一種生物催化的高效農(nóng)業(yè)殼寡糖的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生物催化的高效農(nóng)業(yè)殼寡糖的生產(chǎn)方法，屬于從殼聚糖制備殼寡糖產(chǎn)品的生物化工領(lǐng)域。以蝦蟹加工副產(chǎn)品為原料，利用生物酶解法提取甲殼素，并脫乙?；玫綒ぞ厶?，利用蝦蟹加工副產(chǎn)物生產(chǎn)決了蝦加工副產(chǎn)物的污染問題，而且有利于解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上主要病害問題，對(duì)發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)和克服農(nóng)藥環(huán)境污染會(huì)產(chǎn)生巨大的社會(huì)效應(yīng)。本發(fā)明的工藝過程綠色無(wú)污染，產(chǎn)品收率高。
【專利說明】一種生物催化的高效農(nóng)業(yè)殼寡糖的生產(chǎn)方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種生物催化的高效農(nóng)業(yè)殼寡糖的生產(chǎn)方法，屬于從殼聚糖制備殼寡糖產(chǎn)品的生物化工領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0003]甲殼質(zhì)(chitin)是地球上最豐富的天然高分子化合物之一,其脫乙酰產(chǎn)物為殼聚糖(chitosan),殼聚糖降解即得殼寡糖(Oligochitosan 或 Chitooligosaccharides)。甲殼素和殼聚糖廣泛存在于節(jié)肢動(dòng)物(甲殼綱、昆蟲綱)、軟體動(dòng)物的外殼和真菌(卵菌除外)的細(xì)胞壁中，是地球上總量?jī)H次于纖維素的天然生物資源。殼聚糖是自然界中少見的聚陽(yáng)離子堿性多糖，特殊的分子組成和結(jié)構(gòu)賦予其多種生物學(xué)活性和功能，在農(nóng)業(yè)、食品、紡織、醫(yī)療和環(huán)保等方面已被廣泛的研究。作為一種天然的抗菌劑，殼聚糖對(duì)多種微生物如絲狀真菌、酵母和細(xì)菌等具有廣譜的抑菌活性。然而由于分子量大、粘度高、不溶于水和堿性介質(zhì)，僅溶于稀的酸溶液，其實(shí)際應(yīng)用受到很大的限制。
[0004]殼寡糖屬于低聚糖，分子量一般低于5000Da，具有良好的水溶性，且可生物降解，對(duì)人畜無(wú)毒，具有抑菌活性，可誘導(dǎo)植物抗病性，因而在植物病害防治、食品防腐以及醫(yī)療等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，
殼寡糖以其獨(dú)特的作物機(jī)理用于維護(hù)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，保護(hù)人民身體健康，是用于生產(chǎn)綠色食品的一種環(huán)保 型農(nóng)藥，無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)和可持續(xù)農(nóng)業(yè)的重要資源。
[0005]目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)殼寡糖的生產(chǎn)方法主要包括如下幾種:
1.化學(xué)法
降解殼聚糖的化學(xué)方法包括酸解法、氧化降解法及硼酸鈉降解法等。
[0006]酸解法對(duì)殼聚糖的解聚是一種最基本和最簡(jiǎn)單的方法。它是利用殼聚糖分子中存在眾多的游離氨基能夠與溶液中氫離子結(jié)合的特點(diǎn)，引起殼聚糖分子間與分子內(nèi)部的氫鍵斷裂，使分子結(jié)構(gòu)舒展，而長(zhǎng)鏈部分易發(fā)生糖苷鍵斷裂，形成許多聚合度不等的分子片段。濃鹽酸、醋酸、濃硫酸、硝酸、磷酸、氫氟酸、三氧乙酸和甲酸等無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸均可采用，但其降解產(chǎn)物以單糖較多，殼寡糖含量低，且需消耗大量酸，反應(yīng)條件苛刻，工藝煩瑣，后處理麻煩，同時(shí)這一工藝易給環(huán)境帶來巨大的壓力，故不夠理想。
[0007]氧化降解法是近年來國(guó)內(nèi)外研究比較多的殼聚糖降解方法。其中的過氧化氫(H2O2)氧化降解因成本低、降解速度相對(duì)較快、產(chǎn)品分子量低且分布窄，無(wú)殘毒、易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化而倍受關(guān)注。該法降解殼聚糖的收率受濃度、溫度、PH值及反應(yīng)時(shí)間的影響。酸性條件下H2O2對(duì)殼聚糖的氧化降解可制備分子量小于10000的殼聚糖；在中性條件下H2O2對(duì)殼聚糖的氧化降解反應(yīng)中制備了分子量為1000左右的藥用低聚氨基葡萄糖。
[0008]2.物理制備法
(I)超聲波法和微波法選用適當(dāng)頻率和功率的超聲波能使溶于酸性溶液中的殼聚糖發(fā)生降解反應(yīng)，得到低聚合度的甲殼低聚糖。超聲波作用時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度的升高均有利于降低產(chǎn)物的分子量，可使降解產(chǎn)物的分子量分布帶變窄，得到分子量較為均一的甲殼低聚糖。Kage等人的研究表明，將28kHz、45W的超聲波在60°C溫度下對(duì)溶于酸中的殼聚糖作用30 h，可得到分子量為500Da的甲殼低聚糖。該方法與化學(xué)降解法相比，所需的酸用量明顯減少，降解后的處理過程大為簡(jiǎn)化，也減輕了對(duì)環(huán)境污染，同時(shí)，具有反應(yīng)溫和、氨基(-NH2)在降解過程中不會(huì)被締合等優(yōu)點(diǎn)。但該法只適合在濃度較低的狀態(tài)下進(jìn)行，且甲殼低聚糖回收率較低，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高，目前還無(wú)法被廣泛運(yùn)用。微波降解法不僅能使殼聚糖分子中的糖苷鍵斷裂，還能讓脫乙酰不完全的殼聚糖發(fā)生脫乙酰反應(yīng)，使脫乙酰反應(yīng)和降解反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，縮短了甲殼低聚糖的制備時(shí)間。微波降解法具有操作簡(jiǎn)單、節(jié)能環(huán)保、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但由于微波使升溫過快，導(dǎo)致單體容易揮發(fā)，反應(yīng)不完全，目前還無(wú)法用于大量生產(chǎn)。
[0009](2) Y射線照射輻射降解
采用Y-射線照射殼聚糖可使它的糖苷鍵發(fā)生斷裂、聚合度下降、分子量降低。在剛開始照射時(shí)殼聚糖的降解速度較快，當(dāng)分子量下降到50kDa后降解速度就變得十分緩慢，因此采用該法難以制備分子量小于40 kDa的甲殼低聚糖。研究發(fā)現(xiàn)，輻射劑量對(duì)產(chǎn)物的分子量有一定的影響，通過控制不同的輻射劑量可得到不同分子量的甲殼低聚糖，而真空環(huán)境的負(fù)壓能破壞殼聚糖的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有助于降解反應(yīng)的進(jìn)行。Y射線降解法是一種無(wú)須添加物的固相反應(yīng)，具有無(wú)污染、反應(yīng)易控、產(chǎn)品品質(zhì)高等優(yōu)點(diǎn)。
[0010]3.酶降解法
酶降解法與其它降解方法相比，具有反應(yīng)條件溫和，降解過程及降解產(chǎn)物相對(duì)分子量分布容易控制，制備的低聚殼聚糖生物活性高，產(chǎn)物不用除鹽，過程容易控制，且不對(duì)環(huán)境造成污染等優(yōu)勢(shì)，是理想的降解方法。
[0011]酶法降解殼聚糖分為專一性酶和非專一性酶降解。。迄今為止已發(fā)現(xiàn)有37種各類水解酶對(duì)殼聚糖均有降解效果.。幾丁質(zhì)酶、殼聚糖酶、甲殼胺酶、溶菌酶和N-乙酰葡萄糖胺酶能專一性水解殼聚糖；糖酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、半纖維素酶和里氏木酶等在內(nèi)的30多種水解酶有部分和完全非專一性水解作用。
[0012](I)專一性酶降解法
專一性水解酶是利用以殼聚糖為專一性底物的殼聚糖酶，可以高選擇性地切斷殼聚糖的β-α，4)-糖苷鍵水解殼聚糖，主要包括甲殼素酶、殼聚糖酶和溶菌酶。該反應(yīng)條件溫和且無(wú)須大量試劑，為大規(guī)模生產(chǎn)殼寡糖提供了可能，是一種較為理想的制備方法。目前，殼聚糖酶的研究主要是在自然界中繼續(xù)篩選產(chǎn)酶活性較高的微生物菌種及酶最佳反應(yīng)條件研究。此外，運(yùn)用基因工程手段，通過對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶的基因分析，運(yùn)用分子方法克隆并高效表達(dá)所選菌株的殼聚糖酶基因，以實(shí)現(xiàn)重組菌的殼聚糖酶高效表達(dá)也是目前研究的重點(diǎn)。
[0013](2)非專一性酶降解法
專一性水解酶主要來源于真菌細(xì)胞，因來源有限、價(jià)格昂貴而制約其應(yīng)用。使用非專一性酶如多糖酶、脂肪酶、蛋白酶等進(jìn)行殼聚糖的降解也成為重要的生產(chǎn)策略。我國(guó)揚(yáng)州大學(xué)酶工程研究室建立了一個(gè)用蛋白酶降解高分子殼聚糖的制備工藝，制備的殼寡糖平均分子量約為1500，2000，3000，4000，10000，20000。無(wú)錫輕工大學(xué)多年來對(duì)殼聚糖的水解進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用多種非專一性酶組成的復(fù)合酶(糖酶、蛋白酶、脂肪酶等)對(duì)殼聚糖水解的作用。其產(chǎn)物的平均分子量可達(dá)10000以下。然而，非專一性水解酶降解程度比較有限，到一定程度后，即使再增加酶量也難以提高水解程度；而且產(chǎn)物復(fù)雜，不易分離，工業(yè)化生產(chǎn)過程中酶使用量大，導(dǎo)致成本增高，有一定缺陷。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種成本低、能耗小、環(huán)保的生物催化高效農(nóng)業(yè)殼寡糖的生產(chǎn)方法。
[0015]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種生物催化的高效農(nóng)業(yè)殼寡糖的生產(chǎn)方法:將殼聚糖原料干燥后粉碎分篩，倒入池子，向池子中加水進(jìn)行溶解攪拌，再加入一水檸檬酸和枯草桿菌發(fā)酵，水洗，固液分離，向物料中加入亞硫酸氫鈉和水進(jìn)行脫鈣，脫鈣后水洗過濾，擠干，得到甲殼素，向甲殼素中添加水?dāng)嚢?，再加入氫氧化鈉，待氫氧化鈉完全溶解后，給池子加熱，使其池內(nèi)的溫度保持在115-125攝氏度，攪拌3個(gè)小時(shí)就可以脫乙酰成功，得到目標(biāo)產(chǎn)品。
[0016]用一水檸檬酸脫蛋白水洗后，先用高錳酸鉀加水經(jīng)行攪拌8個(gè)小時(shí)后，進(jìn)行水洗過濾擠干，后用亞硫酸氫鈉進(jìn)行脫鈣。
[0017]生產(chǎn)的殼寡糖的分子量〈3000，脫乙酰度>90%，顆粒度≥100目；水分〈10% ;灰分<1% ；pH值5.5-7.0 ;不溶物≤0.1%。
[0018]原料殼聚糖和水的比例為1:8。
[0019]所述的水溶淀粉和枯草桿菌殼聚糖重量的40%。
[0020]所述的亞硫酸氫鈉為蝦蟹殼重量的10%。
[0021]所述的高錳酸鉀為蝦蟹殼重量的0.5%。
[0022]所述的氫氧化鈉的重量為蝦蟹殼重量的50%。
[0023]本發(fā)明的有益效果:利用蝦蟹加工副產(chǎn)物生產(chǎn)決了蝦加工副產(chǎn)物的污染問題，而且有利于解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上主要病害問題，對(duì)發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)和克服農(nóng)藥環(huán)境污染會(huì)產(chǎn)生巨大的社會(huì)效應(yīng)。本發(fā)明的工藝過程綠色無(wú)污染，產(chǎn)品收率高。
【具體實(shí)施方式】
[0024]為了是本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，本發(fā)明采用如下具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作詳細(xì)說明。
[0025]實(shí)施例1
將IOOkg蝦蟹殼進(jìn)行粉碎，粉碎后用餐40目的篩網(wǎng)進(jìn)行分篩，把一些小顆粒的粉塵過濾掉，篩網(wǎng)上面的大顆粒蝦蟹殼進(jìn)行收集；
把干燥的蝦蟹殼倒入進(jìn)行生產(chǎn)的圓形池子里，蝦蟹殼倒入池子后，向池子里加入800kg水?dāng)嚢瑁靡欢üβ实碾姍C(jī)加上減速機(jī)能使該電機(jī)帶動(dòng)用不銹鋼制作的攪拌機(jī)，轉(zhuǎn)動(dòng)速度為每分鐘三十轉(zhuǎn)進(jìn)行攪拌，在生產(chǎn)車間的溫度為37-40攝氏度的環(huán)境中攪拌，待蝦蟹殼與水?dāng)嚢杈鶆蚝螅蚱浼尤?9.5kg酸和2.3g枯草桿菌進(jìn)行發(fā)酵52小時(shí)，發(fā)酵完后，進(jìn)行水洗；
洗干凈后，把蝦蟹殼放入池子里，向其里面放入IOkg亞硫酸氫鈉，加入蝦殼中的800kg水?dāng)嚢?，使其快速溶解，進(jìn)行脫鈣，攪拌兩個(gè)小時(shí)后，進(jìn)行水洗過濾，然后一水檸檬酸脫蛋白水洗后，先用0.5kg高錳酸鉀加水經(jīng)行攪拌7小時(shí)后，進(jìn)行水洗過濾擠干，后用亞硫酸氫鈉進(jìn)行脫鈣，脫鈣完成生成甲殼素。
[0026]將甲殼素水洗過濾擠干后，倒入能耐強(qiáng)堿的池子里，加水至能把甲殼素完全淹沒，在加入的同時(shí)，把其重量稱號(hào)記錄，打開攪拌機(jī)進(jìn)行攪拌，攪拌均勻后，再向池子里加入水和甲殼素等重量的氫氧化鈉，在加入氫氧化鈉的時(shí)候，一定要在攪拌機(jī)攪動(dòng)的同時(shí)慢慢的加入，使其慢慢的放熱，待氫氧化鈉完全溶解后，給池子加熱，使其池內(nèi)的溫度保持在116度左右，攪拌3個(gè)小時(shí)就可以脫乙酰成功，生成殼聚糖了。攪拌完成后，進(jìn)行水洗，過濾干燥得到糖的干品。
[0027]實(shí)施例2
將IOOkg蝦蟹殼進(jìn)行粉碎，粉碎后用餐40目的篩網(wǎng)進(jìn)行分篩，把一些小顆粒的粉塵過濾掉，篩網(wǎng)上面的大顆粒蝦蟹殼進(jìn)行收集；
把干燥的蝦蟹殼倒入進(jìn)行生產(chǎn)的圓形池子里，蝦蟹殼倒入池子后，向池子里加入800kg水?dāng)嚢?，用一定功率的電機(jī)加上減速機(jī)能使該電機(jī)帶動(dòng)用不銹鋼制作的攪拌機(jī)，轉(zhuǎn)動(dòng)速度為每分鐘三十轉(zhuǎn)進(jìn)行攪拌，在生產(chǎn)車間的溫度為37-40攝氏度的環(huán)境中攪拌，待蝦蟹殼與水?dāng)嚢杈鶆蚝?，向其加?0kg酸和2.5g枯草桿菌進(jìn)行發(fā)酵48小時(shí)，發(fā)酵完后，進(jìn)行水洗；洗干凈后，把蝦蟹殼放入池子里，向其里面放入IOkg亞硫酸氫鈉，加入蝦殼中的600kg水?dāng)嚢瑁蛊淇焖偃芙?，進(jìn)行脫鈣，攪拌兩個(gè)小時(shí)后，進(jìn)行水洗過濾，然后一水檸檬酸脫蛋白水洗后，先用0.5kg高猛酸鉀加水經(jīng)行攪拌8個(gè)小時(shí)后,進(jìn)行水洗過濾擠干,后用亞硫酸氫鈉進(jìn)行脫鈣，脫鈣完成生成甲殼素。
[0028]將甲殼素水洗過濾擠干后，倒入能耐強(qiáng)堿的池子里，加水至能把甲殼素完全淹沒，在加入的同時(shí)，把其重量稱號(hào)記錄，打開攪拌機(jī)進(jìn)行攪拌，攪拌均勻后，再向池子里加入水和甲殼素等重量的氫氧化 鈉，在加入氫氧化鈉的時(shí)候，一定要在攪拌機(jī)攪動(dòng)的同時(shí)慢慢的加入，使其慢慢的放熱，待氫氧化鈉完全溶解后，給池子加熱，使其池內(nèi)的溫度保持在124氏度左右，攪拌3個(gè)小時(shí)就可以脫乙酰成功，生成殼聚糖了。攪拌完成后，進(jìn)行水洗，過濾干燥得到糖的干品。
[0029]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
【權(quán)利要求】
1.一種生物催化的高效農(nóng)業(yè)殼寡糖的生產(chǎn)方法，其特征在于:將殼聚糖原料干燥后粉碎分篩，倒入池子，向池子中加水進(jìn)行溶解攪拌，再加入一水檸檬酸和枯草桿菌發(fā)酵，水洗，固液分離，向物料中加入亞硫酸氫鈉和水進(jìn)行脫鈣，脫鈣后水洗過濾，擠干，得到甲殼素，向甲殼素中添加水?dāng)嚢瑁偌尤霘溲趸c，待氫氧化鈉完全溶解后，給池子加熱，使其池內(nèi)的溫度保持在115-125攝氏度，攪拌3個(gè)小時(shí)就可以脫乙酰成功，得到目標(biāo)產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物催化的高效農(nóng)業(yè)殼寡糖的生產(chǎn)方法，其特征在于:用一水檸檬酸脫蛋白水洗后，先用高錳酸鉀加水經(jīng)行攪拌8個(gè)小時(shí)后，進(jìn)行水洗過濾擠干，后用亞硫酸氫鈉進(jìn)行脫鈣。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物催化的高效農(nóng)業(yè)殼寡糖的生產(chǎn)方法，其特征在于:生產(chǎn)的殼寡糖的分子量〈3000，脫乙酰度>90%，顆粒度≥100目；水分〈10%;灰分<1%; ρΗ值5.5-7.0 ;不溶物≤0.1%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物催化的高效農(nóng)業(yè)殼寡糖的生產(chǎn)方法，其特征在于:原料殼聚糖和水的比例為1:8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物催化的高效農(nóng)業(yè)殼寡糖的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述的水溶淀粉和枯草桿菌殼聚糖重量的40%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物催化的高效農(nóng)業(yè)殼寡糖的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述的亞硫酸氫鈉為蝦蟹殼重量的10%。
7.根據(jù)權(quán)利要求所述的一種生物催化的高效農(nóng)業(yè)殼寡糖的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述的高錳酸鉀為蝦蟹殼重量的0.5%。
8.根據(jù)權(quán)利要求所述的一種生物催化的高效農(nóng)業(yè)殼寡糖的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述的氫氧化鈉的重量為蝦蟹殼重量的50%。
【文檔編號(hào)】C12R1/125GK103436573SQ201310329647
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年8月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月1日
【發(fā)明者】馮端林, 羅紅宇, 趙新安 申請(qǐng)人:武漢高龍水產(chǎn)食品有限公司