專利名稱：編碼診斷相關(guān)的病毒衣殼抗原的eb病毒dna序列，通過聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)生的表達(dá)克隆和該 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼一種EB病毒相關(guān)抗原的EB病毒基因組的DNA序列，和定位及分離至少部分個(gè)別DNA序列的方法，這一抗原可用于下面所提及的方法和診斷組合物及藥物組合物。而且，本發(fā)明涉及一種快速、簡便、極靈敏和高度專一性的檢測(cè)針對(duì)EB病毒相關(guān)抗原的抗體的方法及組合物或試劑盒。在這些檢測(cè)中，所述EB病毒抗原明顯提高了病人血清中特異性抗體種類的檢出率。該檢出率提供了有關(guān)供體感染狀態(tài)如感染前、初次感染、慢性感染，恢復(fù)期和致瘤條件的可信結(jié)論。
EB病毒(EBV)感染及結(jié)果EB病毒引起的初始癥狀為傳染性單核細(xì)胞增多。這主要涉及兒童或年輕的成人。平均百分之九十多的成年人感染過EB病毒并成為它的終生攜帶者。這種病毒終生在口咽部產(chǎn)生并通過口的途徑傳播。而且幼童的感染往往會(huì)導(dǎo)致幾乎無癥狀的血清轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，成年人的感染則經(jīng)常引起伴有高燒、白細(xì)胞數(shù)量顯著增加、咽喉炎、肝臟和脾臟腫大的嚴(yán)重疾病。猩紅熱、弓形體病、白喉和白血病須經(jīng)診斷手段加以區(qū)別。
慢性感染與急性原發(fā)性感染相比，EBV感染很少導(dǎo)致慢性的或慢性波動(dòng)癥狀。
毛狀白斑在免疫缺損病人中，EBV能導(dǎo)致舌部的嚴(yán)重病變。
在免疫喪失個(gè)體中EBV的重新激活抑制細(xì)胞介導(dǎo)的免疫導(dǎo)致EBV的重新激活。一個(gè)結(jié)果是抗體滴度升高，而且已描述了對(duì)多種可能狀況如免疫排斥的有害影響。
X染色體連鎖增殖綜合癥某些遺傳位點(diǎn)與男性同胞感染而導(dǎo)致致命的淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞疾病相關(guān)。
Burkitt′s淋巴瘤和EBVBurkitt′s淋巴瘤的發(fā)生與染色體重排有關(guān)。并非所有的腫瘤細(xì)胞里都含有EBV基因組。但是，至少在高發(fā)區(qū)，97％的這種腫瘤是EBV相關(guān)的，而且控制EBV感染可能會(huì)降低發(fā)生Buikitt′s淋巴瘤的風(fēng)險(xiǎn)。
鼻咽癌一種與EBV相關(guān)的“繼發(fā)疾病”另一種與EBV表現(xiàn)出100％相關(guān)的疾病為鼻咽癌(NPC)(“TheBiology of Nasopharyngeal Carcinoma”，UICC technical report series，vol.71，M.J.Simons and K.Shanmugaratnam(eds)，InternationalUnion Against Cancer，Geneva，p.t(1982)。NPC最常見發(fā)生在鼻后腔的Roserrmeller氏窩(咽隱窩)。病人往往只在頸部淋巴結(jié)中發(fā)生第一個(gè)典型轉(zhuǎn)移后才就醫(yī)。
EBV相關(guān)腫瘤的控制有三種可能的基本策略控制腫瘤1.早期檢測(cè)后進(jìn)行治療，2.將疾病的發(fā)生理想地推遲至平均壽命之外，和3.預(yù)防這些目標(biāo)也可在多因素疾病中實(shí)現(xiàn)，如多種腫瘤。可通過消除一種或多種必需因素(這些因素自身不一定能導(dǎo)致疾病)，或者可通過減少那些促進(jìn)顯現(xiàn)腫瘤發(fā)生條件的因素來降低疾病的發(fā)生率。應(yīng)用本發(fā)明的特異性病毒相關(guān)抗原、抗體或遺傳物質(zhì)作為工具，用于病毒相關(guān)腫瘤的早期診斷，有利于必需因子的排除。
應(yīng)用EBV相關(guān)基因產(chǎn)物診斷EBV相關(guān)的NPC在不能獲得確切組份的重組抗原時(shí)，最常規(guī)的病毒特異性血清學(xué)試驗(yàn)是基于免疫熒光試驗(yàn)，即在免疫熒光和免疫酶試驗(yàn)中使用具有各種特點(diǎn)的EBV基因組陽性細(xì)胞和/或預(yù)處理成常與細(xì)胞相關(guān)的抗原來源。表1總合了疾病、抗體和可用于診斷的病毒抗原。
表1EBV導(dǎo)致的疾病和可通過常規(guī)免疫熒光試驗(yàn)來確定的Ig—亞類特異性抗體反應(yīng)的相關(guān)性疾病VCA IgG IgMIgAEA IgGEBNA IgGMA1IgG正常成人 +- - - +成人急性感染(早期)++ + - + - -慢性感染 ++ - +/- +/- +/-？重新激活 ++ - + + +XLP2+- - +/- (+) ？NPC ++ - + +(D) + ++BL++ - - +(R) + +
VCA病毒衣殼抗原；EA早期抗原；EBNAEpstein—Burr核抗原；1.通過gp240/200免疫沉淀確定；2.XLP作為免疫喪失宿主的一個(gè)例子。
因?yàn)槊庖邞?yīng)答的制約，目前使用的EBV抗原不能被所有的EBV感染的人識(shí)別。而且，許多EBV相關(guān)抗原在蛋白水平上與其它皰疹病毒具有序列同源性。因此，本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供一種更可靠的診斷EBV感染的EBV相關(guān)蛋白。上述技術(shù)問題可通過所提供的權(quán)利要求書中表述的具體實(shí)施方案來解決。因此本發(fā)明提供一種沒有重大遺傳變異的EBV編碼探針。
本發(fā)明EBV特異性抗原的產(chǎn)生1.所有發(fā)現(xiàn)的結(jié)果表明，本發(fā)明的目的之一是提高檢測(cè)抗體種類和病毒衣殼抗原種類的特異性抗體試驗(yàn)的靈敏度，改進(jìn)一允許大量試驗(yàn)和更加標(biāo)準(zhǔn)化的體系。
2.重組DNA技術(shù)的應(yīng)用使確定一對(duì)改良EBV抗原性重要的多肽成為可能。用重組DNA分子轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞及在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)則可達(dá)到產(chǎn)生抗原的目的。
3.根據(jù)本發(fā)明，重組DNA的方法，包括聚合酶鏈反應(yīng)的改進(jìn)引物的選擇，被用以在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼23KDa、EBV蛋白(以BLLF2讀起)基因或至少部分基因的遺傳信息，如在細(xì)菌(如大腸桿菌屬，沙門氏菌屬，假單胞菌屬或牙孢桿菌屬)，酵母(如假絲酵母屬或釀酒酵母屬)，昆蟲細(xì)胞(如草地夜蛾SF251)及哺乳細(xì)胞(如Vero細(xì)胞，CHO細(xì)胞或淋巴細(xì)胞系)中表達(dá)。
4.而且，鑒定了編碼23KDaEBV蛋白的基因組區(qū)，并闡明了它們與診斷目的的相關(guān)性。因此，產(chǎn)生這些蛋白或其抗原決定簇的關(guān)鍵信息也在本發(fā)明中給予揭示。
該DNA序列可與一任何來源得到的DNA序列雜交，來源包括天然的、合成的或半合成的，其通過突變，包括核苷酸置換、缺失、插入及核苷酸序列的倒位，與編碼和EBVB95—8蛋白中讀碼框架BLRF2編碼的23KDa蛋白相關(guān)的至少一部分蛋白的DNA序列相關(guān)。優(yōu)選的雜交條件為低于同源雙體DNA分子熔點(diǎn)15～27℃的范圍內(nèi)。本發(fā)明涉及通過重組DNA技術(shù)制備EBV特異性抗體，及其在EBV相關(guān)疾病的診斷、預(yù)防和治療中的應(yīng)用。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是要鑒定一種新的E—B病毒抗原，其通過免疫學(xué)方法與E—B病毒相關(guān)疾病如鼻咽癌(NPC)，傳染性單核細(xì)胞增多癥和Burkitt′s淋巴瘤(見表1說明)相互關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是定位和鑒定EBV的基因組區(qū)域，例如已從B95—8細(xì)胞中克隆得到(American Type Culture Collection，Rockville，MD USA(ATCC)CRL1612)(Skare，J.and Strominger，J.L.Cloning and mapping ofBamHI endonuclease fragments of the DNA from the transformingB95—8 strain of Epstein Barr Virus；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 773860(1980))，其編碼具有診斷學(xué)重要性和與醫(yī)藥用途相關(guān)的所述抗原。這可通過雜交篩選方法結(jié)合與病人血清免疫沉淀來實(shí)現(xiàn)(

圖1)。本發(fā)明的又一目的是EBV基因組片段的亞克隆，例如可來自存在的EBV文庫，從編碼有用抗原p23的至少一部分的B95—8細(xì)胞克隆。這可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來實(shí)現(xiàn)，PCR可以不要求在讀碼框架末端有適當(dāng)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)而擴(kuò)增基因組DNA片段，并可通過適當(dāng)?shù)目寺》椒▽⑦@些含有引物序列合成末端的擴(kuò)增基因插入到表達(dá)質(zhì)粒中。很明顯，同樣的克隆方法可用于從其它與B95—8編碼序列不同的病毒分離物中擴(kuò)增目的基因。針對(duì)其目的，可能需要其它引物，其制備和選擇在本領(lǐng)域中已闡明。通過選擇具有附加序列的引物——序列的5’與編碼區(qū)互補(bǔ)(5′引物)或序列的3′與編碼區(qū)互補(bǔ)，使得直接從聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物建立克隆而不必通過廣泛的亞克隆成為可能，因?yàn)镻CR產(chǎn)物可通過附加的調(diào)控信號(hào)來優(yōu)化表達(dá)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)各種遺傳信息以產(chǎn)生蛋白，如在細(xì)菌(例如大腸桿菌屬、沙門氏菌屬、假單孢菌屬或芽孢桿菌屬)，酵母(如假絲酵母屬、釀酒酵母屬)，動(dòng)物細(xì)胞和人細(xì)胞(如Vero細(xì)胞；CHO—dhfr—細(xì)胞；結(jié)合一套適當(dāng)?shù)倪x擇系統(tǒng)，可選擇帶有功能性dhfr基因及由適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列調(diào)控的EBV基因的遺傳信息的質(zhì)粒；或淋巴母細(xì)胞系)中表達(dá)。由這些宿主細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白含有23KDa相關(guān)抗原決定簇(表位)，根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)，可合成為融合蛋白或非融合蛋白。為了由細(xì)菌產(chǎn)生融合蛋白，編碼EBV B95—8的p23的基因組亞片段的表達(dá)可導(dǎo)入至已知的質(zhì)粒pUC8中，并由如異丙基—β—D—硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)誘導(dǎo)。不同的表達(dá)產(chǎn)物用免疫學(xué)方法鑒定。為了產(chǎn)生只含天然存在蛋白或其部分的氨基酸序列的非融合蛋白，可修飾本發(fā)明的重組質(zhì)粒。如果一個(gè)寡核苷酸接頭被插入到表達(dá)載體中細(xì)菌蛋白編碼區(qū)和EBV相關(guān)蛋白編碼區(qū)之間，相應(yīng)于寡核苷酸接頭的氨基酸序列就變成了表達(dá)的融合蛋白的一部分。從表達(dá)該蛋白的轉(zhuǎn)化子中分離該融合蛋白后，它可通過氨基酸序列特異性蛋白酶在引入的氨基酸接頭處進(jìn)行切割，或者如果氨基酸接頭含有對(duì)酸切割敏感的肽鍵，則可通過酸處理(如甲酸)進(jìn)行裂解。
本發(fā)明的又一目的是應(yīng)用23KDa EBV相關(guān)蛋白或其亞區(qū)，或者如果適宜的活，EBV相關(guān)DNA片段或克隆，以生產(chǎn)診斷組合物(試劑盒)，用于臨床診斷或科學(xué)研究。這些檢測(cè)是基于己建立的方法，如ELISA、RIA(放免分析)或間接血凝試驗(yàn)。而且，EBV相關(guān)蛋白可用于如監(jiān)視免疫接種進(jìn)展、分析流行病學(xué)問題、病人治療(藥物成份)和生產(chǎn)作為治療EBV相關(guān)疾病如單核細(xì)胞增多癥、Burkitti′s淋巴瘤和鼻咽癌的預(yù)防措施的疫苗。總之，該蛋白可用于預(yù)防和治療EBV相關(guān)疾病，因?yàn)樗苷{(diào)節(jié)患有如NPC、慢性傳染性單核細(xì)胞增多癥或EBV相關(guān)的Burkitt′s淋巴瘤的病人的免疫應(yīng)答。
附圖的簡要說明圖1用EBV基因組的BamHI DNA片段選擇的雜交RNA體外翻譯產(chǎn)物的放射自顯影。應(yīng)用NPC病人的EBV特異性混合血清進(jìn)行免疫沉淀。通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離免疫沉淀的35S標(biāo)記蛋白并將X光片對(duì)膠曝光。對(duì)照，稱為“混合液”，含有所有的免疫沉淀EBV特異性蛋白。從放射自顯影中可發(fā)現(xiàn)針對(duì)23KDa的抗體存在于EBV陽性血清中，還顯于來自佛波醇酯誘導(dǎo)的P3HR1細(xì)胞的RNA可與EBV DNA的BamHI限制性內(nèi)切酶酶切片段雜交，該片段是在體外洗脫并翻譯的。翻譯產(chǎn)物用經(jīng)EBV基因組陰性的BJAB細(xì)胞預(yù)先吸附的混合EBV反應(yīng)性血清免疫沉淀，如以前所描述的方法(Seibl，R.and Wolf H.Mapping of Epstein—BarrVirus proteins on the genome by translation of hybrid—selected RNAfrom induced P3HR1 cell and induced Raji cells.Virology 1411—13(1985))。
圖2.與EBV B95—8基因組相關(guān)的mRNA 5精細(xì)圖譜圖的底部給出了EBV B95—8基因組的BamHI酶切位點(diǎn)，并且不同限制性片段用大寫和小寫字母標(biāo)注。通過對(duì)個(gè)個(gè)BamHI片段進(jìn)行雜交選擇而定位的蛋白的mRNA用數(shù)字和橫線來表示。從該精細(xì)圖譜中可發(fā)現(xiàn)針對(duì)23KDa的抗體存在于EBV恢復(fù)期血清中。
圖3.A)在BamHI—L片段中讀碼框架的定位23KDa大小的EBV抗原通過雜交選擇翻譯進(jìn)行作圖。BLLF1編碼EBV主要膜抗原，BLLF2、BLRF1和BLRF3編碼量論分子量為31.11KDa和12KDa的蛋白。BLLF3也畫在附近的BamHI—S片段中，但23KDa抗原編碼區(qū)只在于BamHI—L中，因此編碼23KDa抗原最可能的選擇似乎是BLRF2編碼的蛋白。
B)BLRF2雙鏈5′和3′端的擴(kuò)大及應(yīng)用于PCR的寡聚脫氧核苷酸引物引物1與編碼23KDa蛋白N—末端的DNA序列雜交?；パa(bǔ)鏈在第二個(gè)密碼子后開始，在翻譯起始點(diǎn)附近的區(qū)域改成一BspHI位點(diǎn)，用以克隆到ATG—表達(dá)載體。這包括將第二個(gè)密碼子從TCA改為AGC，兩者都編碼絲氨酸。ATG啟始密碼子上游的寡脫氧核苷酸序列編碼一BamHI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和幾個(gè)額外的堿基，以便于限制性內(nèi)切酶酶切和克隆。引物2雜交在23KDa的翻譯終止位點(diǎn)，并在其5，末端含有一HindIII位點(diǎn)以插入載體中。兩個(gè)引物的非雜交5′末端在第一個(gè)PCR循環(huán)時(shí)都不合成到互補(bǔ)鏈上，直到當(dāng)新產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物用作模板時(shí)，在后面的循環(huán)中才能合成。
圖4.擴(kuò)增DNA的形成和克隆1(B)所示寡脫氧核苷酸引物在一8700DNA合成儀(Biosearch/MILLIGEN)的1mol柱中合成。因?yàn)楹铣尚屎芨?，所以PCR中使用從柱上分離下來的引物不需進(jìn)一步純化。五個(gè)含有100μl相同組份的PCR反應(yīng)按廠家的說明平行進(jìn)行，其含有引物總產(chǎn)量的0.25％，4ng含EBVBamHI—L片段的質(zhì)粒(Skare，J.and Stro-minger，J.L.Cloning and Mapping of BamHI endo nuclease fragmentsof the DNA from the fransforming B95—8 strain of Epstein—BarrVirus.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 773860(1980))，核苷酸，緩沖液和Taq—聚合酶。反應(yīng)在一Ericomp溫度循環(huán)儀上進(jìn)行，50℃退火2分鐘，72℃延伸4分鐘及94℃變性1分鐘，進(jìn)行50個(gè)循環(huán)，收集最終DNA，用乙醇沉淀并干燥。重懸于200μl H2O中，然后用BamHI和HindIII進(jìn)行酶切，該DNA片段經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，分離并與用BamH1和HindIII線性化的pUR289連接。轉(zhuǎn)化至E.coli JM 109中后(Yanish—Perron et al.Improved M13 phageCloning Vectors and host strains nucleotide sequences of M13mp18 andpUC19 vectors，Gene 33103—119(1985))，通過限制性內(nèi)切酶消化23KDa抗原編碼片段以篩選菌落的質(zhì)粒。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)陽性克隆、蛋白的PAGE電泳及考馬斯亮蘭染色或Western印跡顯示EBV抗原的產(chǎn)生(圖5)。從一生產(chǎn)性克隆pUR23K中，通過BamHI和HindIII的降解重新分離出23KDa編碼片段并插入到pDS(pD523K)中。第三步，經(jīng)BspHI和HindIII剪切而分離到的片段與用Ncol和HindIII線性化的pKK233—2連接(PKK23K)。最后，從PDS23K中得到一370bp的NlaIV/HindIII片段，并連接到因HindII和HindIII線性化的pUC8中，得到pUC8—N234。所有的所述表達(dá)克隆方法提供從載體序列到EBV片段的可讀框架中的翻譯功能。
圖5.大腸桿菌中23KDa表達(dá)產(chǎn)物的鑒定IPTG誘導(dǎo)克隆(1mM IPTG 37℃3小時(shí))產(chǎn)生的蛋白經(jīng)SDS—17.5PAGE和考馬斯亮蘭染色(左側(cè)系列)或經(jīng)Western印跡和用高滴度NPC病人混合血清免疫染色來分析。泳道1pUD289，β—Gal的表達(dá)；泳道2pUR23K；泳道3pDS23K；泳道4pKK23K；泳道5PUCN23K。泳道2中的β—Gal23KDa融合蛋白比泳道1的β—Gal(116KDa)要大，表明擴(kuò)增的DNA片段的通讀。泳道3的23KDa表達(dá)產(chǎn)物大小約為24KDa，產(chǎn)量高。但泳道4中ATG載體的真正23KDa表達(dá)產(chǎn)物并未有效產(chǎn)生。泳道5中pUCN23的C—末端23KDa抗原片段似乎是穩(wěn)定的而且非常有效地產(chǎn)生。所有抗原與NPC混和血清的反應(yīng)都很強(qiáng)，表明了在病毒感染時(shí)這種蛋白的抗原性。
圖6.EB病毒讀碼框架BLRF2的23KDa抗原的DNA和氨基酸序列下列實(shí)施例說明本發(fā)明實(shí)施例123KDa蛋白編碼區(qū)的擴(kuò)增在EBV的BamHI—L片段上23KDa蛋白的可能編碼區(qū)(BLRF2)含162個(gè)氨基酸。在5’和3’末端沒有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)用以克隆全長的讀碼框架。因?yàn)檫@一原因，我們合成了兩個(gè)與編碼區(qū)5，和3′末端互補(bǔ)的寡脫氧核苷酸，作為引物用于PCR。每個(gè)引物在5′末端的附加序列中含有用于克隆擴(kuò)增DNA的限制性酶切位點(diǎn)(圖1)及幾個(gè)附加核苷酸以便于用這些限制性內(nèi)切酶剪切。PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增的DNA片段用BamHI和HindIII剪切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化用于用質(zhì)粒載體克隆。一含有來自EBV B95—8分離株的完整的BamHI—L片段的質(zhì)粒(Skare，J.and Strominger，J.L.Cloning and mapping of BamHI endonuclease fragments of the DNAfrom the transforming B95—8 Strain of Epstein—Barr Virus，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 773860(1980))用作模板。
實(shí)施例2作為β—半乳糖苷酶融合蛋白的23KDa VCA在大腸桿菌中的表達(dá)。
因?yàn)樵S多重組抗原在大腸桿菌中不能以非融合抗原穩(wěn)定表達(dá)，第一種改進(jìn)方法是產(chǎn)生β—半乳糖苷酶融合蛋白，其中大細(xì)菌蛋白理論上可阻止不穩(wěn)定蛋白片段的降解。為此，用BamI和HindIII消化的擴(kuò)增DNA被克隆到βGal表達(dá)載體pUR289的lacZ基因的讀框3’端(Ruther和Muller—Hill，Easy identification of cDNA clones.EMBO J.2(1983)1791—1794)(圖4)。會(huì)有這一載體的大腸桿菌克隆用IPTG誘導(dǎo)以便表達(dá)βGal23KDa融合蛋白。圖5表明已合成了分子量高于真正βGal的產(chǎn)物。該融合蛋白與含有高EBV抗體滴度的血清持異性反應(yīng)。這表明已發(fā)生了正確的翻譯，PCR沒有引入重要的錯(cuò)誤或終止密碼，并且產(chǎn)生了有免疫原性的EBV抗原。
實(shí)施例323KDa VCA作為一種真正蛋白的表達(dá)從pUR289—23K中用BamHI和HindIII分離EBV編碼區(qū)，并克隆到此處重新命名為pDS12/RBSII—2的pDS3中(Bujard，H.etal.The T5 promotor—based trascription translation system for theanalysis in vitro and in vivo.Meth.Enzymol.155416(1987))，這可提供與23KDa編碼區(qū)相同的翻譯讀框(圖4)。IPTG誘導(dǎo)后，一23KDa新的蛋白條帶在考馬斯染色的PAGE上出現(xiàn)。它在Western印跡上可特異性地與EBV血清反應(yīng)，并約占可從考馬斯染色的凝膠上估量的全部大腸桿菌蛋白的約10％(圖5)。因?yàn)楸磉_(dá)產(chǎn)物含有一些來自克隆位點(diǎn)和寡脫氧核苷酸序列的氨基酸，通過用BspHI和HindIII分離該片段并將其插入到ATG載體pKK233—2的NcoI和HindIII位點(diǎn)，以實(shí)現(xiàn)真正蛋白的表達(dá)(Amann，E.and Brosius，J.｀ATG Vectors′for regulated high—level expression of cloned gene inEscherichia coli.Gene 40183—190(1985))。但是，通過這一載體23KDa抗原的表達(dá)產(chǎn)量遠(yuǎn)低于pDS載體中的量，這可能是由于改變了N—末端序列而導(dǎo)致這種蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中的低效翻譯。
對(duì)編碼23KDa抗原的C—末端部分的較小片段進(jìn)行進(jìn)一步的表達(dá)。從編碼區(qū)中分離NlaIV/HindIII片段并插入到pUC8的HindII/HindIII中(Vieira，B.and Messing，B.The pUC plasmids，a M13mp7—derived system for insertion mutagenesis and sequencing withsynthetic universal primers.Gene 19(1982)259—268)，以形成PUCN23K。IPTG誘導(dǎo)后，發(fā)現(xiàn)非常高效地產(chǎn)生抗原。但因?yàn)檫@一抗原不含真正蛋白的N—末端，所以它不能用于進(jìn)一步評(píng)估。
實(shí)施例423KDa VCA的反應(yīng)性和特異性重組抗原的診斷學(xué)價(jià)值的初步評(píng)估是用從各種血清來源的EBV陽性和陰性血清進(jìn)行的，例如來自傳染性單核細(xì)胞增多癥病人、NPC病人和健康攜帶者的血清。
對(duì)來自pDS23K的含23KDa抗原的細(xì)菌粗裂解物和作為對(duì)照的不合外源抗原的裂解物分別進(jìn)行PAGE。將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并將其條帶與血清孵育。免疫染色的Western印跡條帶的結(jié)果總結(jié)于表II中。通過與傳統(tǒng)的免疫熒光檢測(cè)比較，來自健康攜帶者和NPC病人的VCA陽性血清對(duì)23KDa抗原顯示清楚的陽性。僅有兩份在免疫熒光(IF)檢測(cè)中的反應(yīng)性血清沒有反應(yīng)。以IF確定的三份來自新感染的人的血清也沒有反應(yīng)，而三份被認(rèn)為EBV陰性的血清用p23KDa抗原發(fā)現(xiàn)為陽性?？傊梢园l(fā)現(xiàn)IF和Western印跡活性具有廣泛的相關(guān)性。但需要進(jìn)一步的測(cè)試以檢查這種抗原與IF檢測(cè)相比的相關(guān)性和敏感性。
表II與IF結(jié)果的比較，23KDa抗原與各種血清的反應(yīng)性IF-反應(yīng)性EBV狀態(tài)a檢測(cè)血清數(shù) 與重組23K抗原的反應(yīng)性b陽性陰性VCA+EBNA+健康攜帶者 34 32 2VCA+EBNA+NPC 病人 4 4 0VCA+EBNA-新感染者 9 6 3VCA-EBNA-EBV陰性6 3 3a.EBV狀態(tài)通過IF反應(yīng)性和其它臨床指標(biāo)的常規(guī)診斷來確定。
b.23KDa抗原的反應(yīng)性通過Western印跡來測(cè)定。
根據(jù)IF檢測(cè)的血清分類VCA+，EBNA+＝健康攜帶者；VCA+，EBNA+，臨床指標(biāo)＝NPC；VCA+，EBNA-，臨床指標(biāo)＝新感染者；VCA-，EBNA-＝EBV陰性。
(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)姓名WOLF，hans Joachim(B)街道Josef—Jaegerhuber—Strasse 9(C)城市Starnberg(E)國家德國
(F)郵政編碼(ZIP)82319(A)姓名REISCHI，Udo(B)街道Grosse Leite 7(C)城市Grafenau(E)國家德國(F)郵政編碼(ZIP)94481(A)姓名MOTZ，Manfred(B)街道Schachnerstrasse 7(C)城市Munich(E)國家德國(F)郵政編碼(ZIP)81379(ii)發(fā)明題目編碼診斷相關(guān)的病毒衣殼抗原的EB病毒DNA序列，通過聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)生的表達(dá)克隆和該重隆在診斷檢測(cè)中的應(yīng)用(iii)序列數(shù)目2(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC—DOS/MS—DOS(D)軟件Patent In Release#1.0，Version#1.25(EPO)
(v)本申請(qǐng)資料申請(qǐng)?zhí)朠CT/EP94/02436(vi)在先申請(qǐng)的資料(A)申請(qǐng)?zhí)朎P93 11 1883.0(B)申請(qǐng)日1993年7月23日(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度489堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)湫途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1…486(xi)序列描述SEQ ID NO1ATG TCA GCT CCA CGC AAA GTC AGA TTG CCT TCT GTT AAG GCT GTT GAC 48Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp1 5 10 15ATG AGC ATG GAA GAC ATG GCC GCC CGC CTG GCT CGC CTG GAG TCT GAG 96Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu20 25 30AAT AAG GCT CTG AAG CAA CAG GTC CTC AGA GGG GGT GCC TGT GCC TCG 144Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser35 40 45TCT ACC TCT GTT CCT TCT GCT CCA GTG CCT CCG CCT GAG CCG CTT ACA 192Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr50 55 60CT CGA CAG CGA GAG GTA ATG ATT ACG CAG GCC ACG GGC CGT TTG GCG 240Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala65 70 75 80TCT CAG GCT ATG AAG AAG ATT GAA GAC AAG GTT CGG AAA TCT GTT GAC 288Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp85 90 95GGT GTA ACT ACC CGC AAT GAA ATG GAA AAT ATA TTG CAA AAT CTG ACC 336Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr100 105 110CTC CGC ATT CAA GTA TCT ATG TTG GGT GCA AAA GGC CAA CCC AGC CCT 384Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro115 120 125GGT GAG GGA ACA CGA CCA CGA GAA TCA AAC GAC CCC AAC GCC ACC CGA 432Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg130 135 140CGT GCC CGC TCC CGC TCC CGG GGA CGT GAA GCA AAG AAA GTG CAA ATT 480Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile145 150 155 160TCT GAT TAA 489Ser Asp(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度162個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)湫途€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)
(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp1 5 10 15Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu20 25 30Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser35 40 45Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr50 55 60Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala65 70 75 80Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp85 90 95Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr100 105 110Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro115 120 125Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg130 135 140Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile145 150 155 160Ser Asp
權(quán)利要求
1.EB病毒基因組的DNA序列，其特征為它與具有圖6所示氨基酸序列的EBV相關(guān)抗原蛋白的至少部分相對(duì)應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA序列，其特征為它所編碼的EBV相關(guān)抗原蛋白的分子量為23KDa。
3.與權(quán)利要求1或2的DNA序列雜交的DNA序列，它可從任何來源獲得，包括天然的、合成的或半合成來源，所述DNA序列通過包括核苷酸置換、核苷酸缺失、核苷酸插入和核苷酸區(qū)段倒位的突變使之與根據(jù)權(quán)利要求1的DNA序列相關(guān)，并編碼具有所述23kDaEBV蛋白的抗原特性的蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的DNA序列，其特征為它被插入到重組質(zhì)粒pUR289—23K中。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的DNA序列，其特征為它被插入到重組質(zhì)粒pDS—23K和pUC8—N23中。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的DNA序列，其特征為它被插入到重組質(zhì)粒pMDIII和pVL941中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)的DNA序列，其特征為其5’末端含有編碼寡肽的寡脫氧核苷酸，這一寡肽在形成的多肽中作為序列特異性蛋白酶的酶切位點(diǎn)，或它可以用酸如甲酸進(jìn)行酸處理而裂解，或它便于隨后的純化。
8.一種用于克隆的重組DNA分子，其特征為它含有權(quán)利要求1—7任一項(xiàng)中的DNA序列。
9.一種用于表達(dá)的重組DAN分子，其特征為它含有與表達(dá)調(diào)控序列有效連接的權(quán)利要求1—7任一項(xiàng)中的DNA序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的重組DNA分子，其特征為表達(dá)調(diào)控序列是大腸桿菌的λ—啟動(dòng)子系統(tǒng)，大腸桿菌的lac—系統(tǒng)，大腸桿菌的β—內(nèi)酰胺酶系統(tǒng)，大腸桿菌的trp—系統(tǒng)，大腸桿菌的脂蛋白啟動(dòng)子系統(tǒng)，酵母表達(dá)調(diào)控序列或另一種真核表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)。
11.一種宿主，其特征為它被權(quán)利要求8—10中任一項(xiàng)中的至少一種重組DNA分子轉(zhuǎn)化。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的宿主，它是大腸桿菌菌株，另一種細(xì)菌，酵母，另一種真菌，動(dòng)物或人的細(xì)胞。
13.適用于EBV相關(guān)疾病的診斷和治療的含有EBV相關(guān)抗原決定簇的蛋白，其特征為它是由權(quán)利要求1—7任一項(xiàng)中的DNA序列編碼的。
14.一種融合蛋白，其特征為它含有權(quán)利要求13的蛋白。
15.一種非融合蛋白，其特征為它含有權(quán)利要求13的蛋白。
16.根據(jù)權(quán)利要求13—15任一項(xiàng)中蛋白的生產(chǎn)方法，包括在合適條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求11或12的宿主，在培養(yǎng)物中積累蛋白及從中回收該蛋白。
17.一種用于檢測(cè)抗EBV抗體的診斷組合物，其含有權(quán)利要求13—15任一項(xiàng)中的至少一種蛋白，其量足夠與樣品中所述的抗EBV抗體相結(jié)合。
18.一種構(gòu)建可克隆的和/或可表達(dá)的DNA序列的方法，包括將適當(dāng)?shù)墓丫酆塑账嵋锿嘶鸬綑?quán)利要求1—7任一項(xiàng)中的DNA序列上，并進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的步驟，其特征為在引物的5’和3，末端分別含有代表克隆和/或表達(dá)調(diào)控序列的額外的非同源序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其持征為表達(dá)調(diào)控序列含有轉(zhuǎn)錄和/或翻譯起始位點(diǎn)和/或增強(qiáng)位點(diǎn)，及轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的終止信號(hào)，或?qū)庸け痪幋a轉(zhuǎn)錄物重要的序列。
20.一種試劑盒，它包括權(quán)利要求13—15任一項(xiàng)中的至少一種蛋白。
21.一種藥物組合物，它包括權(quán)利要求13—15任一項(xiàng)中的至少一種蛋白和藥物上可接受的載體。
22.含有權(quán)利要求13至15任一項(xiàng)中的蛋白的疫苗。
23.權(quán)利要求13至15任一項(xiàng)中的蛋白在制備用于預(yù)防或治療EBV相關(guān)疾病的藥物組合物中的用途。
24.一種治療EBV相關(guān)疾病的方法，包括給需要治療的病人服用權(quán)利要求22中的藥物組合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的用途或根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述EBV相關(guān)疾病是NPC、慢性傳染性單核細(xì)胞增療癥或EBV相關(guān)的Burbitt’s淋巴瘤、Hodgkin’s病、鼻咽癌、與器官移植相關(guān)的EBV的再激活。
26.一種檢測(cè)EBV感染的特異性方法，其特征為利用權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)中的DNA序列的全部或部分在有或沒有額外擴(kuò)增的情況下，通過雜交檢測(cè)臨床樣品中的EBV DNA。
全文摘要
本申請(qǐng)描述了EB病素編碼基因的鑒定，和迅速構(gòu)建有效表達(dá)該基因或其它基因的質(zhì)粒的方法。可純化該EBV基因并用作診斷和治療EBV相關(guān)疾病的抗原。
文檔編號(hào)C12N15/38GK1129460SQ94193098
公開日1996年8月21日 申請(qǐng)日期1994年7月22日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月23日
發(fā)明者H·J·沃爾夫, U·里斯奇, M·莫茲 申請(qǐng)人:H·J·沃爾夫