假病毒顆粒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在大腸桿菌中表達(dá)MSJg病毒顆粒的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大腸桿菌MS2噬菌體屬于正極性單鏈RNA球形病毒，基因組全長(zhǎng)3659bp，由編碼成 熟酶蛋白（或A蛋白）、外殼蛋白、復(fù)制酶蛋白和裂解蛋白等4種蛋白質(zhì)分子的基因組成， 每個(gè)MS2噬菌體病毒顆粒中包含180拷貝的外殼蛋白，一拷貝的成熟蛋白，及一分子的基因 組RNA。研究發(fā)現(xiàn)將MS 2噬菌體的成熟酶蛋白和外殼蛋白的基因以及包含基因調(diào)控序列的 5'非編碼序列克隆到表達(dá)載體中，經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)后能夠得到和野生噬菌體形態(tài)相同的病 毒樣顆粒（virusal like particle, VLP)，該顆粒內(nèi)部包裹有RNA分子，且具有耐核酸酶的 特性[2,3,4]。如果將外源基因片段插入到成熟酶包裝位點(diǎn)的下游，表達(dá)載體表達(dá)時(shí)將噬菌體 基因和外源基因轉(zhuǎn)錄成重組RNA，同時(shí)外殼蛋白進(jìn)行包裝，得到可以包裹重組RNA的病毒樣 顆粒，即Armored RNA病毒樣顆粒。Armored RNA病毒樣顆粒被廣泛應(yīng)用于RNA病毒檢測(cè) 中質(zhì)控品的構(gòu)建，此外該病毒外殼還被作為疫苗載體使用，被用于一些病原微生物抗原表 位表面展示的載體。研究人員在應(yīng)用該載體構(gòu)建高致病性H5N1禽流感病毒多肽疫苗時(shí)發(fā) 現(xiàn)，按照現(xiàn)有技術(shù)（Pickett G G，Peabody D S. Encapsidation of heterologous RNAs by bacteriophage MS2Coat proein[J]. Nucleic Acids Res, 1993, 21(19):4621-4626. ；Cheng Yangjian, Niu Jianjun, Zhang Yongyou, et al. Preparation of His-Tagged armored RNA phage particles as a control for real-time reverse transcription-PCR detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus[J]. Journal of clinical microb iology, 2006, 44 (10) :3557-3561;竇敏，張國(guó)廣，于廣福，等。含口蹄疫病毒IRES RNA病毒 樣顆粒表達(dá)載體的構(gòu)建[J]。中國(guó)生物工程雜志，2007,27 (9) :31-35)構(gòu)建的載體在大腸 桿菌細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)假病毒顆粒時(shí)產(chǎn)量較低，上述文獻(xiàn)中均采用將噬菌體整個(gè)基因組 利用PCR擴(kuò)增后連接入原核表達(dá)載體pET32a或pET28a等原核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，這 種載體在導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)候有幾個(gè)限制因素會(huì)影響假病毒顆粒相關(guān)蛋 白的表達(dá)，首先從菌體基因組結(jié)構(gòu)分析外殼蛋白是位于成熟酶蛋白的下游，原核載體 蛋白表達(dá)時(shí)一般上游的基因先翻譯表達(dá)，下游的基因后表達(dá)，但位于上游的成熟酶蛋白一 個(gè)病毒顆粒中只需要一個(gè)拷貝，若其過多表達(dá)肯定對(duì)下游的外殼蛋白基因的表達(dá)有一定影 響，而每一個(gè)病毒顆粒的衣殼構(gòu)成中需要180個(gè)拷貝的外殼蛋白，成熟酶蛋白只需要一個(gè) 拷貝，顯然要使表達(dá)載體多表達(dá)出假病毒顆粒，則外殼蛋白基因的大量表達(dá)是前提，原文獻(xiàn) 這種構(gòu)建方式顯然影響了 pET32a等原核表達(dá)載體對(duì)克隆到其多克隆位點(diǎn)的噬菌體外殼蛋 白基因的表達(dá)能力。其次MS2噬菌體基因組插入的是原核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)處，而所 使用的原核表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)前都有較長(zhǎng)的引導(dǎo)肽序列，這些引導(dǎo)肽的合成會(huì)消耗掉原 核細(xì)胞的部分翻譯能力，也勢(shì)必影響其下游基因的合成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種在大腸桿菌中表達(dá)MS2假病毒顆 粒的方法。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0005] -種在大腸桿菌中表達(dá)MS2假病毒顆粒的方法，包括如下步驟：
[0006] (1)合成下列引物：
[0007] CP-F (SEQ ID NOl):
[0008] 5' -GCCATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTC-3'
[0009] CP-R (SEQ ID N02)：
[0010] 5' -GCGGATCCTTAGTAGATGCCGGAGTTTGC-3,
[0011] MP-F (SEQ ID N03)：
[0012] 5' -GCGGATCCTCCTAGGAGG TTTGACCTGT-3，
[0013] MP-R (SEQ ID N04)：
[0014] 5' -GCAAGCTTGCTCTATCTAGAGAGCCGTTG-3'
[0015] Pac-F (SEQ ID N05)：
[0016] 5' ~GCAAGCTTTAGACGCCGGCCATTCAAACATG~3,
[0017] Pac-R (SEQ ID N06)：
[0018] 5' ~CGCGGCCGCCGAGAGAAAGATCGCGAGGAAG~3,；
[0019] (2)用引物CP-F和CP-R通過PCR擴(kuò)增出菌體的外殼蛋白基因序列；用引 物MP-F和MP-R通過PCR擴(kuò)增出MS 2噬菌體的成熟酶基因序列；用引物Pac-F和Pac-R通 過PCR擴(kuò)增出MS2噬菌體的包裝位點(diǎn)基因序列；
[0020] (3)將上述外殼蛋白基因序列、成熟酶基因序列和包裝位點(diǎn)基因序列依次連接到 沒有引導(dǎo)肽序列的原核表達(dá)載體中，得到重組載體；
[0021] (4)將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，再依次收集菌體、破碎菌體、離心、 取上清液、過濾及純化，即得所述MS 2假病毒顆粒。
[0022] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述步驟（3)具體包括如下步驟：
[0023] a、對(duì)所述沒有引導(dǎo)肽序列的原核表達(dá)載體和上述外殼蛋白基因序列用NheI和 BamHI雙酶切，再連接形成第一中間載體；
[0024] b、對(duì)上述第一中間載體和上述成熟酶基因序列用BamHI和HindIII雙酶切，再連 接形成第二中間載體；
[0025] c、對(duì)上述第二中間載體和上述包裝位點(diǎn)基因序列用HindIII和NotI雙酶切，再連 接形成所述重組載體。
[0026] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述沒有引導(dǎo)肽序列的原核表達(dá)載體為 pET21a〇
[0027] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述步驟（4)的大腸桿菌為BL21。
[0028] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述步驟（2)的PCR的模板為pMS27。
[0029] 本發(fā)明的有益效果是：
[0030] 本發(fā)明的方法將MS2噬菌體外殼蛋白基因序列、成熟酶基因序列和包裝位點(diǎn)基因 序列依次連接到?jīng)]有引導(dǎo)肽序列的原核表達(dá)載體中，得到重組載體，該重組載體能夠在大 腸桿菌中表達(dá)MS2噬菌體假病毒顆粒，且具有很高的表達(dá)量。
【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1為本發(fā)明的實(shí)施例1構(gòu)建的重組載體的序列結(jié)構(gòu)圖，其中RBS為核糖體結(jié)合 位點(diǎn)，pac指噬菌體包裝位點(diǎn)；
[0032] 圖2為本發(fā)明的實(shí)施例2的SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，其中1--對(duì)照載體pCPES未 加 IPTG誘導(dǎo)，2--對(duì)照載體pCPES加 IPTG誘導(dǎo)（箭頭所示為誘導(dǎo)表達(dá)蛋白條帶)，3-- pET2Ia-CMPc載體未加 IPTG誘導(dǎo)，4--pET2Ia-CMPc載體加 IPTG誘導(dǎo)(箭頭所示為誘導(dǎo)表 達(dá)蛋白條帶)，M-Marker ；
[0033] 圖3為本發(fā)明的實(shí)施例4中表達(dá)的MS2假病毒顆粒的掃描電鏡照片；
[0034] 圖4為本發(fā)明的實(shí)施例5中RNase和/或DNase消化pET21a_CMPc載體的電泳照 片。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 以下通過【具體實(shí)施方式】結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明和描述。
[0036] 下述實(shí)施例中的pCPES來(lái)自于文獻(xiàn)"竇敏，張國(guó)廣，于廣福，等。含口蹄疫病毒IRES RNA病毒樣顆粒表達(dá)載體的構(gòu)建[J]。中國(guó)生物工程雜志，2007,27 (9):31-35"構(gòu)建，該載 體是將大腸桿菌噬菌體的基因組構(gòu)建在載體pET32a中，同時(shí)在大腸桿菌基因組后插入了 口蹄疫的IRES片段基因。
[0037] pMS27質(zhì)粒參見中國(guó)發(fā)明專利ZL200710008843. 6。
[0038] BL21 購(gòu)自 novagen 公司。
[0039] 實(shí)施例1
[0040] 采用PCR擴(kuò)增、酶切、連接等方法進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建；
[0041] (1)合成以下引物，引物由上海英駿生物公司合成，工具酶等購(gòu)自大連寶生物公 司：
[0042] CP-F ：5' ~GCCATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTC~3,
[0043] CP-R ：5' -GCGGATCCTTAGTAGATGCCGGAGTTTGC-3'
[0044] MP-F ：5' -GCGGATCCTCCTAGGAGG TTTGACCTGT-3'
[0045] MP-R ：5' -GCAAGCTTGCTCTATCTAGAGAGCCGTTG-3'
[0046] Pac-F ：5' -GCAAGCTTTAGACGCCGGCCATTCAAACATG-3;
[0047] Pac-R ：5' -CGCGGCCGCCGAGAGAAAGATCGCGAGGAAG-3'
[0048] (2)以CP-F和CP-R為引物，以pMS27為模板（D. S. Pesbody教授惠贈(zèng))，擴(kuò)增出外 殼蛋白基因序列，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為400bp左右，擴(kuò)增體系為10XPCR bufferl.OyL， CP-F 和 CP-R (10 μ mol/L)均為 0· 5 μ L，dNTPO. 5 μ L，TaqDNA 聚合酶（5U/ μ L) 0· 3 μ L，質(zhì) 粒pMS271. 0 μ L，超純水補(bǔ)足總體積為20 μ L，反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min ;然后94°C變性 45s，55°C退火45s，72°C延伸30s，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸8min，4°C保存，PCR產(chǎn)物經(jīng) 1 %瓊脂糖凝膠電泳確定目的條帶。PCR擴(kuò)增出的特異性片段，用NheI和BamHI雙酶切，先 進(jìn)行他61酶切，酶切體系為？〇?產(chǎn)物2(^1^，10\]\11311冊(cè)^4以1^，他613以1^，超純水補(bǔ)足至 40μ L 體系，37°C 酶切 4h 后，65°C 15min 終止反應(yīng)，然后加入 IOXK buffer6y L，BamHI4y L， 超純水10 μ L，37°C酶切4h。酶切產(chǎn)物1%凝膠電泳分離后，紫外箱內(nèi)切割目的條帶。凝膠回 收試劑盒回收酶切片段(上海華舜生物公司），凝膠回收步驟為1)在紫外燈下切取的相應(yīng)待 回收DNA片段，放入I. 5mL的Ep管中，按IOOmg瓊脂糖加入300 μ L Sl液的比例加入Sl液， 置50-60°C溫浴lOmin，為使膠充分溶解，每隔2min搖晃一次；若瓊脂糖重量低于lOOmg，用 水補(bǔ)齊至l〇〇mg。務(wù)必將瓊脂糖充分溶解；2)如果回收片段小于300bp，則加入1/3S1體積 的異丙醇，混勻，50-60°C放置lmin，如果回收片段大于300bp，此步可跳過；3)將溶解液體 加至吸附柱中，l〇〇〇〇g離心15s，倒掉收集管中的液體，將吸附管放置同一個(gè)收集管中；4) 在吸附柱中加入500 μ L Wl液，IOOOOg離心15s，倒掉收集管中的液體，將吸附管放于同一 個(gè)收集管中；5)在吸附柱中加入500 μ L Wl液，室溫靜置lmin，IOOOOg離心15s，倒掉收集 管中的液體，將吸附管放于同一個(gè)收集管中；6) IOOOOg離心lmin，將吸附柱放于另一個(gè)干 凈的1.5mLEP管中，在吸附膜的中間加30μLTl液，靜置lmin，10000g離心lmin，-2(rC 保存待用。如果室溫低于20°C，可延長(zhǎng)室溫放置時(shí)間，或在37°C溫浴lmin，以保證DNA充分 洗脫。回收的酶切DNA片段與同樣酶切凝膠回收純化(按照上述酶切PCR擴(kuò)增DNA片段的 步驟操作）的原核表達(dá)載體pET21a連接（Novagen公司產(chǎn)品)，連接反應(yīng)體系為（總體積為 10μL) :pET21a載體片段lμL，T4DNA連接酶lμL，10XT4DNAbuf?erlμL，目的片段7μ