專(zhuān)利名稱(chēng)：產(chǎn)河豚毒素的氣單胞菌從暗紋東方鲀組織分離、發(fā)酵培養(yǎng)和所產(chǎn)河豚毒素的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從暗紋東方飩Takifugu fasciatus組織分離產(chǎn)河豚毒素的氣單 胞菌Aeromonas molluscorum，氣單胞菌的發(fā)酵培養(yǎng)及所產(chǎn)河豚毒素的檢測(cè)方法，本發(fā)明涉 及藥用微生物開(kāi)發(fā)和利用的領(lǐng)域，更具體地涉及從細(xì)菌中提取河豚毒素，可用作河豚毒素 的規(guī)?；a(chǎn)，可為科學(xué)研究、醫(yī)藥行業(yè)等相關(guān)領(lǐng)域提供原料。
背景技術(shù)：
河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)，是一種神經(jīng)毒素，特異性阻斷神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞膜上 的電壓門(mén)控鈉離子通道，可潛在地作為鎮(zhèn)痛、麻醉、戒毒、美容等的藥品，臨床實(shí)踐證明了 TTX對(duì)頭痛、關(guān)節(jié)炎、破傷風(fēng)、霍亂、傷寒、哮喘、百日咳、晚期癌癥等多種疾病都有一定療效 目前，河豚毒素的應(yīng)用還主要局限在科學(xué)研究領(lǐng)域。雖然河豚毒素的人工合成成功了，但合成成本非常昂貴，目前，人工提取的河豚毒 素主要來(lái)自于于東方飩屬的河飩。一方面，目前國(guó)內(nèi)外TTX的提取的原材料全部來(lái)源于野 生河豚的內(nèi)臟組織，人工養(yǎng)殖的河豚內(nèi)臟組織幾乎不含TTX或含量極低，僅為野生河豚魚(yú) TTX含量的1%，由于野生河飩魚(yú)數(shù)量有限、且原料昂貴、提取成本也相對(duì)較高。因?yàn)榱硪环?面，從河飩中提取河豚毒素，會(huì)破壞河飩魚(yú)的天然資源。因此，有必要從其它生物資源中提 取河豚毒素。已有很多研究表明河飩體內(nèi)的河豚毒素，是來(lái)自其體內(nèi)的某些細(xì)菌所分泌的，但 細(xì)菌分泌的河豚毒素和來(lái)自河豚體內(nèi)的河豚毒素是否完全一樣，還沒(méi)有定論。如果兩者是 同一物質(zhì)，那么通過(guò)分離篩選產(chǎn)河豚毒素的細(xì)菌，再經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵技術(shù)，就可以大規(guī)模的 TTX,降低生產(chǎn)成本，也會(huì)相應(yīng)地保護(hù)野生河飩魚(yú)的資源。雖然，目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)有從紅鰭東方飩Takifugu obscurus中分離能產(chǎn)河豚毒素細(xì) 菌的報(bào)道，但這些細(xì)菌所分泌的產(chǎn)物是否為真正的河豚毒素，還需要更嚴(yán)格的檢測(cè)鑒定。 目前鑒定從河飩中提取的河豚毒素的常見(jiàn)方法有小鼠法、高效液相色譜法、質(zhì)譜法、酶聯(lián)免 疫法等，其中，最可靠的方法是質(zhì)譜法和酶聯(lián)免疫法。質(zhì)譜法可以鑒定分子量，酶聯(lián)免疫法 可以幫助鑒定有相似或相同的分子結(jié)構(gòu)。在目前還不清楚細(xì)菌來(lái)源的河豚毒素晶體三維結(jié) 構(gòu)的情況下，應(yīng)該需要同時(shí)利用高效液相色譜-質(zhì)譜和酶聯(lián)免疫法來(lái)鑒定細(xì)菌來(lái)源的河豚 毒素，否則，很難確定細(xì)菌來(lái)源的河豚毒素和河豚來(lái)源的河豚毒素是同一物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從野生暗紋東方飩(Takifugu obscurus)卵巢中分離 的能產(chǎn)河豚毒素的氣單胞菌Aeromonas molluscorum的方法，包括分離氣單胞菌Aeromonas molluscorum所用的方法、氣單胞菌Aeromonasmolluscorum發(fā)酵培養(yǎng)方法、氣單胞菌 Aeromonas molluscorum所產(chǎn)河豚毒素的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)方法、氣單胞菌Aeromonas molluscorum所產(chǎn)河豚毒素的LC-MS檢測(cè)方法。
河飩為暖溫帶及熱帶近海底層魚(yú)類(lèi)，棲息于海洋的中、下層，有少數(shù)種類(lèi)進(jìn)入淡 水江河中，當(dāng)遇到外敵，腹腔氣囊則迅速膨脹，使整個(gè)身體呈球狀浮上水面，同時(shí)皮膚上的 小刺豎起，借以自衛(wèi)。每年3月由外海游至江河口的咸淡水區(qū)域產(chǎn)卵。唯有暗紋東方飩 (Takifugu obscurus，英文名0bscure puffer) 一種成群溯河進(jìn)入淡水，5-6月在江河中有 產(chǎn)卵；懷卵量一般在4-5萬(wàn)粒間。秋季水溫下降，開(kāi)始降河，和其它種類(lèi)一樣游向深海區(qū)，12 月初返回深海區(qū)越冬。當(dāng)年出生的幼魚(yú)在江河或通江的湖泊中生活，到翌年春才回到海里， 在海里長(zhǎng)大至性成熟后再?gòu)?fù)進(jìn)入江河產(chǎn)卵。進(jìn)入長(zhǎng)江的河飩于4-6月，在中游江段或洞庭 湖、鄱陽(yáng)湖中產(chǎn)卵。河飩的食性雜，以魚(yú)、蝦、蟹、貝殼類(lèi)為食，亦食昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)、枝角類(lèi)、橈足類(lèi) 以及高等植物的葉片和絲狀藻類(lèi)。在生殖洄游期間一般很少攝食。暗紋東方飩Takifugu obscurus中分離出能產(chǎn)河豚毒素的細(xì)菌 Aeromonasmolluscorum的方法，該細(xì)菌所產(chǎn)的河豚毒素與河豚來(lái)源的河豚毒素一樣或非常 相似，可用作河豚毒素的商業(yè)開(kāi)發(fā)和相關(guān)的科學(xué)研究。產(chǎn)河豚毒素的氣單胞菌(Aeromonas molluscorum)，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心。保藏地址中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué) 院微生物研究所郵編100101。保藏日期2010年4月23日，保藏編號(hào)CGMCC N0. 3760。
本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問(wèn)題，可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)作為本發(fā)明的第一方面，一種產(chǎn)河豚毒素的氣單胞菌Aeromonasmolluscorum從 暗紋東方飩Takifugu fasciatus組織分離方法，其特征在于，包括如下步驟(1)取具河飩毒素(TTX)的暗紋東方飩組織。(2)勻漿處理，并以生理鹽水1 10的比例制成稀釋液，取Iml稀釋液涂布于TCBS
固體培養(yǎng)基上。(3) 23°C培養(yǎng)48h，以挑取平板上的特征菌落，劃線于另一 TCBS固體培養(yǎng)基上。(4)23°C培養(yǎng)24h，再將分離到的單菌落再次劃線分離培養(yǎng)。(5)重復(fù)劃線分離培養(yǎng)，直到分離到單菌落。其中，步驟⑴所述組織為卵巢組織。其中，所述TCBS固體培養(yǎng)基的組成為0. 5%酵母抽提物，0.5%酪蛋白胨，0.5% 牛肉蛋白胨，1.0%檸檬酸鈉，1.0%硫代硫酸鈉，0.5%牛膽汁，0.3%膽酸鈉，2.0%蔗糖， 1. 0%氯化鈉，0. 檸檬酸鐵，0. 004%百里酚藍(lán)，0. 004%溴酚藍(lán)，1. 4%瓊脂，余量為蒸餾 水，pH 8. 6。利用16S rDNA全長(zhǎng)序列鑒定細(xì)菌的方法(1)將分離得到的菌株基因組DNA的提?。?2) 16S rDNA 全長(zhǎng)序列的 PCR 擴(kuò)增，上游引物5，-AGA GTT TGA TCC TGGCTC AG-3，，下游引物:5，-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3，；(3)25μ 1 PCR 反應(yīng)體系中，包括2. 5μ 1 IOxPCR 反應(yīng)緩沖液，1 μ 1 2. 5mM dNTP， IU Taq酶，各Ιμ 6. 25mM的上下游引物，細(xì)菌基因組DNA50ng ；(4)PCR反應(yīng)程序95°C預(yù)變性5min后，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)95°C lmin,50°C lmin，72°C 延伸2min。最后72°C延伸IOmin0(5)將16S rDNA全長(zhǎng)序列的擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收；(6)回收的產(chǎn)物克隆在pMD18-T載體中；
(7)轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10 ；(8)挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序。(9)測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST N在GenBank比對(duì)，獲得同源性較高的序列；(10)利用MEGA 4. 0軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，確定該分離的菌株為氣單胞菌Aeromonas molIuscorum0作為本發(fā)明的第二方面，所述氣單胞菌Aeromonas molluscorum的發(fā)酵培養(yǎng)方法， 其特征在于，包括如下步驟(1)將細(xì)菌接種在ORI液體培養(yǎng)基中；(2) 23°C 下，225 轉(zhuǎn) / 分鐘，培養(yǎng) 5-6 天。其中，所述ORI液體培養(yǎng)基的組成為0. 2%動(dòng)物蛋白胨，0. 2%植物蛋白胨，0. 1% 酵母抽提物，0.088%檸檬酸鐵，3% NaCl，余量為蒸餾水，pH 8.0。作為本發(fā)明的第三方面，所述的氣單胞菌Aeromonas molluscorum所產(chǎn)河豚毒素 的競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法(即競(jìng)爭(zhēng)性ELISA)檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步 驟(1)在0-250叫/1111范圍內(nèi)分別把0、50、100、150、200、250叫/1111的河豚源的河豚毒
素標(biāo)準(zhǔn)樣品先固定在微孔板上；(2)在微孔板中加入河豚毒素單克隆抗體MAb_TTX(購(gòu)自商業(yè)公司(北京中衛(wèi)食品 衛(wèi)生科技公司)，分光光度計(jì)檢測(cè)吸光值，以Ao表示；(3)建立河豚毒素濃度在0-250ng/ml范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線；(4)發(fā)酵培養(yǎng)的河豚毒素和河豚毒素單克隆抗體MAb-TTX —起加入微孔板中，分 光光度計(jì)檢測(cè)吸光值，以Ai表示；(5)Ai/Ao比例，得出氣單胞菌Aeromonas molluscorum的細(xì)菌源河豚毒素的濃度。作為本發(fā)明的第四方面，所述的氣單胞菌Aeromonas molluscorum所產(chǎn)河豚毒素 的液相色譜質(zhì)譜(即LC-MS)檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟(1)氣單胞菌Aeromonas molluscorum細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)后，4°C下4000Xg離心3Omin 收集細(xì)胞；(2)用0. 乙酸溶解細(xì)胞，超聲波破碎細(xì)胞；(3) 100°C煮20-25min，冷卻后離心去除細(xì)胞碎片；(4)上清用直徑0. 25 μ m濾紙過(guò)濾；(5)過(guò)濾液過(guò)活性碳柱，用洗脫液洗脫活性碳，洗脫液的配方為甲醇的乙 酸溶液=20 80;(6)洗脫液45°C減壓至0. 001-0. 003MPa濃縮，冷凍干燥；(7)溶于2ml無(wú)菌去離子水中；(8)過(guò) IX80cm 的 Bio-Gel P2 柱子(Bio-Rad Lab, Richmond, VA, USA)；(9)用0.03M乙酸洗脫，從洗脫液流出開(kāi)始收集，收集2ml ；(10)洗脫液再用 C18 Sep-Pak cartridges 過(guò)柱(Waters，Milford, ΜΑ)；(11)用IOmlO. 3%的乙酸洗脫，從第二個(gè)柱體積洗脫液流出開(kāi)始收集，收集兩個(gè) 柱體積的洗脫液；
(12)將洗脫液過(guò)濾；(13)過(guò)濾液冷凍干燥后，溶解在Iml無(wú)菌去離子水中；(14)利用系統(tǒng)來(lái)分析河豚
毒素；(15)對(duì)河豚毒素質(zhì)譜分析。其中，步驟(10)所述C18 Sep-Pak cartridges在使用前，需要用IOml甲醇和IOml
水清洗。其中，步驟(12)洗脫液用 3000MW cut-off Ultrafree microcentrifugefilter (Micron YM-3, Waters)過(guò)濾。其中，步驟(14)利用ACQUITY Ultra Performance LC system(UPLC) (Waters, Milford,MA)系統(tǒng)來(lái)分析河豚毒素。其中，步驟(15)河豚毒素質(zhì)譜分析利用Quadrupole-Time of Flight MassSpectrometry (Q-T0F MS) (Waters, Milford, MA)。本發(fā)明的有益效果1)本發(fā)明是通過(guò)選擇合適的培養(yǎng)基TCBS分離到能產(chǎn)河豚毒素的細(xì)菌。2)本發(fā)明所提供的細(xì)菌氣單胞菌Aeromonas molluscorum能分泌與河豚源河豚 毒素一樣的物質(zhì)。


以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。圖1為氣單胞菌Aeromonas molluscorum細(xì)菌全長(zhǎng)16S rDNA的細(xì)菌鑒定。圖2為氣單胞菌Aeromonas molluscorum的細(xì)菌源河豚毒素鑒定的競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免 疫吸附試驗(yàn)的定量結(jié)果。圖3為離子色譜圖表明來(lái)自氣單胞菌Aeromonas molluscorum細(xì)菌源樣品(A)和 河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)品(B)都在m/z 320. 11出現(xiàn)。圖4為氣單胞菌Aeromonas molluscorum細(xì)菌源樣品(A)和河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)品(B) 的質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具 體圖示，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例1從野生暗紋東方飩Takifugu fasciatus的卵巢中分離氣單胞菌 Aeromonasmolluscorum的方法,可按照以下步驟操作(1)選取野生暗紋東方飩Takifugu fasciatus活體，發(fā)明人采集自中國(guó)，江蘇省。(2)用95%酒精擦洗消毒魚(yú)體體表，用無(wú)菌解剖刀、剪刀和鑷子解剖魚(yú)體，取出卵桌。(3)用無(wú)菌的勻漿器勻漿卵巢，并以0.9%的生理鹽水以1 10的比例制成稀釋 液，(4)取Iml稀釋液涂布于TCBS固體培養(yǎng)基上，23°C培養(yǎng)48h。
(5)挑取培養(yǎng)基上的特征菌落，劃線于另一 TCBS固體培養(yǎng)基上，(6)23°C培養(yǎng)24h，再將分離到的單菌落重新劃線分離培養(yǎng)，(7)重復(fù)劃線分離培養(yǎng)，直到分離到足夠純的單菌落。(8)分離到的各個(gè)單菌落用作細(xì)菌鑒定分離氣單胞菌Aeromonas molIuscorum的TCBS固體培養(yǎng)基組成如下0.5%酵母抽提物，0.5%酪蛋白胨，0. 5%牛肉蛋白胨，1.0%檸檬酸鈉，1.0%硫代 硫酸鈉，0.5%牛膽汁，0.3%膽酸鈉，2.0%蔗糖，1.0%氯化鈉，0. 檸檬酸鐵，0. 004%百 里酚藍(lán)，0. 004%溴酚藍(lán)，1. 4%瓊脂，余量為蒸餾水，pH8. 6。實(shí)施例2利用16S rDNA全長(zhǎng)序列鑒定Aeromonas molluscorum細(xì)菌的方法，可按照以下步 驟操作(1)將分離到的細(xì)菌菌株接種在液體培養(yǎng)基ORI中。(2) 23 °C 下，225 轉(zhuǎn) / 分鐘，培養(yǎng) 5-6 天。(3)提取菌株基因組DNA。(4) 16S rDNA全長(zhǎng)序列的PCR擴(kuò)增，所用的上游引物5，_AGA GTT TGA TCCTGG CTC AG-3，，下游引物:5，-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T_3，。(3) 25 μ 1 PCR反應(yīng)體系中，包括2. 5 μ 1 IOxPCR 反應(yīng)緩沖液，1 μ 1 2. 5mM dNTP,IU Taq 酶，各1 μ 1 6. 25mM的上下游引物，細(xì)菌基因組DNA50ng。(4) PCR 反應(yīng)程序95°C預(yù)變性 5min 后。進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)95°C Imin，50 °C Imin，72°C 延伸 2min。最后72°C延伸 lOmin。(5)將16S rDNA全長(zhǎng)序列的擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收。(6)回收的產(chǎn)物克隆在pMD18-T載體中。(7)轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10。(8)挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序。(9)測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST N在GenBank比對(duì)，獲得同源性較高的序列。(10)利用 MEGA 4. 0 軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，確定 Aeromonas molluscorum。(11)結(jié)果如圖1所示，該分離的菌株為氣單胞菌Aeromonas molluscorum。氣單胞菌Aeromonas molIuscorumORI液體培養(yǎng)基的組成為0. 2 %動(dòng)物蛋白胨，0. 2 %植物蛋白胨，0. 1 %酵母抽提物，0. 088 %檸檬酸鐵，3 % NaCl，余量為蒸餾水，pH 8.0。實(shí)施例3氣單胞菌Aeromonas molluscorum的細(xì)菌源河豚毒素鑒定的競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附 試驗(yàn)方法，包括以下步驟進(jìn)行
(1)在0-250叫/1111范圍內(nèi)分別把0、50、100、150、200、250叫/1111的河豚源的河豚毒
素標(biāo)準(zhǔn)樣品先固定在微孔板上；(2)在微孔板中加入購(gòu)自商業(yè)公司(北京中衛(wèi)食品衛(wèi)生科技公司)的河豚毒素單 克隆抗體MAb-TTX，分光光度計(jì)檢測(cè)吸光值，以Ao表示；(3)建立河豚毒素濃度在0-250ng/ml范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線。(4)發(fā)酵培養(yǎng)河豚毒素和河豚毒素單克隆抗體MAb-TTX —起加入微孔板中，分光 光度計(jì)檢測(cè)吸光值，以Ai表示；(5)Ai/Ao比例，可以得知?dú)鈫伟鶤eromonas molluscorum細(xì)菌源河豚毒素的濃度。(6)結(jié)果如圖2所示的河豚毒素競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的定量結(jié)果。實(shí)施例4氣單胞菌Aeromonas molluscorum細(xì)菌源河豚毒素鑒定的液相色譜質(zhì)譜檢測(cè)方 法，包括如下步驟(I)Aeromonas molluscorum 細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)后，4°C下 4000Xg 離心 30min 收集細(xì) 胞；(2)用0. 乙酸溶解細(xì)胞，超聲波破碎細(xì)胞；(3) 100°C煮約20min，冷卻后離心去除細(xì)胞碎片；(4)上清用直徑約0. 25 μ m濾紙過(guò)濾；(5)過(guò)濾液過(guò)活性碳柱，用洗脫液洗脫活性碳，洗脫液的配方為甲醇的乙 酸溶液=20 80;(6)洗脫液45°C減壓至0. 001-0. 003MPa濃縮，冷凍干燥；(7)溶于2ml無(wú)菌去離子水中；(8)過(guò) IX80cm 的 Bio-Gel P2 柱子(Bio-Rad Lab, Richmond, VA, USA)；(9)用0.03M乙酸洗脫，從洗脫液流出開(kāi)始收集，收集2ml ；(10)洗脫液再用 C18 Sep-Pak cartridges 過(guò)柱(Waters，Milford, MA), C18 Sep-Pak cartridges在使用前，需要用IOml甲醇和IOml水清洗；(11)用IOmlO. 3%的乙酸洗脫，從第二個(gè)柱體積洗脫液流出開(kāi)始收集，收集兩個(gè) 柱體積的洗脫液；(12)洗脫液用 3000MW cut-off Ultrafree microcentrifuge filter (Micron YM-3, Waters)過(guò)濾；(13)過(guò)濾液冷凍干燥后，溶解在Iml無(wú)菌去離子水中；(14)利用 ACQUITY Ultra Performance LC system(UPLC) (Waters, Milford, MA) 系統(tǒng)來(lái)分析河豚毒素；(15) 可月豕普 禾lJffl Quadrupole-Time of Flight MassSpectrometry (Q-T0F MS) (Waters, Milford, MA)；(16)結(jié)果如圖4所示的質(zhì)譜圖，(A)為來(lái)自Aeromonas molluscorum細(xì)菌源樣品； (B)為河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)品。在本發(fā)明中，采用從暗紋東方飩卵巢中分離細(xì)菌，采用TCBS培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，首 次從河豚魚(yú)體中分離到能產(chǎn)河豚毒素的氣單胞菌Aeromonasmolluscorum，所分離的細(xì)菌采用了 16S rDNA法進(jìn)行了鑒定。分離到的氣單胞菌所產(chǎn)的河豚毒素首次采用競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)方法 (競(jìng)爭(zhēng)性ELISA)和液相色譜質(zhì)譜檢測(cè)方法(LC-MS)，同時(shí)檢測(cè)的方法，競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附 試驗(yàn)適用于河豚毒素的檢測(cè)，靈敏度高。本發(fā)明的所要檢測(cè)的河豚毒素為大分子、熱不穩(wěn)定 化合物，所以選擇液質(zhì)聯(lián)用儀。明確所產(chǎn)河豚毒素與從河豚體內(nèi)提取的河豚毒素為同一種 物質(zhì)。本發(fā)明所分離的氣單胞菌Aeromonas molluscorum，經(jīng)培養(yǎng)后可從細(xì)菌中大規(guī)模 分離河豚毒素。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù) 人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變 化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)及其 等同物界定。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)河豚毒素的氣單胞菌Aeromonas moIluscorum從暗紋東方飩Takifugu fasciatus組織分離方法，其特征在于，包括如下步驟(1)取具河飩毒素(TTX)的暗紋東方飩卵巢組織；(2)勻漿處理，并以生理鹽水1 10的比例制成稀釋液，取Iml稀釋液涂布于TCBS固體培養(yǎng)基上；(3)23°C培養(yǎng)48h，以挑取平板上的特征菌落，劃線于另一TCBS固體培養(yǎng)基上；(4)23°C培養(yǎng)24h，再將分離到的單菌落再次劃線分離培養(yǎng)，(5)重復(fù)劃線分離培養(yǎng)，直到分離到單菌落。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)河豚毒素的氣單胞菌從暗紋東方飩組織分離方法，其特征 在于，其中，所述組織為卵巢組織。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)河豚毒素的氣單胞菌從暗紋東方飩組織分離方法，其特 征在于，所述的TCBS固體培養(yǎng)基的組成為0. 5%酵母抽提物，0. 5%酪蛋白胨，0. 5%牛肉 蛋白胨，1. 0 %檸檬酸鈉，1. 0%硫代硫酸鈉，0. 5 %牛膽汁，0. 3 %膽酸鈉，2. 0 %蔗糖，1. 0 % 氯化鈉，0. 檸檬酸鐵，0. 004%百里酚藍(lán)，0. 004%溴酚藍(lán)，1. 4%瓊脂，余量為蒸餾水，pH 8. 6。
4.一種如權(quán)利要求1所述氣單胞菌Aeromonas molluscorum的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征 在于，包括如下步驟(1)將細(xì)菌接種在ORI液體培養(yǎng)基中；(2)23°C下，225轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)5-6天。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的氣單胞菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于，其特征在于，所 述ORI液體培養(yǎng)基的組成為0. 2%動(dòng)物蛋白胨，0.2%植物蛋白胨，0. 酵母抽提物， 0. 088%檸檬酸鐵，3% NaCl，余量為蒸餾水，pH 8. 0。
6.一種如權(quán)利要求4所述的氣單胞菌Aeromonas molluscorum所產(chǎn)河豚毒素的競(jìng)爭(zhēng)性 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟(1)在0-250ng/ml范圍內(nèi)分別把0、50、100、150、200、250ng/ml的河豚源的河豚毒素標(biāo) 準(zhǔn)樣品先固定在微孔板上；(2)在微孔板中加入河豚毒素單克隆抗體MAb-TTX，分光光度計(jì)檢測(cè)吸光值，以Ao表示；(3)建立河豚毒素濃度在0-250ng/ml范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線；(4)發(fā)酵培養(yǎng)的河豚毒素和河豚毒素單克隆抗體MAb-TTX—起加入微孔板中，分光光 度計(jì)檢測(cè)吸光值，以Ai表示；(5)Ai/Ao比例，得出氣單胞菌Aeromonasmolluscorum的細(xì)菌源河豚毒素的濃度。
7.一種如權(quán)利要求4所述的氣單胞菌Aeromonas molluscorum所產(chǎn)河豚毒素的液相色 譜質(zhì)譜檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟(1)氣單胞菌Aeromonas molluscorum細(xì)菌 發(fā)酵培養(yǎng)后，4°C下4000 Xg離心30min收集細(xì)胞；(2)用0.乙酸溶解細(xì)胞，超聲波破碎細(xì)胞；(3)100°C煮20-25min，冷卻后離心去除細(xì)胞碎片；(4)上清用直徑0.25 μ m濾紙過(guò)濾；(5)過(guò)濾液過(guò)活性碳柱，用洗脫液洗脫活性碳，洗脫液的配方為甲醇的乙酸溶液=20 80 ；(6)洗脫液45°C減壓至0. 001-0. 003M Pa濃縮，冷凍干燥；(7)溶于2ml無(wú)菌去離子水中；(8)過(guò)lX80cm 的 Bio-Gel P2 柱子(Bio-Rad Lab, Richmond, VA, USA)；(9)用0.03M乙酸洗脫，從洗脫液流出開(kāi)始收集，收集2ml ；(10)洗脫液再用C18 Sep-Pak cartridges 過(guò)柱(Waters，Milford，MA)；(11)用IOmlO.3%的乙酸洗脫，從第二個(gè)柱體積洗脫液流出開(kāi)始收集，收集兩個(gè)柱體 積的洗脫液；(12)將洗脫液過(guò)濾；(13)過(guò)濾液冷凍干燥后，溶解在Iml無(wú)菌去離子水中；(14)利用系統(tǒng)來(lái)分析河豚毒素；(15)對(duì)河豚毒素質(zhì)譜分析。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(10)所述ClSSep-Pak cartridges在使用前，需要用IOml甲醇和IOml水清洗。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(12)洗脫液用3000MWcut-off Ultrafree microcentrifuge filter 過(guò)濾。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(14)利用ACQUITYUltra Performance LC system UPLC系統(tǒng)來(lái)分析河豚毒素。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(15)河豚毒素質(zhì)譜分析利用 Quadrupole-Time of Flight Mass Spectrometry。
全文摘要
一種產(chǎn)河豚毒素的氣單胞菌Aeromonas molluscorum從暗紋東方鲀Takifugu fasciatus組織分離、發(fā)酵培養(yǎng)和所產(chǎn)河豚毒素的檢測(cè)方法，包括細(xì)菌分離、細(xì)菌鑒定、細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)、氣單胞菌所產(chǎn)河豚毒素的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)和LC-MS檢測(cè)等方法。在本發(fā)明中，采用從暗紋東方鲀卵巢中分離細(xì)菌，采用TCBS培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，首次從河豚魚(yú)體中分離到能產(chǎn)河豚毒素的氣單胞菌，所分離的細(xì)菌采用了16SrDNA法進(jìn)行了鑒定，分離到的氣單胞菌所產(chǎn)的河豚毒素首次采用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA和LC-MS同時(shí)檢測(cè)的方法，明確所產(chǎn)河豚毒素與從河豚體內(nèi)提取的河豚毒素為同一種物質(zhì)。本發(fā)明所分離的氣單胞菌，經(jīng)培養(yǎng)后可從細(xì)菌中大規(guī)模分離河豚毒素。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101993834SQ20101017936
公開(kāi)日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2010年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月20日
發(fā)明者楊桂梅, 鮑寶龍 申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)