一種紅鰭東方鲀神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白卵黃抗體及其應(yīng)用
【專利說(shuō)明】-種紅韓東方純神經(jīng)壞死病毒衣亮蛋白卵黃抗體及其應(yīng)用 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種紅罐東方鈍神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白卵黃 抗體及其應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 神經(jīng)壞死病毒（Nervousnecrosisvirus,NNV)是一種在世界范圍內(nèi)流行的魚類 病原，流行在中國(guó)大陸、臺(tái)灣地區(qū)、日本、澳大利亞、英國(guó)、加拿大、挪威等國(guó)家和地區(qū)，可造 成30多種重要經(jīng)濟(jì)魚類的稚魚、仔魚甚至石斑魚成魚大規(guī)模死亡，嚴(yán)重危害著魚類的健康 養(yǎng)殖。此病毒病的研究是國(guó)際水產(chǎn)病害的研究熱點(diǎn)。神經(jīng)壞死病毒分類上屬于野田村病 毒科（Nodaviridae)，己型野田村病毒屬炬etanodavirus)。病毒粒子直徑約30-40納米， 二十面體，無(wú)囊膜。神經(jīng)壞死病毒為單一正鏈、2節(jié)段RNA病毒。病毒基因組由RNA1和RNA2 組成。RNA1編碼病毒RNA聚合酶；RNA2編碼衣殼蛋白，也是病毒的唯一結(jié)構(gòu)蛋白，和病毒 感染密切相關(guān)，是研究病毒疫苗的重要蛋白。神經(jīng)壞死病毒主要感染魚苗，患病魚類在腦 部和視網(wǎng)膜可見明顯的空泡，可導(dǎo)致魚苗死亡率達(dá)90%W上。目前對(duì)此病毒病還沒(méi)有特效 藥物可W治療，疫苗是防治此類疾病的重要手段。但是到目前為止，還沒(méi)有商品化的疫苗。 專利CN200410027186公開了一種神經(jīng)壞死病毒重組蛋白疫苗，但是該疫苗存在W下不足： (1)神經(jīng)壞死病毒感染魚類是在稚魚期，此時(shí)稚魚還沒(méi)有產(chǎn)生抗體的能力，因此此類疫苗無(wú) 法在稚魚期使用，因此應(yīng)用價(jià)值不大；（2)該種疫苗需要靠注射來(lái)防疫，相對(duì)于人類和畜牧 而言，由于魚苗較小，生活在水中，注射免疫法耗時(shí)，操作不便，因而大大限制了該疫苗的商 品化推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種紅罐東方鈍神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白卵黃抗體及其應(yīng) 用。
[0004] 為解決W上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0005] 一種紅罐東方鈍神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白卵黃抗體，由下述方法制備得到：
[0006] (1)通過(guò)RT-PCR方法克隆紅罐東方鈍神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白基因的DNA，然后重 組到谷脫甘膚S-轉(zhuǎn)移酶融合基因表達(dá)載體pGEX-5x-l中，構(gòu)建成pGEX-5x-l-CP重組質(zhì)粒， 所述PGEX-5X-1-CP重組質(zhì)粒中含有谷脫甘膚S-轉(zhuǎn)移酶和神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白的融合 基因；
[0007] (2)重組質(zhì)粒pGEX-5x-l-CP在大腸桿菌中的表達(dá)：將pGEX-5x-l-CP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化大腸桿菌，次日挑選轉(zhuǎn)化平板上的大腸桿菌單菌落于含有氨節(jié)青霉素的培養(yǎng)基中擴(kuò)大培 養(yǎng)，利用IPTG誘導(dǎo)谷脫甘膚S-轉(zhuǎn)移酶（GST)和神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白的融合基因在大腸 桿菌中表達(dá)；收集菌體，采用包涵體提純技術(shù)提取并純化得到GST-CP重組蛋白；
[000引 （3)用GST-CP重組蛋白免疫產(chǎn)蛋母雞，收集免疫母雞所產(chǎn)雞蛋，從所收集的雞蛋 中提取并純化卵黃抗體。
[0009] 按上述方案，所述GST-CP重組蛋白的分子量大小為66kDa~68kDa。
[0010] 按上述方案，所述RT-PCR方法為；W紅罐東方鈍神經(jīng)壞死病毒為模板，采用特異 性引物將紅罐東方鈍神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白基因反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，再PCR擴(kuò)增得到雙 鏈cDNA。
[0011] 按上述方案，所述pGEX-5x-l-CP重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法為：將cDNA和pGEX-5x-l載 體分別進(jìn)行雙酶切，再進(jìn)行連接反應(yīng)得到含有谷脫甘膚S-轉(zhuǎn)移酶和神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋 白的融合基因的pGEX-5x-l-CP重組質(zhì)粒。
[0012] 按上述方案，所述重組質(zhì)粒pGEX-5x-l-CP在大腸桿菌中的表達(dá)為；pGEX-5x-l-CP 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，次日挑選轉(zhuǎn)化平板上的單菌落于含有氨節(jié)青霉素的LB液體培養(yǎng) 基中，于37°C、200轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行恒溫?fù)u床培養(yǎng)，當(dāng)大腸桿菌的OD值達(dá)到0. 4~0.6時(shí)，加 入終濃度為Immol/L的IPTG，在25~37°C誘導(dǎo)4~8小時(shí)。
[0013] 按上述方案，所述免疫為兩翅及兩側(cè)胸肌注射。
[0014] 按上述方案，所述免疫的次數(shù)為3次，每次免疫的時(shí)間間隔為2周。
[0015] 按上述方案，所述免疫方式為；首次免疫注射由GST-CP重組蛋白與等體積完全弗 氏佐劑乳化成的疫苗，第二次及第S次免疫注射由GST-CP重組蛋白與不完全弗氏佐劑乳 化成的疫苗。
[0016] 按上述方案，步驟（3)所述從雞蛋中提取并純化卵黃抗體的方法為；將所收集雞 蛋的蛋清和蛋黃分離，取蛋黃，去掉卵黃膜，然后加入滅菌蒸饋水，充分搖勻、置于4°C條件 下過(guò)夜后，收集上清即為卵黃抗體。
[0017] 上述紅罐東方鈍神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白卵黃抗體在制備魚用抗神經(jīng)壞死病毒疫 苗制品中的應(yīng)用。
[001引本發(fā)明的有益效果；本發(fā)明方法制備得到的卵黃抗體表達(dá)持續(xù)穩(wěn)定，經(jīng)中和試驗(yàn) 證實(shí)，本發(fā)明所制備的卵黃抗體能夠有效抑制紅罐東方鈍神經(jīng)壞死病毒，效價(jià)高，具有良好 的免疫保護(hù)效力，可W在魚類的稚魚期，將其作為抗神經(jīng)壞死病毒疫苗添加到魚類飼料中， 為魚類神經(jīng)壞死病毒疫苗的商品化推廣提供了可能性，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的 內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。
[0020] 實(shí)施例1 ;紅罐東方鈍神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白基因pGEX-5x-1-CP重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0021]W紅罐東方鈍神經(jīng)壞死病毒感染的魚類細(xì)胞提取的總RNA為模板，采用下游引物 CP-No11-BW:GATGCGGCCGCTTAGTTTCCCGAGTCAACCC，將紅罐東方鈍神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白基 因進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)生成第一鏈cDNA，RT-PCR反應(yīng)的試劑為：反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、緩沖液；條件 為；75°C，5min;42°C，1小時(shí)；80°C，lOmin。隨后，將獲得的cDNA作為模板，使用上游引物 CP-SalI-FW: 5 ' -GGTCGACTCATGGTACGCAAGGGTGATAAG-3 ' 和下游引物CP-No11-BW:GATGCGGCC GCTTAGTTTCCCGAGTCAACCC，PCR擴(kuò)增得到雙鏈DM。PCR反應(yīng)的試劑為；高保真DM聚合酶、 dNTP、緩沖液；PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為；預(yù)變性95°C5min;隨后95°C，40s;6rC，40s;72°C，1 min;共35個(gè)循環(huán)，隨后在72°C延伸5min，4°C保存。將反應(yīng)產(chǎn)物在1%的瓊脂糖上電泳分 離，提純目的DNA片段。隨后將提純的DNA片段和pGEX-5x-l載體分別用Sail和Notl雙 酶切，用T4DNA連接酶將酶切的DM片段連接到酶切的pGEX-5x-l載體上，獲得到含有GST和神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白融合基因的pGEX-5x-l-CP重組質(zhì)粒。所述連接反應(yīng)體系為；DM 2y1，pGEX-5x-16y1，10X連接緩沖液 2y1，TJ)NA連接酶 1y1，16°C，30 分鐘。
[0022] 實(shí)施例2 ;重組質(zhì)粒pGEX-5x-l-CP在大腸桿菌中的表達(dá)
[0023] 將PGEX-5X-1-CP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，次日挑選轉(zhuǎn)化平板上的單菌落于含有 氨節(jié)青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、200轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行恒溫?fù)u床培養(yǎng)，當(dāng)大腸