部分之間的芳香族相互作用。
基于這些模型，推斷特異性結(jié)合于淀粉樣沉積物的分子傾向于是長的、共軛系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有在每個(gè)末端帶負(fù)電荷的基團(tuán)的多個(gè)苯環(huán)。使用這些標(biāo)準(zhǔn)，已經(jīng)設(shè)計(jì)、合成(N.A.Dezutter等人，Eur.J.Nucl.Med.，1999，261392-1399；D.M.Skovronsky等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，977609-7614))涉及剛果紅的雙偶氮聯(lián)苯胺(bisdiazobenzidine)化合物(參見例如美國專利4,933,156、5,008,099、和5,039,511)；柯胺-G(圖1B)及衍生物(參見例如美國專利6,114,175、6,133,259、和6,168,776)；(反，反)-1-溴-2，5-雙(3-羥基羰基-4-羥基)-苯乙烯基苯(BSB)(圖1C)和多種類似物，并放射性標(biāo)記和評價(jià)其在體外和體內(nèi)作為潛在的淀粉樣沉積物的探針(W.E.Klunk等人，Neurobiol.Aging，1994，15691-698，W.Zhen等人，J.Med.Chem.，1999，422805-2815N.A.Dezutter等人，J.Nucl.Med.，1999，261392-1399；D.M.Skovronsky等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，977609-7614)。發(fā)現(xiàn)所有的這些分子都對Aβ表現(xiàn)出高的親合性和特異性并因此適用于本發(fā)明中。然而，在這些生物標(biāo)志物的一些上的高極性官能團(tuán)的存在顯示出限制其進(jìn)入大腦，只有沒有極性官能團(tuán)的衍生物表現(xiàn)出高的大腦攝入。本發(fā)明的雙官能分子的設(shè)計(jì)將受其預(yù)定目的的限定，并且根據(jù)淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分的已知的、觀察到的或期望的性質(zhì)(例如，它們的血腦屏障透過性)選擇淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分。
當(dāng)選擇淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分設(shè)計(jì)雙官能治療分子時(shí)，還應(yīng)該將毒性作為一個(gè)因素考慮。例如，本領(lǐng)域中已知偶氮染料可能是致癌的(D.L.Morgan等人，Environ.Health Perspec.，1994，10263-78)。偶氮染料的潛在致癌性被認(rèn)為是由于其被大腸菌大量代謝降解為游離的(毒性的)母體胺產(chǎn)生的(C.E.Cerniglia等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1982，1071224-1229；C.E.Cerniglia等人，Carcinogen.，1982，31255-1260)。為了避免毒性的問題，期望避免偶氮染料如剛果紅、柯胺-G及其衍生物作為淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分、或選擇給藥途徑以使雙官能治療分子避開大腸菌。
還評價(jià)了較小分子與淀粉樣沉積物特異性結(jié)合的能力。這些包括但不限于anthracycline，即4′-碘代-4′-脫氧多柔比星(圖1D)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其強(qiáng)烈地結(jié)合于多種不同類型的淀粉樣蛋白和淀粉樣沉積物(G.Merlini等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，922959-2963)；噻唑染料如櫻草素、硫代黃素S、和硫代黃素T(其化學(xué)結(jié)構(gòu)在圖1E中)。已知這些噻唑染料使組織切片中的淀粉樣物質(zhì)染色并在體外有效地結(jié)合于合成的Aβ(G.Kelenyi，Histochem.Cytochem.，1967，15172-180；J.Burns等人，J.Pathol.Bacteriol.，1967，94337-344；R.Guntern等人，Experientia，1992，488-10；H.LeVine，Meth.Enzymol.，1999，309274-284)。有趣地是，最近表明，從硫代黃素T的雜環(huán)除去甲基，這樣去掉了正電荷，產(chǎn)生與Aβ具有高親合性以及在嚙齒類中具有良好的腦攝入的一系列親脂性染料(W.E.Klunk等人，Life Sci.，2001，691471-1484；Z.P.Zhuang等人，J.Med.Chem.，2001，441905-1914)。
在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分是已經(jīng)報(bào)導(dǎo)表現(xiàn)出對淀粉樣沉積物具有高親合性和能夠跨越血腦屏障的小分子的衍生物(D.M.Skovronsky等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，977609-7614)。實(shí)施例1和實(shí)施例9描述了兩類新的包括這種淀粉樣蛋白結(jié)合小分子中的至少一個(gè)的雙官能分子的合成。
優(yōu)選地，淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分包含可用于(或容易地化學(xué)轉(zhuǎn)化成可用的不同官能團(tuán))使淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分共價(jià)連接于金屬螯合部分的至少一個(gè)官能團(tuán)。適當(dāng)?shù)墓倌軋F(tuán)包括但不限于胺(優(yōu)選伯胺)、硫醇、羧基等等。
金屬螯合部分金屬螯合部分是可以以高親合性與過渡金屬離子結(jié)合的實(shí)體。優(yōu)選地，可通過金屬螯合部分復(fù)合的過渡金屬離子為生物金屬(即它們是生物學(xué)相關(guān)的過渡金屬離子)。最優(yōu)選地，金屬螯合部分以高親合性與在淀粉樣沉積物內(nèi)和周圍發(fā)現(xiàn)的高濃度的過渡金屬離子結(jié)合。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，金屬螯合部分以高親合性與選自鋅II(Zn2+)、銅II(Cu2+)、和鐵III(Fe3+)中的至少一種過渡金屬離子結(jié)合。優(yōu)選地，金屬螯合部分是在體外和體內(nèi)條件下保留其結(jié)合性質(zhì)的穩(wěn)定的無毒性實(shí)體。
在淀粉樣蛋白相關(guān)臨床狀況病理學(xué)的至少兩個(gè)方面涉及到過渡金屬離子的實(shí)驗(yàn)證據(jù)越來越多。研究表明(1)過渡金屬與淀粉樣蛋白之間的相互作用可通過加速淀粉樣蛋白肽聚集和積聚成為毒性的β折疊構(gòu)造而增強(qiáng)淀粉樣物質(zhì)毒性，和(2)氧化還原活性過渡金屬離子可以通過有利于產(chǎn)生活性氧物質(zhì)而增加淀粉樣物質(zhì)的毒性。
具體地，已經(jīng)表明β淀粉樣肽具有選擇性的高親合性和低親合性的Cu2+和Zn2+結(jié)合部位(A.I.Bush等人，J.Biol.Chem.，1994，26912152-12158)，并且Aβ與Cu2+、Zn2+、和Fe3+的相互作用已經(jīng)顯示了促進(jìn)肽的聚集和積聚(A.I.Bush等人，J.Biol.Chem.1994，2651464-1467)。在申請人的實(shí)驗(yàn)室中，金屬螯合劑在死亡后尸檢的人腦樣品中反轉(zhuǎn)合成Aβ肽的聚集、溶解淀粉樣物質(zhì)(C.S Atwood等人，J.Biol.Chem.，1998，27312817-12826；X.Huang等人，J.Biol.Chem.，1997，27226464-26470；R.A.Cherny等人，J.Biol.chem.1999，27423223-23228)和誘導(dǎo)對用于阿爾茨海默氏病的Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠模型腦中淀粉樣物質(zhì)負(fù)荷的顯著抑制(R.A.Cherny等人，Neuron.，2001，30665-676)導(dǎo)致了金屬螯合劑和金屬復(fù)合分子作為用于治療與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的潛在治療劑的提議(參見美國專利6,323,218)。
通過干擾過渡金屬離子與淀粉樣蛋白和/或淀粉樣沉積物之間的相互作用，金屬螯合劑可影響淀粉樣物質(zhì)毒性。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，適當(dāng)?shù)慕饘衮喜糠质强梢酝ㄟ^預(yù)防、減慢、或終止淀粉樣蛋白的聚集和積聚、和/或通過促進(jìn)、誘導(dǎo)、或幫助淀粉樣沉積物溶解而降低或抑制淀粉樣物質(zhì)毒性的實(shí)體。這可以在當(dāng)金屬螯合部分以高親合性結(jié)合于至少一個(gè)選自鋅II(Zn2+)、銅II(Cu2+)、和鐵III(Fe3+)的過渡金屬離子時(shí)實(shí)現(xiàn)。
有確鑿的證據(jù)表明，引起細(xì)胞損傷的氧化應(yīng)激對于在阿爾茨海墨氏病中觀察到的神經(jīng)退行性疾病是至關(guān)重要的(R.N.Martins等人，J.Neurochem.，1986，461042-1045)。在AD患者腦中持續(xù)觀察到蛋白質(zhì)以及核DNA和線粒體DNA的氧化增加(P.Gabbita等人，J.Neurochem.，1998，712034-2040；W.R.Markesbery，F(xiàn)ree Radic.Biol.Med.，1997，23134-147；M.P.Cuajungco等人，J.Biol.Chem.，2000，27519439-19442)。此外，β淀粉樣肽已經(jīng)顯示能夠增強(qiáng)神經(jīng)來源的細(xì)胞以及無細(xì)胞培養(yǎng)基中活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生(C.Behl等人，Cell，1994，77817-827；X.Huang等人，J.Biol.Chem.，1999，27437111-37116；X.Huang等人，Biochem.，1999，387609-7616)。當(dāng)Aβ結(jié)合Cu2+和/或Fe3+時(shí)觀察到發(fā)生大規(guī)模的氧化還原化學(xué)反應(yīng)，以催化的方式使兩種金屬的氧化態(tài)降低并從O2產(chǎn)生H2O2(X.Huang等人，Biochem.，1999，387609-7616)。因?yàn)樵谑蹵D-影響的腦中的淀粉樣沉積物中發(fā)現(xiàn)銅(400μM)、鋅(1mM)和鐵(1mM)水平升高(M.A.Lovell等人，J.Neurol.Sci.，1998，15847-52；M.A.Smith等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，949866-9868)，在阿爾茨海默氏病中觀察到的氧化應(yīng)激被認(rèn)為與通過Aβ的金屬結(jié)合形式產(chǎn)生活性氧物質(zhì)有關(guān)。這一假設(shè)得到了從AD腦分離的老年斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)能夠產(chǎn)生活性氧物質(zhì)、并且發(fā)現(xiàn)銅和鐵的存在是反應(yīng)發(fā)生所必需的(L.M.Sayre等人，J.Neurochem.，2000，74270-279)的觀察結(jié)果的支持。
氧化還原活性金屬如Cu2+和Fe3+可以參與導(dǎo)致活性氧物質(zhì)產(chǎn)生的反應(yīng)(W.R.Markesbery，F(xiàn)ree Rad.Biol.Med.，1997，23134-147)。這種反應(yīng)的一個(gè)系列如下所示。β淀粉樣肽以及Aβ淀粉樣物質(zhì)具有還原Cu2+(或Fe3+)的能力并同時(shí)從分子氧的表觀還原生成超氧化物自由基陰離子(O2·-)而形成過氧化氫(H2O2)。隨后發(fā)生類似Fenton的反應(yīng)，該反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基。
(a)如，或
(b)(c)如或除了上述的活性氧物質(zhì)之外，可以形成其它自由基，并且其它自由基也促進(jìn)淀粉樣病變的病理。這些包括但不限于淀粉樣蛋白肽和淀粉樣沉積物的自由基形式，和氧化氮陰離子，氧化氮陰離子可通過例如超氧化物自由基陰離子與一氧化氮的反應(yīng)產(chǎn)生。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面，適當(dāng)?shù)慕饘衮喜糠质强梢酝ㄟ^減少、抑制、或干擾生物金屬介導(dǎo)的和淀粉樣物質(zhì)介導(dǎo)的活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生而降低或抑制淀粉樣物質(zhì)毒性的實(shí)體，所述活性氧物質(zhì)包括超氧化物自由基陰離子(O2·-)、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(·OH)和單線態(tài)氧(1O2)。這可以在當(dāng)雙官能分子中的金屬螯合部分以高親合性結(jié)合于氧化還原活性過渡金屬離子中的至少一種時(shí)實(shí)現(xiàn)，所述氧化還原活性過渡金屬離子選自銅II(Cu2+)和鐵III(Fe3+)。
用于本發(fā)明中的適當(dāng)?shù)慕饘衮喜糠挚梢允且阎愿哂H合性與過渡金屬離子結(jié)合的多種金屬螯合劑和金屬復(fù)合分子中的任何一種。其包括但不限于芳香族胺如紅菲繞啉(4，7-二苯基-1，10-菲繞啉，其結(jié)構(gòu)在圖2A中)、2，9-二甲基-4，7-二苯基-1，10-菲繞啉(圖2B)、和TPEN(四(2-吡啶甲基)乙二胺，圖2I)；和脂肪族胺如去鐵草酰胺(圖2C)、青霉胺(2-氨基-3-巰基-3-甲基丁酸，圖2D)、EDTA(乙二胺四乙酸，圖2E)、EGTA(O，O′-雙(2-氨乙基)乙二醇-N，N′，N″，N_-四乙酸，圖2F)、DTPA(二亞乙基三胺五乙酸，圖2G)、和TETA(三亞乙基四胺，圖2H)；及其官能衍生物、同系物和類似物。
α-硫辛酸衍生物構(gòu)成了可用于本發(fā)明實(shí)踐中的金屬螯合劑的另一個(gè)種類。除了表現(xiàn)出金屬螯合性質(zhì)之外，α-硫辛酸衍生物還具有強(qiáng)大的抗氧化活性(綜述，參見例如H.Moini等人，Toxicol.Appl.Pharmacol.，2002，18284-90；或G.Biewenga等人，Gen.Pharmac.，1997，29315-331)。α-硫辛酸的抗氧化作用已經(jīng)在神經(jīng)元和非神經(jīng)元組織中表現(xiàn)出來(M.A.Lynch，Nutr.Neurosci.，2001，4419-438)。體外、動(dòng)物、和初步的對人的研究結(jié)果表明硫辛酸可在多種神經(jīng)退行性病癥中有效(L.Packer等人，F(xiàn)ree Radic.Biol.Med.，1997，22359-378)。具體地，α-硫辛酸已經(jīng)被證明在AD患者死后尸檢的人腦中有效降低神經(jīng)元淀粉樣物質(zhì)負(fù)荷(J.Fonte等人，J.Alzheimer Dis.，2001，3209-219)，和反轉(zhuǎn)老年小鼠中的記憶損傷和腦氧化應(yīng)激(S.A.Farr等人，J.Neurochem.，2003，831173-1183)。
預(yù)計(jì)α-硫辛酸衍生物(與其它金屬螯合劑相比)表現(xiàn)出的另外的性質(zhì)(如抗氧化)可以擴(kuò)大雙官能分子的作用范圍，因?yàn)棣?硫辛酸可以通過不同機(jī)制發(fā)揮其抗氧化作用，包括螯合金屬離子、清除活性氧物質(zhì)(ROS)或其它自由基、再生內(nèi)原性抗氧化劑(如維生素C、維生素E和谷胱甘肽)、和/或修復(fù)氧化性損傷。
本發(fā)明的雙官能分子的精確設(shè)計(jì)將受其預(yù)定目的影響并且根據(jù)金屬螯合部分的已知的、觀察到的或期望的性質(zhì)選擇金屬螯合部分。用于干擾淀粉樣蛋白聚集和促進(jìn)淀粉樣沉積物溶解的優(yōu)選的金屬螯合部分包括DTPA、2，9-二甲基-4，7-二苯基-1，10-菲繞啉、4，7-二苯基-1，10-菲繞啉、青霉胺，及其衍生物、同系物和類似物，或其任何的組合。用于干擾生物金屬介導(dǎo)的和淀粉樣物質(zhì)介導(dǎo)的活性氧物質(zhì)產(chǎn)生的優(yōu)選的金屬螯合部分包括2，9-二甲基-4，7-二苯基-1，10-菲繞啉、4，7-二苯基-1，10-菲繞啉、α-硫辛酸，及其衍生物、同系物和類似物，或其任何的組合。
已經(jīng)開發(fā)了包括與兩個(gè)相同的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分(苯并噻唑衍生物)共價(jià)結(jié)合的DTPA作為金屬螯合部分的第一類新的雙官能分子，其合成、性質(zhì)和應(yīng)用在實(shí)施例部分中描述(參見實(shí)施例1、4到6)。包括與一個(gè)淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分(選自與第一類中使用的那些相同的苯并噻唑衍生物)共價(jià)結(jié)合的α-硫辛酸作為金屬螯合部分的第二類雙官能分子的合成在實(shí)施例9中描述。
優(yōu)選地，金屬螯合部分含有至少一個(gè)可用于使金屬螯合部分共價(jià)連接于淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分的官能團(tuán)(或可以容易地化學(xué)轉(zhuǎn)化為可使用的不同官能團(tuán))。適當(dāng)?shù)墓倌軋F(tuán)包括但不限于胺(優(yōu)選伯胺)、硫醇、羧基等等。
雙官能分子的合成可通過本領(lǐng)域中已知的任何合成方法制備本發(fā)明的雙官能分子，唯一的必要條件是在反應(yīng)之后，淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分和金屬螯合部分分別保持其結(jié)合和螯合性質(zhì)。淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分可以以多種方式與金屬螯合部分結(jié)合。優(yōu)選地，淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分共價(jià)連接于金屬螯合部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分和金屬螯合部分可直接彼此連接或通過連接基團(tuán)彼此連接。
在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，金屬螯合部分和淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分直接地彼此共價(jià)連接。直接的共價(jià)結(jié)合可以通過酰胺鍵、酯鍵、碳-碳鍵、二硫鍵、氨基甲酸酯鍵、醚鍵、硫醚鍵、脲鍵、胺鍵、或碳酸酯鍵進(jìn)行?？赏ㄟ^利用淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分和金屬螯合部分上的官能團(tuán)實(shí)現(xiàn)共價(jià)結(jié)合?？捎糜趯蓚€(gè)部分連接在一起的適當(dāng)?shù)墓倌軋F(tuán)包括但不限于胺(優(yōu)選伯胺)、酸酐、羥基、羧基、和硫醇。例如如實(shí)施例1中所述，可通過淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分上的伯胺和金屬螯合部分上的酸酐官能團(tuán)之間的反應(yīng)形成酰胺鍵。也可通過使用活性劑如碳二亞胺使一個(gè)部分中的伯胺與另一個(gè)部分上的羧基結(jié)合。有多種活性劑在本領(lǐng)域中已知并適合于用于本發(fā)明中。
在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，金屬螯合部分和淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分可通過連接基團(tuán)彼此間接地共價(jià)連接。這可以通過使用本領(lǐng)域中公知的多種穩(wěn)定的雙功能試劑完成，包括同官能的和雜官能的連接基團(tuán)(參見例如Pierce Catalog and Handbook，1994)。使用雙官能連接基團(tuán)與使用活性劑的不同之處在于雙官能連接基團(tuán)在反應(yīng)之后在本發(fā)明的雙官能分子中得到連接部分，而活性劑使反應(yīng)中的兩個(gè)部分之間得到直接連接。雙官能連接基團(tuán)的主要作用是允許兩個(gè)否則為化學(xué)惰性的部分之間反應(yīng)。然而，還可以選擇變成反應(yīng)產(chǎn)物的一部分的雙官能連接基團(tuán)，使其賦予雙官能分子某種程度的構(gòu)型靈活性(如雙官能連接基團(tuán)包括含幾個(gè)原子的直鏈烷基鏈，例如含有2到10個(gè)碳原子的直鏈烷基鏈)。
在本發(fā)明的情況中可以使用多種本領(lǐng)域中已知的適當(dāng)?shù)耐倌艿暮碗s官能的連接基團(tuán)。優(yōu)選的連接基團(tuán)包括但不限于烷基和芳基，包括具有如氨基、酸酐、羥基、羧基、羰基等活性化學(xué)官能度的直鏈和支鏈烷基、取代烷基和芳基、雜烷基和雜芳基。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地理解，本發(fā)明的雙官能分子可以包括通過多種不同的方式彼此連接的多種淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分的和多種金屬螯合部分。本發(fā)明的雙官能分子內(nèi)的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分可以完全相同或不同。類似地，本發(fā)明的雙官能分子內(nèi)的金屬螯合部分可完全相同或不同。雙官能治療分子的精確設(shè)計(jì)將受其預(yù)定目的和其使用的具體情況中期望的性質(zhì)的影響。
II.靶向?qū)Ρ瘸上駝┍景l(fā)明的另一個(gè)方面涉及一類新的靶向?qū)Ρ瘸上駝?br> 以上已經(jīng)提及，目前淀粉樣病變的診斷包括活組織檢查或組織樣品的組織病理學(xué)。淀粉樣物質(zhì)的存在典型地通過在使用剛果紅染色之后在正交偏振光下檢測的蘋果綠雙折射測定。然而，受影響器官的活組織檢查不排除并發(fā)癥，并且不能令人滿意地顯示淀粉樣沉積物的程度或分布(C.Friman和T.Pettersson，Curr.Opin.Rheumatol.，1996，86-71)。在阿爾茨海默氏病的情況中，淀粉樣沉積物只能在死后評價(jià)。這構(gòu)成了對疾病進(jìn)行研究和開發(fā)更有效的治療方法的主要障礙。
用于診斷淀粉樣病變的理想探針應(yīng)為對淀粉樣物質(zhì)具有高的親合性和特異性；表現(xiàn)出低的毒性；并允許檢測、定位、和定量患者體內(nèi)存在的淀粉樣沉積物。對于與腦中淀粉樣蛋白(或類淀粉樣蛋白)的聚集和積聚有關(guān)的阿爾茨海默氏病和其它神經(jīng)退行性病癥的診斷，理想的探針還應(yīng)該可透過血腦屏障，并且允許非侵入性檢測、定位、和定量活著的患者腦中的淀粉樣沉積物。
本發(fā)明涉及滿足一些上列標(biāo)準(zhǔn)的靶向、可檢試驗(yàn)劑。因此，本發(fā)明提供了靶向?qū)Ρ瘸上駝?，其設(shè)計(jì)為用于(1)對淀粉樣物質(zhì)具有某種程度的吸引力、和(2)可通過成像技術(shù)檢測到。更具體地，本發(fā)明提供了包括與至少一個(gè)淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分連接的至少一個(gè)成像部分的對比成像劑。
淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分本發(fā)明的對比成像劑中的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分起到與在上述雙官能治療分子中的作用相同的作用；它們是對淀粉樣物質(zhì)表現(xiàn)出某種程度的吸引力的靶向?qū)嶓w，即，它們特異性地和/或有效地與淀粉樣沉積物相互作用、結(jié)合、或?qū)ζ錁?biāo)記。因此用于設(shè)計(jì)和開發(fā)對比成像劑的適當(dāng)?shù)牡矸蹣游镔|(zhì)結(jié)合部分與以上列舉的用于雙官能治療分子中的那些淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分相同。
在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的對比成像劑中的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分表現(xiàn)出對淀粉樣沉積物的高的親合性和特異性。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分對Aβ淀粉樣物質(zhì)具有高的親合性和特異性。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分能夠跨越血腦屏障，如上所述，這在當(dāng)對比成像劑預(yù)定用作在腦中定位淀粉樣沉積物的體內(nèi)生物標(biāo)志物時(shí)是一個(gè)重要的性質(zhì)。
上述的某些偶氮染料的潛在致癌性在淀粉樣蛋白成像研究中意義不大，因?yàn)樵谌魏螘r(shí)候只有非常微量的、微不足道量的高特異性淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分接觸大腸菌。
成像部分在本發(fā)明的情況中，成像部分是可通過成像技術(shù)如磁共振成像(MRI)、磁共振光譜分析(MRS)、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像(SPECT)和正電子發(fā)射層析成像(PET)檢測到的實(shí)體。優(yōu)選地，成像部分是在體外和體內(nèi)條件下保持其性質(zhì)的穩(wěn)定的無毒性實(shí)體。
MRI成像部分在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的對比成像劑設(shè)計(jì)為可通過磁共振成像檢測到。
MRI已經(jīng)發(fā)展為診斷臨床醫(yī)學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中最強(qiáng)大的非侵入性技術(shù)(P.Caravan等人，Chem.Rev.，1999，992293-2352；W.Khun，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1990，291-19；M.M.Huber等人，Bioconjug.Chem.，1998，9242-249；R.A.Moats等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1997，36726-728；X.Yu等人，Mag.Res.Med.，2000，44867-872)。MRI是用于化學(xué)、物理學(xué)和分子結(jié)構(gòu)生物學(xué)中最著名的分析方法-核磁共振(NMR)-的應(yīng)用。MRI可以在相對短的時(shí)間跨度內(nèi)產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)信息，并廣泛用作非侵入性診斷工具以識別可能有害的生理學(xué)異常、觀察血液流動(dòng)、或測定心血管系統(tǒng)的一般狀態(tài)(P.Caravan等人，Chem.Rev.，1999，992293-2352)。
MRI的優(yōu)點(diǎn)(優(yōu)于其它高質(zhì)量成像方法)在于不依靠可能有害的電離輻射(A.R.Johnson等人，Inorg.Chem.，2000，392652-2660)。在MRI中，通過檢測水濃度中的局部變化、和NMR信號與水質(zhì)子(1H)的T1(自旋點(diǎn)陣)和T2(自旋-自旋)張弛時(shí)間提供生物樣品或患者身體的對比成像。通常可通過使用對比成像劑改善MRI的清晰度。由于其順磁性性質(zhì)，這些成像劑通過利用其不成對電子促進(jìn)自旋移而縮短T1和T2張弛時(shí)間。這使得濃度依賴性對比度增加并因此增強(qiáng)了不同解剖結(jié)構(gòu)之間的差異。
因?yàn)閷?shí)體的順磁磁化率(由此其能夠縮短水分子附近的質(zhì)子核的T1和T2張弛時(shí)間的能力)隨不成對電子數(shù)的增加而增加(F.A.Cotton等人，“Basic Inorganic Chemistry”，John Wiley&Sons，New York，1995，第68頁)，用于MRI的理想的順磁性金屬離子原則上應(yīng)具有盡可能多的不成對電子。然而，這種順磁性金屬離子與水分子的復(fù)合體為高毒性的，因此不能用于體內(nèi)成像(W.Kuhn，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1990，291-19)。通過將順磁性金屬離子復(fù)合于配體或金屬螯合部分并只留下一個(gè)配位點(diǎn)對水分子開放，認(rèn)為已經(jīng)有力地降低了毒性。因此，大多數(shù)的MRI對比成像劑典型地包括螯合形式的順磁性金屬離子。
因此，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，優(yōu)選將MRI對比成像劑設(shè)計(jì)為使得成像部分包括與順磁性金屬離子復(fù)合的至少一個(gè)金屬螯合部分。
用于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)捻槾判越饘匐x子包括已知為生理學(xué)可接受的、在MRI中是良好的對比增強(qiáng)劑、并容易地結(jié)合到金屬螯合部分中的任何順磁性金屬離子。優(yōu)選地，順磁性金屬離子選擇釓III(Gd3+)、鉻III(Cr3+)、鏑III(Dy3+)、鐵III(Fe3+)、錳II(Mn2+)、和鐿III(Yb3+)。更優(yōu)選地，順磁性金屬離子為釓III(Gd3+)。釓為FDA批準(zhǔn)用于MRI的對比劑，其在異常組織中積聚，使這些異常區(qū)域在MRI上變得非常明亮(得到增強(qiáng))。已知釓在身體不同區(qū)域特別是在腦中正常組織和異常組織之間提供大的對比度。
用于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)慕饘衮喜糠职ㄔ诒绢I(lǐng)域中已知與可由MRI檢測到的順磁性金屬離子復(fù)合的任何實(shí)體。優(yōu)選地，金屬螯合部分是穩(wěn)定的、無毒性實(shí)體，其以高親合性結(jié)合順磁性金屬離子，留下一個(gè)配位點(diǎn)對水分子開放，并且一旦復(fù)合，這種高的親合性使得順磁性金屬離子不能被水置換。
已經(jīng)使用多種這種金屬螯合部分用于Gd3+的復(fù)合。這些包括DTPA(圖2G)；1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N′，N″，N_-四乙酸(DOTA，其化學(xué)結(jié)構(gòu)在圖3A中)；及其衍生物(參見例如美國專利4,885,363、5,087,440、5,155,215、5,188,816、5,219,553、5,262,532、和5,358,704、和D.Meyer等人的Invest.Radiol.，1990，25S53-55)。然而，這些配體的釓復(fù)合體在生理?xiàng)l件下是鹽，并且對非順磁性陽離子抗衡離子的需要增加了溶液的重量克分子滲透壓濃度。已經(jīng)使用DTPA-雙(酰胺)衍生物制備了保持高水溶性和松弛性(relaxativity)的中性的釓復(fù)合體(美國專利4,687,659)。
復(fù)合順磁性金屬離子的其它金屬螯合部分包括非環(huán)形的實(shí)體，如氨基多羧酸及其磷含氧酸類似物(如三亞乙基四胺六乙酸或TTHA，其化學(xué)結(jié)構(gòu)在圖3B中；和二磷酸二吡哆醛，DPDP在圖3C中)；和大環(huán)的實(shí)體(如1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N′，N″-三乙酸或DO3A，其化學(xué)結(jié)構(gòu)在圖3D中)。金屬螯合部分也可是美國專利5,410,043、5,277,895、和6,150,376、或F.H.Arnold的Biotechnol.，1991，9151-156中所述的任何實(shí)體。
在實(shí)施例2中描述了通過在本發(fā)明的治療雙官能分子中嵌入Gd3+開發(fā)的一類新的MRI對比成像劑的合成。本發(fā)明的MRI成像劑的性質(zhì)和應(yīng)用分別在實(shí)施例7和8中報(bào)導(dǎo)。
MRS成像部分在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的對比成像劑設(shè)計(jì)為用于磁共振光譜分析(MRS)中。更具體地，本發(fā)明還提供了對比成像劑，其包括與至少一個(gè)由穩(wěn)定的順磁性同位素標(biāo)記的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分連接的至少一個(gè)金屬螯合部分。優(yōu)選的穩(wěn)定的順磁性同位素是碳-13(13C)和氟-19(19F)。
放射性成像部分在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的對比成像劑設(shè)計(jì)為用于可通過單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像(SPECT)或正電子發(fā)射層析成像(PET)檢測到。
SPECT和PET為已經(jīng)用于檢測腫瘤、動(dòng)脈瘤(血管壁中的淺色斑)、不規(guī)則的或不充分的到各種組織的血液流動(dòng)、血細(xì)胞病癥、和器官如甲狀腺功能不足和肺機(jī)能不足的核醫(yī)學(xué)成像技術(shù)。兩種技術(shù)都獲得被引入生物樣品或患者身體中的放射性核素的濃度的信息。PET通過檢測短壽命的放射性物質(zhì)射出的輻射產(chǎn)生圖像，所述短壽命的放射性物質(zhì)通過用中子轟擊非放射性化學(xué)品以造成放射性同位素而形成。PET檢測其中放射性物質(zhì)與組織中的電子碰撞射出正電子的位置處放出的γ射線。PET分析產(chǎn)生在感興趣部位的身體的一系列薄片圖像(如腦、胸、肝)。這些薄片圖像可裝配成體現(xiàn)被檢組織的三維圖像。然而，只有少數(shù)的PET中心，因?yàn)樗鼈儽仨毼挥诋a(chǎn)生用于該技術(shù)的短壽命放射性同位素所需的粒子加速器裝置附近。SPECT類似于PET，但是用于SPECT的放射性物質(zhì)(如99mTC、123I、133Xe)具有比用于PET的那些更長的衰變時(shí)間，并且其發(fā)射的不是雙γ射線而是單γ射線。雖然SPECT圖像表現(xiàn)出比PET圖像更差的靈敏度和較少的細(xì)節(jié)，但SPECT技術(shù)表比PET具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)其不需要位于粒子加速器附近，并且比PET便宜得多。
因此，在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的對比成像劑設(shè)計(jì)為可通過單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像(SPECT)檢測到。優(yōu)選地，對比成像劑中的成像部分包括至少一個(gè)復(fù)合于可通過SPECT檢測到的金屬實(shí)體的金屬螯合部分。
用于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)慕饘賹?shí)體是本領(lǐng)域中已知為生理學(xué)可接受的、可通過SPECT檢測到的、并且容易被結(jié)合到金屬螯合部分中的放射性核素。優(yōu)選地，放射性核素選自锝-99m(99mTc)、鎵-67(67Ga)、釔-91(91Y)、銦-111(111In)、錸-186(186Re)、和鉈-201(201Tl)。最優(yōu)選地，放射性核素為锝-99m(99mTc)。在目前進(jìn)行的常規(guī)核醫(yī)學(xué)過程中，超過85％使用基于99mTc的方法。
用于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)慕饘衮喜糠职ㄒ阎獜?fù)合于可通過SPECT檢測到的短壽命放射性核素的任何實(shí)體。優(yōu)選地，金屬螯合部分是以高親合性結(jié)合可由SPECT檢測到的放射性核素的穩(wěn)定的、無毒性實(shí)體。
復(fù)合放射性核素如99mTc的金屬螯合部分在本領(lǐng)域中是公知的(參見例如“Technetium and Rhenium in Chemistry and Nuclear Medicine”，M.Nicolini等人，編著，1995，SGEditorialiPadova，Italy)。適當(dāng)?shù)慕饘衮喜糠职ɡ鏝2S2和N3S螯合劑(A.R.Fritzberg等人，J.Nucl.Med.，1982，23592-598，其可以分別通過兩個(gè)氮原子和兩個(gè)硫原子、或通過三個(gè)氮原子和一個(gè)硫原子復(fù)合于放射性核素。半胱氨酸乙酯二聚物(ECD，其化學(xué)結(jié)構(gòu)在圖3C中)為本領(lǐng)域中公知的N2S2螯合劑。N2S2和N3S螯合劑在例如美國專利4,444,690、4,670,545、4,673,562、4,897,255、4,965,392、4,980,147、4,988,496、5,021,556和5,075,099中描述。
其它適當(dāng)?shù)慕饘衮喜糠挚蛇x自多磷酸鹽(如亞乙基二氨基四亞甲基四亞磷酸，EDTMP，其化學(xué)結(jié)構(gòu)在圖3D中)；氨基羧酸(如EDTA、N-(2-羥基)乙二胺-三乙酸、次氮基三乙酸、N，N-二(2-羥乙基)甘氨酸、亞乙基雙(羥基苯基甘氨酸)和二亞乙基三胺五乙酸；1，3-二酮(如乙酰丙酮、三氟乙酰丙酮、和噻吩甲酰三氟丙酮)；羥基羧酸(如酒石酸、檸檬酸、葡糖酸、和5-磺酰基水楊酸；多胺(如乙二胺、二亞乙基三胺、三亞乙基四胺、和三氨乙基胺)；氨基醇(如三乙醇胺、和N-(2-羥乙基)乙二胺)；芳香族雜環(huán)堿(如2，2′-二咪唑、甲基吡啶胺、二甲基吡啶胺和1，10-菲咯啉)；酚(如水楊醛、二磺?；彵蕉?、和變色酸)；氨基酚(如8-羥基喹啉和肟磺酸(oximesulfonic acid))；肟(如六甲基亞丙基胺肟，HMPAO，在圖3E中)；席夫堿(如二水楊醛-1，2-亞丙基二亞胺)；四吡咯(如四苯基卟吩和酞菁)；硫化合物(如甲苯二硫醇、內(nèi)消旋-2，3-二巰基丁二酸、二巰基丙醇、巰基乙酸、乙基黃原酸鉀、二乙基二硫代氨基甲酸鈉、雙硫腙、二硫代磷酸二乙酯、和硫脲)；合成的大環(huán)化合物(如二苯并[18]冠醚-6)，或兩種或多種上述試劑的組合。
優(yōu)選的金屬螯合部分選自多羧酸如EDTA、DTPA、DOTA、DO3A；及其衍生物、同系物、和類似物；或其組合。
其它適當(dāng)?shù)慕饘衮喜糠衷诿绹鴮＠?,559,214和WO 95/26754、WO 94/09056、WO 94/29333、WO 94/08624、WO 94/08629、WO94/13327、和WO 94/12216中描述。
優(yōu)選地，金屬螯合部分含有至少一個(gè)可用于(或容易地化學(xué)轉(zhuǎn)化成可用的不同官能團(tuán))使金屬螯合部分共價(jià)連接于淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分的官能團(tuán)。適當(dāng)?shù)墓倌軋F(tuán)包括但不限于胺(優(yōu)選伯胺)、硫醇、羧基等等。
對比成像劑的合成上述制備本發(fā)明的雙官能分子分的方法可用于合成對比成像劑。
可通過本領(lǐng)域中已知的任何方法制備包括至少一個(gè)與金屬實(shí)體復(fù)合的金屬螯合部分的成像部分。可在金屬螯合部分和淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分之間形成直接或間接的共價(jià)結(jié)合之前、過程中、或之后進(jìn)行復(fù)合。優(yōu)選地，使用本發(fā)明的雙官能分子作為初始物質(zhì)進(jìn)行復(fù)合(參見實(shí)施例2和3)。當(dāng)金屬實(shí)體是短壽命放射性核素時(shí)，優(yōu)選復(fù)合在使用對比成像劑之前不久進(jìn)行。
適當(dāng)?shù)膹?fù)合方法包括例如將金屬實(shí)體直接結(jié)合到金屬螯合部分中和金屬轉(zhuǎn)移作用。當(dāng)可能時(shí)，優(yōu)選直接結(jié)合。在該方法中，通常將金屬螯合部分的水溶液與金屬鹽接觸或混合。反應(yīng)混合物的pH可為約4到約11。優(yōu)選地，pH為5到9。更優(yōu)選地，反應(yīng)在pH為6到8下進(jìn)行。直接結(jié)合的方法在本領(lǐng)域中是公知的，并且已經(jīng)描述了不同的過程(參見例如WO 87/06229)。當(dāng)需要在結(jié)合之前將金屬實(shí)體還原為不同的氧化狀態(tài)時(shí)使用金屬轉(zhuǎn)移作用。金屬轉(zhuǎn)移作用的方法在本領(lǐng)域是公知的。實(shí)施例3說明了這種反應(yīng)，其中通過使用SnCl2將金屬離子還原為Tc(V)將99mTc結(jié)合到雙官能分子中。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，對比成像劑可包括通過多種不同方式彼此連接的多個(gè)淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分和多個(gè)成像部分。對比成像劑內(nèi)的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分可完全相同或不同。類似地，對比成像劑內(nèi)的成像部分可完全相同或不同。對比成像劑的設(shè)計(jì)將受其預(yù)定目的和在其所用的具體情況中所需的性質(zhì)影響。
III.雙官能治療分子的應(yīng)用本發(fā)明的另一方面涉及用于降低或抑制淀粉樣物質(zhì)毒性的系統(tǒng)。因此，本發(fā)明提供了用于降低或抑制淀粉樣蛋白(和類淀粉樣蛋白)當(dāng)以β-折疊構(gòu)型聚集時(shí)對其環(huán)境產(chǎn)生的毒性能力的試劑和對策。本發(fā)明還提供了用于降低或抑制淀粉樣物質(zhì)介導(dǎo)的對多種生物分子具有有害影響并可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的活性氧物質(zhì)產(chǎn)生的試劑和對策。
更具體地，本發(fā)明提供了起到金屬螯合劑作用的靶向試劑和使用它們用于降低或抑制體外、體內(nèi)和回體系統(tǒng)以及活著的患者中的淀粉樣物質(zhì)毒性的方法。本文提供的方法包括使用本發(fā)明的雙官能分子，其通過有效地螯合過渡金屬離子并表現(xiàn)出對淀粉樣沉積物的高的親合性和特異性而顯示出雙重選擇性。
在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使得可通過預(yù)防、減慢、或終止淀粉樣物質(zhì)在系統(tǒng)或患者中積聚，和/或通過促進(jìn)、誘導(dǎo)、或幫助已經(jīng)存在于系統(tǒng)或患者中的淀粉樣沉積物溶解而降低淀粉樣物質(zhì)毒性。這可以在當(dāng)雙官能分子中的金屬螯合部分以高親合性結(jié)合于至少一種過渡金屬離子時(shí)實(shí)現(xiàn)，所述過渡金屬離子選自鋅II(Zn2+)、銅II(Cu2+)、和鐵III(Fe3+)。
在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明使得可通過減少、抑制、或干擾淀粉樣物質(zhì)介導(dǎo)的活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生而降低或抑制淀粉樣物質(zhì)毒性。這可以在當(dāng)雙官能分子中的金屬螯合部分以高親合性結(jié)合于至少一個(gè)選自銅II(Cu2+)和鐵III(Fe3+)的氧化還原活性過渡金屬離子時(shí)實(shí)現(xiàn)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，涉及使用具有金屬螯合部分(其結(jié)合高親合性的Cu2+和/或Fe3+)的雙官能分子的方法可降低或抑制由聚集的淀粉樣蛋白產(chǎn)生的毒性和由活性氧物質(zhì)生成(因?yàn)镃u2+和Fe3+是可以促進(jìn)淀粉樣蛋白聚集的過渡金屬離子和可以在活性氧物質(zhì)生成過程中涉及到的氧化還原活性生物金屬)所引起的毒性。
更具體地，本發(fā)明提供了降低或抑制系統(tǒng)中淀粉樣物質(zhì)毒性的方法，其包括使系統(tǒng)與有效量的本發(fā)明的雙官能分子或其藥物組合物接觸。
接觸可以體外、體內(nèi)、或回體方式進(jìn)行。例如，可通過培養(yǎng)進(jìn)行接觸。
系統(tǒng)可為任何已知能夠產(chǎn)生和/或含有淀粉樣沉積物的任何生物實(shí)體。例如，系統(tǒng)可為細(xì)胞、生物流體、生物組織、或動(dòng)物。當(dāng)系統(tǒng)為細(xì)胞、生物流體或生物組織時(shí)，其可來源于活著的患者(如其可以通過活組織檢查得到)或死亡的患者(如，其可以通過尸體解剖得到)?；颊呖梢允侨嘶蚱渌溉閯?dòng)物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞、生物流體、或生物組織來源于懷疑患有與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的患者。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞、生物流體、或生物組織來源于懷疑患有與β淀粉樣肽的積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的患者。在這種具體情況中，優(yōu)選雙官能分子中的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分表現(xiàn)出對Aβ淀粉樣物質(zhì)的高的親合性和特異性。
本發(fā)明還提供了用于預(yù)防或治療患者中與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的方法。本文所述的方法可用于(1)延遲或預(yù)防疾病的發(fā)作；或(2)減慢或終止疾病的進(jìn)展、加重、或惡化；或(3)反轉(zhuǎn)或改善疾病的癥狀和癥候；或(4)治愈疾病。該治療可在疾病發(fā)作之前給予，用于預(yù)防或預(yù)防性作用；或在疾病開始之后給予，用于治療作用。
更具體地，本發(fā)明提供了治療患有與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的患者的方法，其包括對患者給予有效量的本發(fā)明的雙官能分子或其藥學(xué)組合物。
雙官能分子或其藥學(xué)組合物的給藥可通過本領(lǐng)域中已知的任何方法進(jìn)行，例如通過口服和腸胃外給藥，包括靜脈內(nèi)給藥、肌內(nèi)和皮下注射給藥、和透皮給藥和腸給藥。
影響患者的病理生理學(xué)狀況可與任何淀粉樣蛋白或類淀粉樣蛋白的積聚有關(guān)，所述蛋白例如淀粉樣蛋白免疫球蛋白輕鏈(AL)；血清淀粉樣蛋白相關(guān)蛋白質(zhì)(AA或SAP)；β淀粉樣肽(Aβ)；改變型運(yùn)甲狀腺素蛋白(ATTR)；小島淀粉樣物質(zhì)多肽(IAPP或Amylin)；朊病毒蛋白質(zhì)(PrP)等等。聚集的淀粉樣蛋白或類淀粉樣蛋白的積聚可在身體的任何器官或組織中發(fā)生并在心、腦、胃腸系統(tǒng)、肝、脾、腎、胰腺、肺、關(guān)節(jié)、肌肉等中形成小纖維、纖絲、蛋白斑、和/或纏結(jié)。
病理生理學(xué)狀況可以是已知與淀粉樣病變有關(guān)的任何疾病和病癥。這些疾病和病癥包括但不限于II型糖尿病、進(jìn)行性核上麻痹、某種類型的內(nèi)分泌系統(tǒng)癌癥如甲狀腺骨髓癌、家族性淀粉樣病變(Finnish型)、家族性淀粉樣蛋白多發(fā)性神經(jīng)病(Portuguese型)、家族性淀粉樣蛋白多發(fā)性神經(jīng)病(Iowa型)、家族性淀粉樣蛋白心肌病(Danish型)、有蕁麻疹和耳聾的家族性淀粉樣蛋白腎病(Muckle-Wells′綜合癥)、遺傳性非神經(jīng)性系統(tǒng)性淀粉樣變(Ostertag型)、遺傳性腎淀粉樣病變、與淀粉樣蛋白有關(guān)的骨髓癌或macroglobulinernia相關(guān)的原發(fā)癥、系統(tǒng)性老年性淀粉樣病變、何杰金氏病、郎格罕氏島、孤立型心房淀粉樣蛋白(isolated atrial amyloid)、和家族性地中海熱。
在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法涉及對優(yōu)選在腦中與聚集和積聚的淀粉樣蛋白和類淀粉樣蛋白有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的預(yù)防和治療。這些病理生理學(xué)狀況包括例如朊病毒疾病，其可以影響人(如Creutzfeld-Jakob病、Gerstmann-Straussler-Scheinker綜合癥、FatalFamilial Insomnia、和庫魯病)以及其它哺乳動(dòng)物(如牛的牛海綿狀腦病、羊的癢病、貂的可傳染的腦病、和黑尾鹿和麇鹿的慢性消耗性疾病)；有時(shí)在患有腦外傷的個(gè)體的腦中觀察到的淀粉樣病變；和神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默氏病、路易體癡呆、具有淀粉樣病變(荷蘭型和冰島型)的遺傳性腦出血、關(guān)島帕金森癡呆、和影響成年唐氏綜合癥患者的阿爾茨海默氏病形式。在這些情況中，選擇本發(fā)明的雙官能分子中的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分，以使其能夠跨越血腦屏障。
IV.檢測方法另一方面，本發(fā)明可進(jìn)行與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的診斷。具體地，本發(fā)明可進(jìn)行神經(jīng)退行性疾病的非侵入性診斷的特征在于淀粉樣物質(zhì)在患者腦中的聚集和積聚。因此，本發(fā)明提供了檢測淀粉樣沉積物存在的試劑和對策。更具體地，本發(fā)明提供了可通過成像技術(shù)檢測到的靶向試劑和可在體外、體內(nèi)、和回體系統(tǒng)以及活著的患者中檢測、定位和定量淀粉樣沉積物的方法。本文提供的方法基于本發(fā)明的對比成像劑的使用，該對比成像劑包括與至少一個(gè)可通過成像技術(shù)檢測到的成像部分連接的至少一個(gè)對淀粉樣沉積物有高親合性和特異性的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分。或，本文提供的方法可涉及本發(fā)明的對比成像劑的使用，所述對比成像劑包括至少一個(gè)與至少一個(gè)由穩(wěn)定的順磁性同位素標(biāo)記的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分連接的金屬螯合部分。
更具體地，本發(fā)明提供了用于檢測系統(tǒng)中存在淀粉樣沉積物的方法，其包括使系統(tǒng)與成像有效量的本發(fā)明的對比成像劑或其藥學(xué)組合物接觸的步驟。優(yōu)選在可使對比成像劑與系統(tǒng)中存在的淀粉樣沉積物相互作用、使得相互作用導(dǎo)致對比成像劑與淀粉樣沉積物結(jié)合的條件下進(jìn)行接觸。然后使用成像技術(shù)檢測與系統(tǒng)中存在的淀粉樣沉積物相結(jié)合的對比成像劑，產(chǎn)生系統(tǒng)的至少一部分的一個(gè)或多個(gè)圖像。
接觸可以通過本領(lǐng)域中已知的任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行。例如，可以通過培養(yǎng)進(jìn)行接觸。
系統(tǒng)可以是已知能夠產(chǎn)生和/或含有淀粉樣沉積物的任何生物實(shí)體，例如，系統(tǒng)可為細(xì)胞、生物流體、生物組織、或動(dòng)物。當(dāng)系統(tǒng)是細(xì)胞、生物流體、或生物組織時(shí)，其可來源于活著的患者(如，其可通過活組織檢查得到)或死亡的患者(如，其可通過尸體解剖得到)。患者可以是人或其它哺乳動(dòng)物。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞、生物流體或生物組織來源于懷疑患有與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的患者。例如，細(xì)胞、生物流體或生物組織可來源于懷疑患有與β淀粉樣肽的積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的患者。在這種具體情況中，根據(jù)對Aβ淀粉樣物質(zhì)的高親合性和特異性選擇對比成像劑中的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞、生物流體、或生物組織與用于治療與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的潛在治療劑接觸(體外或回體)。
在本發(fā)明的一個(gè)方面中，上述方法用于識別潛在治療劑。例如，可在使細(xì)胞、生物流體或生物組織與用于治療與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的潛在治療劑接觸之前或之后形成細(xì)胞、生物流體或生物組織的至少一部分的圖像。對“之前”和“之后”的圖像的比較可測定試劑對系統(tǒng)中存在的淀粉樣沉積物的作用。本發(fā)明還包括通過這種方法鑒別的治療劑。
本發(fā)明還提供了用于檢測患者體內(nèi)存在的淀粉樣沉積物的方法。該方法包括對患者給予成像有效量的本發(fā)明的靶向?qū)Ρ瘸上駝┗蚱渌帉W(xué)組合物。優(yōu)選給藥在可使對比成像劑(1)達(dá)到患者身體可能含有淀粉樣沉積物的區(qū)域和(2)與任何淀粉樣沉積物相互作用以使相互作用導(dǎo)致對比成像劑與淀粉樣沉積物結(jié)合的條件下進(jìn)行。在給予對比成像劑之后并且在逝去的足夠時(shí)間內(nèi)用于發(fā)生相互作用(例如在30分鐘到48小時(shí)之后)，使用成像技術(shù)檢測存在于患者中的結(jié)合于淀粉樣沉積物的對比成像劑，并且形成患者身體的至少一部分的一個(gè)或多個(gè)圖像。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法用于定位患者中的淀粉樣沉積物。通過比較從懷疑患有與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的患者得到的結(jié)果與對得自臨床上健康個(gè)體的圖像，可以測定淀粉樣沉積物的存在和分布并且確診淀粉樣病變。例如，該方法可用于定位患者腦中的淀粉樣蛋白斑。在這種情況中，選擇對比成像劑中的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分，使其能夠跨越血腦屏障。具體地。該方法可用于檢測和定位懷疑患有阿爾茨海默氏病的患者腦中的淀粉樣蛋白斑。在這種情況中，對比成像劑中的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分對Aβ淀粉樣物質(zhì)具有高的親合性和特異性并且可透過血腦屏障。對于腦成像，測量結(jié)合的對比成像劑的量并與結(jié)合于患者小腦的對比成像劑的量相比(作為比值)。然后將該比值與年齡相當(dāng)?shù)呐R床健康的患者腦中的同一比值比較。
對比成像劑或其藥學(xué)組合物的給藥可以通過本領(lǐng)域中已知的任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行，例如通過口服和腸胃外的方法給藥，包括靜脈內(nèi)給藥、動(dòng)脈內(nèi)給藥、鞘內(nèi)給藥、皮內(nèi)給藥和腔內(nèi)給藥、和腸方法。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本文提供的用于檢測系統(tǒng)或患者中的淀粉樣沉積物存在的方法通過使用本發(fā)明的對比成像劑進(jìn)行，其中使金屬螯合部分復(fù)合于上述的順磁性金屬離子。然后通過磁共振成像(MRI)和產(chǎn)生MR圖像進(jìn)行淀粉樣沉積物的檢測。優(yōu)選地，順磁性金屬離子為釓III(Gd3+)。
在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，檢測方法通過使用本發(fā)明的對比成像劑進(jìn)行，其中使金屬螯合部分復(fù)合于上述放射性核素。然后通過單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像(SPECT)和產(chǎn)生SPECT圖像進(jìn)行淀粉樣沉積物的檢測。優(yōu)選地，放射性核素為锝-99m(99mTc)。
在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，檢測方法通過使用本發(fā)明的對比成像劑進(jìn)行，其中用上述的穩(wěn)定的順磁性同位素標(biāo)記淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分。然后通過磁共振光譜分析(MRS)和產(chǎn)生MR圖像進(jìn)行淀粉樣沉積物的檢測。優(yōu)選地，穩(wěn)定的順磁性同位素是碳-13(13C)或氟-19(19F)。
提供用于檢測在患者或系統(tǒng)中淀粉樣沉積物存在的本發(fā)明的方法可用于診斷與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況?？赏ㄟ^對患者身體的部分或全身進(jìn)行檢查和成像、或通過對得自患者的生物系統(tǒng)(如一個(gè)或多個(gè)生物流體或生物組織樣品)進(jìn)行檢查和成像實(shí)現(xiàn)診斷。這種方法或其它方法、或兩種方法的組合可根據(jù)懷疑影響患者的臨床狀況的性質(zhì)進(jìn)行選擇。得自患者的結(jié)果與得自臨床健康個(gè)體研究的數(shù)據(jù)的比較將決定和證實(shí)診斷。
這些方法也可用于跟蹤與淀粉樣病變有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的進(jìn)展。例如，這可以通過在一段時(shí)間內(nèi)重復(fù)該方法以建立患者中淀粉樣沉積物的存在、定位、分布、和定量的時(shí)間曲線而實(shí)現(xiàn)。
這些方法也可用于監(jiān)測患者對與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的治療的應(yīng)答。例如，在對患者進(jìn)行治療之前或之后，產(chǎn)生包含淀粉樣沉積物的身體的一部分的圖像(或來源于患者并包含淀粉樣沉積物的細(xì)胞、生物流體、或生物組織的一部分的圖像)?！爸啊焙汀爸蟆钡某上竦谋容^用于測定治療對淀粉樣沉積物的效果并從而監(jiān)測患者對具體治療的應(yīng)答。
可通過本文的方法診斷或跟蹤其進(jìn)展的病理生理學(xué)狀況可以與上述列舉的任何淀粉樣蛋白或類淀粉樣蛋白的積聚有關(guān)。聚集的淀粉樣蛋白或類淀粉樣蛋白可以在身體的任何器官或組織中積聚并形成小纖維、纖絲、蛋白斑、和/或纏結(jié)?？赏ㄟ^本文提供的方法為器官如心、腦、胃腸系統(tǒng)、肝、脾、腎、胰腺、肺、關(guān)節(jié)、肌肉等進(jìn)行檢查和成像。
可通過本文中提供的本發(fā)明的方法診斷或跟蹤其進(jìn)展的病理生理學(xué)狀況可以是已知與淀粉樣病變有關(guān)的任何疾病和病癥。例如，本發(fā)明的方法可用于診斷的狀況如II型糖尿病、進(jìn)行性核上麻痹、某種類型的內(nèi)分泌系統(tǒng)癌癥如甲狀腺骨髓癌、家族性淀粉樣病變(Finnish型)、家族性淀粉樣蛋白多發(fā)性神經(jīng)病(Portuguese型)、家族性淀粉樣蛋白多發(fā)性神經(jīng)病(Iowa型)、家族性淀粉樣蛋白心肌病(Danish型)、有蕁麻疹和耳聾的家族性淀粉樣蛋白腎病(Muckle-Wells′綜合癥)、遺傳性非神經(jīng)性系統(tǒng)性淀粉樣變(Ostertag型)、遺傳性腎淀粉樣病變、與淀粉樣蛋白有關(guān)的骨髓癌或macroglobulinernia相關(guān)的原發(fā)癥、系統(tǒng)性老年性淀粉樣病變、何杰金氏病、郎格罕氏島、孤立心房淀粉樣蛋白、和家族性地中海熱。
在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法涉及與特別在腦中聚集和積聚的淀粉樣蛋白和類淀粉樣蛋白有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的診斷。這些病理生理學(xué)狀況包括例如朊病毒疾病，其可以影響人(如Creutzfeld-Jakob病、Gerstmann-Straussler-Scheinker綜合癥、Fatal FamilialInsomnia、和庫魯病)以及其它哺乳動(dòng)物(如牛的牛海綿狀腦病、羊的癢病、貂的可傳染的腦病、和黑尾鹿和麋鹿的慢性消耗性疾病)；有時(shí)在患有腦外傷的個(gè)體腦中觀察到的淀粉樣病變；和神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默氏病、路易體癡呆、具有淀粉樣病變(荷蘭型和冰島型)的遺傳性腦出血、關(guān)島帕金森癡呆、和影響成年唐氏綜合癥患者的阿爾茨海默氏病形式。在這些情況中，選擇本發(fā)明的雙官能分子中的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分，以使其能夠跨越血腦屏障。
制劑、劑量和給藥雙官能治療分子本文描述的雙官能治療分子可本身直接給藥或以藥學(xué)組合物的形式給藥。因此，本發(fā)明提供包括有效量的至少一種雙官能分子或其生理學(xué)可耐受的鹽、和至少一種藥學(xué)可接受的載體的藥學(xué)組合物。具體的制劑取決于選擇的給藥途徑。雙官能治療分子或其藥學(xué)組合物可通過本領(lǐng)域中已知的任何適當(dāng)?shù)姆椒ńo藥。適當(dāng)?shù)耐緩降睦影诜湍c胃外給藥，包括靜脈內(nèi)給藥、肌內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、和皮下注射、經(jīng)皮給藥和腸給藥、等等。
可通過將本發(fā)明的雙官能分子與一種或多種藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑合并得到用于口服用藥學(xué)組合物。這種載體的應(yīng)用可使本發(fā)明的雙官能分子配制成例如片劑、膠囊劑、丸劑、糖衣劑、液體劑、凝膠劑、糖漿劑、淤漿劑(slurries)、和懸浮劑。用于口服用藥學(xué)可接受的載體和稀釋劑是本領(lǐng)域已知的(參見例如Remington′s PharmaceuticalSciences，1990)，期望包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、抗菌藥和抗真菌藥、等滲劑和吸收延遲劑等等。這種藥學(xué)組合物應(yīng)包含至少1重量％的活性化合物?？筛淖兘M合物的百分比，其可方便地為每單位約5重量％到約80重量％。可用于治療應(yīng)用的組合物中的活性化合物的量是將獲得適當(dāng)劑量的量。本發(fā)明的優(yōu)選組合物制備為包含約0.5μg到2000mg活性化合物的口服劑量單元形式。
口服制劑可選擇性地包含其它常規(guī)的、無毒的組分，如填料和粘合劑(例如，糖，如乳糖、蔗糖、甘露糖醇、和山梨糖醇；和纖維素制劑如淀粉、凝膠、甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、和聚乙烯吡咯烷酮)；賦形劑(例如磷酸二鈣)；崩解劑(如交聯(lián)的聚乙烯基吡咯烷酮、瓊脂、藻酸、和海藻酸鈉)；潤滑劑(如硬脂酸鎂)；和調(diào)味劑(如胡椒薄荷、冬青油、和櫻桃香料)。當(dāng)制劑形成膠囊時(shí)，其可包含除上述之外的液體或半液體介質(zhì)(如脂肪油、液體石蠟、和液體聚乙二醇)?？纱嬖诙喾N其它物質(zhì)作為包衣或用于改變劑量單元的外形。例如，片劑、丸劑、或膠囊劑可由蟲膠、糖、或兩者一起包衣。糖漿或酏劑可包含活性化合物、作為甜味劑的蔗糖、作為防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯、染料、和香料如櫻桃或橙口味的香料。用于制備口服用藥學(xué)組合物的任何物質(zhì)都應(yīng)是藥學(xué)純的并在使用量下是基本上無毒的。
也可將本發(fā)明的雙官能分子配制為用于注射的腸胃外給藥(如通過彈丸注射或連續(xù)輸注)，并且作為單位劑型存在(如在安瓿中或多劑量容器中存在)。用于注射的劑量單元形式對于容易給藥和劑量的均勻性特別有利。本文中使用的術(shù)語“劑量單元形式”是指適合作為待治療患者使用的單一劑量的物理離散形式單元。每個(gè)單元包含計(jì)劃產(chǎn)生期望的治療效果的預(yù)定量的活性物質(zhì)。劑量單元形式直接取決于活性化合物和期望的治療效果的特征。例如，單位劑型包含0.5μg到約2000mg的主要活性化合物?；蚩梢越o藥200ng/kg體重到超過10mg/kg體重的量。所述量可以是單個(gè)活性化合物的量或合并的活性化合物的總量。
腸胃外組合物可為活性雙官能分子的懸浮液、乳液、或水性和非水溶液，并且可選擇性地包含其它助劑，如助懸劑、穩(wěn)定劑、和/或分散劑。親脂性的溶劑或媒介物(如脂肪油、合成脂肪酸酯、和脂質(zhì)體)可用于制備懸浮液和乳液?？赏ㄟ^加入另外的物質(zhì)如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、和右旋糖酐增加水性腸胃外制劑的粘度。
或者，可將本發(fā)明的雙官能分子配制為可控制釋放活性成分?？刂漆尫沤M合物在本領(lǐng)域中是已知的(參見例如，Remington′sPharmaceutical Sciences，1990)，并且其可以是微膠囊、栓劑、或depot劑型?？赏ㄟ^將活性分子結(jié)合或截留在聚合物材料(諸如例如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯基吡咯烷酮、水凝膠、聚乳酸、乙烯-乙酸乙烯酯、甲基纖維素、羥甲基纖維素、和羧甲基纖維素)的粒子中、或膠質(zhì)的藥物遞送系統(tǒng)(諸如例如脂質(zhì)體、微球、微或大乳液、納米粒子、和納米膠囊)中得到這些藥學(xué)組合物。Depot制劑可通過植入或經(jīng)皮遞送、肌肉注射、或通過使用經(jīng)皮貼膏給藥(參見例如美國專利4,708,716和5,372,579中所述的裝置)。
本發(fā)明的雙官能治療分子或其藥學(xué)組合物可單獨(dú)給藥或與本發(fā)明的其它試劑組合、和/或與其它治療劑組合，其性質(zhì)部分地取決于要治療的疾病狀況。例如，在阿爾茨海默氏病的情況中，本發(fā)明的雙官能分子可與FDA批準(zhǔn)的治療劑如多奈哌齊(Aricept_)、他克林(Cognex_)、rivastigmine(Exelone_)、和velnacrine(Mentane_)組合給藥，所述治療劑是起到認(rèn)知增強(qiáng)劑作用并且已知為一些AD患者提供輕微緩解的乙酰膽堿酯酶抑制劑。確定適合于治療具體病癥的化合物的組合的能力在從業(yè)醫(yī)生的能力范圍內(nèi)。
可治療性地給予本發(fā)明的雙官能分子或其藥學(xué)組合物以治療與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的多種病理生理學(xué)狀況，(即在疾病發(fā)病之后)或事先預(yù)防這些病理生理學(xué)狀況。
本發(fā)明的雙官能分子或其藥學(xué)組合物的給藥應(yīng)劑量應(yīng)是遞送對于其預(yù)定目的有效的劑量。給藥途徑、制劑和劑量取決于患者的年齡、性別、體重和健康狀況；要治療的具體的病理生理學(xué)狀況(系統(tǒng)的或局部的、原發(fā)性或繼發(fā)性淀粉樣病變)；疾病程度；雙官能治療分子的效力、生物利用度、體內(nèi)半衰期和副作用的嚴(yán)重程度。這些因素可在治療過程中容易地測定。選擇性地或另外地，給藥劑量可以由使用用于治療的具體狀況的動(dòng)物模型研究測定，和/或從已知表現(xiàn)出類似藥理學(xué)活性的化合物的動(dòng)物或人的數(shù)據(jù)決定。對于每種治療需要的總劑量可通過多次劑量或單次劑量給藥?；谶@些或其它方法調(diào)節(jié)劑量以實(shí)現(xiàn)最大效力是本領(lǐng)域已知的，并且在從業(yè)醫(yī)生的能力范圍內(nèi)。
患有與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的適當(dāng)?shù)幕颊呖赏ㄟ^實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)和病史鑒別。具體地，可通過本文所述的涉及應(yīng)用靶向?qū)Ρ瘸上駝┖统上窦夹g(shù)的本發(fā)明的方法測定淀粉樣沉積物的存在、定位、分布、和定量。
靶向?qū)Ρ瘸上駝┍景l(fā)明還提供包括靶向?qū)Ρ瘸上駝┑乃帉W(xué)組合物。更具體地，本發(fā)明的藥學(xué)組合物包括成像有效量的至少一種上述對比成像劑或其生理學(xué)可耐受的鹽，和至少一種藥學(xué)可接受的載體。在某些優(yōu)選的藥學(xué)組合物中，對比成像劑的成像部分包括至少一個(gè)與順磁性金屬離子或放射性核素復(fù)合的金屬螯合部分。優(yōu)選地，順磁性金屬離子為釓III(Gd3+)；放射性核素為锝-99m(99mTc)。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，對比成像劑中的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分被穩(wěn)定的順磁性同位素標(biāo)記。優(yōu)選地，穩(wěn)定的順磁性同位素是碳-13(13C)或氟-19(19F)。
可通過本領(lǐng)域中已知的任何適當(dāng)方法進(jìn)行對比成像劑或其藥學(xué)組合物的給藥，如在Remington′s Pharmaceutical Sciences中所述的那些。根據(jù)懷疑影響患者的淀粉樣病變的具體類型和待檢身體位置，可將對比成像劑局部地或系統(tǒng)地給藥，口服遞送(作為固體、溶液、或懸浮液)或通過注射(例如靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)(即通過脊髓液)、皮內(nèi)、或腔內(nèi))遞送。
對于口服，可在上述雙官能治療分子的情況中所述配制本發(fā)明的對比成像劑。
對于注射給藥，可將對比成像劑的藥學(xué)組合物配制為無菌水溶液或非水溶液、或作為用于臨時(shí)制備無菌的可注射溶液的無菌粉末。這種藥學(xué)組合物在生產(chǎn)和儲(chǔ)存條件下應(yīng)是穩(wěn)定的，并且必須在避免微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用下保存。
藥學(xué)可接受的載體是溶劑或分散介質(zhì)，如水溶液(如Hank′s溶液、醇/水溶液、或鹽水溶液)、和非水載體(如丙二醇、聚乙二醇、植物油、和可注射的有機(jī)酯如油酸乙酯)?？勺⑸涞乃帉W(xué)組合物也可包含腸胃外介質(zhì)(如氯化鈉和Ringer′s葡萄糖)、和/或靜脈內(nèi)介質(zhì)(如流體和營養(yǎng)補(bǔ)充劑)；以及其它常規(guī)的、藥學(xué)可接受的、無毒的賦形劑和添加劑，包括鹽、緩沖劑、和防腐劑如抗菌藥和抗真菌藥(如parabens、氯代丁醇、酚、山梨酸、thirmerosal等等)?？赏ㄟ^加入可以延遲吸收的試劑(如單硬脂酸鋁和凝膠)引起可注射組合物的吸收延長。不同組分的pH和濃度可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地測定。
無菌的可注射溶液通過將活性化合物引入到具有上列多種其它組分的需要量的適當(dāng)溶劑中，然后通過例如過濾或輻照滅菌制備。在用于制備無菌的可注射溶液的無菌粉末的情況中，優(yōu)選的制備方法為真空干燥和凍干技術(shù)。
通常，可檢測到的對比成像劑的劑量根據(jù)以下考慮因素的改變而改變，如患者的年齡、性別、和體重，以及懷疑影響患者的具體病理生理學(xué)狀況、疾病程度和待檢身體區(qū)域。還要考慮的因素如禁忌癥、伴隨治療和其它變量，以調(diào)整待給藥的可檢測對比成像劑的劑量。然而，這可以通過從業(yè)醫(yī)生容易地實(shí)現(xiàn)。
通常，本發(fā)明的藥學(xué)組合物的適當(dāng)?shù)娜談┝肯喈?dāng)于足夠檢測患者體內(nèi)存在的所有淀粉樣沉積物的對比成像劑的最低量。為了使該劑量最小化，優(yōu)選給藥為靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、或皮下，并且優(yōu)選鄰近待檢部位。例如，靜脈內(nèi)給藥適合于尿路成像、脊柱內(nèi)給藥更適合于腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的成像；而未進(jìn)食患者的口服適合于胃腸道成像。
優(yōu)選本發(fā)明的放射性對比成像劑以0.1到約10m居里/kg體重每天的范圍給藥。優(yōu)選本發(fā)明的順磁性對比成像劑以每天0.02到1.3毫摩爾/kg體重的范圍給藥。
實(shí)施例以下實(shí)施例描述完成和實(shí)踐本發(fā)明的某些優(yōu)選方式。然而，應(yīng)該理解，這些實(shí)施例只是用于說明性的目的，并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1一類與淀粉樣物質(zhì)結(jié)合的金屬螯合劑的合成已經(jīng)設(shè)計(jì)了一類新的雙官能分子并正在開發(fā)。新的雙官能分子包括直接共價(jià)連接于兩個(gè)相同的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分的一個(gè)金屬螯合部分。該類所有的雙官能分子共有的金屬螯合部分是本領(lǐng)域中公知的金屬螯合劑二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)。如圖4A所示，該類的母體分子的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分為硫代黃素衍生物，其屬于經(jīng)報(bào)導(dǎo)為在嚙齒動(dòng)物中可透過血腦屏障并表現(xiàn)出對Aβ淀粉樣物質(zhì)具有高親合性(W.E.Klunk等人，Life Sci.，2001，691471-1484)的硫代黃素類似物類。
該類的其它成員為其中苯并噻唑部分的芳環(huán)被一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)取代的母體雙官能分子的類似物，所述官能團(tuán)包括例如4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙?；?、5-羧基、5-磺酰氧基(sulfonoxyl)、5-溴、4-，5-或6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-，5-或6-甲磺酰基、和4-，5-或6-羥基(參見圖4B)。
用于以下報(bào)告的合成中的所有試劑和溶劑得自AldrichChemical(St.Louis，MO)、Acros Organics(Pittsburg，PA)、或LancasterSynthesis Inc.(Windham，NH)，為可能得到的最高純度級別，其不經(jīng)純化直接使用。
在本文中描述了該類母體雙官能分子(化合物XH1)的合成。如以下圖解所示，XH1的制備涉及在金屬螯合部分與淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分之間形成酰胺鍵。該反應(yīng)根據(jù)以前發(fā)表的合成方法而改編的方法進(jìn)行(W.E.Klunk等人，Life Sci.，2001，691471-1484；D.Shi等人，J.Med.Chem.，1996，393375-3384‘和M.S.Konings等人，Inorg.Chem.，1990，291488-1491)。
步驟(a)的合成得到硫代黃素類似物，2-(4′-氨基苯基)苯并噻唑(化合物III)，其通過4-硝基苯甲酰氯(化合物II)和2-氨基苯硫酚(化合物I)之間直接偶聯(lián)的產(chǎn)物的還原制備。在步驟(b)的合成中，DTPA-雙(酸酐)(化合物IV)與過量的硫代黃素類似物反應(yīng)形成所需的化合物XH1。
更具體地，在室溫下攪拌無水苯(200mL)中的化合物I(10g，80mmol)和化合物II(15g，80mmol)16小時(shí)。然后用乙酸乙酯萃取，蒸發(fā)溶劑并通過急驟層析純化殘余物(己烷∶乙酸乙酯85∶15，v∶v)，得到15g(73％)的2-(4′-硝基苯基)-苯并噻唑，為淺黃色固體。然后在氮?dú)庀聦⒁掖贾性撝虚g體(10g，40mmol)和氯化錫(II)二水合物(20g，90mmol)的混合物回流4小時(shí)。通過蒸發(fā)除去乙醇，并將殘余物溶解于乙酸乙酯(200mL)中。用1M NaOH(3×200mL)和水(3×200mL)洗得到的溶液。蒸發(fā)溶劑，得到10g(97％)的2-(4′-氨基苯基)-苯并噻唑。
然后在30分鐘內(nèi)將DTPA-雙(酸酐)(2.5g，7.0mmol)分批加入到冰冷卻的化合物III(8.85g，7.8mmol)的乙醇溶液中。加入水(150mL)之后，再在環(huán)境溫度下攪拌得到的反應(yīng)混合物12小時(shí)。通過減壓濃縮反應(yīng)混合物并加入水(500mL)，得到的溶液用HCl調(diào)節(jié)到pH 2.5，以誘導(dǎo)形成晶體。在收集之后，晶體從乙醇重結(jié)晶，得到純的XH1(收率71％)。
通過LC/MS和1H-NMR表征得到的母體雙官能分子。使用在250MHz下操作的Bruker AVANT儀器記錄質(zhì)子-NMR光譜?；瘜W(xué)位移單位為ppm，使用DMSO作為參考。通過M-Scan Inc.(West Chester，PA)通過FAB-MS進(jìn)行反相LC/MS分析。在SymmetryTMC18，3.5μM，2.1×50mm的柱(Waters Corporation，Milord，MA)上進(jìn)行LC-MS色譜法，流速為1mL/min，以10分鐘、梯度為15-85％乙腈/水，并且具有0.1％恒定濃度的甲酸。XH1的質(zhì)譜和1H-NMR光譜在圖5中。
上述合成路線可用于和適合于制備該類的其它雙官能分子。
實(shí)施例2一類MRI對比成像劑的合成可從實(shí)施例1中描述的雙官能分子制備可通過磁共振成像(MRI)檢測到的對比成像劑。如在以下母體化合物的情況中所示，MRI對比成像劑Gd-XH1的合成涉及將釓III(Gd3+)嵌入到XH1中。該反應(yīng)根據(jù)以前報(bào)導(dǎo)的方法進(jìn)行(M.S.Konings等人，Inorg.Chem.，1990，291488-1491)。
更具體地，將水(30mL)中的XH1(12.1g，25.0mmol)和氧化釓Gd2O3(4.53g，12.4mmol)的混合物回流5小時(shí)。通過用1M NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH到6.5，定量形成釓復(fù)合體的無色晶體。
實(shí)施例3一類SPECT對比成像劑的合成類似地，可從實(shí)施例1中描述的雙官能分子制備可通過單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像(SPECT)檢測到的對比成像劑。在以下所示母體雙官能分子的情況中，通過使用美國專利4,434,151中所述的在pH 6.5條件下的亞錫還原方法嵌入锝-99m進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)定量地得到锝復(fù)合體，即化合物99mTc-XH1。
更具體地，將XH1(8.25g，0.17mmol)溶解于1.0mL的乙醇和pH為5.5的1.0M乙酸鈉中，并向反應(yīng)混合物中加入99mTcO4-(5-50mCi)在鹽水中的1.0mL發(fā)生劑洗提液。通過使每毫升乙醇溶解2.0mgSnCl2·H2O得到的0.2mL的亞錫溶液的加入產(chǎn)生锝復(fù)合體、15-30分鐘之后，可通過電泳測定標(biāo)記效率。
實(shí)施例4用于試驗(yàn)雙官能分子生物活性的無細(xì)胞試驗(yàn)在下文中，描述可用于檢測本發(fā)明的雙官能分子的生物活性的多種無細(xì)胞試驗(yàn)。更具體地，第一系列的試驗(yàn)用于評價(jià)感興趣的雙官能分子降低、抑制、或干擾氧化還原活性過渡金屬離子與β淀粉樣肽結(jié)合從而導(dǎo)致Aβ聚集的能力。第二系列的試驗(yàn)用于評價(jià)感興趣的雙官能分子抑制淀粉樣物質(zhì)介導(dǎo)的氧化還原活性過渡金屬離子的還原的能力。第三系列的試驗(yàn)用于評價(jià)本發(fā)明的雙官能分子對金屬介導(dǎo)的和淀粉樣物質(zhì)介導(dǎo)的活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生的抑制作用，活性氧物質(zhì)如H2O2、O2·-、和·OH。本節(jié)中描述的最后的試驗(yàn)用于評價(jià)雙官能分子溶解金屬誘導(dǎo)的Aβ聚集物的能力。
對金屬-β淀粉樣肽結(jié)合的抑制已知氧化還原活性過渡金屬離子與淀粉樣蛋白的結(jié)合(1)促進(jìn)蛋白質(zhì)的聚集和積聚、(2)還原過渡金屬離子、和(3)產(chǎn)生活性氧物質(zhì)如過氧化氫(H2O2)、超氧化物自由基陰離子(O2·-)和羥基自由基(·OH)。在本發(fā)明的雙官能分子的存在下，這三個(gè)過程的效率應(yīng)至少被降低，最好被完全抑制。以下的無細(xì)胞試驗(yàn)可通過評價(jià)它們對這三種次發(fā)過程的作用來評價(jià)本發(fā)明的雙官能分子對氧化還原活性過渡金屬離子與淀粉樣蛋白β肽結(jié)合的效果。
(a)Aβ肽的合成通過固相Fmoc化學(xué)在W.M.Keck Foundation BiotechnologyResource Laboratory(Yale University，New Haven，CT)；Glabe Laboratory(University of California，Irvine，CA)；或Multhaup Laboratory(Universityof Heidelberg，Germany)合成人Aβ肽(Aβ1-40和Aβ1-42)，或直接購自U.S.Peptide，Inc.(Rancho Cucamonga，CA)；或Aldrich-Sigma(St.Louis，MO)。合成物通過反相HPLC純化、氨基酸排序、和質(zhì)譜學(xué)證實(shí)。將合成的Aβ肽溶解于三氟乙醇(30％的Milli-Q水(MilliporeCorporation，Milord，MA)溶液)或20mM HEPES(pH 8.5)中，為0.5-1.0g/mL的濃度，在10,000xg下離心20分鐘，并將上層清液(Aβ備用液)用于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天的隨后分析。
通過214nm的紫外光譜學(xué)或通過Micro BCA蛋白質(zhì)分析(Pierce，Rockford，IL)測定Aβ備用液的濃度。通過向140μL的蒸餾水加入10μL的Aβ備用液(或牛血清清蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)液)、然后向96孔板中加入等量的Micro BCA Protein Assay Reagent(150μL)并測量562nm的吸光度進(jìn)行Micro BCA分析。使用BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線測定Aβ的濃度。在使用之前，所有的緩沖液和金屬離子(如氯化物鹽)的備用液通過0.22μm過濾器(Gelan Sciences，Ann Arbor，MI)過濾，以除去任何粒狀物質(zhì)。
可使用兩種不同的方法研究XH1對Zn2+誘導(dǎo)的Aβ聚集的反轉(zhuǎn)性濁度和免疫過濾。
(b)通過濁度測量的對金屬誘導(dǎo)的聚集的抑制如前所述(X.Huang等人，J.Biol.Chem.，1997，27226464-26470)進(jìn)行濁度測定。在有或沒有25μM化合物XH1(母體雙官能分子)的存在下將Aβ1-40(10μM)與Zn2+(25μM)在67mM磷酸鹽緩沖液、150mM NaCI(pH7.4)中共同培養(yǎng)1小時(shí)，并以1分鐘為間隔進(jìn)行濁度測定。隨后，將20μL等分試樣量的10mM待測雙官能分子或10mMZn2+加入到混合物中，在2分鐘之后，以1分鐘間隔再取得4個(gè)讀數(shù)。在最終加入雙官能分子并讀取濁度之后，再在讀取最后一個(gè)讀數(shù)之前將混合物培養(yǎng)30分鐘。為了對照，使用二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)代替化合物XH1進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)(DTPA是公知的金屬螯合劑也是包含在XH1中的金屬螯合部分)。
圖8中所示的這些試驗(yàn)的結(jié)果表明，DTPA和本發(fā)明的母體雙官能分子都顯著地降低溶液中Zn2+誘導(dǎo)的Aβ1-40的聚集，觀察到DTPA有最強(qiáng)的效果。
(c)通過免疫過濾測量的對金屬誘導(dǎo)的Aβ聚集的抑制在用于評價(jià)本發(fā)明的雙官能分子對金屬誘導(dǎo)的Aβ聚集的效果的第二種方法中，將生理學(xué)濃度的Aβ(8nM)加入到包含150mM NaCI、20mM HEPES(pH7.4)、100nM BSA、并具有ZnCl2(0、0.1、0.2、0.5和2M)的混合物中，并在有或沒有待測雙官能分子(1-5μM)的存在下培養(yǎng)(30分鐘，37℃)，然后將反應(yīng)混合物(200μL)置于96孔Easy-TiterELISA系統(tǒng)(Pierce，Rockford，IL)中并通過0.22μm醋酸纖維素過濾器(MSI，Westboro，MA)過濾。將聚集的粒子固定在膜上(0.1％戊二醛，15分鐘)，充分洗滌，然后用抗-Aβ單克隆抗體6E10(Senetek，MarylandLeights，MI)探測。洗滌印跡并在ECL化學(xué)發(fā)光試劑(AmershamBiosciences Corp.，Piscataway，NJ)的存在下暴露于膜。然后通過從免疫印跡的ECL膜的透光度定量分析免疫反應(yīng)性。
對淀粉樣物質(zhì)介導(dǎo)的氧化還原活性過渡金屬離子的還原的抑制可根據(jù)對已有方案(J.W.Landers等人，Amer.Clin.Path.，1958，29590-592)的改進(jìn)使用96孔微量滴定板(Corning Costar，Acton，MA)進(jìn)行金屬還原試驗(yàn)。在有或沒有本發(fā)明的待測待測雙官能分子(200μM)的存在下在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，pH為7.4，中將Aβ肽(10μM)或維生素C(100μM)、金屬離子(10μM，F(xiàn)e(NO3)3或Cu(NO3)2))和被還原的金屬離子指示劑(紅菲繞啉二磺酸，BP，用于Fe2+，200μM，Aldrich-Sigma，或浴銅靈二磺酸，BC，用于Cu+，200μM，Aldrich-Sigma)在37℃共同培養(yǎng)1小時(shí)。通過將購自the National Institute of Standardsand Technology(NIST)的金屬離子的含水備用液直接在緩沖液中稀釋制備金屬離子溶液。然后使用96孔板閱讀器(SPECTRAmax 250，Molecular Devices，CA)分別在536nm(Fe2+-BP復(fù)合體)和483nm(Cu+-BC復(fù)合體)下測量吸光度。還測量了對照樣品的吸光度，以評價(jià)光散射作用并測定在這些波長下的背景緩沖液信號。通過在有各自的指示劑和雙官能分子存在的肽和金屬產(chǎn)生的吸光度中減去這些對照吸光度得到536nm或483nm的凈吸光度(ΔA)。
根據(jù)式[Fe2+]或[Cu+]＝(ΔAx106)/(εxι)，其中ι為儀器的說明書手冊中所述的300μL容積孔的測量后的相同垂直長度(Fe2+為0.856cm，Cu+為1.049cm)，ε是已知的復(fù)合體的摩爾吸光度，即Fe2+-BP為7124M-1cm-1，Cu+-BC為2762M-1cm-1。
對金屬介導(dǎo)的和淀粉樣物質(zhì)介導(dǎo)的活性氧物質(zhì)產(chǎn)生的抑制H2O2試驗(yàn)可根據(jù)從現(xiàn)有方案(J.C.Han等人，Anal.Biochem.，1996，234107-109；和J.C.Han等人，Biochem.，1994，2205-10)改編的方法在UV透明的96孔微量滴定板(Molecular Devices，CA)中進(jìn)行H2O2分析。在有或沒有本發(fā)明的待測雙官能分子(1-5μM)的存在下、在PBS緩沖液(300mL，pH 7.4)中將Aβ肽(Aβ1-40或Aβ1-42；10μM)或維生素C(10μM)、Fe3+或Cu2+(1μM)，和H2O2截留劑(三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP，Pierce，50μM)在37℃共同培養(yǎng)1小時(shí)。在相同條件下，用過氧化氫酶(Aldrich-Sigma，100U/mL)代替肽，用作表示沒有H2O2的對照信號。在培養(yǎng)之后，通過5，5-二硫-雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB，Aldrich-Sigma)檢測未反應(yīng)的TCEP，其產(chǎn)生2摩爾的顯色產(chǎn)物2-(硝基-5-硫代苯甲酸)(NTB)。該反應(yīng)如下
然后殘留的TCEP與DTNB反應(yīng)
根據(jù)下式定量H2O2的產(chǎn)生量H2O2(μM)＝(ΔA*×106)/(2×ι×ε)，其中ΔA*為在412nm下的樣品和只有過氧化氫酶對照之間的絕對吸光度差；ι＝0.875cm，為得自板閱讀器制造商的說明書的相等垂直長度；ε為NTB的摩爾吸光度(在412nm下為14，150M-1cm-1)。TCEP為強(qiáng)還原劑，其可以主動(dòng)與包含二硫鍵的多肽反應(yīng)。然而，該反應(yīng)不能在Aβ上發(fā)生，因?yàn)锳β沒有這種化學(xué)鍵。
用于O2·-檢測的試驗(yàn)可以通過在有或沒有本發(fā)明的待測雙官能分子(1-5μM)的存在下、在PBS(pH 7.4)中在37℃培養(yǎng)一小時(shí)之后測量(使用96孔板閱讀器)Aβ肽(Aβ1-42或Aβ1-40，10M，300μL每孔)的吸光度來評價(jià)O2·-的產(chǎn)生。相應(yīng)的空白為單獨(dú)的PBS的信號。在該試驗(yàn)中沒有得到通過肽產(chǎn)生的信號的絕對基線，因?yàn)槔野彼岬奈辗?Aβ的殘基10)接近O2·-的吸收峰值(254nm)。然而，通過與過氧化物歧化酶(100U/mL)的共同培養(yǎng)引起的吸光度的降低幫助確定大部分吸光度信號是由于O2·-的存在。
用于檢測·OH的硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)(TBARS)試驗(yàn)在根據(jù)已有方案(J.M.Gutteridge等人，Biochim.Biophys.Acta，1983，75938-41)改造的96孔微量滴定板中進(jìn)行與Fe3+或Cu2+的培養(yǎng)混合物的硫代巴比妥酸活性物質(zhì)(TBARS)試驗(yàn)。在有或沒有本發(fā)明的待測雙官能分子的存在下將β淀粉樣肽(Aβ1-42或Aβ1-40；10μM)或維生素C(100μM)與Fe3+或Cu2+(1μM)和脫氧核糖(7.5mM，Aldrich-Sigma)在PBS(pH7.4)中培養(yǎng)。在培養(yǎng)(37℃，1小時(shí))之后，加入冰醋酸和2-硫代巴比妥酸(1％，w/v的0.05M NaOH中，Aldrich-Sigma)并加熱(100℃，10分鐘)。將最終的混合物置于冰上1-3分鐘，然后在532nm下測量吸光度。通過減去由除了維生素C或Aβ肽之外的相同化學(xué)組分構(gòu)成的對照樣品的吸光度得到每個(gè)樣品的凈吸光度改變。
對金屬誘導(dǎo)的Aβ聚集物的再溶解作用為了評價(jià)本發(fā)明的雙官能分子再溶解金屬誘導(dǎo)的Aβ聚集物的能力，首先通過加入ZnCl2(25μM)或CuCl2(5μM)誘導(dǎo)Aβ(Aβ1-40或Aβ1-42；10ng/孔，在PBS中)聚集。然后通過過濾將聚集物轉(zhuǎn)移到0.22μm尼龍膜上。然后用單獨(dú)的PBS或包含2μM的本發(fā)明的待測雙官能分子的PBS或包含2μM的氯碘羥喹作為對照洗滌聚集物(200μL/孔)。將膜固定，用抗Aβ單克隆抗體6E10探測，并且通過暴露ECL-膜顯影。通過ECL膜的光密度分析測定相對信號強(qiáng)度，根據(jù)已知量的肽進(jìn)行校正。各個(gè)值表示為在用單獨(dú)的PBS洗滌后保留在過濾器上的Aβ信號的百分比。
實(shí)施例5檢測雙官能分子的基于細(xì)胞的試驗(yàn)雙官能分子的神經(jīng)毒性(a)E17大鼠皮層原代神經(jīng)元使用原代神經(jīng)元培養(yǎng)物檢測母體雙官能分子XH1的神經(jīng)毒性。如G.J.Brewer和C.W.Cotman(在Brain Res.，1989，49465-74)中所述，E17大鼠皮層原代神經(jīng)元得自妊娠之后17天的無病原體的雌性Sprague-Dawley大鼠(購自Taconic Farms，MA)。使用的方案允許在精確定義的培養(yǎng)條件下以低密度長期培養(yǎng)神經(jīng)元。該方案提供最大為90％的神經(jīng)元培養(yǎng)物。最好使少數(shù)的膠質(zhì)細(xì)胞與大鼠皮層原代神經(jīng)元共同培養(yǎng)，因?yàn)檫@些細(xì)胞有助于神經(jīng)元的存活。阿糖胞苷(1μM)用于控制培養(yǎng)物制備中膠質(zhì)細(xì)胞的增長。使用神經(jīng)元特異性的烯醇酶(和/或星形神經(jīng)膠質(zhì)特異性的S100β)免疫組織化學(xué)有規(guī)律地檢查神經(jīng)元群。
使E17大鼠皮層原代神經(jīng)元在95％O2、5％CO2、85％濕度條件下，在37℃下，在具有B-27添加劑(Life Technologies，Inc.)、20μM L-谷氨酸鹽、100單位/mL青霉素、0.1g/mL鏈霉素、和2mM L-谷氨酰胺的不含血清的NeurobasalTM介質(zhì)中生長4天。在第5天(處理日)，將介質(zhì)替換為不含血清的NeurobasalTM加上L-谷氨酰胺，沒有B-27添加劑。然后在XH1(0、1或10μM)的存在下培養(yǎng)細(xì)胞并在用XH1處理后48小時(shí)分析細(xì)胞存活率。使用購自Roche(Nutley，NJ)的試劑盒進(jìn)行LDH釋放試驗(yàn)和MTT試驗(yàn)，以分別評價(jià)壞死細(xì)胞的死亡并測定細(xì)胞代謝活動(dòng)。
這些分析的結(jié)果在圖9A中報(bào)告，是使用三組實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)的平均值。結(jié)果表明，XH1在E17大鼠皮層原代神經(jīng)元中的低的大分子濃度沒有誘導(dǎo)任何顯著的細(xì)胞死亡。
(b)人SH-SYSY成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞還在人SH-SYSY成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞上試驗(yàn)了XH1的神經(jīng)毒性。SH-SYSY細(xì)胞系通常用于研究神經(jīng)生成、分化、和腫瘤形成(D.Vu等人，Brain Res.Mol.Brain Res.，2003，11593-103)。SH-SYSY細(xì)胞得自American Type Culture Collection并在補(bǔ)充有10％胎牛血清(Gibco-BRL)和抗生素的Dulbecco氏改進(jìn)伊格爾培養(yǎng)基中生長。
在XH1(0、1、5或10μM)的存在下培養(yǎng)(95％O2，5％CO2，85％濕度，37℃)人SH-SYSY成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞并在處理48小時(shí)后使用上述LDH釋放試驗(yàn)評價(jià)細(xì)胞的存活率。在圖9B中報(bào)導(dǎo)的這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，XH1在人SH-SYSY成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞的低的大分子的濃度沒有引起任何顯著的細(xì)胞死亡。
雙官能分子對金屬介導(dǎo)的APP蛋白表達(dá)的效果若干事實(shí)暗示在淀粉樣蛋白前體(APP)的水平增加與阿爾茨海默氏病發(fā)展之間有直接聯(lián)系。APP已經(jīng)與AD有關(guān)，因?yàn)槠渫ㄟ^蛋白酶剪切處理進(jìn)入β-肽中，β-肽積聚成為淀粉樣蛋白斑，并且因?yàn)锳PP基因突變可以引起AD的早期發(fā)病。然而，即使在家族性AD突變的存在下，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因小鼠中APP的過度表達(dá)是引起淀粉樣纖絲沉積和阿爾茨海默狀病理的發(fā)展的足夠Aβ肽所必需的?，F(xiàn)在有若干報(bào)告支持翻譯的調(diào)節(jié)機(jī)制對控制APP合成和可能的Aβ肽分泌物在生物學(xué)相關(guān)的狀況中的重要作用(van Leeuwen等人，Science，1998，279242-247)。
可以通過進(jìn)行不同的實(shí)驗(yàn)評價(jià)XH1及其類似物降低或抑制APP合成和隨后發(fā)生的Aβ產(chǎn)生的能力。
(a)APP蛋白合成的測定在SH-SYSY人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞中，通過SDS-PAGE測量XH1抑制APP合成的能力。對照蛋白質(zhì)(β-微管蛋白和/或兩種淀粉樣蛋白前體狀蛋白APLP1和APLP2)用于保證本發(fā)明的雙官能分子的靶向抑制特異性。
SDS-PAGE收獲SH-SYSY人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞并用冷的PBS洗三次，然后混合有蛋白酶抑制劑雞尾酒(Roche)的M-PERTM哺乳動(dòng)物蛋白萃取試劑(Pierce)進(jìn)行細(xì)胞溶解。將細(xì)胞溶解產(chǎn)物在冷藏室中以13,000rpm渦流15分鐘，并且BCA分析上層清液的總蛋白濃度。在具有相等的蛋白質(zhì)負(fù)荷(15μg/孔)的預(yù)制的NuPAGETM4-12％Bis-TrisGel(Invitrogen)上進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。其在200V進(jìn)行45分鐘并在75mA/凝膠轉(zhuǎn)運(yùn)95分鐘。根據(jù)制造商的說明書通過原代和二代抗體探測印跡并最后以15分鐘間隔洗滌2-3小時(shí)。然后使用化學(xué)發(fā)光的試劑盒(Pierce)使印跡顯影。
這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖10中報(bào)告。如圖10中所示，XH1濃度增加使APP合成減少，而在同樣的條件下，對β-微管蛋白表達(dá)無作用。類似地，如圖10B所示，XH1的存在(最大為10μM的濃度)不影響APLP1或APLP2合成。這些數(shù)據(jù)證明XH1的靶向抑制特異性。
成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞的代謝標(biāo)記可以在每次處理之前將細(xì)胞以相同數(shù)目平皿接種到8微量滴定孔(96孔皿中每孔1×105細(xì)胞)之后測定原代成神經(jīng)細(xì)胞瘤中的胞內(nèi)APP蛋白合成。在XH1、DPTA的存在下處理細(xì)胞48小時(shí)，或未處理。計(jì)數(shù)隨機(jī)孔中的細(xì)胞，以保證在每個(gè)實(shí)驗(yàn)開始時(shí)每個(gè)孔都存在1×105細(xì)胞。在不含甲硫氨酸的介質(zhì)中預(yù)培養(yǎng)成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞15分鐘并在不含甲硫氨酸的介質(zhì)(RPMI1640，GIBCO)中用300μCi/mL[35S]-甲硫氨酸脈沖標(biāo)記30分鐘。在用25mLSTEN緩沖液和無菌玻璃棒(STEN緩沖液是0.2％NP-40、2mM EDTA，50mM Tris，pH7.6)使成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞溶解之前在冷的PBS(4℃)中洗滌每個(gè)微量滴定板兩次。向細(xì)胞溶解緩沖液中加入20mM PMSF、5mg/mL亮肽素以防止蛋白質(zhì)水解。將每個(gè)孔的緩沖液合并為300uL的總體積。使用對抗APP的羧基末端產(chǎn)生的抗血清(對抗APP-695的676-695氨基酸殘基產(chǎn)生的C-8抗體的1∶500稀釋物)使每種合并的溶解液的一半免疫沉積。每種溶解液的殘余部分用人鐵蛋白抗血清(1∶500稀釋物，Boehringer)免疫沉積。
在所有的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，通過將抗體標(biāo)記的抗原復(fù)合體結(jié)合于A蛋sepharoseTM小珠收集免疫沉積的蛋白質(zhì)。將免疫沉積的樣品施用于10-20％的Tris-Tricine凝膠(Novex)并且根據(jù)生產(chǎn)商的說明書使樣品在Tris-Tricine緩沖液中電泳。用25％甲醇、7％(v/v)甲醇使凝膠固定1小時(shí)，用熒光試劑(Amplify，Amersham)處理30分鐘，干燥，并在-80℃暴露于X-omat Kodak膠片下過夜。
(b)APP mRNA水平的測定為了比較，通過實(shí)時(shí)RT-PCR測量APP的mRNA水平評價(jià)XH1影響APP生成的能力。
(c)胞內(nèi)和分泌的Aβ1-40和Aβ1-42濃度的測定使用市售的用于Aβ40/42水平的ELISA試劑盒(BioSourceInternational)測定在用XH1處理SH-SYSY細(xì)胞后的胞內(nèi)和分泌的Aβ1-40和Aβ1-42濃度。
(d)篩選分析APP的mRNA編碼的5′-非翻譯區(qū)(5′-UTR)被證明包含鐵應(yīng)答元素(J.T.Rogers等人，J.Biol.Chem.，2002，4745518-45528)，即，通過調(diào)節(jié)鐵蛋白翻譯和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體mRNA穩(wěn)定性控制細(xì)胞鐵動(dòng)態(tài)平衡的RNA莖環(huán)。已經(jīng)表明鐵含量調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的APP mRNA翻譯(J.T.Rogers等人，J.Biol.Chem.，1999，2746421-6431)，而已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)的鐵含量調(diào)節(jié)成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞中的APP合成(J.T.Rogers等人，J.Biol.Chem.，2002，4745518-45528)。此外，報(bào)導(dǎo)鐵螯合劑如desferrioxiame的存在誘導(dǎo)對由APP 5′-UTR引起的翻譯的下調(diào)，觀察到通過鐵內(nèi)流而使其反轉(zhuǎn)。
J.T.Rogers和同事開發(fā)了基于轉(zhuǎn)染的分析，以通過與用于APP的mRNA編碼的5′-UTR的相互作用抑制APP表達(dá)的能力篩選可能的藥物。他們使用這種分析篩選不同類別的藥物，包括已知的受體配體相互作用的阻斷劑、細(xì)菌抗生素、脂類代謝中涉及的藥物、和金屬螯合劑。
與Dr.Rogers合作，類似于較早報(bào)告的試驗(yàn)用于檢測XH1及其類似物通過與mRNA 5′-UTR的相互作用降低APP表達(dá)和隨后發(fā)生的Aβ產(chǎn)生的能力。
構(gòu)造制備如J.T.Rogers等人，J.Mol.Neurosci.，2002，1977-82中所述，通過將APP基因的5′-UTR序列分別與下游報(bào)道基因(熒光素酶和綠色熒光蛋白質(zhì)，GFP)熔合制成pSV2(APP)熒光素酶和pSV2(APP)GFP構(gòu)造。
轉(zhuǎn)染用10μg的pGL-3、pGAL和pGALA構(gòu)造的DNA轉(zhuǎn)染人SH-SYSY成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞，并用5μg的表達(dá)綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)的構(gòu)造的DNA共同轉(zhuǎn)染。從SV40促進(jìn)劑表達(dá)熒光素酶和GFP報(bào)道基因。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(Invitrogen)，轉(zhuǎn)染在LipofectAMINE-2000的存在下進(jìn)行。典型地，在燒瓶(100mm2)中生長的成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞用于每種處理。將各個(gè)燒瓶轉(zhuǎn)染(12h)，隨后相同地轉(zhuǎn)移到96孔板中用于每種處理中接觸XH1(或其它待測雙官能分子)和作為對照的去鐵草酰胺48小時(shí)。
在處理48小時(shí)之后，通過顯微鏡檢查每個(gè)孔確定細(xì)胞的存活率。通過使用自動(dòng)Wallac 1420 multilabel計(jì)數(shù)器在480/509nm波長(GFP)下讀取96孔板的每個(gè)孔中GFP的相對表達(dá)來證實(shí)細(xì)胞生的存活率。在得到GFP讀數(shù)之后，將每個(gè)96孔板中的細(xì)胞在50μL的報(bào)道溶解緩沖液(Promega，Madison，WI)進(jìn)行細(xì)胞溶解，隨后使用Wallac 1420計(jì)數(shù)器進(jìn)行熒光素酶分析。
為了排除本發(fā)明的雙官能分子表現(xiàn)出對總翻譯的非特異性下調(diào)作用的可能性，還需要在報(bào)道分子(即，APP、CAT、熒光素酶、和GFP)前面使用表達(dá)APP 5′UTR序列的反義版本的構(gòu)造。這些構(gòu)造的轉(zhuǎn)染將保證篩選的化合物以高選擇性靶向于APP-mRNA的正確的二級結(jié)構(gòu)。特異性的黃金標(biāo)準(zhǔn)(gold standard)將用于檢查當(dāng)APP基因表達(dá)、合成、和Aβ水平被抑制時(shí)是否APLP1和APLP2合成和5′-UTR驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)仍然是未改變的。
實(shí)施例6Aβ淀粉樣物質(zhì)通過本發(fā)明雙官能分子的回體溶解下述試驗(yàn)可用于評價(jià)本發(fā)明的雙官能分子從人腦組織提取Aβ沉積物的能力。
樣品制備得到貯存在-80℃下的死后組織以及隨附的組織病理學(xué)和臨床數(shù)據(jù)，一半樣品得自阿爾茨海默氏病患者，另一半得自年齡相當(dāng)?shù)慕】祷颊?。根?jù)Consortium to Establish a Register for Alzheimer′sDisease(CERAD)標(biāo)準(zhǔn)(S.S.Mirra等人，Neurology，1997，49S14-16)評價(jià)阿爾茨海默氏病，特別注意神經(jīng)炎斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)的存在。
得自死后腦組織的Aβ淀粉樣物質(zhì)提取物使用DIAX 900勻漿器(Heidolph&Co，Kelheim，Germany)以全速將在3mL冰冷的PBS(pH7.4)中的額皮層的相同區(qū)域(0.5g)勻化三個(gè)30秒周期，每個(gè)動(dòng)作之間靜止30秒，PBS包含除了EDTA之外的蛋白酶抑制劑混合物(BioRad，Hercules，CA)，或在0.1到2mM的本發(fā)明的雙官能分子或用作對照的氯碘羥喹的存在下。為了得到PBS-可提取級分，將勻漿以100,000xg離心30分鐘(Beckman J180，Beckman instruments，F(xiàn)ullerton，CA)并收集上層清液，分成1-mL等分試樣量并在冰上貯存或立即在-70℃凍結(jié)。使用1∶5的冰冷的10％三氯乙酸使1-mL上層清液樣品中的蛋白質(zhì)沉積，并通過在10,000xg離心20分鐘形成小球。通過在包含8％SDS、10％巰基乙醇、和8M尿素的Tris-Tricine SDS-樣品緩沖液中煮沸10分鐘將小球準(zhǔn)備用于聚丙烯酰胺凝膠電泳。通過在1mL PBS中勻化并在如上樣品緩沖液中煮沸得到皮層樣品中的總Aβ。
聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡通過將樣品裝載到10孔、10-20％梯度凝膠(Novex，San Diego，CA)隨后Western轉(zhuǎn)移到0.2-mm硝化纖維素膜(BioRad，Hercules，CA)上進(jìn)行Tris-Tricine聚丙烯酰胺凝膠電泳。使用單克隆抗體WO2(其檢測5到8表位處的Aβ1-40和Aβ1-42)、G210(其對在羧基殘基40封端的Aβ物質(zhì)有特異性)或G211(其對在殘基42處封端的Aβ物質(zhì)有特異性)(N.Ida等人，J.Biol.Chem.，1996，27122908-22914))與辣根過氧化酶結(jié)合兔抗小鼠IgG(Dako，Denmark)結(jié)合并使用化學(xué)發(fā)光(ECL，Amersham BiosciencesCorp.，Piscataway，NJ)顯現(xiàn)來檢測Aβ肽。每個(gè)凝膠包括兩個(gè)或多個(gè)泳道，泳道含有起內(nèi)部參考標(biāo)準(zhǔn)作用的已知量的合成Aβ。
Aβ印跡掃描和透射密度測定分析使用配有透明適配器(TecoInformation Systems，Taiwan)的Relisys掃描器掃描印跡圖像，并且使用用于PC(Scion Corporation，F(xiàn)rederick，MD)的改進(jìn)的Image 1.6軟件(NIH，Bethesda，MD)進(jìn)行密度測定，使用步進(jìn)擴(kuò)散表進(jìn)行校正。為了定量測量腦提取物中的Aβ，使用合成Aβ作為內(nèi)部參考標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將得到的值內(nèi)插。
實(shí)施例7本發(fā)明的MRI對比成像劑的性質(zhì)得自球形圖的MRI信號將不同的溶液混合物(在PBS中包含對比成像劑、Gd-XH1或Gd-DTPA，有或沒有Aβ1-40、Aβ1-42、或HSA，pH7.4)注射到4.5-mL空心圓球體(由聚丙烯制成)中并經(jīng)受3-T磁掃描器(Simens)。使用旋轉(zhuǎn)-回聲掃描方式并使用12TR值(TE＝5ms)測量每個(gè)溶液的T1信號，R1＝1/T1，R1(obs)＝R1(0)+R1(Gd-XH1-Aβ1-40或Aβ1-42)。
報(bào)告在圖11中的這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示了Gd-XH1對縱向(T1)磁弛豫速率的影響。當(dāng)Gd-XH1濃度增加時(shí)，T1減小并且信號變得更亮。對于Gd-DTPA(用作對照的小的親水性分子)與HSA或Aβ的組合沒有觀察到效果。
這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果還在圖12和圖13中報(bào)告。它們表明Gd-XH1特異性地與Aβ1-40肽相互作用，而只與HSA有輕微的相互作用(圖12)。另外，如圖13所示，當(dāng)與富有β折疊的Aβ1-42結(jié)合時(shí)，Gd-XH1的馳豫速率比與表現(xiàn)出較少β折疊含量的天然Aβ1-40結(jié)合時(shí)有增加。
AD小鼠和人腦組織提取物的MRI信號通過使用與蛋白酶抑制劑雞尾酒(Roche)混合的T-PER組織蛋白提取試劑將組織溶解制備AD小鼠(PS1(M146V)xAPPTg2576)和人腦組織提取物。然后將包含0.25mM Gd-XH1和10μg/mL(總蛋白)提取物的不同的溶液混合物注入到4.5-mL空心圓球體中并進(jìn)行與上述同樣的實(shí)驗(yàn)方案。
這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果報(bào)告在圖14中。它們表明，當(dāng)與Gd-XH1混合時(shí)，AD小鼠和人腦組織提取物中的MRI信號增強(qiáng)。
實(shí)施例8在AD動(dòng)物模型中的Aβ淀粉樣沉積物的MRI檢測本文描述了檢測阿爾茨海默氏病的動(dòng)物模型中淀粉樣沉積物存在的方法。該方法基于Gd-XH1的使用。如上所述，Gd-XH1特異性地與Aβ1-40和Aβ1-42相互作用。此外，發(fā)現(xiàn)當(dāng)AD小鼠和人腦組織提取物與Gd-XH1混合時(shí)，提取物的MRI信號增強(qiáng)。
用于該系列實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型為轉(zhuǎn)基因Tg2576小鼠株，其過度表達(dá)具有家族性AD基因突變的人淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)，并表現(xiàn)出AD的神經(jīng)病理學(xué)特征，如記憶缺失和在腦的特定區(qū)域形成年齡相關(guān)性淀粉樣沉積物。使用小的9.4T MRI系統(tǒng)(400MHz，MagnexScientific，Kidlington，UK)在MGH/MIT/HMS Athinoula A.MartinosCenter for Functional and Structural Biomedical Imaging(Department ofRadiology，Massachusetts General Hospital，Boston，MA)進(jìn)行成像。
為了評價(jià)Gd-XH1的體內(nèi)毒性，為PS1(M146V)xAPPTg2576小鼠(約6個(gè)月大，每組5只小鼠)每天腹腔內(nèi)注射每千克體重為30mg劑量的Gd-XH1，進(jìn)行4周。對照包括注射相同劑量的Gd-DTPA和無治療。沒有觀察到Gd-XH1的急性毒性。
進(jìn)行第一系列的試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)以評價(jià)Gd-XH1的MRI對比成像能力。將Gd-XH1與甲基纖維素混合并制備為懸浮液。為一只雄性Sprague-Dawley大鼠(8個(gè)月大)腹腔內(nèi)注射每千克體重為10mg的單一劑量的這種懸浮液。注射一小時(shí)后，使用4.7T MRI儀器(GE)以序列掃描方式為動(dòng)物成像。記錄解剖學(xué)的和S/N比率制的MRI圖像。得到的一些圖像在圖15中表示。在i.p.注射一小時(shí)之后，觀察到信噪比有8％的增加。T1加權(quán)信號強(qiáng)度的增加好象是普遍的，表明Gd-XH1可以滲透BBB和骨骼肌。
使用APP轉(zhuǎn)基因小鼠代替大鼠進(jìn)行另外的實(shí)驗(yàn)。更具體地，為每組5到10只APP轉(zhuǎn)基因Tg2576小鼠腹腔內(nèi)注射每千克體重為0.1mmol單一劑量的本發(fā)明的MRI對比成像劑如Gd-XH1在DMSO和PBS(60∶40；v∶v)的混合物中溶液。為了比較，另一組5到10只PS1(M146V)xAPPTg2576小鼠腹腔內(nèi)注射每千克體重為0.1mmol單一劑量的對照用對比成像劑在PBS中的溶液。對照成像劑為使其包括與本發(fā)明的對比成像劑同樣的復(fù)合于相同的順磁性金屬離子的同樣的金屬螯合部分，但是與本發(fā)明的對比成像劑的不同之處在于其不包括任何淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分。例如，在對比成像劑Gd-XH1的情況中，使用Gd-DTPA作為對照。在注射之后，通過MRI為兩組動(dòng)物成像。通過在處死動(dòng)物之后的Aβ免疫染色評價(jià)和證實(shí)本發(fā)明的MRI對比成像劑對轉(zhuǎn)基因小鼠中腦的Aβ淀粉樣物質(zhì)成像的增強(qiáng)的作用。
實(shí)施例9一類包括α-硫辛酸部分的雙官能分子的合成已經(jīng)設(shè)計(jì)并了正在開發(fā)第二類新的雙官能分子。新的雙官能分子包括直接共價(jià)連接于一個(gè)淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分的一個(gè)金屬螯合部分。該類的所有雙官能分子共有的金屬螯合部分為α-硫辛酸，其還已知具有強(qiáng)大的抗氧化性質(zhì)。如圖6A所示，該類的母體分子的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分是與第一雙官能分子(實(shí)施例1)中所用的同樣的苯并硫代黃素衍生物。
該類的其它成員為其中苯并噻唑部分的芳環(huán)被一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)取代的母體雙官能分子的類似物，所述官能團(tuán)包括例如4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙?；?、5-羧基、5-磺酰氧基、5-溴、4-，5-或6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-，5-或6-甲磺?；?、和4-，5-或6-羥基(參見圖6B)。
本文描述該類母體雙官能分子(化合物XH2)的合成。XH2的制備涉及在金屬螯合部分和淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分之間形成酰胺鍵。根據(jù)由以前發(fā)表的合成方法(W.E.Klunk等人，Life Sci.，2001，691471-1484；D.Shi等人，J.Med.Chem.，1996，393375-3384；h M.S.Konings等人，Inorg.Chem.，1990，291488-1491)改編的方法進(jìn)行反應(yīng)。
向在室溫下攪拌的1mg硫辛酸(Aldrich Chemical)的二氯甲烷溶液加入二滴DMF。向該溶液中逐滴加入0.5mL草酰氯。反應(yīng)表面顯示產(chǎn)生少量氣體。當(dāng)起泡停止時(shí)，混合物用1.2mg的4-苯并噻唑-2-基苯胺和1mL的N，N-二異丙基乙胺在15mL二氯甲烷中的溶液處理。在室溫下攪拌深綠色混合物一小時(shí)。用水洗混合物，硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)，得到固體。將其與乙酸乙酯研磨并在真空下干燥，得到XH2(90％)，其結(jié)構(gòu)通過1H-NMR證實(shí)(參見圖7)。
權(quán)利要求
1.雙官能分子，其包括與至少一個(gè)淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分連接的至少一個(gè)金屬螯合部分。
2.權(quán)利要求1的雙官能分子，其中金屬螯合部分以高親合性與至少一種選自鋅II(Zn2+)、銅II(Cu2+)、和鐵III(Fe3+)的過渡金屬離子結(jié)合。
3.權(quán)利要求1的雙官能分子，其中金屬螯合部分包括DTPA。
4.權(quán)利要求1的雙官能分子，其中金屬螯合部分包括α-硫辛酸衍生物。
5.權(quán)利要求1的雙官能分子，其中淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分可透過血腦屏障。
6.權(quán)利要求1的雙官能分子，其中淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分對Aβ淀粉樣沉積物具有高的親合性和特異性。
7.權(quán)利要求1的雙官能分子，其中淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分包括苯并噻唑衍生物。
8.權(quán)利要求1的雙官能分子，其中金屬螯合部分以高親合性與至少一種選自鋅II(Zn2+)、銅II(Cu2+)、和鐵III(Fe3+)的過渡金屬離子結(jié)合，并且其中淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分對Aβ淀粉樣沉積物具有高的親合性和特異性。
9.權(quán)利要求8的雙官能分子，其中金屬螯合部分包括DTPA。
10.權(quán)利要求8的雙官能分子，其中淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分包括苯并噻唑衍生物。
11.權(quán)利要求8的雙官能分子，其中金屬螯合部分包括DTPA，并且其中淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分包括苯并噻唑衍生物。
12.具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)的雙官能分子
13.具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)的雙官能分子 其中R選自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙?；?、5-羧基、5-磺?；?、5-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺?；?-甲磺?；?、6-甲磺?；?、4-羥基、5-羥基、和6-羥基。
14.具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)的雙官能分子
15.具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)的雙官能分子 其中R選自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺?；?、5-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺酰基、5-甲磺?；?、6-甲磺?；?、4-羥基、5-羥基、和6-羥基。
16.對比成像劑，其包括與至少一個(gè)淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分連接的至少一個(gè)成像部分。
17.權(quán)利要求16的對比成像劑，其中淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分可透過血腦屏障。
18.權(quán)利要求16的對比成像劑，其中淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分對Aβ淀粉樣沉積物具有高的親合性和特異性。
19.權(quán)利要求16的對比成像劑，其中淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分包括苯并噻唑衍生物。
20.權(quán)利要求16的對比成像劑，其中成像部分包括至少一個(gè)與金屬實(shí)體復(fù)合的金屬螯合部分。
21.權(quán)利要求20的對比成像劑，其中金屬螯合部分包括DTPA。
22.權(quán)利要求16的對比成像劑，其中成像部分包括至少一個(gè)與金屬實(shí)體復(fù)合的金屬螯合部分，并且其中淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分對Aβ淀粉樣沉積物具有高的親合性和特異性。
23.權(quán)利要求22的對比成像劑，其中金屬螯合部分包括DTPA，并且其中淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分包括苯并噻唑衍生物。
24.權(quán)利要求20或22的對比成像劑，其中金屬實(shí)體是順磁性金屬離子。
25.權(quán)利要求20或22的對比成像劑，其中金屬實(shí)體是選自釓III(Gd3+)、鉻III(Cr3+)、鏑III(Dy3+)、鐵III(Fe3+)、錳II(Mn2+)、和鐿III(Yb3+)的順磁性金屬離子。
26.權(quán)利要求20或22的對比成像劑，其中金屬實(shí)體是釓III(Gd3+)。
27.權(quán)利要求20或22的對比成像劑，其中金屬實(shí)體是放射性核素。
28.權(quán)利要求20或22的對比成像劑，其中金屬實(shí)體是選自锝-99m(99mTc)、鎵-67(67Ga)、釔-91(90Y)、銦-111(111In)、錸-186(186Re)、和鉈-201(201Tl)的放射性核素。
29.權(quán)利要求20或22的對比成像劑，其中金屬實(shí)體是锝-99m(99mTc)。
30.對比成像劑，其中釓III(Gd3+)與具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)的雙官能分子復(fù)合
31.對比成像劑，其中釓III(Gd3+)與具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)的雙官能分子復(fù)合 其中R選自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺?；?、5-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺?；?、5-甲磺?；?、6-甲磺?；?、4-羥基、5-羥基、和6-羥基。
32.對比成像劑，其包括與至少一個(gè)由穩(wěn)定的順磁性同位素標(biāo)記的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分連接的至少一個(gè)金屬螯合部分。
33.權(quán)利要求32的對比成像劑，其中穩(wěn)定的順磁性同位素是碳-13(13C)或氟-19(19F)。
34.藥學(xué)組合物，其包括有效量的權(quán)利要求1的至少一種雙官能分子或其生理學(xué)可耐受的鹽，和至少一種藥學(xué)可接受的載體。
35.藥學(xué)組合物，其包括有效量的權(quán)利要求8的至少一種雙官能分子或其生理學(xué)可耐受的鹽，和至少一種藥學(xué)可接受的載體。
36.藥學(xué)組合物，其包括有效量的權(quán)利要求12的至少一種雙官能分子或其生理學(xué)可耐受的鹽，和至少一種藥學(xué)可接受的載體。
37.藥學(xué)組合物，其包括有效量的權(quán)利要求13的至少一種雙官能分子或其生理學(xué)可耐受的鹽，和至少一種藥學(xué)可接受的載體。
38.藥學(xué)組合物，其包括有效量的權(quán)利要求14的至少一種雙官能分子或其生理學(xué)可耐受的鹽，和至少一種藥學(xué)可接受的載體。
39.藥學(xué)組合物，其包括有效量的權(quán)利要求15的至少一種雙官能分子或其生理學(xué)可耐受的鹽，和至少一種藥學(xué)可接受的載體。
40.藥學(xué)組合物，其包括成像有效量的權(quán)利要求16的至少一種對比成像劑或其生理學(xué)可耐受的鹽，和至少一種藥學(xué)可接受的載體。
41.藥學(xué)組合物，其包括成像有效量的權(quán)利要求20的至少一種對比成像劑或其生理學(xué)可耐受的鹽，和至少一種藥學(xué)可接受的載體。
42.藥學(xué)組合物，其包括成像有效量的權(quán)利要求25的至少一種對比成像劑或其生理學(xué)可耐受的鹽，和至少一種藥學(xué)可接受的載體。
43.藥學(xué)組合物，其包括成像有效量的權(quán)利要求28的至少一種對比成像劑或其生理學(xué)可耐受的鹽，和至少一種藥學(xué)可接受的載體。
44.藥學(xué)組合物，其包括成像有效量的權(quán)利要求30的至少一種對比成像劑或其生理學(xué)可耐受的鹽，和至少一種藥學(xué)可接受的載體。
45.藥學(xué)組合物，其包括成像有效量的權(quán)利要求31的至少一種對比成像劑或其生理學(xué)可耐受的鹽，和至少一種藥學(xué)可接受的載體。
46.用于降低或抑制系統(tǒng)中淀粉樣物質(zhì)毒性的方法，其包括使系統(tǒng)與權(quán)利要求1的雙官能分子或其藥學(xué)組合物接觸。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述方法預(yù)防、減慢或終止系統(tǒng)中的淀粉樣物質(zhì)積聚；或促進(jìn)、誘導(dǎo)、或幫助系統(tǒng)中存在的淀粉樣沉積物的溶解；或兼有上述兩種作用。
48.權(quán)利要求46的方法，其中所述方法降低、抑制或干擾淀粉樣物質(zhì)介導(dǎo)的活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生。
49.權(quán)利要求46的方法，其中接觸通過體外或回體培養(yǎng)進(jìn)行，并且其中系統(tǒng)選自細(xì)胞、生物流體、和生物組織。
50.權(quán)利要求49的方法，其中細(xì)胞、生物流體、或生物組織來源于懷疑患有與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的患者。
51.權(quán)利要求50的方法，其中病理生理學(xué)狀況與β淀粉樣肽的積聚有關(guān)，并且其中雙官能分子中的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分對Aβ淀粉樣沉積物具有高的親合性和特異性。
52.權(quán)利要求46的方法，其中雙官能分子具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)
53.權(quán)利要求46的方法，其中雙官能分子具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu) 其中R選自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺酰基、5-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺?；?、5-甲磺酰基、6-甲磺?；?、4-羥基、5-羥基、和6-羥基。
54.權(quán)利要求46的方法，其中雙官能分子具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)
55.權(quán)利要求46的方法，其中雙官能分子具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu) 其中R選自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙?；?、5-羧基、5-磺?；?-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺?；?、5-甲磺酰基、6-甲磺?；?、4-羥基、5-羥基、和6-羥基。
56.用于治療患有與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的患者的方法，其包括對患者給藥有效量的權(quán)利要求1的雙官能分子或其藥學(xué)組合物。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述方法預(yù)防、減慢或終止患者體內(nèi)的淀粉樣物質(zhì)積聚；或促進(jìn)、誘導(dǎo)、或幫助患者體內(nèi)存在的淀粉樣沉積物的溶解；或兼有上述兩種作用
58.權(quán)利要求56的方法，其中所述方法降低、抑制或干擾淀粉樣物質(zhì)介導(dǎo)的活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生。
59.權(quán)利要求56的方法，其中給藥通過選自口服給藥和腸胃外給藥的方法進(jìn)行，包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下注射、和經(jīng)皮給藥以及腸給藥。
60.權(quán)利要求56的方法，其中病理生理學(xué)狀況與β淀粉樣肽的積聚有關(guān)，并且其中雙官能分子中的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分對Aβ淀粉樣沉積物具有高的親合性和特異性。
61.權(quán)利要求56的方法，其中雙官能分子具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)
62.權(quán)利要求56的方法，其中雙官能分子具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu) 其中R選自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙?；?、5-羧基、5-磺酰基、5-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺?；?-甲磺?；?、6-甲磺酰基、4-羥基、5-羥基、和6-羥基。
63.權(quán)利要求56的方法，其中雙官能分子具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)
64.權(quán)利要求56的方法，其中雙官能分子具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu) 其中R選自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺?；?-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺?；?、5-甲磺?；?-甲磺?；?-羥基、5-羥基、和6-羥基。
65.權(quán)利要求56的方法，其中病理生理學(xué)狀況選自阿爾茨海默氏病、唐氏綜合癥、路易體癡呆、具有淀粉樣病變的(荷蘭型)遺傳性腦出血、關(guān)島帕金森癡呆、和腦外傷。
66.權(quán)利要求56的方法，其中病理生理學(xué)狀況是阿爾茨海默氏病。
67.檢測系統(tǒng)中淀粉樣沉積物存在的方法，其包括步驟使系統(tǒng)與成像有效量的權(quán)利要求20的對比成像劑或其藥學(xué)組合物在可使對比成像劑與存在的任何淀粉樣沉積物相互作用從而導(dǎo)致對比成像劑與淀粉樣沉積物結(jié)合的條件下接觸；使用成像技術(shù)檢測系統(tǒng)中存在的并與對比成像劑結(jié)合的任何淀粉樣沉積物；和產(chǎn)生系統(tǒng)的至少一部分的一個(gè)或多個(gè)圖像。
68.權(quán)利要求67的方法，其中系統(tǒng)中存在的淀粉樣沉積物通過β淀粉樣肽的積聚形成，并且其中對比成像劑中的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分對Aβ淀粉樣沉積物具有高的親合性。
69.權(quán)利要求67的方法，其中接觸通過體外或回體培養(yǎng)進(jìn)行，并且其中系統(tǒng)選自細(xì)胞、生物流體、和生物組織。
70.權(quán)利要求69的方法，其中細(xì)胞、生物流體、或生物組織來源于懷疑患有與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的患者。
71.權(quán)利要求69的方法，其中細(xì)胞、生物流體、或生物組織來源于接受與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的治療的患者。
72.權(quán)利要求69的方法，其中細(xì)胞、生物流體、或生物組織與用于治療與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的潛在治療劑接觸。
73.權(quán)利要求67的方法，其中所述方法用于鑒別用于治療與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的潛在治療劑。
74.權(quán)利要求67的方法，其中所述方法用于診斷與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況。
75.權(quán)利要求67的方法，其中所述方法用于跟蹤與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的進(jìn)展。
76.權(quán)利要求67的方法，其中所述方法用于監(jiān)測患者對與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的治療的應(yīng)答。
77.檢測患者體內(nèi)淀粉樣沉積物存在的方法，其包括步驟在可使對比成像劑與存在的任何淀粉樣沉積物相互作用從而導(dǎo)致對比成像劑與淀粉樣沉積物結(jié)合的條件下對患者給藥成像有效量的權(quán)利要求20的對比成像劑或其藥學(xué)組合物；使用成像技術(shù)檢測患者體內(nèi)存在的并與對比成像劑結(jié)合的任何淀粉樣沉積物；和產(chǎn)生患者身體的至少一部分的一個(gè)或多個(gè)圖像。
78.權(quán)利要求77的方法，其中給藥通過選自口服給藥和腸胃外給藥的方法進(jìn)行，包括靜脈內(nèi)給藥、動(dòng)脈內(nèi)給藥、鞘內(nèi)給藥、皮內(nèi)給藥、和腔內(nèi)給藥、以及腸給藥。
79.權(quán)利要求77的方法，其中淀粉樣沉積物通過β淀粉樣肽的聚集和積聚形成，并且其中對比成像劑中的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分對A β淀粉樣沉積物具有高的親合性或特異性。
80.權(quán)利要求77的方法，其中所述方法用于定位患者體內(nèi)的淀粉樣沉積物。
81.權(quán)利要求77的方法，其中所述方法用于定位患者腦中的淀粉樣沉積物，并且其中對比成像劑中的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分可透過血腦屏障。
82.權(quán)利要求77的方法，其中所述方法用于診斷與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況。
83.權(quán)利要求77的方法，其中所述方法用于跟蹤與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的進(jìn)展。
84.權(quán)利要求77的方法，其中所述方法用于監(jiān)測患者對與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的治療的應(yīng)答。
85.權(quán)利要求67或77的方法，其中對比成像劑中的成像部分包括至少一個(gè)與順磁性金屬離子復(fù)合的金屬螯合部分；檢測通過磁共振成像(MRI)進(jìn)行；和產(chǎn)生MR圖像。
86.權(quán)利要求85的方法，其中順磁性金屬離子選自釓III(Gd3+)、鉻III(Cr3+)、鏑III(Dy3+)、鐵III(Fe3+)、錳II(Mn2+)、和鐿III(Yb3+)。
87.權(quán)利要求85的方法，其中順磁性金屬離子是釓III(Gd3+)。
88.權(quán)利要求87的方法，其中釓III(Gd3+)與具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)的雙官能分子復(fù)合
89.權(quán)利要求87的方法，其中釓III(Gd3+)與具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)的雙官能分子復(fù)合 其中R選自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙?；?、5-羧基、5-磺?；?-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺酰基、5-甲磺?；?、6-甲磺?；?、4-羥基、5-羥基、和6-羥基。
90.權(quán)利要求67或77的方法，其中對比成像劑中的成像部分包括至少一個(gè)與放射性核素復(fù)合的金屬螯合部分；檢測通過單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像(SPECT)進(jìn)行；和產(chǎn)生SPECT圖像。
91.權(quán)利要求90的方法，其中放射性核素選自锝-99m(99mTc)、鎵-67(67Ga)、釔-91(90Y)、銦-111(111In)、錸-186(186Re)、和鉈-201(201Tl)。
92.權(quán)利要求90的方法，其中放射性核素是锝-99m(99mTc)。
93.權(quán)利要求73、74、75、76、82、83或84的方法，其中病理生理學(xué)狀況與β淀粉樣肽的積聚有關(guān)，并且其中對比成像劑中的淀粉樣物質(zhì)結(jié)合部分對Aβ淀粉樣沉積物具有高的親合性。
94.權(quán)利要求73、74、75、76、82、83或84的方法，其中病理生理學(xué)狀況選自阿爾茨海默氏病、唐氏綜合癥、路易體癡呆、具有淀粉樣病變的(荷蘭型)遺傳性腦出血、關(guān)島帕金森癡呆、和腦外傷。
95.權(quán)利要求73、74、75、76、82、83或84的方法，其中病理生理學(xué)狀況是阿爾茨海默氏病。
全文摘要
本發(fā)明涉及與淀粉樣物質(zhì)積聚有關(guān)的病理生理學(xué)狀況的診斷、預(yù)防和治療。本發(fā)明描述了表現(xiàn)出對淀粉樣沉積物具有高親合性的雙官能治療分子和對比成像劑、及其藥學(xué)組合物。本發(fā)明還提供了使用成像技術(shù)以及這些雙官能分子、對比成像劑、及其藥學(xué)組合物用于檢測淀粉樣沉積物存在的方法；并且提供了用于預(yù)防或治療淀粉樣物質(zhì)相關(guān)性狀況諸如例如阿爾茨海默氏病的方法。
文檔編號A61P25/28GK1774267SQ200480004902
公開日2006年5月17日 申請日期2004年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月22日
發(fā)明者黃旭東 申請人:綜合醫(yī)院有限公司