一種透明質(zhì)酸酶編碼基因及其發(fā)酵生產(chǎn)和純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了透明質(zhì)酸酶基因，其核苷酸序列如（a）或（b）或（c）所示：（a）核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；（b）在（a）中的核苷酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個核苷酸或幾個核苷酸且具有透明質(zhì)酸酶活性的基因；（c）與（a）中氨基酸序列整體相似度在85%以上，具有透明質(zhì)酸酶活性的基因。本發(fā)明通過采用畢赤酵母表達系統(tǒng)，成功實現(xiàn)了對所獲得的水蛭透明質(zhì)酸酶的高效異源表達及其純化。本發(fā)明重組制備的水蛭透明質(zhì)酸酶產(chǎn)物屬于藥理活性化合物，可以用于治療腦、心血管疾病、眼科疾病、抗腫瘤和藥物擴散劑等醫(yī)療領域。本發(fā)明為實現(xiàn)水蛭來源的透明質(zhì)酸酶的工業(yè)化制備生產(chǎn)奠定了基礎。
【專利說明】一種透明質(zhì)酸酶編碼基因及其發(fā)酵生產(chǎn)和純化方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種透明質(zhì)酸酶基因及其發(fā)酵生產(chǎn)和純化方法，特別是一種來源于水蛭的透明質(zhì)酸酶基因，屬于生物工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]透明質(zhì)酸酶于1928年被Duran Reynals發(fā)現(xiàn)并稱為擴散因子，1940年被Chain和Duthie正式命名為透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase, HAase)。透明質(zhì)酸酶廣泛存在于真核生物和原核生物中，主要水解透明質(zhì)酸，是一種重要的生理活性物質(zhì)。根據(jù)透明質(zhì)酸酶作用的底物特異性和催化機制，將其分為三類。第一類是來源于哺乳動物的透明質(zhì)酸4-糖基水解酶家族，這類透明質(zhì)酸酶(EC3.2.1.35)是具有水解和轉糖苷活性的糖苷酶，通過水解透明質(zhì)酸(HA)的β-1、4-糖苷鍵，產(chǎn)物以四糖透明質(zhì)酸分子為主。也可作用于硫酸軟骨素、4-硫酸軟骨素和6-硫酸軟骨素產(chǎn)生硫酸皮膚素產(chǎn)物。第一類中比較常見的有來自于哺乳動物的睪丸、蛇毒、蜂毒以及溶菌體的透明質(zhì)酸酶。第二類為微生物透明質(zhì)酸酶，這類透明質(zhì)酸酶(EC4.2.2.1)通過β -消除反應裂解HA的β -糖苷鍵，產(chǎn)生以不飽和的雙糖分子2_acetamido-2-deoxy-3-0- ( β -D-gluco-4-enepyranosyluronic acid) -D-glucose 為主要產(chǎn)物。這類透明質(zhì)酸裂解酶來源于包括 Clostridium, Micrococcus, Streptococcus, andStrePtomyces等菌株，并且它們的底物特異性也不同。第三類代表性的透明質(zhì)酸酶主要來源于水蛭，這類水蛭來源的透明質(zhì)酸酶(EC3.2.1.36)屬于透明質(zhì)酸3-糖基水解酶家族，通過水解HA的β-1、3-糖苷鍵，生產(chǎn)以四糖分子HA且還原端帶有葡萄糖醛酸為主的產(chǎn)物。水蛭來源的透明質(zhì)酸酶對底物的專一性強，對硫酸軟骨素、4-硫酸軟骨素和6-硫酸軟骨素不具有活性，并且不具有轉糖苷活性。
[0003]透明質(zhì)酸酶主要水解透明質(zhì)酸，在動物機體內(nèi)參與許多重要的生物學過程，例如細胞分裂、細胞間的連接、生殖細胞的活動、DNA的轉染、胚胎發(fā)育、受傷組織的修復，以及正常細胞和腫瘤細胞增生。許多病理變化過程往往伴隨著透明質(zhì)酸酶和透明質(zhì)酸的變化，暗示它們可能起著重要的作用。同時透明質(zhì)酸酶也可以改變機體內(nèi)一些藥物和生理活性物質(zhì)的分布狀況。
[0004]透明質(zhì)酸水解酶作為一種藥理活性物質(zhì)在臨床上具有比較廣泛的用途。透明質(zhì)酸酶能夠降解心肌透明質(zhì)酸，顯著減少間隙體積，阻止由缺血引起的動脈阻力增大，增加血流量。WaidenstrSin A等人對大鼠實驗性心肌梗塞研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗塞區(qū)的含水量顯著增高與HA的積累強烈相關。相關研究實驗也證實透明質(zhì)酸酶對治療心肌梗塞效果顯著。另外，透明質(zhì)酸酶在抗腫瘤方面也具有重要的作用，惡性組織經(jīng)透明質(zhì)酸酶處理后粘多糖含量增加，有利于腫瘤細胞結合更多的抗癌藥物。如它可以加強阿霉素對乳腺癌的抗癌能力，降低膀胱癌的復發(fā)率等。此外，透明質(zhì)酸酶在臨床上也作為藥物擴散助劑，眼科手術后用于降低眼內(nèi)壓，與麻醉劑利多卡因鹽酸鹽配合使用，可加快進入麻醉狀態(tài)和延長麻醉時間。
[0005]水蛭來源的透明質(zhì)酸酶由于其底物專一性強，與其它來源的透明質(zhì)酸酶相比，它不能降解軟骨素或硫酸軟骨素，活性不受肝素影響。因此，理論上來講，水蛭透明質(zhì)酸酶用于臨床藥用更具醫(yī)療價值意義。1941年Hirst首次證實水蛭透明質(zhì)酸酶強有力的抗菌性。水蛭透明質(zhì)酸酶能溶解體內(nèi)和體外細菌被膜并形成抗體，從而使宿主獲得很好的藥物治療效果。雖然哺乳動物透明質(zhì)酸酶作為“擴散因子”被廣泛應用于藥物擴散助劑，然而這類透明質(zhì)酸酶活性易受肝素抑制。相比水蛭透明質(zhì)酸酶活性不受肝素影響，在臨床上作為“藥物擴散因子”、治療血栓、青光眼和其它藥用方面具有更大的應用價值。
[0006]目前，尚無水蛭來源的透明質(zhì)酸酶基因的相關報道。水蛭來源的透明質(zhì)酸酶是以活體水蛭組織進行提取為主獲得，且每個水蛭提取所獲得透明質(zhì)酸酶僅約為230U。水蛭原料的來源和提取分離步驟的繁瑣等因素都極大的限制了水蛭透明質(zhì)酸酶在醫(yī)療和科研上的廣泛應用。本發(fā)明提供的重組微生物工程菌株高效生產(chǎn)制備純化水蛭透明質(zhì)酸酶的方法，打破了水蛭透明質(zhì)酸酶的活體水蛭提取純化的瓶頸。對實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)和醫(yī)療科研應用水蛭透明質(zhì)酸酶奠定了堅實的基礎。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提 供了一種透明質(zhì)酸酶基因，核苷酸序列如如(a)或(b)或(C)所示: [0008]Ca)核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；
[0009](b)在(a)中的核苷酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個核苷酸或幾個核苷酸且具有透明質(zhì)酸酶活性的基因；
[0010](C)與(a)中氨基酸序列整體相似度在85%以上，具有透明質(zhì)酸酶活性的基因。
[0011]所述透明質(zhì)酸酶基因編碼的蛋白質(zhì)，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，或其保守性變異多肽。
[0012]含有權利要求1所述透明質(zhì)酸酶基因的轉基因細胞系也為本發(fā)明要求保護的范圍。
[0013]本發(fā)明要還提供了一種表達上述透明質(zhì)酸酶基因的方法，具體步驟如下:以含有透明質(zhì)酸酶基因的重組畢赤酵母為生產(chǎn)菌株，使用BMGY培養(yǎng)基，甲醇誘導發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶。
[0014]所述畢赤酵母為GS115，具體為以含有透明質(zhì)酸酶基因的重組畢赤酵母P.pastorisGS115/pPIC9K-HaseA3887為生產(chǎn)菌株，發(fā)酵條件為:將種子培養(yǎng)液按10%的接種量接種到25ml (搖瓶容量250ml )BMGY培養(yǎng)基中，溫度為30°C、pH為6.0培養(yǎng)至0D600為4，更換誘導表達培養(yǎng)基，添加1%的甲醇進行誘導，每隔24h補加一次甲醇，誘導表達96h。
7、權利要求4所述的方法，其特征在于所示透明質(zhì)酸酶的純化條件為:采用二乙氨乙基纖維素柱(DEAE-ellulose)進行離子交換，分別用pH6.5,6.0的雙甘氨肽緩沖液洗脫雜質(zhì)，再以pH5.6、50mM的乙酸鹽緩沖液特異性洗脫目標蛋白。
[0015]透明質(zhì)酸酶活性分別采用平板檢測法和CTAB濁度檢測法進行鑒定，發(fā)酵液比活采用DNS還原糖測定法。
[0016]本發(fā)明成功從野生水蛭中克隆獲得透明質(zhì)酸酶全長基因，并實現(xiàn)利用重組畢赤酵母，異源高效表達透明質(zhì)酸酶及其純化制備的方法。本發(fā)明為實現(xiàn)水蛭來源的透明質(zhì)酸酶的工業(yè)化制備生產(chǎn)奠定了基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】:[0017]圖1為重組透明質(zhì)酸酶的蛋白純化SDS-PAGE電泳結果(M，蛋白marker ;1，pPIC9k-GS115對照發(fā)酵液上清；2，重組HaseA3887-pPIC9K發(fā)酵液上清；3，純化的重組透明質(zhì)酸酶蛋白)。
[0018]圖2為平板法鑒定發(fā)酵液產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的活性(A3887-1和A3887-2為兩個重組透明質(zhì)酸酶發(fā)酵液，pPIC9k-GS115為不含重組基因的空白對照發(fā)酵液)。
[0019]圖3為濁度法快速簡便的鑒定透明質(zhì)酸酶的活性。(A3887-1和A3887-2為兩個重組透明質(zhì)酸酶發(fā)酵液，pPIC9k-GS115為不含重組基因的空白對照發(fā)酵液)
[0020]圖4為兩個重組HaseA3887-pPIC9K_GS115克隆搖瓶發(fā)酵產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的粗酶液比活。
【具體實施方式】
[0021]材料與方法
[0022]透明質(zhì)酸酶活力單位定義:在ρΗ5.5和38°C下，每小時從透明質(zhì)酸中釋放Iug葡萄糖還原當量的還原糖所需的酶量為一個酶活力單位。
[0023]平板透明圈法和CTAB (Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)池度法檢測透明質(zhì)酸酶活性:透明質(zhì)酸為大分子聚多糖，在一定濃度的表面活性劑水溶液中沉淀析出，被水解的小分子量低聚HA不會被沉淀析出。利用這一原理可以快速簡便的鑒定透明質(zhì)酸酶活性。
[0024]DNS還原糖測定方法:水蛭透明質(zhì)酸酶水解HA，通過降解β -1,3-糖苷鍵，產(chǎn)生帶有還原端羥基的還原糖產(chǎn)物。通`過DNS還原糖法測定水解HA產(chǎn)生的相對于葡萄糖還原當量的還原糖產(chǎn)物的產(chǎn)生量，來計算酶比活力。
[0025]實施例1:野生水蛭RNA提取
[0026]取活體水蛭一條，剪取頭部組織約lOOmg，迅速液氮冷凍。用液氮研磨的方法將組織充分磨碎，采用組織/細胞總RNA提取試劑盒(杭州寶賽生物科技有限公司)進行提取。加入Iml的裂解液,迅速渦旋混勻使細胞裂解充分及RNA酶滅活,室溫孵育放置2min。加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩混勻使樣品變?yōu)槿榘咨?，放?-3min。以12000rpm在4°C離心lOmin，樣品分三層，將上層含RNA的水相轉移置一新管中。加入1/2體積的無水乙醇，顛倒混勻后全部轉入吸附柱，以12000rpm在4°C離心lmin。棄掉濾液,再加入500 μ I去蛋白液，以12000rpm在4°C離心lmin,棄掉濾液。加入600 μ I的漂洗液，以12000rpm在4V離心lmin,棄掉濾液,該步驟重復一次。棄掉濾液后,再以12000rpm在4°C離心2min,室溫靜置幾分鐘以去除干凈乙醇，將吸附管套至一新管，加入50 μ I預熱的RNA-Free的ddH20，室溫靜置2min，以12000rpm在4°C離心lmin，收集RNA，_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0027]實施例2:反轉錄制備cDNA
[0028]反轉錄cDNA制備采用的是M-MLV First Strand RT kit (杭州寶賽生物科技有限公司)。以提取的水蛭RNA為模板，按下述(20 μ I)體系配置反應混合物:5 XFirst-Strandbuffer,4 μ I ；01igo(dT) 18Primer(50 μ Μ)，I μ I; IOmM dNTP, I μ I;RNase Inhibitor(40U/μ I), Iu l；M-MLV(200U/y 1),1μ 1;RNA, 12 μ I。將該反應體系置于 PCR 儀 50°C 反應 lh。再70°C加熱IOmin終止反應。置于冰上進行后續(xù)實驗或-80°C保存。
[0029]實施例3:水蛭透明質(zhì)酶基因的獲取[0030]通過對NCBI數(shù)據(jù)庫的Expressed sequence tags (EST)中的水蛭EST搜索分析，發(fā)現(xiàn)兩個不完整的mRNA基因(GenBank: JZ186329.1和GenBank:FP652258.1)類似肝素酶基因(同源性低于40%)，通過進一步與其他透明質(zhì)酸酶進行比較，初步確認這兩條不完整的mRNA序列為水蛭透明質(zhì)酸酶序列。根據(jù)這兩條序列在靠近5端設計兩條簡并引物(EST1:CTGGTGMYCACRTAACYGCTTTTAC ；EST2:TCAACATACCTTGAYGCYffCffTA)。簡并引物分別作為上游引物，下游引物為Oligo(ClT)18，以實施例2中制備的cDNA作為模板，PCR擴增目標片段。經(jīng)PCR擴增，獲得以引物ESTl Oligo (dT) 18擴增的約900bp的目標片段。回收目標片段，連接PMD19克隆載體并測序，經(jīng)比對與EST庫中的兩條序列同源性達到80%以上。再根據(jù)測序獲得的序列，從5端設計合成一條反向引物,采用SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒，按操作說明擴增該片段的上游未知序列。擴增獲得的片段進行測序比對，與之前的下游片段進行拼接，分析比對找到一個1470bp的0RF，根據(jù)這個ORF序列，設計上下游引物，以cDNA為模板，進行目標序列全長基因的擴增。將PCR擴增獲得目標片段大小的序列進行測序，比對正確，獲取的透明質(zhì)酸酶基因命名為HaseA3887。 [0031]實施例4:含透明質(zhì)酸酶基因(HaseA3887)表達系統(tǒng)的構建
[0032]根據(jù)實施例3中獲取的本發(fā)明透明質(zhì)酸酶HaseA3887全長基因序列設計表達引物，(A3887BYF:CCGGAATTCATGAAAGAGATCGCGGTGACAATTGAC ；A3887BYR:TCCGCGGCCGCTTATTTTTTGCACGCTTCAACGTTAGC)。在上下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(本發(fā)明中所述表達載體為PPIC9K，根據(jù)此載體選取上游酶切位點為EcoR I，下游為Not I)。使用含本發(fā)明中所述的透明質(zhì)酸酶A3887基因序列的質(zhì)粒，經(jīng)PCR擴增后，對擴增獲得的透明質(zhì)酸酶核苷酸片段進行雙酶切，連接至具有相對應切口的表達載體上(載體PPIC9K經(jīng)EcoR1、Not I雙酶切)，轉化至E.coil DH5a中，在確保閱讀框正確的前提下鑒定出重組表達質(zhì)粒HaseA3887-pPIC9K，經(jīng)DNA測序比對，重組序列正確。HaseA3887_pPIC9K重組質(zhì)粒經(jīng)Sal I線性化后電轉入表達宿主P.pastoris GSl 15中，重組克隆子經(jīng)PCR驗證正確。
[0033]實施例5:重組畢赤酵母異源表達透明質(zhì)酸酶
[0034]驗證正確的重組A3887克隆子進行發(fā)酵培養(yǎng)表達。單克隆接種于5ml的YPD培養(yǎng)基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)，30°C、200rpm培養(yǎng)16h。按10%的接種量轉接于100ml的誘導表達培養(yǎng)基BMGY (配1L，酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K2HPO4,11.8g/L KH2PO4,加水至890mL, 121 °C滅菌20分鐘，然后待溫度降至60°C以后在超凈臺上加入 IO X YNBI OOmL (13.4g/L), 500 X 生物素 lmL(4X l(T4g/L)，甘油 IOmL),30°C 200rpm培養(yǎng)至OD6tltl值為2_5之間，離心收集菌體，更換至100ml誘導表達培養(yǎng)基BMMY(酵母提取物 10g/L，蛋白胨 20g/L，3g/L K2HPO4,11.8g/L KH2PO4,加水至 895mL，121°C滅菌20分鐘，然后待溫度降至60°C以后在超凈臺上加入100 X YNBlOOmL (13.4g/L)，500 X生物素lmL(4Xl(T4g/L)，甲醇5mL)。30°C 200rpm培養(yǎng)，每24h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至終濃度為0.5~1.0%進行誘導表達，誘導表達96h。重組透明質(zhì)酸酶發(fā)酵液與對照菌發(fā)酵液進行SDS-PAGE電泳分析，結果如圖1所示，泳道I為對照發(fā)酵液，泳道2為重組酶發(fā)酵液，經(jīng)比較分析，確定在箭頭標示的位置為重組酶的表達蛋白。
[0035]實施例6:重組生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的活性檢測搖瓶發(fā)酵液酶活測定
[0036]根據(jù)平板透明圈法檢測透明質(zhì)酸酶活性。配置緩沖液(50mM的檸檬酸/檸檬酸鈉ρΗ5.3，150mM 的 NaCl, 0.02%Na3N),量取 50ml 緩沖液，加入 1.5% 的瓊脂糖和 lmg/ml 的 HA,融化后配置平板。將發(fā)酵液滴入孔徑內(nèi)部，平板置于37°C培養(yǎng)10h，在平板上覆蓋適量的10% (w/v)的氯化十六燒吡唳(cetylpyridinium chloride)水溶液,約10_20min后出現(xiàn)透明圈，如本發(fā)明專利附圖2所示。CTAB濁度法檢測透明質(zhì)酸酶活性。在Iml反應體系中，含HA (2mg/ml)100l.! 1，加入發(fā)酵液上清或者酶液適量，pH5.5、50mM的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液補足至Iml0混勻后置于38°C水浴反應30min，立即加入2ml的CTAB (2.5g/L),室溫反應5min，在400nm下進行濁度對比測定。濁度比色結果如附圖3所示，具有透明質(zhì)酸酶活性的A3887-1和-2發(fā)酵液作用透明質(zhì)酸后，反應體系呈澄清狀，而對照呈渾濁狀。
[0037]透明質(zhì)酸酶專一作用于透明質(zhì)酸內(nèi)的葡萄糖苷酸鍵，產(chǎn)生具有還原端為葡萄糖醛酸小分子多糖。采用3，5—二硝基水楊酸比色法測量水解透明質(zhì)酸產(chǎn)生的還原糖當量，用分析純葡萄糖作標準曲線，用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量，求出酶的比活力。反應體系為lml，用pH5.5、50mM的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配置2mg/ml的HA，反應體系加入400 μ I的HA溶液、100 μ I的發(fā)酵上清液酶液，緩沖液補足至Iml ;對照組采用pPIC9K_GS115發(fā)酵上清液。在38°C反應20min，立即沸水終止反應，采用DNS法測定產(chǎn)生的還原糖當量(相當于等量葡萄糖的還原力)，計算發(fā)酵液產(chǎn)生的酶活單位數(shù)。兩個平行發(fā)酵組采用此方法測定的發(fā)酵液酶比活如圖4所示，分別為3963.22U/ml和4043.67U/ml。
[0038]實施例7:重組透明質(zhì)酸酶的純化制備
[0039]根據(jù)透明質(zhì)酸的結構特性，屬于高聚陰離子型糖胺聚糖，可采用二乙氨乙基纖維素柱(DEAE-ellulose)進行離子交換純化。發(fā)酵液上清用磷酸鹽緩沖液調(diào)pH值至7.0，DEAE纖維素柱采用相同PH值的緩沖液平衡30min，將發(fā)酵液上清注入DEAE纖維素柱，混勻靜置Ih,每15min攪勻一次。隨 后分別用pH6.5,6.0的雙甘氨肽緩沖液洗脫雜質(zhì)，再采用pH5.6的乙酸鹽緩沖液特異性洗脫目標蛋白。洗脫的目標蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測，如附圖1中泳道3所示，采用此步驟純化方法獲得了單一條帶的透明質(zhì)酸酶蛋白。
【權利要求】
1.一種透明質(zhì)酸酶基因，其特征在于核苷酸序列如(a)或(b)或(C)所示: Ca)核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示； (b)在(a)中的核苷酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個核苷酸或幾個核苷酸且具有透明質(zhì)酸酶活性的基因； (C)與(a)中氨基酸序列整體相似度在85%以上，具有透明質(zhì)酸酶活性的基因。
2.根據(jù)權利要求1所述透明質(zhì)酸酶基因編碼的蛋白質(zhì)，氨基酸序列如SEQID N0.2所示，或其保守性變異多肽。
3.含有權利要求1所述透明質(zhì)酸酶基因的轉基因細胞系。
4.一種表達權利要求1所述透明質(zhì)酸酶基因的方法，其特征在于包括如下步驟:以含有透明質(zhì)酸酶基因的重組畢赤酵母為生產(chǎn)菌株，使用BMGY培養(yǎng)基，甲醇誘導發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶。
5.權利要求4所述的方法，其特征在于所述畢赤酵母為GSl15。
6.權利要求4所述 的方法，其特征在于具體步驟如下:以含有透明質(zhì)酸酶基因的重組畢赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-HaseA3887為生產(chǎn)菌株，發(fā)酵條件為:將種子培養(yǎng)液按10%的接種量接種到25ml (搖瓶容量250ml) BMGY培養(yǎng)基中，溫度為30°C、pH為6.0培養(yǎng)至0D600為4，更換誘導表達培養(yǎng)基，添加1%的甲醇進行誘導，每隔24h補加一次甲醇，誘導表達96h。
7.權利要求4所述的方法，其特征在于所示透明質(zhì)酸酶的純化條件為:采用二乙氨乙基纖維素柱(DEAE-ellulose)進行離子交換，分別用pH6.5,6.0的雙甘氨肽緩沖液洗脫雜質(zhì)，再以pH5.6、50mM的乙酸鹽緩沖液特異性洗脫目標蛋白。
【文檔編號】C12N15/56GK103695448SQ201410007408
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2014年1月8日 優(yōu)先權日:2013年7月29日
【發(fā)明者】陳堅, 堵國成, 康振, 金鵬 申請人:江南大學