一株紫孢菌新菌株f1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種微生物新菌株及其應(yīng)用，具體的說(shuō)是一株紫孢菌新菌株及其在吸 附重金屬方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水是生命之源，3月22日是聯(lián)合國(guó)確定的"世界水日"。2015年，聯(lián)合國(guó)發(fā)表的《世界 水資源開(kāi)發(fā)報(bào)告》中指出，當(dāng)今世界面臨著水資源危機(jī)的共同挑戰(zhàn)，水一旦受到污染，就不 能用于飲用、洗浴、工業(yè)或農(nóng)業(yè)用途。水質(zhì)不佳會(huì)損害人體健康，導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)的服務(wù)功能 退化。我國(guó)是世界上水資源污染比較嚴(yán)重的國(guó)家，尤其是重金屬的積累，已經(jīng)成為水污染的 重要因素之一。
[0003] 目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)出現(xiàn)了很多種清除水中重金屬的方法，如化學(xué)修復(fù)法，活性炭吸 附法和離子交換法等，這些方法雖然吸附效果很好，但是成本高，容易造成二次污染，不能 徹底解決水資源再生利用問(wèn)題。近年來(lái)，生物吸附技術(shù)越來(lái)越引起各國(guó)研究人員的重視，研 究結(jié)果表明酵母菌、霉菌、細(xì)菌和藻類(lèi)等具有較強(qiáng)的吸附重金屬的能力。
[0004] 霉菌在工業(yè)生產(chǎn)中是非常重要的一類(lèi)微生物，它作為生物吸附劑具有很多優(yōu)勢(shì)： 來(lái)源廣泛，容易培養(yǎng)，價(jià)格低廉;操作簡(jiǎn)單，易于工業(yè)化;細(xì)菌制備吸附劑時(shí)，菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 后必須通過(guò)大量離心收集生物量，操作麻煩。霉菌在擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)，形成均勻的菌絲球且生物 量高，易于收集。
[0005] 目前，對(duì)霉菌作為吸附劑的研究主要集中在青霉菌（Penicillium.sp)，毛霉菌 (Mucor · sp)，根霉菌（Rhizopus · sp)，曲霉菌（Aspergillus · sp)和木霉（Trichoderma· sp) 等，湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心發(fā)明的一種耐鎘青霉菌（專(zhuān)利號(hào)CN104805021A)，陳雯莉 等發(fā)明的一種高吸附鎘的絲狀真菌淡紫擬青霉(專(zhuān)利號(hào)CN103451103A)，馬晨晨等利用橘綠 木霉處理含Cr 6+的水體，證明橘綠木霉對(duì)受污染水體有修復(fù)作用(專(zhuān)利號(hào)CN103740596A)。
[0006] 目前，對(duì)于紫孢菌的研究在我國(guó)僅僅看到有關(guān)于紫孢菌防治線蟲(chóng)和害蟲(chóng)的報(bào)道， 而對(duì)利用紫孢菌作為重金屬吸附劑的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一株紫孢菌新菌株F1，該菌株高度耐受重金屬Cd2+，其菌
[0008] 體可以大量吸附重金屬Cd2+，在處理重金屬污染水體中具有良好的應(yīng)用前景。
[0009] 本發(fā)明菌株是從山西省太原市楊家堡污水處理廠污水過(guò)濾后的淤泥中分離得到 的紫孢菌新菌株，該菌株已于2015年12月17日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生 物中心(CGMCC)保藏，（地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所， 郵編100101)，分類(lèi)命名為紫孢菌，拉丁文學(xué)名為，？11印1^6〇〇;111;[111118。，保藏號(hào)為，06100 Νο·118130
[0010] 本發(fā)明的紫孢菌新菌株是一株屬于子囊菌亞門(mén)，糞殼菌綱，肉座菌目，形蟲(chóng)草科， 紫孢菌屬的真菌，是一株首次發(fā)現(xiàn)的具有高耐受重金屬的霉菌，本發(fā)明豐富了微生物作為 吸附劑的種質(zhì)資源。
[0011] 本發(fā)明的紫孢菌新菌株F1具體是通過(guò)如下方法分離獲得的：
[0012] (1)取太原市楊家堡污水處理廠污水過(guò)濾后的淤泥，裝入自封袋，在實(shí)驗(yàn)室自然晾 干。
[0013] ⑵耐重金屬Cd2+的紫孢菌新菌株F1誘捕分離:在100mL含有濃度為2mmol/L Cd2+ 的PB液體培養(yǎng)基（土豆200g切塊加水煮沸20min，過(guò)濾取濾液加入葡萄糖20g，定容至 1000mL，121°C高壓滅菌20min)上，加入lg瞭干后的齡泥置于搖床中，在30°C，180r/min的條 件下振蕩培養(yǎng)3天，得到懸浮液。
[0014] (3)取步驟(2)中的懸浮液做濃度梯度稀釋至1〇Λ吸取10-5、10- 6、10-7的菌懸浮液 各150μ1涂布于含Cd2+的TOA(土豆200g切塊加水煮沸20min，過(guò)濾取濾液加入葡萄糖20g，瓊 脂粉15g，定容至1000mL，121°C高壓滅菌20min)平板中，倒置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，平板上 長(zhǎng)出明顯的白色菌落。
[0015] 紫孢菌新菌株F1的篩選：
[0016] (1)待初篩平板中菌落長(zhǎng)出后，挑取白色菌落的菌株轉(zhuǎn)接入PB液體培養(yǎng)基（加入 2mmol/L Cd2+)，在30°C，180r/min的搖床中培養(yǎng)3-5天。
[0017] (2)取上述培養(yǎng)的菌懸浮液涂布在PDA平板上，30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)3-5天至長(zhǎng)出單菌 落，然后將單菌落保存在PDA試管斜面上得到純培養(yǎng)的菌株，命名為F1。
[0018] 對(duì)本發(fā)明的紫孢菌新菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定：
[0019] (1 )DNA分子的提取:采用Solarbio試劑盒提取
[0020] (2汗0財(cái)廣增絲狀真菌185扣祖區(qū)：引物序列為：幾51 :5/101^厶66了6厶厶0^6066-3/ 和ITS4:5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，共35個(gè)循環(huán)，所得的擴(kuò)增產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠 板，在120V，60mA條件下進(jìn)行電泳檢測(cè)。
[0021] PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1，反應(yīng)程序見(jiàn)表2
[0022] 表1 PCR反應(yīng)體系
[0023]
[0024] 表2 PCR反應(yīng)程序
[0025]
[0026] (3)序列測(cè)定與分析:經(jīng)由PCR擴(kuò)增得到的ISSrRNA，由基因公司進(jìn)行純化后，測(cè)序。 將所測(cè)得序列登陸WWW. ncbi . nlm. nlh. gov進(jìn)行同源性分析與比較，將所測(cè)序列提交至gen bank，獲取登陸號(hào)（KT809457)。經(jīng)過(guò)比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)F1與紫孢菌（Purpureocillium KJ935014.1)之間的的相似性為100%，可以初步確定F1為紫孢菌(Purpureocillium) 〇
[0027] 本發(fā)明的紫孢菌菌株F1對(duì)Cd2+耐受濃度的檢測(cè)
[0028]將純化保存的紫孢菌菌株F1接入PB培養(yǎng)液中培養(yǎng)獲得菌懸液，分別取菌懸液lmL 依次轉(zhuǎn)移到含 W2+濃度 5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L...... 60mmol/L的三角瓶中，放于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，150r/min培養(yǎng)5天，觀察菌株的生長(zhǎng)情況。若 目的菌株能在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，說(shuō)明其能耐受相應(yīng)的Cd2+濃度，不能生長(zhǎng)則說(shuō)明其不能耐受相 應(yīng)的Cd 2+濃度。結(jié)果為紫孢菌菌株F1可以耐受大于60mmol/L的重金屬鎘離子。
[0029] 紫孢菌菌株F1對(duì)其他重金屬離子的耐受檢測(cè)
[0030] 將紫孢菌菌株F1接種在含有濃度為2mmol/L的Cu2+，Pb2+，Mn 2+，Zn2+，F(xiàn)e2+的1?培養(yǎng) 液中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察菌株的生長(zhǎng)狀況。若目的菌株能在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，說(shuō)明其能耐受相應(yīng)的 重金屬離子，不能生長(zhǎng)則說(shuō)明其不能耐受相應(yīng)的重金屬離子。結(jié)果表明對(duì)Cu 2+，Pb2+，Mn2+， Zn2+，F(xiàn)e2+這些