專利名稱：用于測定靶物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于測定分子的方法。更具體地，本發(fā)明涉及一種借助于適體來 測定分子的方法。
背景技術(shù)：
生物傳感器由能夠識別分子的材料和檢測由該材料與靶化學(xué)物質(zhì)之間的相互作 用引起的物理和/或化學(xué)信號的轉(zhuǎn)換器構(gòu)成。能夠識別分子的傳統(tǒng)材料為諸如酶、抗體和 受體的蛋白質(zhì)。文獻1 (BUNSEKI KAGAKU Vol. 51，No. 6，(2002)389-396)披露了一種借助于表面細 胞質(zhì)基因共振(SPR)傳感器來高速篩選內(nèi)分泌擾亂化學(xué)藥品的方法。這種方法包括將雌激 素響應(yīng)基因的啟動子區(qū)的激素響應(yīng)序列DNA(ERE)固定在Sra傳感器芯片上，并向其中加入 純化的雌激素受體α (ER)，從而在沒有修飾的情況下實時測量ER與ERE的相互作用。不幸的是，因為蛋白質(zhì)由于其化學(xué)和熱不穩(wěn)定性而在壽命上受到限制，并且它們 經(jīng)受了非特性吸附，所以它們不適合于長期使用。引人注意的是蛋白質(zhì)的代替物為適體，其為核酸序列，該核酸序列對于從低分子 量化合物至蛋白質(zhì)范圍的抗原引起像抗體一樣的特異性結(jié)合。由于不是蛋白質(zhì)，所以適體 在穩(wěn)定性和壽命方面具有優(yōu)勢。此外，由于其在比較溫和的條件下用于再生的能力、其通過 化學(xué)合成用于經(jīng)濟上批量生產(chǎn)的潛力、以及其諸如與互補鏈可逆的結(jié)合和解離的核酸的性 能特性，所以期望將其用作生物傳感器。文獻2 (J.Am. Chem. Soc. 128，(2006)3138-3139)披露 了一種電化學(xué)方法，用于觀 察由于當利用亞甲藍修飾適體的末端時作為靶物質(zhì)的可卡因的存在而在適體的結(jié)構(gòu)中發(fā) 生的變化。

發(fā)明內(nèi)容
不幸地，文獻2 (J. Am. Chem. Soc. 128，(2006) 3138-3139)中披露的方法具有不能 夠區(qū)分由于適體與靶物質(zhì)的結(jié)合而引起其結(jié)構(gòu)變化的適體與由于在其分子中的雙鏈的形 成而引起的結(jié)構(gòu)變化(下文中，稱作自退火)的適體的缺點，這導(dǎo)致了與已經(jīng)進行了自退火 的適體的量成比例的更高的噪聲水平以及因此導(dǎo)致更高的檢測極限。鑒于上述想法完成了本發(fā)明，以提供一種借助于適體來對靶物質(zhì)(target substance)進行高度敏感測定的方法。根據(jù)本發(fā)明，上述技術(shù)問題是通過用于測定靶物質(zhì)的方法來解決的，所述方法包 括使能夠與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的適體、與靶物質(zhì)和具有與適體的至少一部分互補的堿基 序列的核酸鏈競爭性結(jié)合；檢測由適體與核酸鏈的結(jié)合所引起的物理變化和化學(xué)變化中的 至少任一個；并且基于檢測結(jié)果來測定靶物質(zhì)。另外，本發(fā)明所涉及的靶物質(zhì)應(yīng)該在廣義上理解成不僅包括分子，而且還包括離 子。而且，“適體”表示DNA分子或與特定分子特異性結(jié)合的肽。
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根據(jù)本發(fā)明，適體應(yīng)該優(yōu)選為被固定在傳感器的檢測表面上的適體。在這種情況下，傳感器應(yīng)該優(yōu)選為基于表面細胞質(zhì)基因共振的原理進行檢測并能 夠檢測由適體與核酸鏈的結(jié)合引起的介電常數(shù)的變化的傳感器。此外，傳感器應(yīng)該優(yōu)選為 基于石英晶體微量天平的原理進行檢測并能夠檢測由適體與核酸鏈的結(jié)合引起的質(zhì)量變 化的傳感器。根據(jù)本發(fā)明的方法，適體應(yīng)該優(yōu)選為具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem loop structure)的適 體，并且核酸鏈應(yīng)該優(yōu)選為具有與適體的非莖部互補的堿基序列的核酸鏈。至少具有與適 體的非莖部(non-stem portion)互補的堿基序列，核酸鏈與已經(jīng)進行自退火的適體結(jié)合， 并解開適體的自退火。另外，在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“非莖部”表示排除了莖環(huán)結(jié)構(gòu)從而形成互補鏈的 適體的部分，并且其表示具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的環(huán)狀部和沒有形成互補鏈的膨脹部。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法，核酸鏈應(yīng)該優(yōu)選為具有與適體非互補的堿基序列的核 酸鏈，或者適體和核酸鏈中的至少任一種應(yīng)該優(yōu)選為具有取代基從而增強由適體與核酸鏈 的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué)變化中的至少任一種。以這種方式構(gòu)造的互補鏈產(chǎn)生了期望 的效果，即，核酸鏈與適體的結(jié)合引起用于更高的檢測敏感度的顯著的物理變化和化學(xué)變 化。另外，核酸鏈可以為被固定在傳感器的檢測表面上的核酸鏈。在這種情況下，傳感器以傳感器檢測由核酸鏈與適體的結(jié)合引起的介電常數(shù)變化 的方式基于表面細胞質(zhì)基因共振的原理來進行檢測?？商鎿Q地，傳感器以傳感器檢測由核 酸鏈與適體的結(jié)合引起的質(zhì)量變化的方式基于石英振蕩器微量天平的原理來進行檢測。最后，本發(fā)明涉及一種用于測定樣品中的靶物質(zhì)的的方法，所述方法包括以下步 驟在檢測表面上固定能夠與靶物質(zhì)進行特異性結(jié)合的適體；通過適體與樣品中的靶物質(zhì) 和具有與適體的至少一部分互補的堿基序列的核酸鏈的競爭性結(jié)合來檢測由適體與核酸 鏈的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué)變化中的至少任一種；通過適體與規(guī)定量的靶物質(zhì)和規(guī)定 量的核酸鏈的競爭性結(jié)合，檢測由適體與核酸鏈的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué)變化中的至 少任一種，從而知道靶物質(zhì)的量與檢測結(jié)果之間的關(guān)系；以及估算樣品中靶物質(zhì)的量。


圖1是示出了關(guān)于本發(fā)明的方法的示意圖。圖2是示出了用于關(guān)于本發(fā)明的方法的第一優(yōu)選實施方式的流程圖。圖3是示出了在關(guān)于本發(fā)明的方法的第一優(yōu)選實施方式中的第一步驟的示意圖。圖4是示出了在關(guān)于本發(fā)明的方法的第一優(yōu)選實施方式中的第二步驟的示意圖。圖5是示出了在關(guān)于本發(fā)明的方法的第一優(yōu)選實施方式中的第三步驟的示意圖。圖6是示出了在關(guān)于本發(fā)明的方法的第一優(yōu)選實施方式中的第四步驟的示意圖。圖7是示出了在關(guān)于本發(fā)明的方法中所使用的優(yōu)選核酸鏈的一個實例的示意圖。圖8是示出了在關(guān)于本發(fā)明的方法中所使用的優(yōu)選核酸鏈的另一個實例的示意 圖。圖9是示出了用于關(guān)于本發(fā)明的方法的第二優(yōu)選實施方式的流程圖。圖10是示出了在關(guān)于本發(fā)明的方法的第二優(yōu)選實施方式中的第一步驟的示意
4圖。圖11是示出了在關(guān)于本發(fā)明的方法的第二優(yōu)選實施方式中的第二步驟的示意 圖。圖12是示出了在關(guān)于本發(fā)明的方法的第二優(yōu)選實施方式中的第三步驟的示意 圖。圖13是示出了在關(guān)于本發(fā)明的方法的第二優(yōu)選實施方式中的第四步驟的示意 圖。圖14是示出了用于關(guān)于本發(fā)明的方法的第三優(yōu)選實施方式的示意圖。圖15是示出了適體細胞(在本發(fā)明實施例中所使用的)與參考細胞之間的sra 角位移的差異的曲線圖。圖16是示出了其中繪制在每個膽酸甲酯濃度(在本發(fā)明的實施例中)下的峰位 移值與空白的峰位移值之間的差異的曲線圖。
具體實施例方式下面為參照附圖給出的本發(fā)明的優(yōu)選實施方式的描述。應(yīng)當注意，實施方式僅為 典型實例，不應(yīng)該理解為限制本發(fā)明的范圍。圖1是示出了用于測定根據(jù)本發(fā)明的靶物質(zhì)的方法的示意圖?！癟”表示靶物質(zhì)， “A”表示與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的適體，并且“N”表示具有與適體A的至少一部分互補的堿基 序列的核酸鏈。根據(jù)本發(fā)明的方法期望通過使與靶物質(zhì)T特異性結(jié)合的適體A與靶物質(zhì)T和具有 與適體A的至少一部分互補的堿基序列的核酸鏈N進行競爭性結(jié)合來測定靶物質(zhì)T (參見 圖1 (1))。在這種狀態(tài)下，適體A與核酸鏈N的結(jié)合至少引起物理變化和化學(xué)變化中的任一 種被檢測到(參見圖1(2))。檢測的結(jié)果被用于測定靶物質(zhì)T。由適體A與核酸鏈N結(jié)合引起的物理變化和化學(xué)變化中的任一種的檢測提供了即 使在例如靶物質(zhì)T為低分子量(當與適體A結(jié)合時，不會引起可以以充分高的靈敏度被檢 測的物理變化和化學(xué)變化中的任一種)的情況下也允許靶物質(zhì)T的檢測的優(yōu)勢。另外，上述程序排除了由適體A的自退火所產(chǎn)生的影響。這導(dǎo)致由于經(jīng)受了自退 火的適體A所引起的噪聲的降低。下面逐步描述適合于根據(jù)本發(fā)明的方法的第一實施方式。應(yīng)當注意，圖2是示出 了用于關(guān)于本發(fā)明的方法的第一優(yōu)選實施方式的流程圖，并且圖3至圖6是示出了在關(guān)于 本發(fā)明的方法的優(yōu)選實施方式中的每一步驟的示意圖。另外，這些圖中示出了傳感器的檢 測表面1和接頭11。 第一步驟為將規(guī)定量的適體A弓I入到檢測表面1上。適體A具有用于固定在檢測 表面1上的末端官能團。固定在檢測表面1上是通過經(jīng)由接頭11的連接來發(fā)生的(參見 用于第一步驟的圖3)。下一步驟為將包含靶物質(zhì)T和核酸鏈N的樣品引入至其上固定了適體A的檢測表 面1。通過兩者與適體A的競爭性結(jié)合，由適體A與核酸鏈N的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué) 變化中的至少任一種被檢測到(參見用于第二步驟的圖4)。通過以以下方式制備的校準曲線來估算樣品中的靶物質(zhì)T的量。其上固定了適體A的檢測表面1被設(shè)置有規(guī)定量的靶物質(zhì)T和規(guī)定量的核酸鏈N，使得它們與適體A競爭性 結(jié)合。在這種條件下，適體A與核酸鏈的結(jié)合引起其中的至少任一種被檢測的物理變化和 化學(xué)變化。通過將核酸鏈N的量保持恒定并改變靶物質(zhì)T的量來重復(fù)用于檢測的該程序， 使得檢測結(jié)果與所引入的靶物質(zhì)T的量相關(guān)。因此，獲得了校準曲線(參見用于第三步驟 的圖5)。在上面所提及的第三步驟中所獲得的關(guān)系允許通過在上述第二步驟中的檢測結(jié) 果來估算樣品中靶物質(zhì)T的量(參見用于第四步驟的圖6)。下面為本發(fā)明的第一實施方式的詳細描述。根據(jù)本發(fā)明的方法并不具體限定于用于由適體A與核酸鏈N的結(jié)合所引起的物理 變化和化學(xué)變化中的至少任一種的檢測的目的。物理變化的典型實例包括介電常數(shù)和質(zhì)量 的變化?；瘜W(xué)變化的典型實例包括適體A的結(jié)構(gòu)變化和適體A的分子內(nèi)部鍵的鍵強度的變 化。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選借助于具有在其檢測表面1上所固定的適體A并允許物理變化 和化學(xué)變化中的任一種作為適體A與核酸鏈N結(jié)合的結(jié)果發(fā)生的傳感器來檢測由適體A與 核酸鏈N結(jié)合所引起的物理變化和化學(xué)變化中的任一種。用于檢測的手段(方式)并不限 制于該實施方式中所使用的手段。因為不需要通過諸如染料的不穩(wěn)定標記物來修飾適體A 和核酸鏈N，所以上述的方式是期望的。也因為其允許重復(fù)檢測，只要檢測表面1被再生即 可，所以是期望的。如上所述，傳感器被用于檢測由適體A與核酸鏈N的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué) 變化中的任一種。這種傳感器不被具體限定，只要其能夠檢測由所固定的適體A與核酸鏈 N的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué)變化中的任一種。其典型實例包括基于表面細胞質(zhì)基因共 振(下文中，簡稱為SPR)原理的傳感器以及基于石英晶體微量天平(下文中，簡稱為QCM) 原理的傳感器?；赟I^R原理的檢測憑借當適體A(被固定在檢測表面1上)與核酸鏈N結(jié)合時發(fā) 生的介電常數(shù)的變化。具體而言，當適體A(被固定在檢測表面1上)與核酸鏈N結(jié)合時， 介電常數(shù)變化，并且這種介電常數(shù)的變化以由于表面細胞質(zhì)基因共振所引起的反射光的強 度的衰減峰角度的變化的方式被觀察到。因此，基于sra原理的檢測依賴于由適體A與核 酸鏈N的結(jié)合導(dǎo)致的介電常數(shù)的變化量來改變靈敏度。基于QCM的原理的檢測憑借當適體A (被固定在檢測表面1上)與核酸鏈N結(jié)合 時發(fā)生的質(zhì)量的變化。具體而言，當適體A (被固定在檢測表面1上)與核酸鏈N結(jié)合時， 質(zhì)量變化，并且這種質(zhì)量的變化以由于石英振蕩器的壓電效應(yīng)所引起的共振頻率的變化的 方式被觀察到。因此，基于QCM原理的檢測依賴于由適體A與核酸鏈N的結(jié)合導(dǎo)致的質(zhì)量 的變化量來改變靈敏度。根據(jù)本發(fā)明的方法測定的靶物質(zhì)T沒有特別限定。例如，它包括蛋白質(zhì)、核酸、激 素、環(huán)境激素以及藥物。在這些實例中，優(yōu)選的是低分子量化合物形式的激素、環(huán)境激素以 及藥物。由于在借助于諸如SI^R傳感器和QCM傳感器的生物傳感器的直接檢測中介電常數(shù) 或質(zhì)量的變化較小，所以常常不能高靈敏度地測定具有低分子量的激素、環(huán)境激素以及藥 物。即使在這種情況下，也可以通過根據(jù)本發(fā)明的方法以高靈敏度來檢測諸如激素、環(huán)境激 素以及藥物的低分子量化合物。
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在根據(jù)本發(fā)明的方法中所使用的適體A是與靶物質(zhì)T特異性結(jié)合的分子(諸如核 酸)。其沒有具體限定，只要其與靶物質(zhì)T特異性結(jié)合即可。它包括DNA適體、RNA適體、肽 適體、PNA (肽核酸)等。根據(jù)本發(fā)明的方法被設(shè)計成檢測由適體A與核酸鏈N的結(jié)合所導(dǎo)致的物理變化和 化學(xué)變化中的任一種；因此，它可以減小由于自退火的適體A所引起的噪聲。這允許在本發(fā) 明的方法中的檢測靈敏度的改善，而沒有由于適體A的量的增加而引起噪聲增加。根據(jù)本發(fā)明的方法，適體A以任意方式被固定在檢測表面1上，而沒有具體的限 定。存在如下列出的幾種固定方式。通過由修飾適體A的末端基團的抗生物素蛋白與修飾 檢測表面1的生物素之間的反應(yīng)引起的抗生物素蛋白_生物素連接的固定。通過由適體A 的胺化末端基團與修飾檢測表面1的羧酸之間的反應(yīng)引起的酰胺基連接的固定。通過由 適體A的硫醇化末端基團與構(gòu)成檢測表面1的貴金屬之間的反應(yīng)引起的硫醇金屬連接的固 定。通過由用于修飾適體A的末端基團的蛋白質(zhì)與由容易吸附蛋白質(zhì)的材料制成的檢測表 面1之間的反應(yīng)引起的蛋白質(zhì)物理吸附的固定。本發(fā)明的方法對適體A的量沒有任何限定，適體A的量可以根據(jù)所要測定的靶物 質(zhì)τ的種類和濃度而適當?shù)卮_定。被固定在檢測表面1上的適體A的量沒有具體限定。在本發(fā)明的方法中所使用的核酸鏈N具有與適體A的至少一部分互補的堿基序 列，使得核酸鏈N與適體A結(jié)合，從而引起物理變化和化學(xué)變化，為了靶物質(zhì)T的測定而測 量物理變化和化學(xué)變化中的任一種。核酸鏈N沒有具體限定與適體A互補的堿基序列的堿基的數(shù)目。互補堿基序列的 堿基數(shù)目的變化導(dǎo)致適體A與核酸鏈N之間的雙鏈鍵的平衡常數(shù)的變化。由此可以調(diào)整靈 敏度。核酸鏈N沒有特別限于與適體A互補的堿基序列。如果適體A具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，則 核酸鏈N應(yīng)當優(yōu)選具有與適體A的非莖部的堿基序列互補的堿基序列，使其從自退火適體 A的非莖部分開始與適體A有效地結(jié)合。這導(dǎo)致靈敏度的改善。換句話說，存在這樣的情況，其中，自退火的適體A(其具有莖環(huán)結(jié)構(gòu))并不與靶物 質(zhì)T結(jié)合，因此，對檢測沒有貢獻。類似于此的適體A在檢測時引起噪聲。在這種情況下， 具有與適體A的非莖部的堿基序列互補的堿基序列的核酸鏈N解開具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的自退火 適體A的自退火，從而有助于檢測。此外，它也減少了自退火的適體A，從而降低了噪聲并改 善了檢測靈敏度(參見圖8)。在核酸鏈N具有與適體A的非莖部的堿基序列互補的堿基序列的情況下，與適體A 的非莖部的堿基序列互補的堿基序列的堿基數(shù)目沒有特別限制；然而，期望的數(shù)目不小于 4。這種條件對于核酸鏈N與適體A的非莖部的有效結(jié)合是必須的。另外，當其與靶物質(zhì)T結(jié)合時，核酸鏈N應(yīng)該優(yōu)選具有與靶物質(zhì)T作用最強的堿基 序列(在適體A的堿基序列中)的部分互補的堿基序列。與靶物質(zhì)T結(jié)合的適體A的堿基 序列的所述部分在與靶物質(zhì)T結(jié)合時變得穩(wěn)定。因此，具有與所述部分互補的堿基序列的 核酸鏈N容易與還沒有與靶物質(zhì)T結(jié)合的適體A結(jié)合(參見圖7 (1))，但很難與已經(jīng)與靶物 質(zhì)T結(jié)合的適體A結(jié)合(參見圖7(2))。在核酸鏈N具有與結(jié)合了靶物質(zhì)T的適體A的堿基序列部分互補的堿基序列的情 況下，與結(jié)合了靶物質(zhì)T的適體A的部分互補的堿基序列的堿基數(shù)目沒有特別限制。
另外，在根據(jù)本發(fā)明的方法中所使用的核酸鏈N沒有具體限定，只要其具有與適 體A的至少一部分互補的堿基序列即可。然而，其優(yōu)選為具有與適體A非互補的堿基序列 的核酸鏈N。當其與適體A結(jié)合時，具有與適體A非互補的堿基序列的核酸鏈N引起介電常 數(shù)和質(zhì)量的較大變化。這導(dǎo)致靈敏度的改善。此外，對于當與適體A結(jié)合時為了改善靈敏度而引起介電常數(shù)和質(zhì)量的較大變化 的核酸鏈而言，可以通過增大當適體A與核酸鏈N結(jié)合時發(fā)生的物理變化和化學(xué)變化中的 至少任一種的取代基來修飾適體A和核酸鏈N中的至少任一種。這種取代基沒有具體限定， 而是可以根據(jù)用于檢測的手段而適當?shù)剡x擇。例如，在適體A被固定在基于SPR的原理執(zhí) 行檢測的傳感器的表面上的情況下，核酸鏈可以具有通過介電材料修飾的末端基團。根據(jù)本發(fā)明的方法在核酸鏈N的量方面沒有特別限定，核酸鏈N的量可以根據(jù)適 體A和核酸鏈N的結(jié)構(gòu)以及所要引入的靶物質(zhì)T的量適當?shù)卮_定。當根據(jù)本發(fā)明的方法讓適體A與靶物質(zhì)T和核酸鏈N競爭性結(jié)合時，對引入靶物 質(zhì)T和核酸鏈N的順序沒有施加具體限定。例如，可以同時引入靶物質(zhì)T和核酸鏈N。而 且，當借助于傳感器檢測由適體A與核酸鏈N的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué)變化中的至少 任一種時，靶物質(zhì)T可以在核酸鏈N之前被引入，使得在適體A與核酸鏈N的結(jié)合達到平衡 之前可以快速獲得信號。下面為本發(fā)明的第二實施方式的逐步描述。它排除了與第一實施方式中相同的項 目，而是僅提及與第一實施方式中不同的項目。應(yīng)當注意，圖9為用于關(guān)于本發(fā)明的方法的 第二優(yōu)選實施方式的流程圖，并且圖10至圖13是示出了在關(guān)于本發(fā)明的方法的優(yōu)選實施 方式中的每個步驟的示意圖。另外，在這些圖中示出了傳感器的檢測表面2和接頭21。第一步驟為將規(guī)定量的核酸鏈N固定在檢測表面2上。核酸鏈N具有用于在檢測 表面2上固定的末端官能團。在檢測表面2上的固定通過接頭21的連接來進行(參見用 于第一步驟的圖10)。接下來的步驟為將包含靶物質(zhì)T和適體A的樣品引入其上已經(jīng)固定了核酸鏈N的 檢測表面2。通過核酸鏈N和靶物質(zhì)T與適體A的競爭性結(jié)合，由核酸鏈N與適體A的結(jié)合 引起的物理變化和化學(xué)變化中的至少任一種被檢測到(參見用于第二步驟的圖11)。通過以下面方式制作的校準曲線來估算樣品中靶物質(zhì)T的量。其上固定有核酸鏈 N的檢測表面2設(shè)置有規(guī)定量的適體A和規(guī)定量的靶物質(zhì)T，使得它們與核酸鏈N競爭性結(jié) 合。在這種條件下，核酸鏈N與適體A的結(jié)合引起物理變化和化學(xué)變化，檢測至少任一種變 化。通過將適體A的量保持恒定，并且改變靶物質(zhì)T的量來重復(fù)這種用于檢測的程序，使得 檢測的結(jié)果與所引入的靶物質(zhì)T的量相關(guān)。因此，獲得了校準曲線(參見用于第三步驟的 圖 12)。在上面所提及的第三步驟中所獲得的關(guān)系允許通過在上述第二步驟中的檢測結(jié) 果來估算樣品中靶物質(zhì)τ的量(參見用于第四步驟的圖13)。下面為本發(fā)明第二實施方式的詳細描述。根據(jù)該實施方式，核酸鏈N被固定在傳感器的檢測表面2上，并且核酸鏈N與適體 A結(jié)合，從而引起物理變化和化學(xué)變化，其中的至少任一種通過傳感器檢測。因為不需要通 過諸如染料的不穩(wěn)定標記物來修飾適體A和核酸鏈N，所以期望以這種方式的檢測。也因為 其允許重復(fù)測量，只要檢測表面2被再生即可，所以其也是期望的。
如上所述，傳感器被用于檢測由核酸鏈N與適體A的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué) 變化中的任一種。這種傳感器沒有具體限定，只要其能夠檢測由核酸鏈N與適體A的結(jié)合 引起的物理變化和化學(xué)變化中的任一種。它的典型實例包括基于Sra原理和QCM原理的傳 感器?；赟ra原理的檢測借助于當核酸鏈N(被固定在檢測表面2上)與適體A結(jié)合 時發(fā)生的介電常數(shù)的變化。具體而言，當核酸鏈N(被固定在檢測表面2上)與適體A結(jié)合 時，介電常數(shù)變化，并且這種介電常數(shù)的變化以由于表面細胞質(zhì)基因共振所引起的反射光 的強度的衰減峰角度的變化的方式被觀察到。因此，基于SPR的原理的檢測依賴于由核酸 鏈N與適體A的結(jié)合導(dǎo)致的介電常數(shù)的變化量來改變靈敏度?；赒CM的原理的檢測借助于當核酸鏈N(被固定在檢測表面2上)與適體A結(jié)合 時發(fā)生的質(zhì)量的變化。具體而言，當核酸鏈N(被固定在檢測表面2上)與適體A結(jié)合時， 質(zhì)量變化，并且這種質(zhì)量的變化以由于石英振蕩器的壓電效應(yīng)所引起的共振頻率的變化的 方式被觀察到。因此，基于QCM原理的檢測依賴于由核酸鏈N與適體A的結(jié)合導(dǎo)致的質(zhì)量 的變化量來改變靈敏度。核酸鏈N以任意方式被固定在檢測表面2上，而沒有具體的限定。存在如下列出 的幾種固定方式。通過由修飾核酸鏈N的末端基團的抗生物素蛋白與修飾檢測表面2的生 物素之間的反應(yīng)引起的抗生物素蛋白-生物素連接的固定。通過由核酸鏈N的胺化末端基 團與修飾檢測表面2的羧酸之間的反應(yīng)引起的酰胺基連接的固定。通過由核酸鏈N的硫醇 化末端基團與構(gòu)成檢測表面2的貴金屬之間的反應(yīng)引起的硫醇金屬連接的固定。通過由修 飾核酸鏈N的末端基團的蛋白質(zhì)與由容易吸附蛋白質(zhì)的材料制成的檢測表面之間的反應(yīng) 引起的蛋白質(zhì)物理吸附的固定。本發(fā)明的方法對適體A的量沒有任何限制，適體A的量可以根據(jù)待測定的靶物質(zhì) T的種類和濃度而適當?shù)卮_定?？梢酝ㄟ^改變適體A的濃度來改變用于靶物質(zhì)T的動態(tài)范圍。此外，對于當與核酸鏈結(jié)合時為了改善靈敏度而引起介電常數(shù)和質(zhì)量的較大變化 的適體A而言，可以通過增大當適體A與核酸鏈N結(jié)合時產(chǎn)生的物理變化和化學(xué)變化中的 任一種的取代基來修飾適體A和核酸鏈N中的至少任一種。這種取代基沒有具體限定，而 是可以根據(jù)用于檢測的手段而適當?shù)剡x擇。例如，在核酸鏈ν被固定在基于sra原理進行 檢測的傳感器的表面上的情況下，適體A可以具有通過介電材料所修飾的末端基團。根據(jù)本發(fā)明的方法的核酸鏈N(被固定在傳感器的檢測表面2上)的量沒有特別 限定，核酸鏈N的量可以根據(jù)適體A和核酸鏈N的結(jié)構(gòu)以及待引入的靶物質(zhì)T的量而適當 地確定。根據(jù)該實施方式，對將靶物質(zhì)T和適體A引入到檢測表面2上的順序沒有特別的 限制。例如，可以同時引入靶物質(zhì)T和適體A。也可以優(yōu)先使靶物質(zhì)T與適體A反應(yīng)，然后 將反應(yīng)產(chǎn)物引入到核酸鏈N中，使得以在靶物質(zhì)T與適體A之間已經(jīng)達到反應(yīng)平衡的這種 狀態(tài)來完成檢測。這樣可高靈敏度地測定靶物質(zhì)T。下面為本發(fā)明的第三實施方式的描述。它排除了與第一和第二實施方式中相同的 項目，而是僅提及與第一和第二實施方式中不同的項目。圖14為用于第三實施方式的示意 圖，其中，“F”表示熒光染料，并且“Q”表示猝滅熒光染料Q的猝滅劑。
根據(jù)該實施方式，適體A與核酸鏈N結(jié)合，從而引起物理變化和化學(xué)變化，借助于 熒光染料F和猝滅熒光染料F的猝滅劑Q (兩者均修飾適體A的堿基序列)檢測物理變化 和化學(xué)變化中的至少任一種。當適體A被連接至靶物質(zhì)T或處于自退火狀態(tài)下時，熒光染 料F和猝滅劑Q以它們彼此接近的這種方式來修飾適體A，但是當適體A與核酸鏈N連接 時，以它們彼此遠離的這種方式來修飾適體A(參見圖14)。當適體A被連接至靶物質(zhì)T或處于自退火狀態(tài)時，熒光染料F與猝滅劑Q接近，并 且通過猝滅劑Q來猝滅熒光染料F，使得沒有觀察到熒光(參見圖14(1))。相反，當適體A被連接至核酸鏈N時，熒光染料F遠離猝滅劑Q，并且熒光染料沒有 被猝滅劑Q猝滅，使得觀察到熒光(參見圖14(2))。因此，根據(jù)該實施方式的方法，由適體A與核酸鏈N的結(jié)合引起的結(jié)構(gòu)上的變化可 以以修飾適體A的熒光染料F的熒光強度的變化的方式被觀察到。關(guān)于本發(fā)明的方法提供了即使在其為低分子量從而不允許對由適體A與靶物質(zhì)T 的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué)變化中的任一種進行靈敏檢測的情況下，也可以以高靈敏度 來測定靶物質(zhì)T的優(yōu)勢。另外，上述方法免于由適體A的自退火所產(chǎn)生的效應(yīng)，因此能夠降低由于自退火 的適體A所引起的噪聲。此外，上述方法允許根據(jù)核酸鏈N與適體A的平衡狀態(tài)以及核酸鏈N、靶物質(zhì)T和 適體A的平衡狀態(tài)來計算適體A與靶物質(zhì)T的平衡常數(shù)。此外，如果靶物質(zhì)T的量變化，其中適體A的量保持不變，則可以容易地測量靶物 質(zhì)T與適體A的親和力。因此，例如，關(guān)于本發(fā)明的方法可以容易地被用于藥物的篩選。將參照下面的實施例更詳細地描述發(fā)明，下面的實施例不應(yīng)該被理解為限制本發(fā) 明的范圍。<實驗條件>參考物質(zhì)為膽酸甲酯，并且適體為被制備用于膽酸的適體。通過用于結(jié)合檢測表 面的生物素修飾5’ -端。表1示出了適體和參考DNA的堿基序列。[表 1]
權(quán)利要求
一種用于測定靶物質(zhì)的方法，所述方法包括使得能夠與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的適體與所述靶物質(zhì)和具有與所述適體的至少一部分互補的堿基序列的核酸鏈進行競爭性結(jié)合，檢測由所述適體與所述核酸鏈的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué)變化中的至少一種，以及基于檢測結(jié)果來測定所述靶物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述適體為固定在傳感器的檢測表面上的適體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述傳感器為基于表面細胞質(zhì)基因共振原理來 執(zhí)行檢測并且能夠檢測由所述適體與所述核酸鏈的結(jié)合引起的介電常數(shù)的變化的傳感器。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述傳感器為基于石英晶體微量天平原理來執(zhí) 行檢測并且能夠檢測由所述適體與所述核酸鏈的結(jié)合引起的質(zhì)量變化的傳感器。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述適體具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并且所述核酸鏈至少具 有與所述適體的非莖部互補的堿基序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述核酸鏈具有與所述適體非互補的堿基序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述適體和所述核酸鏈中的至少一種由取代基 修飾，所述取代基使由所述適體與所述核酸鏈的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué)變化中的任一 種增加。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述核酸鏈被固定在傳感器的檢測表面上。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述傳感器基于表面細胞質(zhì)基因共振的原理以 這樣的方式來進行檢測所述傳感器檢測由所述核酸鏈與所述適體的結(jié)合引起的介電常數(shù) 的變化。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述傳感器基于石英振蕩器微量天平的原理 以這樣的方式來進行檢測所述傳感器檢測由所述核酸鏈與所述適體的結(jié)合引起的質(zhì)量變 化。
11.一種用于測定樣品中的靶物質(zhì)的方法，所述方法包括以下步驟在檢測表面上固 定能夠與所述靶物質(zhì)特異性結(jié)合的適體；利用所述適體與在所述樣品中的所述靶物質(zhì)和具 有與所述適體的至少一部分互補的堿基序列的核酸鏈競爭性結(jié)合，檢測由所述適體與所述 核酸鏈的結(jié)合引起的物理變化和化學(xué)變化中的至少任一種；通過所述適體與規(guī)定量的所述 靶物質(zhì)和規(guī)定量的所述核酸鏈的競爭性結(jié)合，檢測由所述適體與所述核酸鏈的結(jié)合引起的 物理變化和化學(xué)變化中的至少任一種，從而了解所述靶物質(zhì)的量與檢測結(jié)果之間的關(guān)系； 估算所述樣品中的所述靶物質(zhì)的量。
全文摘要
本發(fā)明披露了一種借助于適體來高度靈敏度地定量靶物質(zhì)的方法。具體公開了一種用于定量靶物質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟在靶物質(zhì)和核酸鏈彼此競爭性結(jié)合的條件下，使得能夠特異性結(jié)合所述靶物質(zhì)的適體與具有與所述適體的至少一部分互補的堿基序列的所述核酸鏈結(jié)合，檢測由所述結(jié)合引起的物理變化和化學(xué)變化中的至少一種；以及基于檢測結(jié)果來定量所述靶物質(zhì)。
文檔編號C12Q1/68GK101946011SQ20098010508
公開日2011年1月12日 申請日期2009年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月27日
發(fā)明者原田智子, 渡部祐己 申請人:索尼公司