專利名稱：修飾的eb病毒lmp1編碼序列,其制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于Epstein-Barr病毒(EBV)DNA的序列，特別是涉及經(jīng)修飾的編碼EBV潛伏膜蛋白1抗原(LMP1)基因的DNA序列，其制備方法及其在生產(chǎn)用于控制EBV感染相關(guān)疾病的藥物和DNA疫苗中的應(yīng)用。
EBV是引起常見于兒童和年青人的傳染性單核細(xì)胞增多癥的病原體。人群中，平均約有90％以上的成年人遭受過EBV的感染。該病毒終生在口咽部產(chǎn)生并通過唾液途徑傳播。其中青年人的感染則常常發(fā)生病癥，表現(xiàn)有高燒、白細(xì)胞計數(shù)增加、咽喉疼痛及肝脾腫大等癥狀。兒童期被感染者一般沒有任何臨床癥狀或僅表現(xiàn)輕微的上呼吸道感染癥狀(參見EP-A0726315)。有些個體，由于宿主免疫反應(yīng)與帶毒細(xì)胞持續(xù)存在這兩種因素的相互作用，可能導(dǎo)致EBV相關(guān)腫瘤的發(fā)生。其中伯基特氏淋巴瘤的發(fā)生與發(fā)展與染色體重排有關(guān)。盡管并不是所有病例的腫瘤細(xì)胞中都含有EBV基因組，但在某些高發(fā)地區(qū)，有97％的伯氏淋巴瘤與EBV相關(guān)，而且控制EBV很可能減少伯氏淋巴瘤的發(fā)生。特別值得注意的是，就與EBV相關(guān)的其他腫瘤而言，差不多100％的人鼻咽癌(NPC)與EBV感染有關(guān)。大多數(shù)鼻咽癌都首先發(fā)生在鼻后區(qū)的咽隱窩部，并隨著病情惡化而很快發(fā)生轉(zhuǎn)移。目前臨床上常常通過檢測VCA/IgA和EA/IgA等抗體來早期診斷鼻咽癌并以其作為二級預(yù)防手段。
鑒于EBV與某此腫瘤的關(guān)系，人們一直在研究并試圖制備EBV特異性相關(guān)抗原、其突變蛋白及它們的抗體和核苷酸編碼序列，以其作為早期診斷EBV相關(guān)腫瘤的工具，特別是用于制備可控制腫瘤發(fā)生與發(fā)展的一個或多個因素的藥物或疫苗。例如，國際專利申請97/45444號公開了可用于制備亞單位疫苗或核酸疫苗的細(xì)胞毒性EBV病毒T細(xì)胞抗原決定簇。國際專利申請WO95/24925號描述了用作亞單位疫苗以誘導(dǎo)CD8+CTL反應(yīng)的EBV細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原決定簇。國際專利申請WO94/25599公開了穩(wěn)定地表達(dá)EBV抗原性糖蛋白gp250和gp350或其混合物的倉鼠細(xì)胞系及制備和培養(yǎng)方法。
已有越來越多的證據(jù)表明，EB病毒潛伏膜蛋白1(LMP1)對細(xì)胞生長和分化有重要作用，與幾種人類惡性疾病如鼻咽癌(NPC)、何杰金氏病及免疫母細(xì)胞淋巴癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)(Rickinson AB etal.，Virology，3nd ed.，NY，Raven Press，2397-446，1996)。Wang等人(WangD et al，An EBV membranee proteim expressed in immortalized lymphocytestransforms established rodent cells，cell 43831-40，1995)早期研究證明了EBV-LMP1基因有致癌活性，并闡明了潛伏性EBV感染與某此腫瘤發(fā)生的直接關(guān)聯(lián)。B淋巴細(xì)胞可長期攜帶EB病毒，而且LMP1在B淋巴細(xì)胞內(nèi)的瞬時過表達(dá)可誘導(dǎo)DNA合成。在表皮細(xì)胞中，LMP1可誘導(dǎo)已知能夠刺激細(xì)胞生長的表皮生長因子受體(EGFR)的表達(dá)。另外，已發(fā)現(xiàn)LMP1蛋白的活性區(qū)域特別是胞漿內(nèi)羧基末端與EBV致癌活性有關(guān)。
我們首先證明`EB病毒感染人胚鼻咽上皮細(xì)胞移植于裸鼠，在TPA和丁酸的協(xié)同作用下能誘發(fā)人鼻咽癌。
目前，雖然已對LMP1的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行了較深入的研究，但迄今尚未見有關(guān)修飾的LMP1基因及其相關(guān)疫苗的報道。
本發(fā)明的一個目的是提供EB病毒潛伏膜蛋白基因衍生的DNA序列，該序列基本上是由缺失了致癌相關(guān)區(qū)域的部分潛伏膜蛋白基因序列組成的。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的序列具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個目的是提供生產(chǎn)攜帶如上限定的基因片段的重組DNA序列的方法，該方法包括(1)提供刪除了潛伏膜蛋白1的部分致癌相關(guān)區(qū)域的DNA片段。
(2)使用適當(dāng)?shù)囊铮訮CR方法擴增步驟(1)的DNA片段。
(3)將按照步驟(2)方法制得的DNA片段連接到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體上，以得到攜帶缺失了EBV致癌區(qū)域之潛伏膜蛋白1基因的重組DNA。
本發(fā)明的再一個目的涉及上述重組DNA片段在制備用于診斷或治療EBV相關(guān)疾病的藥物或疫苗中的應(yīng)用。


圖1顯示從已知攜帶LMP1基因的重組質(zhì)粒pUC18-DhetI中獲得缺失了致癌相關(guān)序列的LMP1基因大片段(LMP1Δ)的操作。
圖2顯示攜帶LMP1Δ大片段的重組質(zhì)粒pcDNAIII-LMP1Δ的構(gòu)建。
圖3顯示分別導(dǎo)入了LMP1、LMP1Δ的NIH3T3細(xì)胞及未導(dǎo)入任何外來DNA的正常NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)6天時間內(nèi)的細(xì)胞增殖曲線。
圖4顯示在不同的效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞比例條件下測得的百分細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷活性。
本發(fā)明涉及基于EBV之潛伏膜蛋白1基因(LMP1)的修飾的DNA片段、其制備與擴增方法及其在生產(chǎn)用于診斷和治療包括鼻咽癌在內(nèi)的EBV相關(guān)疾病的藥物或疫苗中的應(yīng)用。
EBV是一種屬于皰疹病毒科的嗜淋巴細(xì)胞病毒。在靈長類動物宿主中，其能夠以整合狀態(tài)潛伏于B細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致被轉(zhuǎn)染的B細(xì)胞增殖和永生化。在EBV潛伏感染期間，潛伏基因?qū)τ诩?xì)胞的轉(zhuǎn)化和增殖各自發(fā)揮不同的功能，其中已知特別重要的是EB病毒核抗原2(EBNA2)和潛伏膜蛋白1(LMP1)。
已知潛伏膜蛋白1基因位于EBV基因組的BamHI-Nhet大片段上，其可讀框(ORF)長約1311bp，相當(dāng)于EBV全序列中的核苷酸序號169474至168163(左向)。LMP1是由386個氨基酸組成的磷酸化的完整跨膜蛋白。目前已知，LMP1是EBV基因編碼的唯一具有轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞活性的膜蛋白。LMP1基因表達(dá)陽性細(xì)胞顯示有較高的增殖能力和低分化程度。LMP1蛋白在結(jié)構(gòu)上與某此離子通道蛋白相似，其跨膜區(qū)參予配體結(jié)合，而游離于胞漿中的氨基和羧基末端則具有偶聯(lián)功能，參予細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞。
另外，LMP1還通過調(diào)節(jié)一系列活性因子的活性阻止細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞惡性生長。例如，其可通過活化NFKb而參予細(xì)胞癌變過程，并誘導(dǎo)A20的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，LMP1基因序列的變異導(dǎo)致氨基酸序列特別是LMP1羧基末端序列的改變，進(jìn)而改變其抗原性，并改變腫瘤細(xì)胞表面組織相容性抗原標(biāo)志，使致癌基因活化的宿主細(xì)胞逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，致使細(xì)胞發(fā)生癌變。
更具體地說，在鼻咽癌發(fā)生與發(fā)展過程中，LMP1是目前已知的EBV基因編碼的唯一具有轉(zhuǎn)化上皮細(xì)胞活性的膜蛋白。另外LMP1也在MHC-1類限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的免疫呈遞、識別和加工中發(fā)揮重要作用。LMP1 N未端跨膜區(qū)域為EBV誘導(dǎo)的人特異性T細(xì)胞毒性殺傷提供了特異性靶抗原。在另一方面，在LMP1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)粘附分子(如LFA1、LFA3、ICAM等)的表達(dá)水平提高，從而在免疫識別期加強了效應(yīng)分子與靶分子的結(jié)合?；贚MP1基因的這些功能特征，本發(fā)明人試圖刪除LMP1基因3′末端對細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能必不可少的部分序列，而保留其中具有免疫原活性和特異性殺傷活性的CTL表位部分，得到經(jīng)過缺失修飾的突變體LMP1編碼序列?？梢允褂没谝阎腖MP1氨基酸序列設(shè)計的引物，從適當(dāng)?shù)腄NA文庫中篩選LMP1編碼序列。另外，也可以從適當(dāng)組織來源如人鼻咽組織中制備的RNA，然后以反轉(zhuǎn)錄方法制備LMP1基因。當(dāng)然，為了方便起見，最好使用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶從攜帶LMP1基因的重組質(zhì)粒中直接得到所需的DNA片段。
在前兩種情況下，可以在對所說片段進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎椇?，在F4 DNA連接酶存在下，將其連接到用同樣確切的適當(dāng)載體(如pcDNAIII)上，然后再用適當(dāng)內(nèi)切酶從攜帶LMP1的重組載體上切掉，不需要的片段，以得到包括對于表達(dá)產(chǎn)物特異性細(xì)胞毒殺傷活性及免疫原活性必不可少的DNA編碼序列，同時缺失了C未湍的具有細(xì)胞轉(zhuǎn)化和致癌能力的DNA片段(NcoI-NcoI片段)的重組表達(dá)載體。
可以使用本領(lǐng)域已知的任何已知的方法瞬時轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)恼婧怂拗骷?xì)胞，如CHO、COS、BHK等哺乳動物細(xì)胞?？墒褂玫霓D(zhuǎn)染方法包括，但不只限于顆粒轟擊法、電穿孔法、直接微量注射法、借助脂轉(zhuǎn)染試劑(如Lipofectarmine或Lipofectin試劑)的方法，以及病毒(如經(jīng)過適當(dāng)修飾的腺病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒)介導(dǎo)的DNA定向送遞或轉(zhuǎn)移方法等。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，發(fā)明人首先從預(yù)制備的，攜帶LMP1全基因的EBV重組質(zhì)粒pVC18-Dhet I中切出長約495bp的NcoI-NcoI片段，從而使所說的LMP1基因失去轉(zhuǎn)化細(xì)胞和進(jìn)一步的誘導(dǎo)細(xì)胞惡變的能力。
可使用EBV基因組中的LMP1基因(MtuI-MiuI片段)，經(jīng)單一酶切后得到刪除了LMP1部分序列的MS187片段(LMP1Δ-MS187片段)。以此片段為模板并使用適當(dāng)?shù)腜CR引物對其進(jìn)行PCR擴增，然后以瓊脂糖電泳法分離并回收之。
然后在T4DNA連接酶存在下將缺失了致癌相關(guān)部分序列(NcoI-NcoI片段)的LMP1基因，即本文中所說的LMP1Δ大片段連接到適當(dāng)?shù)恼婧吮磉_(dá)質(zhì)粒如PCNAIII中。用如此得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)母惺軕B(tài)大腸桿菌細(xì)胞(如大腸桿菌DH52細(xì)胞)，以擴增殖所需的重組質(zhì)粒。經(jīng)大量制備、純化及定量分析后，用所得到的重組表達(dá)質(zhì)粒(pcDNAIII-LMP1Δ)瞬時轉(zhuǎn)化敘利亞地鼠腎成纖維細(xì)胞(BHK細(xì)胞)。最好使用本領(lǐng)域已知的Lipofectamine試劑轉(zhuǎn)染法完成真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟。
以上所述的所有DNA操作步驟，除特別指出者外均按照下Sanbrook等人(Molecular Cloning，Alaboraory Manual，2nd，ed.，Cold SpringHarbor laboretory Press，1989)所述的標(biāo)準(zhǔn)方法完成。
可將上述重組質(zhì)粒(pcDNAIII-LMP1Δ)和空質(zhì)粒載體(pcDNAIII)分別導(dǎo)入BHK靶細(xì)胞，用NPC陽性血清和LMP1特異性單克隆抗體(S12)，在間接免疫螢光法檢測細(xì)胞中LMP1Δ的表達(dá)。另一方面，分別將攜帶未缺失所述片段之LMP1基因的重組質(zhì)粒(pSG5-LMP1)和攜帶缺失了致癌相關(guān)序列之LMP1基因(LMP1Δ)的重組質(zhì)粒(pcDNAIII-LMP1Δ)導(dǎo)入NHI3T3細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞后觀察細(xì)胞形態(tài)及血清依賴性改變。另外，分別給裸鼠皮下接種導(dǎo)入了LMP1基因、LMP1Δ基因的3T3細(xì)胞和正常3T3細(xì)胞，4周后觀察動物皮下接種部位的腫瘤生長。結(jié)果可見，接種含有LMP1基因之3T3細(xì)胞的動物局部皮下有瘤狀腫塊生長，而接種含有LMP1Δ基因和不含任何外來基因之3T3細(xì)胞的動物則未見有皮下瘤狀腫塊生長。
在上述體外和體內(nèi)實驗基礎(chǔ)上，進(jìn)一步使用分別接種不同劑量pcDNAIII-LMP1Δ和空質(zhì)粒載體(100μg/動物)的Balb/c小鼠作為動物模型，觀察免疫接種后動物的體內(nèi)抗體生成和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性。
以重組DNA刺激的免疫動物的脾淋巴也細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，并以導(dǎo)入了重組質(zhì)粒pcDNAIII-LMP1Δ的G418抗性細(xì)胞作為靶細(xì)胞，按適當(dāng)?shù)陌?效細(xì)胞比例混合并常規(guī)保溫后，在相應(yīng)底物存在下，以乳酸脫氫酶法檢測效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷水平，間接判定接受本發(fā)明的DNA免疫的動物體內(nèi)CTL的活性水平(百分殺傷率)。、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、綜上所述，本發(fā)明人首先成功地構(gòu)建了攜帶修飾的缺失了致癌相關(guān)序列之LMP1基因的重組表達(dá)載體。以該重質(zhì)顆瞬時轉(zhuǎn)染真核宿細(xì)胞(BHK細(xì)胞)后，可使用相應(yīng)的特異性抗體(S12)檢測到LMP1蛋白的表達(dá)。使用LMP1和LMP1Δ體外轉(zhuǎn)化NIH3T3細(xì)胞的比較實驗結(jié)果表明，LMP1基因能夠明顯地降低或排除細(xì)胞的血清依賴性、軟瓊脂集落形成及轉(zhuǎn)化效應(yīng)細(xì)胞等生物學(xué)行為能力。由于刪去了LMP1中的部分致癌相關(guān)序列，所以當(dāng)用LMP1Δ DNA序列接種裸鼠后18個月未見動物有腫瘤生長。特別是我們使用Ba1b/c小鼠模型進(jìn)行的實驗顯示，當(dāng)動物接受LMP1ΔDNA編碼序列后2-8周不同時間均可見有特異性抗體反應(yīng)。另一方面，用攜帶LMP1Δ編碼序列的重組DNA免疫動物后，可在體內(nèi)表達(dá)、加工和呈遞細(xì)胞表示的特異性抗原決定簇，進(jìn)而激活和誘導(dǎo)特導(dǎo)性細(xì)胞毒T細(xì)胞反應(yīng)。
因此，我們的研究證明，可以使用刪除了部分細(xì)胞結(jié)合與致癌相關(guān)序列(約495bp的NcoI-NcoI片段)的EBV潛伏膜蛋白1的DNA編碼序列，以相對簡單的方法制得可用于治療和預(yù)防目的重組DNA序列。例如，可以將本發(fā)明的LMP1Δ，或攜帶所說的基因的重組DNA與已知EBV感染細(xì)胞中制得到相應(yīng)序列進(jìn)行必要的同源性比較和/或表達(dá)水平測定，以檢測宿主體內(nèi)是否存在EBV感染相關(guān)疾病的致病傾向。特別是，可以將本發(fā)明LMP1Δ與適當(dāng)?shù)妮o助DNA混合，或連接到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體上制成DNA疫苗，并使用適當(dāng)?shù)腄NA導(dǎo)入方法，將本發(fā)明的DNA或核酸疫苗導(dǎo)入靶組織/細(xì)胞，作為一種有價值的治療和預(yù)防性疫苗，用于治療和預(yù)防某些EBV感染相關(guān)疾病，特別是鼻咽癌。
下例實施例旨在進(jìn)一步舉例描述而不是以任何方式限制本發(fā)明待批權(quán)利要求的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，在不違背本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本說明所述技術(shù)實施方案的各種改動和修飾均將落入本發(fā)明待批權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
實施例1刪除了致癌相關(guān)序列的LMP1Δ大片段的制備首先用限制性內(nèi)切酶NcoI消化攜帶LMP1基因的重組質(zhì)粒Puc18-DhetI(由美國哈佛大學(xué)Kieff教授提供)，從中切掉下長約495bP的致癌相關(guān)片段。用Khenw酶補平所得大片段的兩末端后，重新環(huán)化得到重組質(zhì)粒pUC18-MS187。然后以此片段為模板，并使用上游引物5′-GGGGCTAGATGGAACGCGACCTT-3′(SEQ ID NO1)和下游引物5′-GCCTTAAGTTAGTCATGTAGCTT-3′(SEQ ID NO2)，按下述反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴增94℃變性5分鐘后，按照94℃變1分鐘、55℃退火2分鐘和72℃聚合(延伸反應(yīng))2分鐘的程序共進(jìn)行35次循環(huán)，最后72℃延伸15分鐘。
經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離并回收所需的PCR產(chǎn)物。經(jīng)測序分析證實得到了缺失改癌相關(guān)序列并具有SEQ ID NO3中所示核苷酸序列的修飾LMP1基因大片段，并將其定名為LMP1Δ(參見圖1)。
實例施2重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNAHI-LMP1Δ的構(gòu)建用單一限制性內(nèi)切酶BamHI分別消化(37℃，1小時)真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNAIII(本室寶存)和按實施例1中所述方法制備的LMP1Δ基因片段。然后在上述反應(yīng)條件下再次用EcoRI酶消失。
分別用1％和1.5％瓊脂糖凝膠電游分離兩酶切產(chǎn)物，并使用質(zhì)粒快速回收試劑盒(Promaga)回收之。將回收得到的pcDNAIII質(zhì)粒DNA和同處理的LMP1Δ DNA片段按1∶2比例混合，經(jīng)連續(xù)的45℃水浴和冰水浴處理后向所得混合物中加入10XT4DNA連接酶緩沖液及T4DNA連接酶，以10ml總反應(yīng)體積于16℃下保溫過夜(參見圖2)。
用如此得到連接反應(yīng)混合物(5μl)轉(zhuǎn)化并用0.1McaCl2處理的感受態(tài)大腸桿菌DH52細(xì)胞，并在含有氨芐青霉素(1μg/ml)的LB瓊脂平板上37℃保溫過夜。
從瓊脂平板上收集氨芐青霉素抗性菌落，并使用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液將陽性轉(zhuǎn)化菌株繼續(xù)37℃培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)后收集的菌細(xì)胞，經(jīng)反復(fù)凍融破碎細(xì)胞后，用苯酚/氯仿從離心(12000rpm，5分鐘)上清中提取，并用乙醇沉淀DNA。
分別用單一BamHI、BamHI+EooR和單一XhoI酶消化按上述方法得到的重組質(zhì)粒，對其進(jìn)行酶切鑒定。然后大量制備質(zhì)粒DNA，并以分光光度法進(jìn)行定量分析。
實施例3重組質(zhì)粒pcDNAIII-LMP1Δ在真核宿主細(xì)胞中的表達(dá)(1)在含有10％胎牛血清的LB培養(yǎng)液中將敘利亞地鼠腎成纖維細(xì)胞(BHK細(xì)胞)培養(yǎng)(16-24小時)至生長對數(shù)期，洗細(xì)胞后以Lipofecfmine(20μl)轉(zhuǎn)染法用實施例2中得到的重組DNA轉(zhuǎn)染之(37℃，5％CO2，5小時)。轉(zhuǎn)染后換成合10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液，并于37℃繼續(xù)培養(yǎng)48小時。
培養(yǎng)完成后，用0.25％胰蛋白酶處理培養(yǎng)的細(xì)胞單層。用上述培養(yǎng)液洗細(xì)胞后涂布于微量滴定板上，4℃下用丙酮固定15分鐘并用PBS洗兩次。
向細(xì)胞孔內(nèi)加入NPC陽性血清及特異性LMP1抗體(S12)后，37℃保溫45分鐘。使用螢光素標(biāo)記的羊抗人IgG和羊抗小鼠IgG作為第二抗體，以本領(lǐng)域已知的間接免疫螢光法檢測BHK細(xì)胞中LMP1Δ蛋白的表達(dá)。以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞作為對照。結(jié)果可見，pcDNAIII-LMP1Δ瞬時轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞均呈現(xiàn)為免疫螢光陽性，而對照組BHK細(xì)胞則為陰性。
(2)在另一項比較實驗中，分別用上述重組質(zhì)粒pcDNAIII-LMP1Δ和攜帶完整LMP1基因的重組質(zhì)粒pSG5-LMP1(由美國哈佛大學(xué)Kieff教授惠贈)轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞(Swiss小鼠胚胎永生化成纖維細(xì)胞系)，并以未導(dǎo)入任何外源DNA的正常NIH3T3細(xì)胞作為對照(均為1×104細(xì)胞/孔)，加入含遞減濃度的胎牛血清(5％、1％、0.5％)的Eagle氏培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時后，觀察細(xì)胞的增殖水平。結(jié)果可見，pSG5-LMP1轉(zhuǎn)染的3T3細(xì)胞的生長狀態(tài)明顯好于pcDNAIII-LMP1Δ轉(zhuǎn)染的和未經(jīng)任何處源DNA轉(zhuǎn)染的3T3細(xì)胞。這一結(jié)果表明，LMP1Δ基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)產(chǎn)物可強有力地促進(jìn)細(xì)胞生長與增殖(參見圖3)。
(3)將上述實驗(2)中所述的三組細(xì)胞在添加有2％胎牛血清的1640培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)2周后，按常規(guī)方法從各組大約107個細(xì)胞中提取DNA，然后分別以三組細(xì)胞的DNA為模板，使用上游引物5′-GCGCCTAGHATGGAACACGACCTT-3′(SEQ ID NO4)，和下游引物5′-GCCTTAATTAGCATAGTAGCTT-3′(SEQ ID NO5)，按前述PCR反應(yīng)程序?qū)λ玫腄NA進(jìn)行PCR擴增。
PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離后顯示，以pSG5-LMP1轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞DNA為模板得到的擴增產(chǎn)物中存在一條約1.1kb的條帶，而以pcDNAIII-LMP1Δ轉(zhuǎn)染的3T3細(xì)胞DNA為模板得到的擴增產(chǎn)物中存在一條約800bp的條帶。相對地，對照組3T3細(xì)胞則未見任何來自外源DNA的電泳條帶。
實施例4以重組質(zhì)粒pcDNAIII-LMP1Δ免疫動物后誘發(fā)的EBV-LMP1特異性體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)(1)將5周齡Balb/c(H-2d)小鼠隨機分成4組，動物經(jīng)用1％苯巴比妥(0.2ml)麻醉后，分別肌肉內(nèi)注射(1)空質(zhì)粒pcDNAIII(100μg/動物)，和(2)pcDNAIII-LMP1Δ。三個實驗組動物經(jīng)肌肉內(nèi)注射途徑投用重組DNA的劑量分別為100μg/動物、20μg/動物和100μg+200單位白介素2(IL-2)/動物。第一次免疫后，分別于第二周和第六周進(jìn)行兩次加強免疫。第8周時采血并分離動物脾臟，以常規(guī)間接免疫螢光法檢測動物血清中的特異性抗體滴度，并以已知的乳酸脫氫酶法檢測LMP1特異性CTL活性水平。
為了檢測被免疫動物血清中的抗體水平，使用感染了LMP1基因的痘留病毒(Vac-LMP1)和在含有G418(Promega)的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的P815抗性細(xì)胞作為陽性抗原材料，使用螢光素標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為第二抗體，以間接免疫螢光法檢測不同組DNA免疫之小鼠血清中LMP1特異性抗體的存在及其水平，結(jié)果如下列表1所示。
表1 DNA免疫小鼠血清特異性抗體生成及其滴度DNA免疫血清抗原Vero/Vac-LMP1Vero 抗性P815空質(zhì)粒載體 - --100μg重組DNA1∶10 -1∶10200μg重組DNA1∶10 -1∶10100μg重組DNA1∶10 -1∶10+IL-2另一方面，將被免疫動物的脾細(xì)胞與Vac-LMP1感染正常小鼠脾細(xì)胞(10∶1)混合，并以所得混合細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞。使用在含有G418的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的，pcDNAIII-LMP1Δ轉(zhuǎn)染的P815細(xì)胞作為靶細(xì)胞。選擇最適靶細(xì)胞濃度及不同的效/靶比例，以乳酸脫氫酶法檢測被免疫動物的LMP1特異性CTL水平。結(jié)果如圖4所示。
從圖4所示的結(jié)果可以看出，經(jīng)用本發(fā)明的重組DNA免疫后，動物體內(nèi)LMP1特異性CTL活性隨著效/靶細(xì)胞比例的增加而升高。而且在各免疫組中，高劑量(200μg)組動物的CTL水平稍高于低劑量組，但沒有統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異。
序列表(1)一般信息(I)申請人中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所(II)發(fā)明名稱修飾的EB病毒LMP1編碼序列，其制備及應(yīng)用(III)序列5(IV)通信地址(A)聯(lián)系人周玲(B)街道宣武區(qū)迎新街100號(C)城市北京(D)國家中華人民共和國(E)郵編10052(V)計算機可讀形式(A)介體類型3。5寸軟盤(B)計算機IBM PC(C)操作系統(tǒng)WIN98(D)軟件WORD2000(VI)電訊信息電話86-10-63578308(2)SEQ ID NO。1的信息(i)序列特征(A)長度23bp(B)類型核酸TTAACTGGCACACACTCCCTTAGCCACA(2)SEQ ID NO。4的信息(i)序列特征(A)長度24bp(B)類型核酸(C)連型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型基因組DNA(iii)序列描述SEQ ID NO。4GCGCCTAGHATGGAACACGACCTT(2)SEQ ID NO。5的信息(i)序列特征(A)長度22bp(B)類型核酸(C)連型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型基因組DNA(iii)序列描述SEQ ID NO。5GCCTTAATTAGCATAGTAGCTT(C)連型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型基因組DNA(iii)序列描述SEQ ID NO。1GGGGCTAGATGGAACGCGACCTT(2)SEQ ID NO。2的信息(i)序列特征(A)長度23bp(B)類型核酸(C)連型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型基因組DNA(iii)序列描述SEQ ID NO。2GCCTTAAGTTAGTCATGTAGCTT(2)SEQ ID NO。3的信息(i)序列特征(A)長度964bp(B)類型核酸(C)連型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型基因組DNA(iii)序列描述SEQ ID NO。3CTGCCTTGCTCCTGACACACTGCCCTGAGGATGGAACACGACCTTGAGAGGGGCCCACCGGGCCCGCGACGGCCCCCTCGAGGACCCCCCCTCTCCTCTTCCCTAGGCCTTGCTCTCCTTCTCCTCCTCTTGGCGCTACTGTTTTGGCTGTACATCGTTATGAGTGACTGGACTGGAGGAGCCCTCCTTGTCCTCTATTCCTTTGCTCTCATGCTTATAATTATAATTTTGATCATCTTTATCTTCAGAAGAGACCTTCTCTGTCCACTTGGAGCCCTTTGTATACTCCTACTGATGAGTAAGTATTACACCCTTTGCCCCACACCCCCTTTCCCTTACTCTTCCTTCTCTAACGCACTTTCTCCTCTTTCCCCAGTCACCCTCCTGCTCATCGCTCTCTGGAATTTGCACGGACAGGCATTGTTCCTTGGAATTGTGCTGTTCATCTTCGGGTGCTTACTTGGTAAGATCTAACATTCCCTAGGAATTATTTACCACACCCCACTTTTCCAACCCTAACACTCTTTTTTCAACGCAGTCTTAGGTATCTGGATCTACTTATTGGAGATGCTCTGGCGACTTGGTGCCACCATCTGGCAGCTTTTGGCCTTCTTCCTAGCCTTCTTCCTAGACCTCATCCTGCTCATTATTGCTCTCTATCTACAACAAAACTGGTGGACTCTATTGGTTGATCTCCTTTGGCTCCTCCTGTTTCTGGCGATTTTAATCTGGATGTATTACCATGGCGGCGGTGATCCACACCTTCCTACGCTGCTTTTGGGTTCTTCTGGTTCCGGTGGAGATGATGACGACCCCCACGGCCCAGTTCAGCTAAGCTACTATGACTAACCTTTCTTTACTTCTAGGCATTACCATGTCATAGGCTTGCCTGACTGACTCTCCCTCCATTTACTGGGAATGCCTTAGCTAATCACC
權(quán)利要求
1，EB病毒潛伏膜蛋白1基因衍生的重組DNA序列，該序列基本上是由缺失了致癌相關(guān)區(qū)域的部分潛伏膜蛋白1基因序列組成的。
2，根據(jù)權(quán)利要求1的重組DNA序列，其中所說的序列具有SEQID NO3所示的核苷酸序列。
3，生產(chǎn)攜帶如權(quán)利要求1或2限定的重組DNA序列的方法，該方法包括(1)提供刪除了潛伏膜蛋白1的部分致癌相關(guān)區(qū)域的DNA片段。(2)使用適當(dāng)?shù)囊飳?，以PCR方法擴增步驟(1)的DNA片段。(3)將按照步驟(2)方法制得的DNA片段連接到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體上，以得到攜帶缺失了EBV致癌區(qū)域之潛伏膜蛋白1基因的重組DNA。
4，權(quán)利要求1或2限定的重組DNA序列在制備用于診斷或治療EBV相關(guān)疾病的藥物或疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供基于Epstein－Barr病毒(EBV)DNA的序列，特別是經(jīng)修飾的編碼EBV潛伏膜蛋白1抗原基因的DNA序列，其制備方法及其在生產(chǎn)用于控制EBV感染相關(guān)疾病的藥物和DNA疫苗中的應(yīng)用。
文檔編號A61K39/245GK1403574SQ0114208
公開日2003年3月19日 申請日期2001年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月11日
發(fā)明者曾毅, 周玲, 劉海鷹, 賈俊嶺, 王 琦 申請人:中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所