一種使胞內(nèi)蛋白表達(dá)至胞外的放線菌信號(hào)肽及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種使胞內(nèi)蛋白表達(dá)至胞外的放線菌信號(hào)肽，其命名為Kp?SP，來(lái)源于庫(kù)克氏菌(Kocuria sp.3?3)菌株，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。本發(fā)明還公開了該信號(hào)肽在利用構(gòu)建的重組大腸桿菌表達(dá)淀粉酶或纖維素酶中的應(yīng)用，本發(fā)明的信號(hào)肽不僅在常用的表達(dá)載體中具有將外源蛋白分泌到胞外的能力，使蛋白表達(dá)量增高，酶活明顯提高，并切在組成型表達(dá)載體pBSPPc中也具有外源蛋白分泌到胞外的能力，為生產(chǎn)高活性分泌蛋白提供了一條有效途徑。作為一種基礎(chǔ)的基因工程技術(shù)，本發(fā)明為生產(chǎn)工業(yè)蛋白提供了有利的條件，增強(qiáng)了蛋白的表達(dá)量及酶活，降低了分離成本，在蛋白質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)方面具有很大的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】
-種使胞內(nèi)蛋白表達(dá)至胞外的放線菌信號(hào)化及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種使胞內(nèi)蛋白表達(dá)至胞外的信號(hào)膚及 其在利用構(gòu)建的重組大腸桿菌表達(dá)淀粉酶、及纖維素酶中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因表達(dá)是指細(xì)胞在生命過(guò)程中，把儲(chǔ)存在DNA順序中遺傳信息經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯， 轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子;基因工程技術(shù)中的外源蛋白的表達(dá)是指將獲得的外源 基因片段通過(guò)載體重組到一個(gè)新的基因表達(dá)宿主中，使其能大量生產(chǎn)具有生物活性的蛋白 產(chǎn)物，是當(dāng)今分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的技術(shù)手段之一。隨著生物工業(yè)生產(chǎn)工藝的發(fā)展， 人們對(duì)高純度、高產(chǎn)量和高穩(wěn)定性的重組功能蛋白的需求日益增長(zhǎng)，運(yùn)使得外源蛋白表達(dá) 技術(shù)成為基因工程、生物生產(chǎn)和應(yīng)用的重要內(nèi)容。
[0003] 信號(hào)膚是引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的短(長(zhǎng)度5-30個(gè)氨基酸)膚鏈;常 指新合成多膚鏈中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)移(定位)的N-末端的氨基酸序列(有時(shí)不一定 在N端）。在起始密碼子后，有一段編碼疏水性氨基酸序列的RNA區(qū)域，該氨基酸序列就被稱 為信號(hào)膚序列，它負(fù)責(zé)把蛋白質(zhì)引導(dǎo)到細(xì)胞含不同膜結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞器內(nèi)。外源蛋白在宿主 菌，如大腸桿菌中的表達(dá)形式多為細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá)(包涵體），少數(shù)為細(xì)胞外分泌表達(dá)。利 用信號(hào)膚來(lái)引導(dǎo)外源蛋白定位分泌到細(xì)胞特定區(qū)間，提高可溶性，可避免因包涵體復(fù)性帶 來(lái)的困難。研究表明，多種外源基因連接上信號(hào)膚后，在原核表達(dá)系統(tǒng)，如大腸桿菌、L型細(xì) 菌、芽抱桿菌和乳酸桿菌中等都得到了分泌表達(dá);信號(hào)膚也廣泛應(yīng)用于真核表達(dá)系統(tǒng)如畢 赤酵母和昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中。
[0004] 目前大腸桿菌中異源表達(dá)所用信號(hào)膚一般為來(lái)源于大腸桿菌自身或者芽抱桿菌， 但大多在高效分泌表達(dá)中存在通用性不強(qiáng)的缺陷，導(dǎo)致選擇前需要開展大量的信號(hào)膚篩選 工作。本專利設(shè)及的信號(hào)膚來(lái)自于放線菌，根據(jù)檢索，目前利用放線菌庫(kù)克氏菌來(lái)源的信號(hào) 膚進(jìn)行大腸桿菌重組分泌表達(dá)未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)當(dāng)前研究現(xiàn)狀，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種使胞內(nèi)蛋白表達(dá)至胞外的放 線菌信號(hào)膚及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所述的使胞內(nèi)蛋白表達(dá)至胞外的放線菌信號(hào)膚，其特征是:所述信號(hào)膚命 名為Kp-SP,來(lái)源于庫(kù)克氏菌化ocuria SP.3-3)菌株，其核巧酸序列長(zhǎng)度為90bp，如SEQ ID No. 1所示;氨基酸序列長(zhǎng)度為29aa，如SEQ ID No.7所示。
[0007] 本發(fā)明所述使胞內(nèi)蛋白表達(dá)至胞外的放線菌信號(hào)膚在利用構(gòu)建的重組大腸桿菌 表達(dá)淀粉酶或纖維素酶中的應(yīng)用。
[000引其中：上述淀粉酶是淀粉酶KC441955.1，命名為FSA，來(lái)源于Sinomicrobium Pectinilyticus加 NSOOl，長(zhǎng)度1359bp，其核巧酸序列如沈Q ID No.2所示，氨基酸序列長(zhǎng) 度為452aa，如SEQ ID No.8所示；或是淀粉酶AAU39594，命名為化A，來(lái)源于Bacillus Iicheniformis DSM13,長(zhǎng)度1455bp，其核巧酸序列如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列長(zhǎng)度為 484aa，如SEQ ID No.9所示；上述纖維素酶0RF3883,命名為CCC，來(lái)源于Clostridium cellulosi CS-4-4(Zhang et al.Synergism of Glycoside Hydrolase secretomes from two Thermophilic bacteria cocultivated on Iignocellulose.Appl Environ Microbiol (2014)80:2592-2601.)，長(zhǎng)度2100bp，其核巧酸序列如沈Q ID No. 4所示，氨基酸 序列長(zhǎng)度為699aa，如SEQ ID No. 10所示。
[0009] 上述使胞內(nèi)蛋白表達(dá)至胞外的信號(hào)膚在利用構(gòu)建的重組大腸桿菌表達(dá)淀粉酶或 纖維素酶中的應(yīng)用中，所述重組大腸桿菌的構(gòu)建方法是：
[0010] (1)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)所提供KC441955.1、AAU39594、0RF3883所述的核巧酸序列設(shè) 計(jì)引物；
[00川其中，淀粉酶KC44 1955. 1與信號(hào)膚Kp-SP重組所用引物為：SFSA-Fl : GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC，SFSA-Rl:GCGAGCGCCGATGACAATAATAATTATAC;SFSA-F2: GTATAATTATTATTGTCATCGGCGCTCGC，SFSA-R2: GACGTCGACTTACTCTCCCGAAACCGACCATATG，通過(guò) S步PC時(shí)尋信號(hào)膚Kp-SP序列與KC441955.1序列連接，所得重組基因片段命名為SFSA;
[001^ 淀粉酶AAU39594與信號(hào)膚Kp-SP重組所用引物為：SBLA-F1: GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC,SBLA-Rl：CTTTAAGATTTGCCGCGGCGCTCG,SBLA-F2： GCGAGCGCCGCGGCAAATCTTAAAG，SBLA-R2: CCCAAGCTTGGGCTATCTTTGAACATAAATTG，通過(guò) S 步 PC時(shí)尋信號(hào)膚Kp-SP序列與AAU39594序列連接，所得重組基因片段命名為SBLA;
[001引纖維素酶0RF3883與信號(hào)膚Kp-SP重組所用引物為：SCCC-F1: GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC，SCCC-Rl:CTGGGCCGCTTACGGCGCTCGC，SCCC-F2: GCGAGCGCCGTAAGCGGCCCAG，SCCC-R2: GACGTCGACTTACTGCGGTTCAACGCCCCATATC，通過(guò) S 步 PCR 將信號(hào)膚Kp-SP序列與0RF3883序列連接，所得重組基因片段命名為SCCC;
[0014] 其中：所述KC441955.1的核巧酸序列如沈Q ID齡.2所示，441139594的核巧酸序列 如沈Q ID No.3所示，0RF3883的核巧酸序列如沈Q ID No.4所示；
[0015] 對(duì)照組為一步PCR獲得的不加信號(hào)膚Kp-SP的KC441955.1或AAU39594或0RF3883所 示的基因片段；
[0016] (2)將（1)中得到的S組重組基因片段和對(duì)照組基因片段分別與載體pET-Duet或 pBSP 化連接，構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒 SFSA-pET-Duet、SFSA-pBSPPc 或 SBLA-pET-Duet、SBLA- pBSP化或SCCC-pET-Duet、SCCC-pBSPPc，將所述重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌化21 (DE3)中，獲得的重組菌株通過(guò)PCR和瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證確認(rèn);對(duì)照組為FSA-pET-Duet、 FSA-pBSPPc 或 BLA-pET-Duet、BLA-pBSPPc 或 CCC-祀 T-Duet、CCC-地 SP 化重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受 態(tài)大腸桿菌化21 (DE3)中，通過(guò)PCR和瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證；
[0017] (3)將(2)中得到的W祀T-Duet為載體的重組菌株按照體積比2%的接種量分另臘 于LB搖管中，培養(yǎng)8-化，再W體積比1 %的接種量轉(zhuǎn)接于100mL LB搖瓶中，37°C搖床培養(yǎng)，待 ODsoonm= 0.4-0.6時(shí)，按體積比加入1%。的口PG，其中，產(chǎn)淀粉酶FSA及SFSA的重組菌株放入20 °C搖床過(guò)夜培養(yǎng)，產(chǎn)淀粉酶化A及SBLA的重組菌株于37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h，產(chǎn)纖維素酶CCC及 SCCC的重組菌株于37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h，所獲菌液離屯、保留上清，即得到含有淀粉酶或纖維素 酶的發(fā)酵液；
[001引同樣，將(2)中得到的W地SP化為載體的重組菌株按照體積比2%的接種量分別接 于LB搖管中，培養(yǎng)8-化，再W體積比1%的接種量轉(zhuǎn)接于100mL LB搖瓶中，其中，產(chǎn)淀粉酶 FSA及SFSA的重組菌株直接20°C過(guò)夜培養(yǎng)，產(chǎn)淀粉酶BLA及SBLA的重組菌株直接37°C過(guò)夜培 養(yǎng)，產(chǎn)纖維素酶CCC及SCCC的重組菌株直接37°C過(guò)夜培養(yǎng)，所獲菌液離屯、保留上清，即得到 含有淀粉酶或纖維素酶的發(fā)酵液。
[0019] 本發(fā)明公開了一種使胞內(nèi)蛋白表達(dá)至胞外的放線菌信號(hào)膚及其應(yīng)用。通過(guò)利用來(lái) 源于放線菌的一種高通用性信號(hào)膚構(gòu)建了帶有信號(hào)膚的淀粉酶和纖維素酶，通過(guò)信號(hào)膚分 別與誘導(dǎo)型表達(dá)載體祀T-Duet及組成型表達(dá)載體地SP化融合，獲得了高效的大腸桿菌誘導(dǎo) 型及組成型分泌表達(dá)系統(tǒng)。結(jié)果表明該信號(hào)膚的使用不僅顯著提高了胞外培養(yǎng)基中的目的 蛋白量及酶活，還提高了胞內(nèi)目的蛋白的酶活性，沉淀中包涵體明顯減少。有效解決了異源 蛋白的包涵體形成、不溶性表達(dá)等問(wèn)題。分別利用=個(gè)水解酶進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，其中一個(gè)為稀 有密碼子含量高的古菌淀粉酶同源蛋白，結(jié)果表明該信號(hào)膚具有在大腸桿菌中表達(dá)的通用 性。因此本發(fā)明可顯著提高大腸桿菌重組蛋白的活性表達(dá)量，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1:克隆表達(dá)載體構(gòu)建圖。
[0021] 圖2:重組菌株透明圈實(shí)驗(yàn)
[0022] 其中：BLA表示DSM13淀粉酶，F(xiàn)SA表示抓NSOOl淀粉酶，CCC表示纖維素酶。
[0023] 圖3:重組菌株的淀粉酶及纖維素酶酶活
[0024] 其中：圖中A，B，C分別表示DSM13淀粉酶各轉(zhuǎn)化子酶活，5DNS001淀粉酶各轉(zhuǎn)化子酶 活，纖維素酶各轉(zhuǎn)化子酶活。
[0025] 圖4:重組菌株樣品SDS-PAGE
[0026] 其中：1-8泳道依次為W祀T-Duet為載體不帶有信號(hào)膚轉(zhuǎn)化子的胞外樣品，W祀T- Duet為載體不帶有信號(hào)膚轉(zhuǎn)化子的胞內(nèi)樣品，W祀T-Duet為載體帶有信號(hào)膚轉(zhuǎn)化子的胞外 樣品，WpET-Duet為載體帶有信號(hào)膚轉(zhuǎn)化子的胞內(nèi)樣品，WpBSP化為載體不帶有信號(hào)膚轉(zhuǎn) 化子的胞外樣品，WpBSP化為載體不帶有信號(hào)膚轉(zhuǎn)化子的胞內(nèi)樣品，WpBSP化為載體帶有 信號(hào)膚轉(zhuǎn)化子的胞外樣品，W地SP化為載體帶有信號(hào)膚轉(zhuǎn)化子的胞內(nèi)樣品。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 酶活測(cè)定方法:實(shí)驗(yàn)酶類水解底物產(chǎn)生還原糖，DNS(稱3,5-二硝基水楊酸3.15g， 加水0.化，45 °C水浴，溶解后加入10.48g氨氧化鋼，攬拌至完全溶解后依次加入酒石酸鐘鋼 91g、苯酪2.5g、無(wú)水亞硫酸鋼2.5g;定容至1L，儲(chǔ)存于棟色瓶中避光保存7天后使用）?？膳c 還原糖結(jié)合產(chǎn)生顯色反應(yīng)。
[0028] 實(shí)施例1:化學(xué)法重組菌株的構(gòu)建
[0029] 感受態(tài)的制備:化學(xué)法(化Cb)法
[0030] 1%接種量接化21過(guò)夜培養(yǎng)物到50ml LB中；每隔15-20min測(cè)一次0D600皿，待長(zhǎng)至 0.3-0.4時(shí)收集菌體;將培養(yǎng)物放置于冰上IOmin，再倒入50ml離屯、管中，4°C，450化pm，離屯、 10min(50ml離屯、管也需預(yù)冷，提前將離屯、機(jī)調(diào)至4°C);棄上清，50ml初始培養(yǎng)液用30ml預(yù)冷 的0.1 M MgCl2-CaCl2溶液重懸細(xì)胞沉淀;4°C，4500rpm，離屯、IOmin;棄上清，50ml初始培養(yǎng)液 用2ml預(yù)冷的0.1 M CaCb溶液（15%甘油)重懸細(xì)胞沉淀;5化1/管或IOOiil/管分裝，于-70°C 保藏。
[0031] 連接體系:載體化1，目的片段5.扣1，T4DNA連接酶0.扣1，T4DNA連接酶Buffer化I; 連接條件：25 °C化；將連接液加入到感受態(tài)細(xì)胞化21中，冰上30min，37 °C水浴5min，冰上 Smin;加入5(K)山LB培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)化后涂板化B固體，加入Amp),將平板放入37°C培 養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng);挑單菌落提質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證，正確的菌株保藏備用。
[0032] 實(shí)施例2 :FSA及SFSA重組菌株的構(gòu)建
[0033] FSA淀粉酶基因全長(zhǎng)1359bp。根據(jù)信號(hào)膚序列設(shè)計(jì)引物，將信號(hào)膚序列與 KC441955.1所示的基因序列進(jìn)行重組，獲得融合基因片段SFSA。其中：1輪PCR分別擴(kuò)增上下 兩個(gè)片段，引 物為 SFSA-F1:GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC，SFSA-R1: GCGAGCGCCGATGACAATAATAATTATAC;SFSA-F2:GTATAATTATTATTGTCATCGGCGCTCGC，SFSA-R2: GACGTCGACTTACTCTCCCGAAACCGACCATATG。兩組PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行切膠回收，回收產(chǎn)物測(cè)定濃 度，加水將上下游同源臂濃度調(diào)至基本相同；2輪PCRWl輪PCR產(chǎn)物為引物和模板，將兩段擴(kuò) 增產(chǎn)物連接來(lái)，回收PCR產(chǎn)物;3輪PCR W 2輪PCR為模板，引物為SFSA-Fl，SFSA-R2。
[0034] 對(duì)照組為不加信號(hào)膚的FSA，利用1步PCR獲得片段F SA，引物為F SA-F : GGCGAGCTCGGATGACAATAATAATTATAC，F(xiàn)SA-R: GACGTCGACTTACTCTCCCGAAACCGACCATATG，產(chǎn)物 進(jìn)行切膠回收。
[0035] 與祀T-Duet連接:將所獲回收片段FSA和SFSA按照如圖1所示的構(gòu)建方法，用BamH I和Sal I進(jìn)行雙酶切目的片段，載體祀T-Duetl同樣用BamH I和Sal I進(jìn)行雙酶，目的片段 和載體經(jīng)酶切純化后加入T4連接酶25°C放置化，連接產(chǎn)物化學(xué)法轉(zhuǎn)入到感受態(tài)化2UDE3) 中，冰上放置30min，37°C水浴5min，冰上5min后加入50化1 LB液體，37°C復(fù)蘇培養(yǎng)化后涂含 氨節(jié)青霉素（lOOmg/L)的LB平板，37 °C過(guò)夜培養(yǎng)，挑單菌落于LB+氨節(jié)青霉素（lOOmg/L)搖 管，提質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建的重組質(zhì)粒，測(cè)序由深圳華大基因完成。
[0036] 與pBSP化連接:將所獲回收片段FSA和SFSA按照如圖1所示的構(gòu)建方法，用BamH I 和Sal I進(jìn)行雙酶切目的片段，載體pBSP化同樣用BamH I和Sal I進(jìn)行雙酶，目的片段和載 體經(jīng)酶切純化后加入T4連接酶25°C放置化，連接產(chǎn)物化學(xué)法轉(zhuǎn)入到感受態(tài)化2UDE3)中，冰 上放置30min，37°C水浴5min，冰上5min后加入50化1 LB液體，37°C復(fù)蘇培養(yǎng)化后涂含硫酸 慶大霉素(50mg/L)的LB平板，37 °C過(guò)夜培養(yǎng)，挑單菌落于LB+硫酸慶大霉素(50mg/L)搖管， 提質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建的重組質(zhì)粒，測(cè)序由深圳華大基因完成。
[0037] 實(shí)施例3 :BLA及SBLA重組菌株的構(gòu)建
[0038] BLA淀粉酶基因全長(zhǎng)1455bp。根據(jù)信號(hào)膚序列設(shè)計(jì)引物，將信號(hào)膚序列與AAU39594 所示的基因序列進(jìn)行重組，獲得融合基因片段SBLA，其中，1輪PCR分別擴(kuò)增上下兩個(gè)片段， F2: GCGAGCGCCGCGGCAAATCTTAAAG，SBLA-R2: CCCAAGCTTGGGCTATCTTTGAACATAAATTG。兩組 PCR 產(chǎn)物分別進(jìn)行切膠回收，回收產(chǎn)物測(cè)定濃度，加水將上下游同源臂濃度調(diào)至基本相同；2輪 PCR W1輪PCR產(chǎn)物為引物和模板，將兩段擴(kuò)增產(chǎn)物連接來(lái)，回收PCR產(chǎn)物;3輪PCR W2輪PCR為 模板，引物為SBLA-Fl，SBLA-R2。
[0039] 對(duì)照組為不加信號(hào)膚的B L A，利用1步P C R獲得片段F S A，引物B L A - F : GAGGATCCGATGGCGGCAAATCTTAAAGGGACG，BLA-R: CCCAAGCTTGGGCTATCTTTGAACATAAATTG，產(chǎn)物 進(jìn)行切膠回收。
[0040]與祀T-Duet連接:將所獲回收片段BLA和SBLA按照如圖I所示的構(gòu)建方法，用BamH I和化nd III進(jìn)行雙酶切目的片段，載體祀T-Duetl同樣用BamH I和化nd III進(jìn)行雙酶，目 的片段和載體經(jīng)酶切純化后加入T4連接酶25°C放置化，連接產(chǎn)物化學(xué)法轉(zhuǎn)入到感受態(tài)化21 (DE3)中，冰上放置30min，37°C水浴5min，冰上5min后加入50化1 LB液體，37°C復(fù)蘇培養(yǎng)化 后涂含氨節(jié)青霉素（lOOmg/L)的LB平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，挑單菌落于LB+氨節(jié)青霉素（lOOmg/ U搖管，提質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建的重組質(zhì)粒，測(cè)序由深圳華大基因完成。
[0041 ]與pBSP化連接:將所獲回收片段BLA和SBLA按照如圖1所示的構(gòu)建方法，用BamH I 和化nd III進(jìn)行雙酶切目的片段，載體pBSP化同樣用BamH I和化nd III進(jìn)行雙酶，目的片 段和載體經(jīng)酶切純化后加入T4連接酶25°C放置Ih,連接產(chǎn)物化學(xué)法轉(zhuǎn)入到感受態(tài)化21 (DE3)中，冰上放置30min，37°C水浴5min，冰上5min后加入50化1 LB液體，37°C復(fù)蘇培養(yǎng)化 后涂含硫酸慶大霉素（50mg/L)的LB平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，挑單菌落于LB+硫酸慶大霉素 (50mg/L)搖管，提質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建的重組質(zhì)粒，測(cè)序由深圳華大基因完成。
[0042] 實(shí)施例4: CCC及SCCC重組菌株的構(gòu)建
[0043] CCC纖維素酶基因全長(zhǎng)2100bp。根據(jù)信號(hào)膚序列設(shè)計(jì)引物，將信號(hào)膚序列與 0RF3883所示的基因序列進(jìn)行重組，獲得融合基因片段SCCC，其中，1輪PCR分別擴(kuò)增上下兩 個(gè)片段，引物為SCCC-Fl: GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC，SCCC-Rl: CTGGGCCGCTTACGGCGCTCGC， SCCC-F2:GCGAGCGCCGTAAGCGGCCCAG，SCCC-R2:GACGTCGACTTACTGCGGTTCAACGCCCCATATC，兩 組PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行切膠回收，回收產(chǎn)物測(cè)定濃度，加水將上下游同源臂濃度調(diào)至基本相 同；2輪PCR W1輪PCR產(chǎn)物為引物和模板，將兩段擴(kuò)增產(chǎn)物連接來(lái)，回收PCR產(chǎn)物;3輪PCR W 2 輪PCR為模板，引物為SCCC-Fl，SCCC-R2。
[0044] 對(duì)照組為不加信號(hào)膚的CCC，利用1步PCR(引物CCC-F: GAGGATCCGGTAAGCGGCCCAGG， CCC-R: GACGTCGACTTACTGCGGTTCAACGCCCCATATC)獲得片段 CCC，產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收。
[0045] 與祀T-Duet連接:將所獲回收片段CCC和SCCC按照如圖1所示的構(gòu)建方法，用BamH I和Sal I進(jìn)行雙酶切目的片段，載體祀T-Duetl同樣用BamH I和Sal I進(jìn)行雙酶，目的片段 和載體經(jīng)酶切純化后加入T4連接酶25°C放置化，連接產(chǎn)物化學(xué)法轉(zhuǎn)入到感受態(tài)化2UDE3) 中，冰上放置30min，37°C水浴5min，冰上5min后加入50化1 LB液體，37°C復(fù)蘇培養(yǎng)化后涂含 氨節(jié)青霉素（lOOmg/L)的LB平板，37 °C過(guò)夜培養(yǎng)，挑單菌落于LB+氨節(jié)青霉素（lOOmg/L)搖 管，提質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建的重組質(zhì)粒，測(cè)序由深圳華大基因完成。
[0046] 與pBSP化連接:將所獲回收片段CCC和SCCC按照如圖1所示的構(gòu)建方法，用BamH I 和Sal I進(jìn)行雙酶切目的片段，載體pBSP化同樣用BamH I和Sal I進(jìn)行雙酶，目的片段和載 體經(jīng)酶切純化后加入T4連接酶25°C放置化，連接產(chǎn)物化學(xué)法轉(zhuǎn)入到感受態(tài)化2UDE3)中，冰 上放置30min，37°C水浴5min，冰上5min后加入50化1 LB液體，37°C復(fù)蘇培養(yǎng)化后涂含硫酸 慶大霉素(50mg/L)的LB平板，37 °C過(guò)夜培養(yǎng)，挑單菌落于LB+硫酸慶大霉素(50mg/L)搖管， 提質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建的重組質(zhì)粒，測(cè)序由深圳華大基因完成。
[0047] 實(shí)施例5:透明圈實(shí)驗(yàn)
[004引淀粉酶重組菌株WpET-Duet為載體的點(diǎn)在LB+lg/L淀粉平板，WpBSP化為載體的 點(diǎn)在BSM+lg/L淀粉平板;纖維素酶重組菌株W祀T-Duet為載體的點(diǎn)在LB+lg/LCMC平板，W 地SP化為載體的點(diǎn)在BSM+lg/LCMC平板，37 °C培養(yǎng)兩天。淀粉平板用盧戈式艦液染色，CMC平 板用剛果紅染色，結(jié)果如圖2所示:帶有信號(hào)膚的轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的透明圈明顯高于未帶有信號(hào) 膚的轉(zhuǎn)化子，酶活明顯增高。
[0049] 實(shí)施例6:重組菌株的表達(dá)
[(K)加]2 %接種量接重組菌株于LB搖管，培養(yǎng)8-化，轉(zhuǎn)接LB搖瓶，1 %接種量，37 °C搖床培 養(yǎng)，待長(zhǎng)到0D600nm=0.4-0.6時(shí)，加入1%。的ITPG放入20°C (淀粉酶FSA及SFSA W地SP化為載 體的直接20°C過(guò)夜培養(yǎng)，無(wú)需IPTG誘導(dǎo)過(guò)程;淀粉酶BLA及SBLAW祀T-Duet為載體的37°C誘 導(dǎo)地，淀粉酶BLA及SBLAWpBSP化為載體的直接37 °C過(guò)夜培養(yǎng)，無(wú)需IPTG誘導(dǎo)過(guò)程;纖維素 酶CCC及SCCCWpET-Duet為載體的37°C誘導(dǎo)地，纖維素 WpBSP化為載體的直接37°C過(guò)夜培 養(yǎng)，無(wú)需IPTG誘導(dǎo)過(guò)程)搖床過(guò)夜培養(yǎng)。
[0051] 1)收集菌體
[0化2] 600化mp，4。(：，離屯、IOmin，保留上清，將上清液置于冰上保存，用Buffer PBS重懸 菌體沉淀，GOOOrmp,4°C，離屯、IOmin;重復(fù)兩遍。
[0化3] 2)破壁
[0054] 用Buffer (10 %甘油+ 90 % PBS)將菌體重懸，加入1%。的PMSF后破壁。破壁后 ISOOOrmp,4°C，離屯、20min [005引 3)濃縮
[0056] 將胞外液用濃縮管濃縮，濃縮至90化1左右即可。
[0057] 4)LB培養(yǎng)基：Yeast Powder 5g/L，Tryptone 10g/L，NaCl lOg/L
[0化引 BSM 培養(yǎng)基：K 出 P04 2.4g,化 2冊(cè)04 ? 12 此 0 14.0g，NH4Cl 2.0g，10%MgCl2 ?細(xì) 20 2.0ml,1%化Cl2 100.0山，1%化〔13 100.化1,Solution A 5.Oml,Glycerin 4.Og,Vitamin solution 200.Oul，加水至IL。
[0化9]溶液A:0.5g FeCl2,0.5g aiCl2,0.5g MnCl2,0.1g Na2Mo〇4 ? 2出0,0.05g Na3W〇3 ? 2H2〇，120mM 肥I and 0.05g CuCl2,加水至IL。
[0060]維生素溶液：calcium pantothenate 400.Omg,creatine 200.Omg,nicotinic acid 400.Omg,PABA 200.Omg,Vitamin B6 400.Omg and Vitamin B12 0.5mg，加水至IL。 [0061 ] 實(shí)施例7:重組蛋白SDS-PAGE
[0062] 重組蛋白樣品W相同蛋白量跑11.25%含0.1% (w/v)SDS的聚丙締酷氨凝膠電泳， 120V，SOmin，跑完后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。SDS-Page結(jié)果如圖4所示:帶有信號(hào)膚的轉(zhuǎn)化 子W祀T-Duet為載體的樣品其胞外蛋白的表達(dá)量明顯增高，WpBSP化為載體的轉(zhuǎn)化子BLA 和CCC的胞外樣品表達(dá)量明顯增高，說(shuō)明了信號(hào)膚Kp-SP應(yīng)用的廣泛性，并且Kp-SP的成功應(yīng) 用減少了蛋白的不溶性表達(dá)。
[0063] 實(shí)施例8:酶活的測(cè)定
[0064] FSA及SFSA酶活測(cè)定方法:在50°C下，測(cè)定粗酶液在18化1 Buffer PBS(憐酸 氨二鋼19.1008g/L，憐酸二氨鐘1.8516g/L)和20化1 5g/L淀粉溶液中反應(yīng)15min，加入40化 1 DNS于100°C反應(yīng)10min，在540皿下測(cè)吸光值變化。酶活定義:在50°C、pH 7.3(PBS緩沖液） 條件下，Imin轉(zhuǎn)化可溶性淀粉生成1皿Ol還原糖所需要的酶量，即為1個(gè)酶活力單位，WU表 /J、- O
[00化]BLA及SBLA酶活測(cè)定方法:在7(TC下，測(cè)定粗酶液在18化1 Buffer PBS(憐酸 氨二鋼19.1008g/L，憐酸二氨鐘1.8516g/L)和20化1 5g/L淀粉溶液中反應(yīng)15min，加入 400iil DNS于100°C反應(yīng)lOmin，在540nm下測(cè)吸光值變化。酶活定義:在70°C、pH 7.3(PBS緩 沖液)條件下，lmin轉(zhuǎn)化可溶性淀粉生成Iwiiol還原糖所需要的酶量，即為I個(gè)酶活力單位， Wu表示。
[0066] CCC及SCCC酶活測(cè)定方法:在60°C下，測(cè)定粗酶液在18化1 Buffer PBS(憐酸 氨二鋼19.1008g/L，憐酸二氨鐘1.8516g/L)和200]il 5g/L簇甲基纖維素鋼中反應(yīng)15min，加 入40化1 DNS于100 °C反應(yīng)10min，在540nm下測(cè)吸光值變化。酶活定義：在60 °C、pH 7.3 (PBS 緩沖液)條件下，Imin轉(zhuǎn)化簇甲基纖維素鋼生成I曲iol還原糖所需要的酶量，即為I個(gè)酶活力 單位，WU表示。
[0067] 按照上述方法測(cè)量各轉(zhuǎn)化子蛋白酶活，結(jié)果如圖3所示:帶有信號(hào)膚的轉(zhuǎn)化子其胞 外酶活明顯提高，且酶活總量也有所提高，對(duì)胞內(nèi)外蛋白的表達(dá)均有促進(jìn)作用。信號(hào)膚Kp- SP解決了蛋白的不溶性表達(dá)等問(wèn)題，使蛋白的分離純化更加簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)，對(duì)促進(jìn)一些應(yīng)用酶 類的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。
[0068] 發(fā)明實(shí)施例公開如上，雖然實(shí)施例已有優(yōu)化，但其并非用W限定本發(fā)明，任何熟悉 此技術(shù)的人都可在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)進(jìn)行改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)應(yīng)W 權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種使胞內(nèi)蛋白表達(dá)至胞外的放線菌信號(hào)肽，其特征是:所述信號(hào)肽命名為Kp-SP， 來(lái)源于庫(kù)克氏菌(Kocuria sp.3-3)菌株，其核苷酸序列長(zhǎng)度為90bp，如SEQ ID No.l所示； 其氨基酸序列長(zhǎng)度為29aa，如SEQ ID No.7所示。2. 權(quán)利要求1所述使胞內(nèi)蛋白表達(dá)至胞外的放線菌信號(hào)肽在利用構(gòu)建的重組大腸桿菌 表達(dá)淀粉酶或纖維素酶中的應(yīng)用。3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征是：所述淀粉酶是淀粉酶KC441955.1，命名為FSA， 來(lái)源于Sinomicrobium Pectinilyticus f5DNS001，其核苷酸序列如SEQ ID Νο·2所不，氨基 酸序列如SEQ ID No.8所示；或是淀粉酶AAU39594,命名為BLA，來(lái)源于Bacillus licheniformis DSM13,其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列如SEQ ID No.9所 示;所述纖維素酶0RF3883,命名為CCC，來(lái)源于Clostridium cellulosi CS-4-4,其核苷酸 序列如SEQ ID No.4所示，氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示。4. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征是:所述重組大腸桿菌的構(gòu)建方法是： (1) 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)所提供KC441955.1、AAU39594、0RF3883所述的核苷酸序列設(shè)計(jì)引 物； 其中，淀粉酶KC441955.1與信號(hào)肽Kp-SP重組所用引物為：SFSA-F1: GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC,SFSA-Rl：GCGAGCGCCGATGACAATAATAATTATAC；SFSA-F2： GTATAATTATTATTGTCATCGGCGCTCGC，SFSA-R2: GACGTCGACTTACTCTCCCGAAACCGACCATATG，通過(guò) 三步PCR將信號(hào)肽Kp-SP序列與KC441955.1序列連接，所得重組基因片段命名為SFSA; 淀粉酶AAU39594與信號(hào)肽Kp-SP重組所用引物為：SBLA-F1: GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC，SBLA-Rl:CTTTAAGATTTGCCGCGGCGCTCG，SBLA-F2: GCGAGCGCCGCGGCAAATCTTAAAG，SBLA-R2: CCCAAGCTTGGGCTATCTTTGAACATAAATTG，通過(guò)三步 PCR將信號(hào)肽Kp-SP序列與AAU39594序列連接，所得重組基因片段命名為SBLA; 纖維素酶0RF3883與信號(hào)肽Kp-SP重組所用引物為：SCCC-F1: GAGGATCCGATGAGCAGACGAGC，SCCC-Rl:CTGGGCCGCTTACGGCGCTCGC，SCCC-F2: GCGAGCGCCGTAAGCGGCCCAG，SCCC-R2: GACGTCGACTTACTGCGGTTCAACGCCCCATATC，通過(guò)三步 PCR 將信號(hào)肽Kp-SP序列與0RF3883序列連接，所得重組基因片段命名為SCCC; 其中：所述KC441955.1的核苷酸序列如SEQ ID化.2所示441]39594的核苷酸序列如 SEQ ID No.3所示，0RF3883的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示； 對(duì)照組為一步PCR獲得的不加信號(hào)肽Kp-SP的KC441955.1或AAU39594或0RF3883所示的 基因片段； (2) 將（1)中得到的三組重組基因片段和對(duì)照組基因片段分別與載體pET-Duet或 pBSPPc 連接，構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒 SFSA-pET-Duet、SFSA-pBSPPc 或 SBLA-pET-Duet、SBLA-pBSPPc或SCCC-pET-Duet、SCCC-pBSPPc，將所述重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)中，獲得的重組菌株通過(guò)PCR和瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證確認(rèn);對(duì)照組為FSA-pET-Duet、 FSA-pBSPPc 或 BLA-pET-Duet、BLA-pBSPPc 或 CCC-pET-Duet、CCC-pBSPPc 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受 態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)中，通過(guò)PCR和瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證； (3) 將(2)中得到的以pET-Duet為載體的重組菌株按照體積比2%的接種量分別接于LB 搖管中，培養(yǎng)8-9h，再以體積比1 %的接種量轉(zhuǎn)接于100ml LB搖瓶中，37 °C搖床培養(yǎng)，待 0D6QQnm= 0.4-0.6時(shí)，按體積比加入1%。的ITPG，其中，產(chǎn)淀粉酶FSA及SFSA的重組菌株放入20 °C搖床過(guò)夜培養(yǎng)，產(chǎn)淀粉酶BLA及SBLA的重組菌株于3 7 °C繼續(xù)培養(yǎng)4h，產(chǎn)纖維素酶CCC及 SCCC的重組菌株于37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h，所獲菌液離心保留上清，即得到含有淀粉酶或纖維素 酶的發(fā)酵液； 同樣，將(2)中得到的以pBSPPc為載體的重組菌株按照體積比2%的接種量分別接于LB 搖管中，培養(yǎng)8-9h，再以體積比1 %的接種量轉(zhuǎn)接于100mL LB搖瓶中，其中，產(chǎn)淀粉酶FSA及 SFSA的重組菌株直接20 °C過(guò)夜培養(yǎng)，產(chǎn)淀粉酶BLA及SBLA的重組菌株直接37 °C過(guò)夜培養(yǎng)，產(chǎn) 纖維素酶CCC及SCCC的重組菌株直接37°C過(guò)夜培養(yǎng)，所獲菌液離心保留上清，即得到含有淀 粉酶或纖維素酶的發(fā)酵液。
【文檔編號(hào)】C07K14/195GK105924507SQ201610462367
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月22日
【發(fā)明人】楊春玉, 崔延冰
【申請(qǐng)人】山東大學(xué)