一種從肝素制品中提取基因組dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從肝素制品中提取基因組DNA的方法，屬于核酸純化領域。首先向肝素制品中加入特異性的裂解結合液，待充分裂解結合后對混合物進行離心分離，取離心后上清液轉入硅膜吸附柱中，使DNA與硅膜吸附柱特異性結合后進行離心，然后依次加入漂洗液1、漂洗液2進行去蛋白，去多分多糖類物質離心，再加入漂洗液3進行脫鹽離心，最后干燥離心后，加入無核糖核酸酶的水洗脫離心，得到含有基因組DNA溶液。本發(fā)明方法具有高效、快速、簡潔的特點，提取所得基因組DNA純度高，極大的消除了肝素對PCR實驗的抑制，所得基因組DNA可進行聚合酶鏈式反應（PCR），實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real?Time?PCR）等下游實驗。
【專利說明】—種從肝素制品中提取基因組DNA的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從肝素制品中提取基因組DNA的方法，屬于核酸純化領域。
【背景技術】
[0002]肝素是由豬、?；蜓虻哪c粘膜等組織中提取的黏多糖硫酸酯類物質，被世界公認為“生物黃金”，是很多重大疾病及手術治療的重要臨床用藥，并在科研中用途廣泛。目前年市場額近100億美元，全球60%以上的肝素鈉原料由中國提供。
[0003]上世紀90年代以來，受瘋牛病、口蹄疫等嚴重威脅人類健康的傳染病影響，牛羊源的肝素制品在生產(chǎn)及使用上被嚴格控制，各制劑廠均要求藥用肝素鈉必須單一來源于豬小腸粘膜，一般要求牛羊等基因比例不得超過0.1%。2011年美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)對肝素鈉粗品檢測的指導意見為能夠對肝素鈉物種來源進行定量測定，并具有足夠準確性和特異性。
[0004]目前，動物源性成分的檢測方法有物理、化學、免疫學和分子生物學方法(即聚合酶鏈式反應，PCR法)(以下使用簡稱PCR)。PCR法通過特異檢測肝素制品中殘留的基因組脫氧核糖核酸(DNA)(以下簡稱DNA)，可以快速靈敏的對肝素的物種來源進行鑒定。但由于肝素對PCR反應具有較強的抑制作用，若要使得這一便捷的測定方法得到廣泛推廣使用，需要在從肝素制品中提取殘留的基因組DNA時有效清除肝素的殘留對PCR的影響。現(xiàn)有的清除肝素的主要方法一般是使用肝素酶消化處理樣本，但該過程處理時間較長，一般為18小時左右，且由于肝素 酶價格昂貴，也在一定程度上限制了 PCR測定法的使用。
【發(fā)明內容】
[0005]本發(fā)明的目的是提出一種從肝素制品中提取基因組DNA的方法，采用一種特異性結合DNA的離心吸附柱和獨特的裂解體系，以快速簡單的從肝素制品中提取殘存的基因組DNA,極大地消除了肝素對PCR的抑制，所得產(chǎn)物可方便的用于后續(xù)PCR檢測。
[0006]本發(fā)明提出的從肝素制品中提取基因組DNA的方法，包括以下步驟:
[0007](I)稱取20毫克肝素鈉樣品置于1.5毫升離心管中，加入400微升裂解液，振蕩混勻后放入65°C水浴鍋中保持20分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，以使樣品充分溶解，溶解后得到的混合液呈透明狀；注意裂解液中含有不溶性樹脂，使用前應充分振蕩混懸。
[0008](2)將上述混合液置于離心機中進行離心分離，離心分離的轉速為12000轉/分鐘，離心分離時間為5分鐘；
[0009](3)取出步驟(2)中離心分離得到的上清液轉入硅膜吸附柱中，將硅膜吸附柱放入1.5毫升離心管中，將離心管置于離心機中，在12000轉/分鐘的轉速下離心分離30秒，棄去離心分離的廢液；
[0010](4)向步驟(3)的硅膜吸附柱中加入400微升第一漂洗液，放入80°C水浴中，保持10分鐘，然后在12000轉/分鐘的轉速下離心分離30秒，棄去離心分離的廢液；
[0011](5)向步驟(4)的硅膜吸附柱中加入400微升第二漂洗液，在12000轉/分鐘的轉速下離心分離30秒，棄去離心分離廢液；
[0012](6)向步驟(5)的硅膜吸附柱中加入500微升第三漂洗液，在12000轉/分鐘的轉速下離心分離30秒，棄去離心分離廢液；
[0013](7)重復步驟(6) 2~4次；
[0014](8)將步驟(7)的硅膜吸附柱放入1.5毫升離心管中，開蓋離心分離2分鐘；
[0015](9)將步驟(8)的硅膜吸附柱放入一個新的1.5毫升離心管中，向吸附柱中間懸空加入50微升去離子水，靜置2分鐘；
[0016](10)將步驟(9)中裝有硅膜吸附柱的離心管在12000轉/分鐘的轉速下離心分離I分鐘，收集洗脫液，洗脫液為基因組DNA溶液。
[0017]上述方法中，所述的裂解液的配方為:
[0018]
【權利要求】
1.一種從肝素制品中提取基因組DNA的方法，其特征在于該方法包括以下各步驟: (1)稱取20毫克肝素鈉樣品置于1.5毫升離心管中，加入400微升裂解液，振蕩混勻后放入65°C水浴鍋中保持20分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，以使樣品充分溶解，溶解后得到的混合液呈透明狀；注意裂解液中含有不溶性樹脂，使用前應充分振蕩混懸。 (2)將上述混合液置于離心機中進行離心分離，離心分離的轉速為12000轉/分鐘，離心分尚時間為5分鐘； (3)取出步驟(2)中離心分離得到的上清液轉入硅膜吸附柱中，將硅膜吸附柱放入1.5毫升離心管中，將離心管置于離心機中，在12000轉/分鐘的轉速下離心分離30秒，棄去離心分離的廢液； (4)向步驟(3)的硅膜吸附柱中加入400微升第一漂洗液，放入80°C水浴中，保持10分鐘，然后在12000轉/分鐘的轉速下離心分離30秒，棄去離心分離的廢液； (5)向步驟(4)的硅膜吸附柱中加入400微升第二漂洗液，在12000轉/分鐘的轉速下離心分離30秒，棄去離心分離廢液； (6)向步驟(5)的硅膜吸附柱中加入500微升第三漂洗液，在12000轉/分鐘的轉速下離心分離30秒，棄去離 心分離廢液； (7)重復步驟(6)2~4次; (8)將步驟(7)的硅膜吸附柱放入1.5毫升離心管中，開蓋離心分離2分鐘； (9)將步驟(8)的硅膜吸附柱放入一個新的1.5毫升離心管中，向吸附柱中間懸空加入50微升去離子水,靜置2分鐘； (10)將步驟(9)中裝有硅膜吸附柱的離心管在12000轉/分鐘的轉速下離心分離I分鐘，收集洗脫液，洗脫液為基因組DNA溶液。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的裂解液的配方為:
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的第一漂洗液的配方為: 異丙醇450~700毫升 氯化鈉 80~160克 將上述各組分分別量取后混合，加去離子水，定容混合液體積為1000毫升。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的第二漂洗液的配方為: 異丙醇500~800毫升 聚乙二醇6000 70~120克 將上述各組分分別量取后混合，加去離子水，得到混合液，定容混合液體積為1000毫升。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的第三漂洗液的配方為: 三羥甲基氨基甲烷 0.7~1.8克 無水乙醇 800毫升 將 上述各組分分別量取后混合，加去離子水，得到混合液，定容混合液體積為1000毫升。
【文檔編號】C12N15/10GK103952398SQ201410151885
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月16日 優(yōu)先權日:2014年4月16日
【發(fā)明者】呂書鋒, 俞萍, 李曉晨, 孫克非 申請人:天根生化科技（北京）有限公司