專利名稱：接枝納米炭及混懸液的制備方法和醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及接枝納米炭在制備用于淋巴示蹤(診斷)和淋巴靶向治療的藥物上的應(yīng)用，本發(fā)明還涉及一種接枝納米炭及其混懸液的制備方法。
背景技術(shù)：
中國(guó)發(fā)明專利《一種納米炭混懸組合物的制備方法》(申請(qǐng)?zhí)?2113731.5，已經(jīng)獲得“授予發(fā)明專利權(quán)通知書”)公開了一種用于示蹤惡性腫瘤的區(qū)域引流淋巴結(jié)的納米炭混懸液的制備方法。該技術(shù)的特點(diǎn)是由于納米炭表面結(jié)構(gòu)為疏水性質(zhì)，不能直接在水溶液中分散形成納米炭混懸液，因此必須加入分散助懸輔料，在高剪切力研磨分散設(shè)備的機(jī)械作用下，才能形成納米炭混懸液。納米炭混懸液注射到局部組織后，能夠選擇性進(jìn)入局部組織的引流淋巴結(jié)，將這些淋巴結(jié)染黑，幫助醫(yī)生肉眼辨別淋巴結(jié)，達(dá)到淋巴示蹤的效果，從而有利于清掃這些淋巴結(jié)。但是，其中的分散助懸輔料導(dǎo)致混懸液的稠度變大，有礙于進(jìn)一步提高淋巴示蹤速度，而且，根據(jù)美國(guó)FDA的資料，作為分散助懸輔料的聚乙烯吡咯烷酮如果進(jìn)入血液，可能影響凝血功能。另外，納米炭吸附能力有限，表面活性基團(tuán)較少，很難與化療藥物共價(jià)鍵結(jié)合，不利于進(jìn)一步開發(fā)成淋巴靶向化療藥物。
需要特別申明的是，本發(fā)明中所描述的納米炭，實(shí)質(zhì)上是一種經(jīng)過(guò)純化除去揮發(fā)性有機(jī)成分和重金屬成分的炭黑。因此，在本發(fā)明中納米炭與炭黑是同一物質(zhì)。
通過(guò)化學(xué)或物理方法對(duì)納米炭的表面改性，給其表面接上一些化學(xué)基團(tuán)，就成為接枝納米炭(接枝炭黑)。例如，接上羧基的接枝納米炭，就使得其表面的極性增大，成為親水性接枝納米炭，在水中就可以均勻分散，可以用于制造打印機(jī)用墨水，復(fù)印機(jī)用墨粉，高耐磨輪胎，等等產(chǎn)品。但是，至今為止，接枝納米炭還沒(méi)有在醫(yī)藥領(lǐng)域的淋巴示蹤和淋巴靶向治療方面的應(yīng)用。而且，在工業(yè)上，根據(jù)具體的使用要求，對(duì)納米炭接枝的化學(xué)基團(tuán)也就不同，如果接枝后接枝納米炭的表面性質(zhì)是疏水性的，則這種接枝納米炭并不能在水中分散。本發(fā)明人根據(jù)上述背景內(nèi)容，設(shè)想制造一種接枝納米炭，具有親水性，可以代替納米炭，應(yīng)用于淋巴示蹤和淋巴靶向治療，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，根據(jù)本發(fā)明設(shè)想制造的接枝納米炭可以直接在水中分散成接枝納米炭混懸液，具有比納米炭混懸液更好的淋巴示蹤和淋巴靶向治療效果。
需要特別申明的是，本發(fā)明中所描述的接枝納米炭，是使用經(jīng)過(guò)純化的炭黑(納米炭)接枝而制造的。因此，在本發(fā)明中接枝納米炭與接枝炭黑是同一物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及接枝納米炭在制備用于淋巴示蹤和直接殺死淋巴結(jié)內(nèi)轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的淋巴靶向藥物上的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供一種接枝納米炭的制備方法。該方法包括采用炭黑為原料，經(jīng)過(guò)乙酸乙酯脫脂，酸洗堿洗降低灰分和重金屬，然后大量水洗去酸、堿，制成純化納米炭；將該純化納米炭在67％濃HNO3中，加溫至100℃，在該溫度下回流100小時(shí)；待反應(yīng)后的炭黑硝酸溶液的溫度下降到常溫后，在5600rpm下離心30分鐘；取上層黑色液體，在溫度70℃下減壓蒸發(fā)后得到黑色固體；將該黑色固體溶于水中，在150℃的烘箱里烘8小時(shí)，得到的黑色固體轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)娜萜髦?，加水，使?0％NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.9；然后在70℃溫度下減壓蒸發(fā)后得到黑色固體即得接枝納米炭。由該方法制得的接枝納米炭可以在水中直接分散成接枝納米炭混懸液，具有比納米炭混懸液更好的淋巴示蹤和淋巴靶向治療效果。
本發(fā)明還提供一種接枝納米炭混懸液。該混懸液含接枝納米炭、生理鹽水和pH調(diào)節(jié)劑?；鞈乙旱膒H值為6.0-8.0，優(yōu)選6.7-7.1。其中每1000ml接枝納米炭混懸液中含接枝納米炭2.5-200克，優(yōu)選50克。
本發(fā)明還提供接枝納米炭混懸液的制備方法。該方法包括(1)制備接枝納米炭；(2)將接枝納米炭分散于生理鹽水中，用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)接枝納米炭混懸液的pH值為6.7至7.1。具體步驟包括制備接枝納米炭；向接枝納米炭中加入生理鹽水，通過(guò)攪拌、超聲震蕩等機(jī)械方法使接枝納米炭在水溶液中均勻分散成接枝納米炭混懸液；可以在常溫下制備，也可以加溫縮短分散時(shí)間；用堿性溶液調(diào)節(jié)接枝納米炭混懸液的pH值為6.7至7.1，將調(diào)節(jié)pH值后的接枝納米炭混懸液用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾，可以在膜的輸入側(cè)加壓過(guò)濾，也可以膜的輸出側(cè)負(fù)壓過(guò)濾，除去大顆粒和細(xì)菌。然后分裝，加塞，壓鋁蓋，檢漏，質(zhì)檢，包裝。
通過(guò)檢測(cè)證明，采用本發(fā)明公開的制備工藝制造的接枝納米炭上接有羧基和羥基等官能團(tuán)，不僅改善了接枝納米炭在水中的分散性，而且為接枝納米炭下一步在藥物上的運(yùn)用提供了可能的條件。接枝納米炭的粒徑平均在70nm左右，具有淋巴靶向性，并且有大量的羧酸基團(tuán)分布在接枝納米炭的表面上。
根據(jù)用自動(dòng)電位滴定儀進(jìn)行接枝納米炭基團(tuán)和HCl的反滴定對(duì)接枝納米炭官能團(tuán)的檢測(cè)結(jié)果，可推出其共軛環(huán)為12個(gè)，分子大小為900左右。
接枝納米炭上具有羧基，是親水基團(tuán)，使得接枝納米炭具有親水性，可以直接在水或水溶液中形成均勻分散的混懸液。與現(xiàn)有技術(shù)比較，制備接枝納米炭混懸液不需要分散助懸輔料，也不需要使用高剪切力研磨分散設(shè)備。使用接枝納米炭、生理鹽水和pH調(diào)節(jié)劑制備成接枝納米炭混懸液。
接枝納米炭混懸液在注射到人或動(dòng)物的機(jī)體的部位后，迅速進(jìn)入注射部位的引流淋巴結(jié)，起到淋巴示蹤的效果。將接枝納米炭混懸液注射到惡性腫瘤部位后，可以迅速到達(dá)惡性腫瘤的引流淋巴結(jié)，可以直接殺死淋巴結(jié)內(nèi)的轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞，因此可以作為淋巴靶向化療藥物使用。
接枝納米炭混懸液中接枝納米炭的粒徑、接枝納米炭的含量以及混懸液的pH值對(duì)接枝納米炭混懸液的淋巴靶向性和從注射局部進(jìn)入引流淋巴結(jié)的速度均有明顯影響。
發(fā)明人根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定接枝納米炭粒徑集中在30～70nm、在接枝納米炭混懸液中的平均粒徑(為接枝納米炭團(tuán)粒)小于150nm的條件下，其淋巴靶向性和從注射局部進(jìn)入引流淋巴結(jié)的速度均很好。而當(dāng)接枝納米炭在接枝納米炭混懸液中的平均粒徑大于250nm以上時(shí)，其從注射局部進(jìn)入引流淋巴結(jié)的速度明顯下降。
發(fā)明人根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定1000ml接枝納米炭混懸液中含接枝納米炭為2.5-200克，最佳為50g，這種條件下接枝納米炭混懸液對(duì)注射部位引流淋巴結(jié)的染黑效果最佳。
使用10％氫氧化鈉溶液將接枝納米炭混懸液的pH值調(diào)節(jié)為6.0-8.0，最佳為6.7-7.1。這種條件下接枝納米炭混懸液進(jìn)入注射部位引流淋巴結(jié)的速度最快。而在過(guò)酸或過(guò)堿的情況下，接枝納米炭混懸液進(jìn)入注射部位引流淋巴結(jié)的速度明顯下降，甚至不能進(jìn)入注射部位引流淋巴結(jié)。
制備接枝納米炭混懸液的液體可以是水或水溶液，最好是生理鹽水。


圖1 透射電鏡檢測(cè)接枝納米炭粒徑照片。
圖2 作為對(duì)照的純化納米炭的紅外光譜檢測(cè)圖譜。
圖3 接枝納米炭的紅外光譜檢測(cè)圖譜。
圖4 接枝納米炭的X射線光電子能譜(X PS)檢測(cè)圖譜。
圖5 作為對(duì)照的純化納米炭的X射線光電子能譜(X PS)檢測(cè)圖譜。
圖6 接枝納米炭的核磁共振檢測(cè)圖譜。
圖7 接枝納米炭混懸液的激光粒度檢測(cè)圖譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 納米炭的純化制備采用中國(guó)發(fā)明專利《一種納米炭混懸組合物的制備方法》公開的方法，采用40號(hào)炭黑為化學(xué)原料，經(jīng)過(guò)乙酸乙酯脫脂，酸洗堿洗降低灰分和重金屬，然后大量水洗去酸、堿，制成純化的納米炭，作為制備接枝納米炭的原料。納米炭純化制備工藝步驟如下1、乙酸乙酯脫脂稱取40號(hào)炭黑1600g置于適當(dāng)?shù)娜萜髦?，?000ml乙酸乙酯。加熱回流1小時(shí)，過(guò)濾，濾渣重復(fù)處理1次，真空干燥2小時(shí)，得粗品1420.59g，收率為89.12％，甲苯抽提物透光率為99.98％。
2、酸洗堿洗水洗將上述粗品700g置于適當(dāng)?shù)娜萜髦校?0％硝酸3000ml，室溫下攪拌2小時(shí)，過(guò)濾，濾后用去離子水洗至中性。加0.1mol/L氫氧化鈉3000ml，室溫下攪拌1小時(shí)，過(guò)濾，濾后用去離子水洗滌至中性，120℃干燥5小時(shí)，得納米炭樣品660.69g，收率95.27％，3、檢測(cè)對(duì)樣品純化前后的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。表明用乙酸乙酯脫酯及酸洗堿洗可明顯降低炭黑的脂溶性物質(zhì)、灰分和重金屬的含量，純化前后本品粒徑未發(fā)生變化，形態(tài)呈細(xì)粒狀，見(jiàn)較細(xì)的顆粒呈圓狀，較粗的顆粒呈現(xiàn)出由細(xì)小顆粒粘附形成。細(xì)小顆粒約30nm至70nm，較粗顆?？蛇_(dá)100nm左右。本制備工藝方法簡(jiǎn)單易行，收率高，質(zhì)量穩(wěn)定。
表1 純化前后檢測(cè)結(jié)果

實(shí)施例2 接枝納米炭的制備1、納米炭的氧化接枝反應(yīng)將由炭黑純化得到的納米炭499.35g置于耐酸容器中，加入20000ml 67％濃HNO3，加溫至100℃，在該溫度下回流100小時(shí)。
2、分離提取接枝納米炭待反應(yīng)后的炭黑硝酸溶液的溫度下降到常溫后，在5600rpm下離心30分鐘，將上層黑色液體移入適當(dāng)?shù)娜萜髦?，在溫?0℃下減壓蒸發(fā)后得到深棕黑色固體；將下層的黑色沉淀繼續(xù)加入蒸餾水，攪拌2小時(shí)，在5600rpm離心30分鐘，離心后的上層液體為黑色，黑色沉淀明顯減少；將上層黑色液體移入適當(dāng)?shù)娜萜髦校跍囟?0℃下減壓蒸發(fā)后得到深棕黑色固體。如此重復(fù)5次，收集每次離心后上層液經(jīng)減壓蒸發(fā)后得到的黑色固體。
3、對(duì)純化分離提取得到的接枝納米炭進(jìn)行pH調(diào)節(jié)在上一步所得的黑色固體置于適當(dāng)?shù)娜萜髦?，加入蒸餾水，倒入蒸發(fā)器中在150℃的烘箱里烘干，得到黑色固體。將黑色固體轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)娜萜髦?，加入蒸餾水，使用10％NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.9。然后在70℃溫度下減壓蒸發(fā)后得到黑色固體461.26克，即是接枝納米炭。
4、取接枝納米炭樣品進(jìn)行了如下檢測(cè)4.1 透射電鏡檢測(cè)使用透射電鏡檢測(cè)該接枝納米炭的粒徑為30-70nm(圖1)。
4.2 結(jié)構(gòu)分析4.2.1 紅外分析對(duì)比作為原料的納米炭的出峰位置1619cm-1和3450cm-1(圖2)，接枝納米炭的紅外圖譜上新出現(xiàn)了2918.8cm-1，1721.6cm-1，1442.5cm-1，1244.0cm-1，929.5cm-1，612.3cm-1等峰(圖3)。其中納米炭在1619cm-1的峰為C＝C伸縮振動(dòng)。在3450cm-1處的峰為O-H的伸縮振動(dòng)(可能是納米炭紅外測(cè)定過(guò)程中吸水所致)；接枝納米炭在3438.4cm-1處為O-H的伸縮振動(dòng)(同樣可能是炭黑紅外測(cè)定過(guò)程中吸水所致，也不排除為羰基上的O-H和酚羥基上的O-H)，2918.8cm-1為烴類的C-H振動(dòng)。1721.6cm-1為C＝O的伸縮振動(dòng)的吸收，這表明接枝納米炭上引入了O＝C-OH。1619.9cm-1為C＝C的伸縮振動(dòng)，1549.5cm-1和1442.5cm-1為C-硝基對(duì)稱伸展振動(dòng)和不對(duì)稱振動(dòng)的吸收，1244.0cm-1為C-O的振動(dòng)。929.5cm-1為羧酸二聚體OH基團(tuán)面外振動(dòng)。612.3cm-1為CNO基團(tuán)的彎曲振動(dòng)。
4.2.2 元素分析將作為原料的納米炭和接枝納米炭進(jìn)行對(duì)照，發(fā)現(xiàn)氧化接枝后的接枝納米炭的含碳量明顯減少(減少了43.81％)，含氫量和含氮量略有增加，分別增加1.26％和0.74％。由于在氧化接枝過(guò)程中只引入了H、N、O三種元素，所以在未對(duì)O含量測(cè)定的情況下，可以認(rèn)為除C、H、N外主要元素為O。因此，可得O的含量增大了39.83％為43.31％。
由上可知，氧化接枝后的接枝納米炭上引入了大量的氧。
4.2.3 XPS(X射線光電子能譜)接枝納米炭表面O有三種結(jié)合方式，其中結(jié)合能為531.91eV的氧原子據(jù)認(rèn)為是屬于C-O，結(jié)合能為532.668eV屬于O-H，結(jié)合能為533.568eV屬于O＝C。接枝納米炭的Cls譜(炭黑表面碳元素的1級(jí)光電子能譜)上，在289.570eV的位置上出現(xiàn)了一個(gè)強(qiáng)峰為O-C＝O的Cls結(jié)合能。接枝納米炭表面存在四種不同結(jié)合能的碳原子。其中結(jié)合能284.600eV認(rèn)為是屬于接枝納米炭本身綢環(huán)結(jié)構(gòu)上的碳原子，結(jié)合能285.500eV為C-H的碳原子，結(jié)合能286.570eV屬于表面醌基上的碳原子，結(jié)合能289.570eV屬于帶強(qiáng)吸電性鄰基的-COOH或過(guò)氧化酯基上碳原子(圖4)。
與作為原料的納米炭相比，硝酸氧化后的接枝納米炭表面含碳量由95.6％降至82.83％，氧化后接枝納米炭表面的含氧量增大，由4.4％升至14.34％。并且在其表面引入了含氮物(圖4、圖5)。
4.2.4 核磁共振檢測(cè)圖譜在接枝納米炭的13CNMR中，133.208ppm處屬接枝納米炭中的取代芳烴碳，168.491ppm為羧酸上的碳。在113～137ppm范圍內(nèi)，有一個(gè)突出的弧性峰，應(yīng)該屬接枝納米炭上不同的芳香碳(圖6)。
由以上解析可以看出，接枝納米炭中含有大量的稠環(huán)芳碳，也使得接枝納米炭很難分離成單一分子量的物質(zhì)，同時(shí)，可以看到接枝納米炭上引入了羧基。
4.2.5 官能團(tuán)的檢測(cè)用自動(dòng)電位滴定儀進(jìn)行接枝納米炭基團(tuán)和HCl的反滴定測(cè)定。
得出COOH基的含量為7.74mmol/g接枝納米炭酚羥基的含量為2.85mmol/g接枝納米炭弱酸基團(tuán)為1.51mmol/g接枝納米炭其他為1.71mmol/g接枝納米炭由此可知，E/T＝(COOH+OH+CO+NO2)/C(11.201-COOH)，其中C為碳元素的百分含量，COOH、OH、CO、NO2的單位是mmol/g接枝納米炭，E/T＝0.407，推出其共軛環(huán)為12個(gè)，分子大小為900。
4.2.6 接枝納米炭加熱減量的測(cè)定(按GB/T3780.08-92方法測(cè)定)W1=M11-m21m11-m01×100]]>其中m01＝20.2718g；m11＝22.2946g m21＝22.1831g
W1=22.2946-22.183122.2946-20.2718×100=5.51]]>注W1所測(cè)物質(zhì)的加熱減量值，m01干燥器凈重；m11干燥前干燥器和所測(cè)物質(zhì)重量 m21＝干燥后干燥器和所測(cè)物質(zhì)重量4.2.7 接枝納米炭灰分的測(cè)定(按GB/T3780.10-92方法測(cè)定)W2=m12-m22m12-m02×100]]>其中m02＝36.1225g；m12＝37.1276g m22＝36.1344gW2＝1.20注以上m02、m12、m22均取了平均值。注W2所測(cè)物質(zhì)的灰份，m02坩堝凈重；m12焙燒前坩堝和所測(cè)物質(zhì)重量m22焙燒后坩堝和所測(cè)物質(zhì)重量實(shí)施例3 接枝納米炭混懸液的制備方法一首先稱取接枝納米炭50克置于2000ml容量的玻璃容器中，加入300ml生理鹽水，常溫下，攪拌60分鐘，再加入300ml生理鹽水，攪拌60分鐘，繼續(xù)加入生理鹽水至1000ml，用10％氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.9。
將上述pH值為6.9的混懸液用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾，可以在膜的輸入側(cè)加壓過(guò)濾，也可以膜的輸出側(cè)負(fù)壓過(guò)濾，除去大顆粒和細(xì)菌。
分裝1ml/瓶。加塞，壓鋁蓋，檢漏，質(zhì)檢，包裝。
所制備的接枝納米炭混懸液，顏色為深棕黑色，平均粒徑84nm(圖7)，pH值6.9，無(wú)菌。
實(shí)施例4 接枝納米炭混懸液的制備方法二首先稱取接枝納米炭50克置于2000ml容量的玻璃容器中，加入300ml生理鹽水，60℃溫度下，攪拌45分鐘，再加入300ml生理鹽水，攪拌45分鐘，停止加溫，冷卻至常溫，加入生理鹽水至1000ml，用10％氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.9。
將上述pH值為6.9的混懸液用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾，可以在膜的輸入側(cè)加壓過(guò)濾，也可以膜的輸出側(cè)負(fù)壓過(guò)濾，除去大顆粒和細(xì)菌。
分裝1ml/瓶。加塞，壓鋁蓋，檢漏，質(zhì)檢，包裝。
制備的接枝納米炭混懸液，顏色為深棕黑色，平均粒徑92nm，pH值6.9，無(wú)菌。
實(shí)施例5 接枝納米炭混懸液的制備方法三首先稱取接枝納米炭50克置于2000ml容量的玻璃容器中，加入300ml生理鹽水，90℃溫度下，攪拌20分鐘，再加入300ml生理鹽水，攪拌20分鐘，停止加溫，冷卻至常溫，加入生理鹽水至1000ml，用10％氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.9。
將上述pH值為6.9的混懸液用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾，可以在膜的輸入側(cè)加壓過(guò)濾，也可以膜的輸出側(cè)負(fù)壓過(guò)濾，除去大顆粒和細(xì)菌。
分裝1ml/瓶。加塞，壓鋁蓋，檢漏，質(zhì)檢，包裝。
制備的接枝納米炭混懸液，顏色為深棕黑色，平均粒徑88nm，pH值6.9，無(wú)菌。
實(shí)施例6 接枝納米炭混懸液的制備方法四首先稱取接枝納米炭10克置于500ml容量的玻璃容器中，加入100ml生理鹽水，常溫下，使用超聲波粉碎機(jī)，功率30瓦，震蕩30分鐘，加入生理鹽水至200ml，用10％氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.9。
將上述pH值為6.9的混懸液用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾，可以在膜的輸入側(cè)加壓過(guò)濾，也可以膜的輸出側(cè)負(fù)壓過(guò)濾，除去大顆粒和細(xì)菌。
分裝1ml/瓶。加塞，壓鋁蓋，檢漏，質(zhì)檢，包裝。
制備了批號(hào)040311的接枝納米炭混懸液，顏色為深棕黑色，平均粒徑92nm，pH值6.9，無(wú)菌。
實(shí)施例7 接枝納米炭混懸液中納米炭含量對(duì)淋巴示蹤效果的影響將接枝納米炭混懸液注射到局部后，對(duì)區(qū)域引流淋巴結(jié)的染色示蹤能力，在一定范圍內(nèi)與接枝納米炭的含量正相關(guān)。為了考察接枝納米炭含量對(duì)接枝納米炭混懸液淋巴示蹤作用的影響，特配制不同濃度的接枝納米炭混懸液，用小白鼠作淋巴示蹤試驗(yàn)。并用納米炭混懸液作對(duì)照。
試驗(yàn)方法1、將接枝納米炭混懸液中接枝納米炭含量分別配制為不同濃度，即2.5mg/ml、12.5mg/ml、50mg/ml和75mg/ml備用。將納米炭混懸液中納米炭含量分別配制為不同濃度，即2.5mg/ml、12.5mg/ml、50mg/ml和75mg/ml備用。
2、取健康ICR小鼠240只，雌雄各半，均分24組，每組10只。用50μl微量注射器，從小鼠右后腳墊皮下注射不同劑量的納米炭組合物混懸液，在給藥后1、2、4分鐘，分別將各組10只小白鼠斷頸處死，肉眼觀察后腿彎部淋巴結(jié)、髂淋巴結(jié)和腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)的染黑程度。黑染程度記分標(biāo)準(zhǔn)是0分為淋巴結(jié)顏色無(wú)改變，0.5分為淋巴結(jié)竇部染成灰色，或者部分黑染，1.0分為整個(gè)淋巴結(jié)黑染或邊緣竇部染黑。
3、比較組內(nèi)得分，確定最佳染色的接枝納米炭濃度；比較組間得分，確定接枝納米炭混懸液和納米炭混懸液的淋巴示蹤效果的優(yōu)劣。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 炭懸液對(duì)小鼠淋巴結(jié)黑染程度

小鼠皮下注射試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在注射劑量為0.02ml/只的情況下，使用接枝納米炭濃度為2.5mg/ml的接枝納米炭混懸液時(shí)，對(duì)第一級(jí)的區(qū)域淋巴結(jié)開始染色，呈現(xiàn)淡灰色，隨著接枝納米炭劑量增加，染色范圍和程度開始增加，當(dāng)使用接枝納米炭濃度為50mg/ml的接枝納米炭混懸液，可以很好染色注射區(qū)域引流淋巴結(jié)，達(dá)到淋巴示蹤的效果，再增大劑量時(shí)，染色程度無(wú)明顯增加。因此，確定本品的規(guī)格為每支1ml，含接枝納米炭50mg，劑量適中，合理，便于臨床使用。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還證明，接枝納米炭混懸液的淋巴示蹤效果優(yōu)于納米炭混懸液的淋巴示蹤效果。
實(shí)施例8 接枝納米炭混懸液pH值對(duì)淋巴示蹤效果的影響為了考察接枝納米炭混懸液pH值對(duì)其示蹤作用的影響，特配制不同pH值的接枝納米炭混懸液，用小白鼠作淋巴示蹤試驗(yàn)。
試驗(yàn)方法1、pH調(diào)節(jié)劑枸櫞酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉、碳酸二氫鈉、氫氧化鈣、碳酸鈣、乳酸鈣等。將接枝納米炭混懸液分別調(diào)節(jié)為不同pH值備用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用10％氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值最佳。
2、取健康ICR小鼠70只，雌雄各半，均分7組，每組10只。用50μl微量注射器，從小鼠右后腳墊皮下注射，劑量為50mg/kg，在給藥后8分鐘，將各組小白鼠斷頸處死，肉眼觀察腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)的染黑程度。黑染程度記分標(biāo)準(zhǔn)是0分為淋巴結(jié)顏色無(wú)改變，0.5分為淋巴結(jié)竇部染成灰色，或者部分黑染，1.0分為整個(gè)淋巴結(jié)黑染或邊緣竇部染黑。3、比較得分，確定最佳染色的pH值。
表3 試驗(yàn)條件及結(jié)果

從以上結(jié)果可以看出，當(dāng)混懸液pH在6.0-8.0時(shí)，其示蹤性能較好，其中最好pH值為6.8-7.2。
實(shí)施例9 接枝納米炭混懸液對(duì)4T1乳腺癌動(dòng)物模型淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的療效觀察目的研究接枝納米炭混懸液對(duì)4T1乳腺癌動(dòng)物模型淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的療效。
材料4T1乳腺癌細(xì)胞，細(xì)胞密度為107·ml-1。BALB/C小鼠40只，平均體重18克·只-1，均分成低劑量實(shí)驗(yàn)組、高劑量實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。
方法在低劑量實(shí)驗(yàn)組、高劑量實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組BALB/C小鼠的左下肢腳墊注射接種4T1乳腺癌細(xì)胞，每只小鼠接種100μl；在陰性對(duì)照組BALB/C小鼠的左下肢腳墊注射培養(yǎng)液，每只小鼠接種100μl。常規(guī)飼養(yǎng)5周后，所有實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組的BALB/C小鼠的左下肢腳墊均長(zhǎng)出0.3-0.7cm大小的腫瘤。在低劑量實(shí)驗(yàn)組BALB/C小鼠的左下肢腳墊的腫瘤注射接枝納米炭混懸液100μl，在高劑量實(shí)驗(yàn)組BALB/C小鼠的左下肢腳墊的腫瘤注射接枝納米炭混懸液400μl，在所有對(duì)照組BALB/C小鼠的左下肢腳墊的腫瘤注射生理鹽水400μl。給藥后120小時(shí)處死所有小鼠，摘取接種同側(cè)的腿彎部淋巴結(jié)，病理切片，HE染色觀察。
結(jié)果所有實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組BALB/C小鼠的接種同側(cè)的腿彎部淋巴結(jié)均發(fā)生4T1乳腺癌轉(zhuǎn)移，左下肢腳墊的腫瘤注射接枝納米炭混懸液后120小時(shí)，同側(cè)的腿彎部淋巴結(jié)內(nèi)聚集大量接枝納米炭顆粒，淋巴結(jié)的癌轉(zhuǎn)移灶內(nèi)也有大量接枝納米炭顆粒，但是淋巴結(jié)周圍未見(jiàn)接枝納米炭顆粒存在。在這些淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移灶中，可見(jiàn)較明顯的癌細(xì)胞壞死、溶解，其中又以高劑量實(shí)驗(yàn)組的淋巴結(jié)內(nèi)癌細(xì)胞壞死更明顯。而陽(yáng)性對(duì)照組接種同側(cè)的腿彎部淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移壞死現(xiàn)象不明顯，陰性對(duì)照組無(wú)腿彎部淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移。
小結(jié)接枝納米炭有很好的淋巴趨向性，可以呈劑量依賴性殺死淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.接枝納米炭在制備用于淋巴示蹤和直接殺死淋巴結(jié)內(nèi)轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的靶向藥物上的用途。
2.一種接枝納米炭混懸液，含接枝納米炭、生理鹽水和pH調(diào)節(jié)劑。
3.權(quán)利要求2所述的接枝納米炭混懸液，其中每1000ml接枝納米炭混懸液中含接枝納米炭2.5-200克。
4.權(quán)利要求3所述的接枝納米炭混懸液，其中每1000ml接枝納米炭混懸液中含接枝納米炭50g。
5.權(quán)利要求2所述的接枝納米炭混懸液，其中pH調(diào)節(jié)劑為10％氫氧化鈉。
6.權(quán)利要求2所述的接枝納米炭混懸液，其中接枝納米炭混懸液的pH值為6.0至8.0。
7.權(quán)利要求6所述的接枝納米炭混懸液，其中接枝納米炭混懸液的pH值為6.7至7.1。
8.權(quán)利要求2所述的接枝納米炭混懸液的制備方法，包括(1)制備接枝納米炭；(2)將接枝納米炭分散于生理鹽水中，用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)接枝納米炭混懸液的pH值為6.7至7.1。
9.權(quán)利要求8所述的制備方法，其中接枝納米炭的制備方法包括采用炭黑為原料，經(jīng)過(guò)乙酸乙酯脫脂，酸洗堿洗降低灰分和重金屬，然后大量水洗去酸、堿，制成純化納米炭；將該純化納米炭在67％濃HNO3中，加溫至100℃，在該溫度下回流100小時(shí)；待反應(yīng)后的炭黑硝酸溶液的溫度下降到常溫后，在5600rpm下離心30分鐘；取上層黑色液體，在溫度70℃下減壓蒸發(fā)后得到黑色固體；將該黑色固體溶于水中，在150℃的烘箱里烘8小時(shí)，得到的黑色固體轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)娜萜髦?，加水，使?0％NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.9；然后在70℃溫度下減壓蒸發(fā)后得到黑色固體即得接枝納米炭。
10.權(quán)利要求8所述的制備方法，其中步驟(2)包括向接枝納米炭中加入生理鹽水，通過(guò)攪拌、超聲震蕩等機(jī)械方法使接枝納米炭在水溶液中均勻分散成接枝納米炭混懸液；用堿性溶液調(diào)節(jié)接枝納米炭混懸液的pH值為6.7至7.1，將調(diào)節(jié)pH值后的接枝納米炭混懸液用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾，除去大顆粒和細(xì)菌；然后分裝，加塞，壓鋁蓋，檢漏，質(zhì)檢，包裝。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種接枝納米炭混懸液，其由接枝納米炭顆粒、生理鹽水和pH調(diào)節(jié)劑所組成；本發(fā)明還公開了接枝納米炭和接枝納米炭混懸液的制備方法。與現(xiàn)有技術(shù)比較，制備接枝納米炭混懸液不需要分散助懸輔料，也不需要使用高剪切力研磨分散設(shè)備；接枝納米炭混懸液注射到人或動(dòng)物的機(jī)體的部位后，迅速進(jìn)入注射部位的引流淋巴結(jié)，將淋巴結(jié)染色呈黑色或灰黑色，起到淋巴示蹤的效果，可以作為淋巴示蹤藥物使用；將接枝納米炭混懸注射液注射到惡性腫瘤部位后，可以迅速到達(dá)惡性腫瘤的引流淋巴結(jié)，可以直接殺死淋巴結(jié)內(nèi)的轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞，因此可以作為淋巴靶向藥物使用。
文檔編號(hào)A61K47/02GK1672677SQ200410092028
公開日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2004年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月26日
發(fā)明者唐小海 申請(qǐng)人:成都市藥友科技發(fā)展有限公司